DE2415257C2

DE2415257C2 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Urin

Info

Publication number: DE2415257C2
Application number: DE19742415257
Authority: DE
Inventors: Hugo Dr.rer.nat. 6800 Mannheim; Sojka Bernward Dr.rer.nat. 6806 Viernheim; Lange Hans 6840 Lampertheim; Rey Hans-Georg Dr.rer.nat.; Rieckmann Peter Dr.rer.nat.; 6800 Mannheim Tiedemann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Filing date: 1974-03-29
Publication date: 1976-03-11

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose im Urin, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit Glucoseoxidase, Peroxidase, einem Indikator und einem Puffer imprägniert ist.

Der Nachweis von Glucose im Harn ist von großer Bedeutung für Diagnose und Verlaufskontrolle des Diabetes. Auf Grund dieser Tatsache ist eine große Anzahl von sogenannten Schnelltesten in der Patentliteratur beschrieben, von denen einige im Handel sind. Sie basieren fast ausschließlich auf folgendem Prinzip: Glucose wird mittels Glucoseoxidase durch Sauerstoff zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid oxydiert, dieses oxydiert mittels Peroxidase einen Indikator zu einer f art igen Verbindung. Obwohl eine Reihe solcher Indikatoren beschrieben ist, wird bisher vorwiegend o-To)idin verwendet.

Im allgemeinen wird für einen solchen Glucose-Test ein pH-Bereich von 4 bis 7 beschrieben, der mit den üblichen Puffern wie Phosphat-, Citrat- und ähnlichen Puffern eingestellt wird. Bevorzugt ist jedoch fast ausschließlich pH 5, da bei diesem pH-Wert Empfindlichkeit und Abstufung offensichtlich optimal sind (vergleiche z. B. US-Patentschriften 30 50 373 und 28 48 308 sowie DT-PS 15 98 809). Testpapiere mit diesem pH-Wert haben jedoch den schwerwiegenden Nachteil, daß die Reaktionsfarbe bei der sogenannten »diabetischen Ketoacidose« abgeschwächt ist ia sogar völlig unterdrückt sein kann. Bei der Ketoacidose treten im Harn größere Mengen Acetessigsäure und Hydroxybuttersäure auf, was die Reaktion der Testpapiere mit einem Puffer von pH 5 stört Die Ketoacidose tritt hauptsachlich bei Diabetes

ίο auf "aber auch bei anderen Erkrankungen und bei Hungerzuständen. Die »diabetische Ketoacidose« unterscheidet sich von den anderen nur durch das gleichzeitige Auftreten von Glucose im Harn. Ein Schnelltest auf Glucose, der bei Ketoacidose gestört

is wird ist also weder zur Differential-Diagnose der Keto'acidose noch zur Diagnose und zur Verlaufskontrolle des Diabetes optimal geeignet.

Unser» Versuche haben gezeigt, daß man durch Heraufsetzung des pH-Wertes der Glucose-Test-

papiere auf 5,8 bis 6,2, vorzugsweise 6,0 die Störung bei Ketoacidose herabmindern kann. Bei der Verwendung herkömmlicher Puffer zeigt sich jedoch, daß sich die Abstufung der Farbreaktion stark verschlechtert ohne daß die Störung in allen Fällen vermieden wird. Außerdem läßt die Haltbarkeit der Testpapiere in vielen Fällen zu wünschen übrig.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man Glucose-Testpapiere erhält, die empfindlich, schnell und mit guter Abstufung reagieren und die bei Ketoacidose nicht gestört werden, wenn man bei einem diagnostischen Mittel der eingangs genannten Art als Puffer 2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure (MES) verwendet. Auch sind diese Papiere bei langer dauernden Temperaturbelastungen völlig stabil, was

bei der Verwendung in den Tropen von besonderer Bedeutung ist.

2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure ist zwar ein bekannter Puffer; er wurde von Good, Biochemistry 5 (1966), S. 467, für Arbeiten mit biologischen

Systemen eingeführt, jedoch ausschließlich in flüssiger Phase und nicht in festen Reagenzienzubereitungen wie Testpapieren. Für den Fachmann waren die überraschenden Wirkungen dieses speziellen Puffers bei der Verwendung in Glucose-Testpapieren nicht ohne weiteres vorhersehbar, zumal andere in biologischen Systemen verwendete Puffer, wie z. B. das sogenannte Tris, keine dem MES entsprechenden Wirkungen zeigen (vgl. die folgende Tabelle).

Puffer (pH 6,0) Störung durch 250 mg % Rcaