DE3587510T2

DE3587510T2 - Gerät zur Messung von Endotoxin.

Info

Publication number: DE3587510T2
Application number: DE89114580T
Authority: DE
Inventors: Yasumichi Hatayama; Haruki Oishi; Yoshitsugu Sakata; Hiromi Shiraishi; Kazuya Yanagisawa
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1985-06-25
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2005-06-26
Also published as: ATE76507T1; EP0173021B1; DE3586075D1; ATE92630T1; EP0347951A3; EP0173021A3; DE3587510D1; US4740460A; EP0347951A2; EP0173021A2; EP0347951B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Messen von Endotoxin in einer Probe. Die vorliegende Anmeldung ist ausgeschieden aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 85107877.4, die ein Verfahren zum Messen von Endotoxin in einer Probe betrifft.
Endotoxine sind typische fiebererzeugende Stoffe (Pyrogene). Wenn eine mit einem Endotoxin kontaminierte Bluttransfusionslösung oder parenterale Lösung in einen lebenden Körper eingeführt wird, führt dies bekanntermaßen zu ernsten Nebenwirkungen, beispielsweise zu hohem Fieber oder Schock. Es ist daher absolut notwendig, die Endotoxinmenge in einer Rohstofflösung, im Waschwasser, etc. zu messen, um eine Kontamination mit dem Endotoxin in den Fertigungsstufen medizinischer Produkte wie Injektionslösungen zu vermeiden. Ferner wird die Messung von Endotoxin häufig bei Funktionstests für Membranen zur Erzeugung von hochreinem Wasser oder bei der Untersuchung von Waschwasser, das bei der Herstellung von Halbleitern verwendet wird, angewandt.
In jüngster Zeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem Endotoxin gemessen wird, indem eine Gelierreaktion zwischen dem Limulus-Amöbozyten-Lysat (ein aus Amöbozyten von Limulus polyphemus extrahierter Bestandteil, nachfolgend bezeichnet als "LAL") und einem Endotoxin [J. Levin & F.B. Bang, Thromb. Diath. Haemorrh., 19, 186 (1968)] durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren wird eine Probenlösung und ein LAL-Reagens in einem Reagenzglas gemischt, bei einer konstanten Temperatur für eine bestimmte Zeit stehengelassen, durch Schräghalten oder Umdrehen des Reagenzglases wird mit dem bloßen Auge festgestellt, ob sich ein Gel bildet, dann wird verglichen mit den Ergebnissen einer ähnlichen Reaktion zwischen einer endotoxinhaltigen Probe bekannter Konzentration und dem LAL-Reagens, und es wird semiquantitativ beurteilt, ob die Probenlösung endotoxin-positiv (+) oder endotoxin-negativ (-) ist. Nachdem dieses Verfahren aber viel Geschick erfordert, und der Maßstab für die Beurteilung positiv oder negativ vom subjektiven Eindruck des Beobachters abhängt, hat dieses Verfahren verschiedene Nachteile, denn die Beurteilung fällt individuell sehr unterschiedlich aus, wobei die Untergrenze etwa bei 0,05 ng/ml liegt, und eine noch niedrigere Konzentration von Endotoxin nicht festgestellt werden kann, und so weiter. Außerdem ist der Gelzustand bei der Gelierungsreaktion so schwach, daß der Gelzustand manchmal zerstört wird, wenn das Reagenzglas sich leicht bewegt aufgrund des Wasserstroms in einem Wasserbad konstanter Temperatur und mit Wasserrückführung, das verwendet wird, um die Reaktion auf einer konstanten Temperatur, beispielsweise auf 37ºC, zu halten, oder wenn sich das Reagenzglas leicht bewegt, wenn es zur Begutachtung mit dem bloßen Auge aus dem auf konstanter Temperatur gehaltenen Wasserbad genommen wird, was zu Fehlern führt. Es ist daher sehr schwer, mit diesem Verfahren immer genaue Meßwerte zu erhalten.
Unlängst wurde ein Verfahren zur Bestimmung des Endotoxingehaltes vorgeschlagen, bei dem die Trübung der Proben optisch und unter Verwendung der Änderung der Extinktion gemessen wird, wobei darauf hingewiesen wird, daß die Trübung aufgrund der Gelierung entsteht (z. B. ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 9050/83 und Nr. 42451/84). Bei diesem Verfahren ist die Objektivität der Beurteilung verbessert, aber nachdem die Gelierungsreaktion zig Minuten bis etwa 1 Stunde dauert, nimmt das Messen vieler Proben längere Zeit in Anspruch, und die Meßleistung ist bewerkenswert schlecht. Wenn ferner bei einer Extinktionsmeßvorrichtung, die fortlaufend eine große Anzahl von Proben mißt, ein System zum Weiterbewegen der Proben verwendet wird, um den Wirkungsgrad zu verbessern, besteht die Gefahr, daß der Gelzustand der Proben während des Gelierens aufgrund der obenerwähnten Schwäche des Gels zerstört wird. Es ist daher schwer zu sagen, daß dieses Verfahren zum Messen einer Vielzahl von Proben in einem kurzen Zeitraum praktisch ist.
Andererseits wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem der Endotoxingehalt mit Hilfe eines chromogenen Peptidderivats als synthetischem Substrat bestimmt wird, eine Farbentwicklung durch Hydrolyse des Substrats mit LAL und Endotoxin in einer Probe herbeigeführt wird, und der Grad der Färbung kolorimetrisch bestimmt wird (S. Iwanaga et al., Haemostasis, 7, 183 (1978)]. Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht für tägliche Untersuchungen, da der Meßbereich schmal ist, nämlich mehrere pg/ml bis 100 pg/ml, und die Meßverfahren recht kompliziert sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, mit der Endotoxin in einer Probe in einem recht weiten Bereich von Konzentrationen problemlos mit hoher Genauigkeit gemessen werden kann, selbst wenn eine große Anzahl von Proben verwendet wird, und mit der die Nachteile der bekannten Verfahren beseitigt werden.
Die Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Messen von Endotoxin bereit, die ein oder mehrere optische Systeme, umfaßt, die jeweils folgendes umfassen:
eine Lichtquelle, ein die Probenlösung enthaltendes Gefäß und eine Einrichtung zum Erfassen der übertragenen bzw. durchgelassenen Lichtmengen,
ein Bad mit konstanter Temperatur, welches die optischen Systeme auf einer konstanten Temperatur hält und das Gefäß ruhig hält,
eine Einrichtung, die die Empfindlichkeit der optischen Systeme korrigiert und einen Gelierpunkt bestimmt,
eine Einrichtung, die den Beginn der Messung der übertragenen bzw. durchgelassenen Lichtmengen veranlaßt und an die Einrichtung zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist, und
eine Zeitmeßvorrichtung, die die vom Beginn der Messung der übertragenen bzw. durchgelassenen Lichtmengen an vergangene Zeit für jedes optische System parallel und unabhängig von den anderen mißt und an die Einrichtung zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines optischen Systems, bestehend aus einer Lichtquelle, einem die Probenlösung enthaltenden Gefäß und einer Einrichtung zum Erfassen der durchgelassenen Lichtmengen.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der in einem bestimmten Zeitraum durch eine Probenlösung durchgelassenen Lichtmenge (I)t.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung einer Änderung des Verhältnisses R(t) innerhalb eines bestimmten Zeitraums.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Änderungen des Verhältnisses R(t) innerhalb eines bestimmten Zeitraums im Vergleich zur Endotoxinkonzentration.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung des Zusammenhangs zwischen den Ergebnissen der Beurteilung gemäß vorliegender Erfindung und den Ergebnissen eines bekannten Gelgerinnungsverfahrens.
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung der wesentlichen Bestandteile einer Vorrichtung gemäß der Erfindung.
Fig. 7 ist eine perspektivische Darstellung der Außenansicht eines Beispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 8 ist ein Blockschaltbild einer elektrischen Anlage bei einem Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung einer Eichkurve, die aus den Ergebnissen von Beispiel 1 gewonnen wurde.
Fig. 10-12 sind graphische Darstellungen von Eichkurven, die aus den Ergebnissen von Beispiel 2, 4 und 5 gewonnen wurden.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

In der vorliegenden Erfindung kann ein optisches System, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, beispielsweise zum Messen von durch Probenlösungen durchgelassenen Lichtmengen verwendet werden. Das heißt, ein die Probenlösung enthaltendes Gefäß, beispielsweise eine Küvette 1 (normalerweise mit einem Innendurchmesser von 6 mm bis 12 mm), enthält eine Probenlösung 2, die durch Mischen einer zu untersuchenden flüssigen Probe mit einem Endotoxin gelierenden Reagens, z. B. einem LAL-Reagens (normalerweise 0,1 ml der flüssigen Probe und 0,1 ml des LAL-Reagens, oder gefriergetrocknetes LAL-Reagens und 0,2 ml der flüssigen Probe), erhalten wurde. Licht aus einer Lichtquelle 5 wird durch eine Öffnung 3 auf die Probenlösung 2 gerichtet. Das durch die Probenlösung 2 durchgelassene Licht gelangt durch eine Öffnung 4 und wird an einer Einrichtung zum Erfassen der durchgelassenen Lichtmengen, beispielsweise an einem photoelektrischen Detektor 6, in die entsprechende Menge Elektrizität umgewandelt.
Als Lichtquelle 5 kann ein lichtemittierendes Element wie zum Beispiel eine Leuchtdiode (LED), eine Wolframlampe oder dergleichen verwendet werden.
Als photoelektrischer Detektor 6 kann ein lichtempfangendes Element wie zum Beispiel eine Photodiode, eine Photozelle oder dergleichen verwendet werden.
Die von dem photoelektrischen Detektor 6 gemessene durchgelassene Lichtmenge I(t) zeigt mit der Zeit eine Änderung im Vergleich zur Reaktionszeit "t", nachdem die flüssige Probe und das LAL-Reagens miteinander vermischt wurden, wie in Fig. 2 gezeigt. Das heißt, das Endotoxin geliert nach drei Schritten, nämlich nach einem Schritt (a), bei dem das durchgelassene Licht einen Anfangswert I&sub0; hat und einen nahezu konstanten Wert im Anfangsstadium der Reaktion, einem Schritt (b), bei dem das durchgelassene Licht I(t) rasch abnimmt, und schließlich einem Schritt (c), bei dem I(t) einen nahezu konstanten Wert fast ohne Änderungen zeigt. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, zeigt Schritt (b) einen Zustand rasch fortschreitender Gelierung in der Probenlösung, und Schritt (c) zeigt einen Zustand, der bei der Gelierungsreaktion nach dem bekannten Gelgerinnungsverfahren mit dem bloßen Auge als positiv beurteilt wird. Nachdem die Zeit, die vom Beginn der Reaktion an bis zum Erreichen von Stufe (b) und Stufe (c) vergeht, mit der Endotoxin-Konzentration in Probenlösungen zusammenhängt, und nachdem dies experimentell bestätigt wurde, ist es nun möglich, das Endotoxin qualitativ und quantitativ innerhalb eines weiten Bereichs mit hervorragender Genauigkeit unter Zugrundelegung einer solchen Beziehung zu messen. Ferner kann ein solches Verfahren ohne weiteres bei täglichen Untersuchungen angewandt werden.
Bei dieser Erfindung ist wichtig, daß die Empfindlichkeit der einzelnen optischen Systeme ordnungsgemäß korrigiert wird. Um Unterschiede bei den durchgelassenen Lichtmengen zu korrigieren, die auf die bei den Probenlösungen normalerweise auftretende Trübung und Färbung zurückzuführen sind, wird der Anfangswert der durchgelassenen Lichtmenge 10 und die durchgelassene Lichtmenge zu einem Zeitpunkt "t" nach dem Beginn der Reaktion I(t) gemessen, und man erhält das Verhältnis R(t), das heißt
R(t) = I(t)/I&sub0; · 100 (%)
Das heißt, R(t) wird hinsichtlich der Unterschiede der Empfindlichkeit der optischen Systeme und der Unterschiede der vom Zustand der Proben abhängigen Lichtmengen korrigiert.
Die Änderung von R(t) innerhalb eines bestimmten Zeitraums ist in Fig. 3 dargestellt, in der dasselbe Verhalten dargestellt ist wie die Änderung von I(t) gemäß Fig. 2.
Als Anfangswert I&sub0; kann man vier Werte verwenden, einen maximalen Anfangswert I0 max, einen durchschnittlichen Anfangswert I0 Durch, einen Anfangswert zu einem speziellen Zeitpunkt "ts" I0 ts, und einen minimalen Anfangswert I0 min, gemessen in dem Zeitraum vom Mischen der flüssigen Probe mit dem Endotoxin gelierenden Reagens bis zur Abnahme
der durchgelassenen Lichtmenge aufgrund des Beginns der Reaktion - etwa 2 Minuten.
Der maximale Anfangswert I0 max wird verwendet, wenn es länger dauert, bis die aus dem Reagens und der Probe gemischte Lösung gleichmäßig wird, insbesondere bei Verwendung eines gefriergetrockneten Reagens, oder wenn zum Zeitpunkt des Mischens von Reagens und Probe Bläschen enthalten sind.
Der durchschnittliche Anfangswert I0 Durch wird verwendet, wenn ein Signal schnelles Wechselstromrauschen zeigt, weil feine Mikroteilchen vorhanden sind, oder wenn langsames Wechselstromrauschen auftritt, weil sich relativ große Teilchen bewegen.
Der minimale Anfangswert I0 min wird verwendet, wenn es länger dauert, bis die Mischung aus dem Reagens und der Probe gleichmäßig wird.
Der Anfangswert zu einem speziellen Zeitpunkt "ts", I0 ts, wird verwendet, wenn schon bekannt ist, daß in einer bestimmten Zeitzone ein korrekter Wert von I&sub0; erhalten wird, wenn der Maximalwert oder der Minimalwert gemessen wird.
Im Hinblick auf die Eigenschaften des Reagens ist die Verwendung des Anfangswertes I0 max vorzuziehen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein konstanter Wert R(t), d. h. Rf, bei dem I(t) kaum verändert ist und einen konstanten Wert in Stufe (c) zeigt, nicht verwendet, da es lange dauert, bis man den Rf-Wert erhält. Stattdessen ist ein Schwellenwert Rth in Stufe (b), wo es zu der Gelierungsreaktion kommt, vorgesehen, wie in Fig. 3 gezeigt, und der Zeitpunkt, der am Schwellenwert Rth erreicht wird, wird als "Gelierpunkt" bezeichnet. Ferner ist die Reaktionszeit vom Mischen der Probenlösung bis zum Gelierpunkt definiert als "Gelierzeit TG", die zur quantitativen Bestimmung von Endotoxinen herangezogen wird.
Der Schwellenwert Rth kann wahlweise vorgesehen werden, vorausgesetzt, daß kein Fehler aufgrund von Rauschen vorliegt, und alle Proben im vorgesehenen Wert liegen. Da die Gelierzeit TG anhand von dem Wert Rth ermittelt wird, der nicht von den optischen Systemen abhängt und als ein gemeinsamer Wert eingestellt werden kann, hängt TG auch nicht von den Eigenschaften jedes optischen Systems ab. Wenn die Beziehung zwischen der Gelierzeit und dem Endotoxin bekannt ist, kann die Endotoxinkonzentration durch Messen der Gelierzeit ermittelt werden.
Fig. 4 zeigt eine Kurve, die erhalten wird durch Auftragen der Beziehung zwischen Endotoxinkonzentration und R(t), wobei die seit dem Mischen der Probenlösung vergangene Zeit als Parameter verwendet wird. Folgendes Reagens und folgende Meßmethode wurden verwendet:

LAL-Reagens:

hergestellt von Associates of Cape Cod. Die Empfindlichkeit des Gelgerinnungsverfahrens betrug anhand der FDA-Referenz 0,05 ng/ml.

Endotoxin:

gereinigt aus Escherichia coli UKT-B (Forschungsinstitut für mikrobielle Erkrankungen, Universität Osaka). Der Gehalt wird anhand der FDA-Referenz ermittelt.

Meßmethode:

Das LAL-Reagens und das Endotoxin werden jeweils in destilliertem Injektionswasser gelöst (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) und in einem Reagenzglas mit einem Durchmesser von 10 mm jeweils in Mengen von 0,1 ml unter Rühren vermischt, und die Änderungen der durchgelassenen Lichtmengen werden gemessen, wobei die Probenlösungen auf 37ºC gehalten werden.
In Fig. 4 zeigen die Kurven A, B, C, D, E und F die Änderungen nach 5, 10, 20, 35, 60 und 120 Minuten seit dem Mischen.
Wie aus Fig. 4 hervorgeht, ist R(t) bei allen gemessenen Konzentrationen vermindert, und je höher die Konzentration der Probenlösungen, umso schneller beginnt die Abnahme. Ferner zeigt der endgültige Wert Rf, bei dem R(t) innerhalb einer bestimmten Zeit nahezu keine Abnahme zeigt, keinen bemerkenswerten, Konzentrationsänderungen entsprechenden Unterschied, und so eignet sich Rf nicht als Indikator für die Endotoxinkonzentration. Im Gegenteil, wenn der Rth-Wert verwendet wird, der ein Wert ist, bevor R(t) Rf erreicht, (Rth ist in Fig. 4 durch eine gestrichelte Linie bei R(t) = 95% dargestellt), läßt sich das Gelieren von Probenlösungen in einem weiteren Konzentrationsbereich untersuchen. Durch Messen der Reaktionszeit, bis R(t) Rth erreicht, als Gelierzeit TG, kann ferner die quantitative Bestimmung der Endotoxin-Konzentration in einem weiten Bereich durchgeführt werden. Die Zeit, die benötigt wird, bis R(t) Rf erreicht, ändert sich in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit des LAL-Reagens, der Form der Küvetten und dergleichen.
Fig. 5 ist die graphische Darstellung eines Vergleichs zwischen den Ergebnissen der Erfindung, wo die Gelierung bei einem Wert von Rth = 95% beurteilt wurde, und den Ergebnissen des bekannten Gelgerinnungsverfahrens, wobei dieselbe Probenlösung verwendet wurde. Das Reagens und die Meßmethode bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind dieselben wie in Fig. 4. Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, zeigen die untersuchten Ergebnisse nach den beiden Verfahren gute Übereinstimmung. Bei dem bekannten Gelgerinnungsverfahren wird bezüglich des Gelierzustandes der Probenlösung nach 60 Minuten nur beurteilt, ob dieser mit positiv (+) oder negativ (-) zu bewerten ist. Die vorliegende Erfindung kann daher innerhalb einer bestimmten Meßzeit Tm durch die Beurteilung des Gelierens zwei Bewertungen in Form von "automatische Beurteilung positiv" (AB +) oder "automatische Beurteilung negativ" (AB -) abgeben. Nach dem bekannten Verfahren jedoch kann die Beurteilung positiv (+) nur: für Probenlösungen gegeben werden, bei denen R(t) Rf erreicht, während bei der vorliegenden Erfindung die Beurteilung positiv in einem früheren Stadium, bevor R(t) Rf erreicht, gegeben werden kann. Nachdem Tm bei der vorliegenden Erfindung 25 Minuten beträgt, ist es beispielsweise möglich, dieselbe Beurteilung in etwa der halben Meßzeit oder weniger im Vergleich zu dem bekannten Verfahren zu erreichen. Ferner ist zum Zeitpunkt der Beurteilung kein besonderes Geschick erforderlich, und es lassen sich objektive Ergebnisse ohne persönliche Unterschiede erreichen. Wenn Tm länger ist, kann außerdem die Gelierung bei einer niedrigeren Konzentration von Endotoxin festgestellt werden, was bei dem bekannten Verfahren nicht möglich ist.
Das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführte Verfahren ist besonders wirksam, wenn eine Vielzahl von Probenlösungen mit Hilfe einer Vielzahl von parallel eingesetzten optischen Systemen gemessen wird. Wenn eine Vielzahl von Proben mit einer Vielzahl von optischen Systemen gemessen wird, wie in Fig. 1 dargestellt, ist es bei den bekannten Verfahren unmöglich, parallel zu messen, da gemessene I(t)-Werte in jedem optischen System und in jeder Probe ganz anders sind, vorausgesetzt aber, daß die in den einzelnen optischen Systemen erzielten Werte äquivalent sind. Im Gegenteil, bei der Vorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können Werte I(t) in einem einzelnen optischen System in einem bestimmten Zeitraum gemessen und durch die einzelnen Anfangswerte I&sub0; geteilt werden, wodurch der Empfindlichkeitsunterschied bei jedem optischen System und der Empfindlichkeitsunterschied aufgrund von Unterschieden zwischen den Proben aufgehoben werden. Das Verhältnis R(t) ist ein Verhältnis der durchgelassenen Lichtmengen, das erhalten wurde durch Korrektur der Eigenschaften von einzelnen optischen Systemen durch den Anfangswert I&sub0; (das heißt, eine korrekte zu Beginn durchgelassene Lichtmenge, die erhalten wurde durch Abziehen von Schwankungen und Störungen in der Probenlösung unmittelbar nach dem Mischen), der in Stufe (a) vor dem in Fig. 2 dargestellten Beginn des Gelierens auftrat. Das Verhältnis R(t) ist daher in jedem optischen System eine austauschbare Größe. Der Gelierpunkt kann bestimmt werden durch Festlegen eines entsprechenden Schwellenwertes Rth, vorzugsweise im Bereich von 75 bis 97% von R(t). Die Gelierzeit TG wird von dem Gelierpunkt abgeleitet, der ebenfalls durch den gewissen Wert Rth festgelegt wird, der nicht von dem optischen System abhängt. Somit kann man also die Endotoxinkonzentrationen in einer Vielzahl von optischen Systemen parallel messen unter Verwendung des TG-Wertes, der unabhängig ist von den Eigenschaften der einzelnen optischen Systeme. Ferner kann man durch parallele Messungen in den einzelnen optischen Systemen jede Probenlösung vom Beginn der Reaktion bis zum Ende der Messung still halten. Außerdem schwindet die Gefahr, daß Gele reißen, weil Probenlösungen zum Messen weiterbewegt werden müssen, wie dies bei den bekannten Verfahren der Fall ist.
Die vorliegende Erfindung, bei der eine Vielzahl von optischen Systemen, die Änderungen der durchgelassenen Lichtmengen messen, gleich behandelt werden und für die parallele Messung von Endotoxinkonzentrationen verwendet werden, ist in keiner der Vorveröffentlichungen offenbart.
Wenn Rth im Bereich von 75 bis 97% von R(t) angesetzt wird, wird es möglich, die Endotoxinkonzentration mit hoher Genauigkeit in einem wesentlich weiteren Bereich als bei den bekannten Verfahren zu bestimmen.
Wenn Rth unter 75% liegt, beispielsweise Rth = 70%, wird es sehr schwer, die Gelierung festzustellen, und man erhält keine Eichkurve, oder falls sie erhalten wird, ist der Bereich der Eichkurve sehr schmal und liegt bei 0,1 bis 10 ng/ml. Andererseits, wenn Rth höher als 97% angesetzt ist, wird die Bewegung (Konvektion) in einer Probenlösung unmittelbar nach dem Mischen des LAL-Reagens mit der flüssigen Probe, oder die Schwankung von R(t) aufgrund der Bewegung der Bläschen möglicherweise irrtümlich als Gelierung interpretiert. Um daher eine irrtümliche Bewertung infolge solcher Störungen zu verhindern, muß für Störungen eine Toleranz von 3% eingeräumt werden.
Das heißt also, Rth wird im Bereich von 75 bis 97% angesetzt, vorzugsweise im Bereich von 80 bis 95%.
Die Nachweisempfindlichkeit und der Meßbereich sind je nach der Empfindlichkeit des verwendeten LAL-Reagens unterschiedlich. Aber in jedem Fall ist die Empfindlichkeit bei der vorliegenden Erfindung weit höher als die bei dem Gelgerinnungsverfahren, das eines der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist, und der Meßbereich bei der vorliegenden Erfindung ist weit größer als der bei dem kolorimetrischen Verfahren, wo ein synthetisches Substrat verwendet wird.
Wie in Fig. 6 gezeigt, umfaßt die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Vorrichtung im wesentlichen ein oder mehrere optische Systeme, jeweils bestehend aus einer Lichtquelle 5, einem die Probenlösung enthaltenden Gefäß 1 und einer Einrichtung 6, die die durchgelassenen Lichtmengen erfaßt bzw. mißt; einem Bad 21 mit konstanter Temperatur, welches die optischen Systeme auf einer konstanten Temperatur hält und das Gefäß 1 ruhig hält; einer Einrichtung 22, die die Empfindlichkeit der optischen Systeme korrigiert und den Gelierpunkt bestimmt; einer Einrichtung 8, die den Beginn der Messung der übertragenen bzw. durchgelassenen Lichtmengen veranlaßt und an die Einrichtung 22 zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist; und einer Zeitmeßvorrichtung 22, die die vom Beginn der Messung der übertragenen bzw. durchgelassenen Lichtmengen an vergangene Zeit für jedes optische System parallel und unabhängig von den anderen mißt und an die Einrichtung 22 zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist.
Die Einrichtung 22 hat folgende Funktionen: (a) Starten der Zeitmeßvorrichtung 23 durch den Beginn der Messung, der von der Einrichtung 8 zum Starten der Messung veranlaßt wurde; (b) Beginn der Messung der durchgelassenen Lichtmengen; (c) Messen der innerhalb eines bestimmten Zeitraums durchgelassenen Lichtmengen; (d) Durchführung der Korrektur der Empfindlichkeit von jedem optischen System, z. B. Ermitteln des Verhältnisses R(t) = I(t)/I&sub0;, oder Korrektur der Empfindlichkeit mit Hilfe von Extinktionswerten, die durch Messen der bei einer Bezugsprobe und bei einer Probe durchgelassenen Lichtmengen und Bestimmen ihres Verhältnisses ermittelt werden; (e) Bestimmen eines Gelierpunktes; (f) Stoppen der Zeitmeßvorrichtung 23 zu dem Zeitpunkt, wo die Gelierung festgestellt wird, etc . . Diese Funktionen können mit einer Vorrichtung wie beispielsweise einem Computer, oder mit zwei oder mehr Vorrichtungen getrennt oder in Kombination durchgeführt werden.
Ein konkretes Beispiel für eine solche Vorrichtung ist in Fig. 7 dargestellt. In Fig. 7 sind eine Vielzahl von Küvettenhaltern 7 zum Halten der Küvetten 1 für die Messung in einer Vorrichtung angeordnet. Jedes einzelne optische System zum Messen der durchgelassenen Lichtmengen ist in einem Halter 7 angeordnet. Es ist auch möglich, mit Hilfe einer optischen Faser von einer Lichtquelle auf jeden Halter ein Licht zu richten. Ferner werden alle Halter mit Hilfe eines Wasserbades von konstanter Temperatur (in Fig. 7 nicht dargestellt) oder mit Hilfe einer trockenen Temperaturregelvorrichtung auf einer konstanten Temperatur gehalten, beispielsweise auf 37ºC. Nachdem jede Küvette mit der darin befindlichen Probe in einem Halter befestigt wurde, kann die Probe bis zum Ende der Messung in einem ruhigen Zustand gehalten werden, und die Messung kann durchgeführt werden, ohne daß eine Bewegung verursacht wird, die den Gelzustand zerstört. Nachdem eine Küvette mit einer Mischung aus einer flüssigen Probe und dem LAL-Reagens zur Messung in einem Küvettenhalter 7 befestigt wurde, wird ein Schalter 8, der den Beginn der Messung auslöst, sofort gedrückt, um mit der Messung der Probe zu beginnen.
Dann wird der Schalter 8 jedesmal gedrückt, wenn eine Küvette zwecks Messung in einem Halter 7 auf ähnliche Weise befestigt wird, um die parallele Messung einer Vielzahl von Proben mit wahlweiser Zeitsteuerung in der in der Vorrichtung vorgesehenen Anzahl von Küvettenhaltern durchzuführen. Fig. 7 zeigt, daß es möglich ist, 16 Küvetten in den Haltern der Vorrichtung zu befestigen. Die Anzahl von Küvetten, die gleichzeitig gemessen werden können, ist jedoch nicht auf diese Zahl 16 begrenzt und kann gewünschtenfalls solange erhöht oder vermindert werden, wie eine Steuerung von der Kapazität her möglich ist. Es ist auch möglich, den Schalter 8 so anzuschließen, daß er jedem Küvettenhalter 7 den Beginn der Messung mitteilt. Es ist ferner möglich, den Schalter jedesmal dann zu betätigen, wenn eine Küvette befestigt wird.
Es ist möglich, eine Reihe von Meßanzeige-LEDs (Leuchtdioden) 9 zu installieren, die den Zustand der entsprechenden optischen Systeme anzeigen. Anhand solcher Anzeigen kann man sehen, welches optische System gemessen werden soll, wenn der Schalter 8 gedrückt wurde, oder welches optische System gerade gemessen wird. Wenn eine Reihe von Leuchtdioden 10 zur Anzeige der ermittelten Gelierung in der Vorrichtung installiert sind, kann ferner für jede Probe die Beurteilung positiv/negativ angezeigt werden. Somit können dieselben Ergebnisse, wie sie im Stand der Technik durch Begutachtung mit dem bloßen Auge erhalten wurden, innerhalb kurzer Zeit objektiv und mit hoher Genauigkeit angezeigt werden. Wenn die Gelierzeit TG auf der Basis der Beurteilung der Gelierung durch jedes optische System mit einer Reihe von Leuchtdioden 11 zur Anzeige der Gelierzeit angezeigt wird, ist es ferner möglich, neben der Beurteilung positiv/negativ die Endotoxinkonzentration aufgrund der Beziehung zwischen der Endotoxinkonzentration und TG rasch und mit guter Reproduzierbarkeit zu bestimmen, wie in Fig. 9 dargestellt.
Ein Anzeigesteuerungsschalter 12 kann verwendet werden, um die Anzeige von jedem TG-Wert jeder Probe immer wieder umzustellen, wenn eine Vielzahl von Proben gemessen wird. Es ist auch möglich, alle Werte anzuzeigen, wenn ein anderes Anzeigeverfahren verwendet wird, beispielsweise mittels Kathodenstrahlröhre.
Fig. 8 ist ein Blockschaltbild eines elektrischen Systems von einem Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung. In Fig. 8 ist das System zur Steuerung der konstanten Temperatur um die Küvetten bei der Messung der Einfachheit halber weggelassen, und es ist nur das optische System zur Steuerung der Messung dargestellt. Die mit einer Vielzahl von photoelektrischen Detektoren 6 ermittelten durchgelassenen Lichtmengen werden nacheinander durch einen Multiplexer 13 ausgewählt, durch eine Verhältnisberechnungsschaltung 14 in R(t) umgewandelt und in einen A/D-Wandler 15 eingelesen. Das durch den A/D-Wandler in eine digitale Größe umgewandelte Signal wird in einem Rechner 16 verarbeitet, der die Gelierung auswertet und den TG-Wert bestimmt. Die Gelierbewertungsanzeige 10 und die Gelierzeitanzeige-LED 11 werden ebenfalls über den Rechner gesteuert. Es ist auch möglich, die Meßergebnisse auf einem Drucker 17 auszudrucken. Falls erforderlich, ist es immer noch möglich, den Rechner 16 je nach Verwendungszweck an einen oder mehrere externe Rechner anzuschließen.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, speziell geformte Küvetten für die Messungen zu verwenden, und es können normale Küvetten verwendet werden, wie sie bei einem bekannten manuellen Verfahren zum Einsatz kommen.
Wie oben erwähnt, wird mit der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zum Messen von Endotoxin in einer Vielzahl von Proben parallel und wirksam mit hoher Zuverlässigkeit bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Unter Verwendung einer Vorrichtung, die im Prinzip der in Fig. 7 und 8 dargestellen ähnlich ist, aber 64 Küvetten gleichzeitig messen kann, wurden 10 flüssige Proben, die Endotoxin in einer Konzentration von 0,02 ng/ml enthielten, in 10 optischen Systemen gleichzeitig gemessen, um die Gelierzeit TG zu bestimmen.
Für die Messung wurden die folgenden Reagenzien und Bedingungen verwendet:

LAL-Reagens:

hergestellt von Associates of Cape Cod. Die Empfindlichkeit wurde anhand der FDA-Referenz ermittelt.

Endotoxin:

gereinigt aus Escherichia coli UKT-B (Forschungsinstitut für mikrobielle Erkrankungen, Universität Osaka). Der Gehalt wurde anhand der FDA-Referenz ermittelt.

Meßbedingungen:

Das LAL-Reagens und das Endotoxin wurden jeweils in destilliertem Injektionswasser (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) gelöst und in jedem Reagenzglas mit einem Durchmesser von 10 mm in Mengen von jeweils 0,1 ml unter Rühren vermischt; die Änderungen der durchgelassenen Lichtmengen wurden dann gemessen, wobei die Probenlösungen auf 37ºC gehalten wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Optisches System Nr. Anfangswert Gelierzeit
Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind die Anfangswerte (I0 max), die die durchgelassenen Lichtmengen sind, an sich schon in den jeweiligen optischen Systemen unterschiedlich, aber das Verhältnis R(t) = I(t)/I0 max (t = 60) zeigt fast dieselben Werte unabhängig von den optischen Systemen. In Tabelle 1 wird der Zeitraum von 60 Minuten vom Beginn der Reaktion in dem Verhältnis R(t) mit "t" bezeichnet. Rth = 92% wird angesetzt, um die Gelierzeit TG zu erhalten.
Wie aus den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen deutlich wird, wird die Gelierung der Proben objektiv beurteilt wie bei dem Trübungsmeßverfahren aus dem Stand der Technik, und außerdem kann eine Vielzahl von Proben bei wirksamem Einsatz der entsprechenden Anzahl optischer Systeme mit gleichbleibend hoher Genauigkeit parallel bewertet werden.
Unter Verwendung von 30 anderen optischen Systemen wurden als nächstes jeweils 10 Proben, die 0,1 ng/ml, 1,0 ng/ml oder 10 ng/ml Endotoxin enthielten (insgesamt 30), gleichzeitig in der oben beschriebenen Art und Weise gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, werden bestimmte Eigenschaften einzelner optischer Systeme gestrichen, um stabile Werte zu erhalten. Tabelle 2 Endotoxingehalt Probe Nr. Gelierzeit
Fig. 9 zeigt eine Eichkurve, die aus der von den Ergebnissen von Tabelle 1 und 2 hergeleiteten Beziehung zwischen dem Endotoxingehalt und der Gelierzeit TG erstellt wurde.
Wie oben erwähnt, kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der Endotoxingehalt in einer Vielzahl von Proben mit Hilfe einer Vielzahl von optischen Systemen ohne persönlichen Unterschied und mit guter Reproduzierbarkeit gemessen werden. Aufgrund der parallelen Messung der Proben wird ferner eine stabile Messung mit hohem Wirkungsgrad und hoher Zuverlässigkeit möglich. Da eine Vorrichtung verwendet wird, die im Prinzip dieselbe ist wie die in Fig. 7 und 8, jedoch gleichzeitig 64 Küvetten messen kann, konnten die Werte von insgesamt 40 Proben innerhalb von 60 Minuten gemessen werden, wie aus Tabelle 1 und 2 hervorgeht.

Beispiel 2

Die Endotoxinkonzentrationen wurden unter den folgenden Bedingungen gemessen:

LAL-Reagens:

hergestellt von Associates of Cape Cod. Die Empfindlichkeit nach dem Gelgerinnungsverfahren unter Verwendung der FDA-Referenz betrug 0,05 ng/ml.

Endotoxin:

Meßmethode:

Das LAL-Reagens und das Endotoxin wurden jeweils in destilliertem Injektionswasser (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) gelöst und in jedem Reagenzglas mit einem Durchmesser von 10 mm in Mengen von jeweils 0,1 ml unter Rühren vermischt, und die Änderungen der durchgelassenen Lichtmengen wurden gemessen, wobei die Probenlösungen auf 37ºC gehalten wurden.
Fig. 10 zeigt eine Eichbeziehung zwischen den Gelierzeiten und den Endotoxinkonzentrationen, wenn Rth mit 95% angesetzt war. Wie aus Fig. 10 deutlich wird, erhält man bei diesem Beispiel eine gute Eichbeziehung in einem sehr weiten Bereich von 0,0005 ng/ml bis 100 ng/ml. Die Empfindlichkeit in diesem Beispiel ist 100 mal so hoch wie diejenige, die bei dem bekannten Gelgerinnungsverfahren unter Verwendung derselben Reagenzien erhalten wurde. Ferner ist der Meßbereich bei diesem Beispiel ein Dynamikbereich, der mindestens 1000 mal so breit ist wie der des kolorimetrischen Verfahrens, bei dem das synthetische Substrat verwendet wird.
Wenn Rth in diesem Beispiel mit 70% angesetzt wurde, wurde keine Gelierung festgestellt, und man erhielt keine Eichkurve.

Beispiel 3

Sechs Probenlösungen mit unterschiedlichem Endotoxingehalt wurden zur Messung der Gelierzeit verwendet, wobei dieselben Meßbedingungen wie in Beispiel 2 innerhalb des Bereichs der in Beispiel 2 erhaltenen Eichkurve verwendet wurden. Die Messung wurde 16 mal an einer Art von Probenlösung wiederholt.
Die Reproduzierbarkeit der Gelierzeit TG und der mit Hilfe der Eichkurve von Fig. 10 erhaltenen Werte für die Endotoxinkonzentration ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Probe Nr. Gelierzeit Konzentration
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, ist der CV-Wert von TG so gut, daß er unter 4,5% liegt, und der CV-Wert der Konzentration ist so gut, daß er unter 15% liegt. Eine solche Bestimmung der Endotoxinkonzentration mit hoher Genauigkeit in einem sehr weiten Bereich war bei allen bekannten Verfahren unmöglich und wird nun mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich. Ferner ist der Meßvorgang der vorliegenden Erfindung so einfach wie das Gelgerinnungsverfahren.

Beispiel 4

Die Endotoxinkonzentrationen wurden unter den folgenden Bedingungen gemessen:

LAL-Reagens:

hergestellt von Associates of Cape Cod. Die Empfindlichkeit bei dem Gelgerinnungsverfahren unter Verwendung der FDA-Referenz betrug 0,01 ng/ml.

Endotoxin:

wie in Beispiel 2.

Meßmethode:

wie in Beispiel 2.
Fig. 11 zeigt eine Eichbeziehung zwischen den Gelierzeiten und den Endotoxinkonzentrationen, wenn Rth mit 95% angesetzt war. Wie aus Fig. 11 deutlich wird, kann man die Eichbeziehung bei den Endotoxinkonzentrationen von 0,0001 bis 100 ng/ml erhalten. Die Empfindlichkeit ist bei diesem Beispiel 100 mal so hoch wie diejenige, die bei Verwendung derselben Reagenzien mit dem Gelgerinnungsverfahren erhalten wurde. Ferner ist der Meßbereich bei diesem Verfahren ein Dynamikbereich, der etwa 10.000 mal so breit ist wie der des kolorimetrischen Verfahrens, bei dem das synthetische Substrat verwendet wird.
Wenn Rth in diesem Beispiel mit 70% angesetzt war, wurde keine Gelierung festgestellt und man erhielt keine Eichkurve.

Beispiel 5

Die Endotoxinkonzentrationen wurden unter den folgenden Bedingungen gemessen:

LAL-Reagens:

hergestellt von Associates of Cape Cod. Die Empfindlichkeit bei dem Gelgerinnungsverfahren unter Verwendung der FDA-Referenz betrug 0,1 ng/ml.

Endotoxin:

wie in Beispiel 2.

Meßmethode:

Das Endotoxin wurde in destilliertem Injektionswasser (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) gelöst, um eine flüssige Probe zu erhalten. Das gefriergetrocknete LAL-Reagens und 0,2 ml der flüssigen Probe wurden in ein Reagenzglas mit einem Durchmesser von 12 mm gegeben und gerührt, um das LAL-Reagens zu lösen. Die Änderungen der durchgelassenen Lichtmengen wurden gemessen, wobei die Probenlösung auf 37ºC gehalten wurde.
Fig. 12 zeigt eine Eichbeziehung zwischen der Gelierzeit und den Endotoxinkonzentrationen, wenn Rth mit 85% angesetzt war. Wie aus Fig. 12 deutlich wird, kann die Eichbeziehung bei den Endotoxinkonzentrationen von 0,02 bis 100 ng/ml erhalten werden. Die Empfindlichkeit bei diesem Beispiel ist 5 mal so hoch wie diejenige, die bei dem Gelgerinnungsverfahren unter Verwendung derselben Reagenzien erhalten wurde. Ferner ist der Meßbereich bei diesem Beispiel ein Dynamikbereich, der 50 mal so breit ist wie der bei dem kolorimetrischen Verfahren, wo das synthetische Substrat verwendet wird.
Wenn Rth in diesem Beispiel mit 70% angesetzt war, war der Konzentrationsbereich mit dieser Eichbeziehung auf die Endotoxinkonzentration von 0,1 bis 10 ng/ml begrenzt.

Claims

1. Vorrichtung zum Messen von Endotoxin, die ein oder mehrere optische Systeme umfaßt, die jeweils folgendes umfassen:

eine Lichtquelle, ein die Probenlösung enthaltendes Gefäß und eine Einrichtung zum Erfassen der übertragenen Lichtmengen,

ein Bad mit konstanter Temperatur, welches die optischen Systeme auf einer konstanten Temperatur hält und das Gefäß ruhig hält,

eine Einrichtung, die die Empfindlichkeit der optischen Systeme korrigiert und eine Gelierungstemperatur ermittelt,

eine Einrichtung, die den Beginn der Messung der übertragenen Lichtmengen veranlaßt und an die Einrichtung zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist, und

eine Zeitmeßvorrichtung, die die vom Beginn der Messung der übertragenen Lichtmengen an vergangene Zeit für jedes optische System parallel und unabhängig von den anderen mißt und an die Einrichtung zum Korrigieren und Ermitteln angeschlossen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das die Lösung enthaltende Gefäß eine Küvette mit einem Innendurchmesser von 6 bis 12 mm ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung, die den Beginn der Messung veranlaßt, ein Schalter ist, der den Befehl an zwei oder mehr die Lösung enthaltende Gefäße unabhängig voneinander geben kann.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Korrigieren der Empfindlichkeit der optischen Systeme und zum Ermitteln einer Gelierungstemperatur eine oder mehrere Vorrichtungen umfaßt, die folgende Funktionen besitzen:

(a) Starten der Zeitmeßvorrichtung durch Veranlassen der Messung auf Befehl der Einrichtung, die das Veranlassen der Messung befiehlt,

(b) Beginn der Messung der übertragenen Lichtmengen,

(c) Messen der in dem Zeitraum übertragenen Lichtmengen,

(d) Vornahme der Korrektur der Empfindlichkeit jedes optischen Systems,

(e) Ermitteln einer Gelierungstemperatur, und

(f) Anhalten der Zeitmeßvorrichtung zu dem Zeitpunkt, wo die Gelierungstemperatur ermittelt wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Korrektur der Empfindlichkeit jedes optischen Systems mit einer Einrichtung durchgeführt wird, die ein Verhältnis einer zu einer Zeit t (I(t)) übertragenen Lichtmenge zu einer zu einem Anfangsstadium (I&sub0;) übertragenen Lichtmenge, d. h. I(t)/I&sub0; ermittelt.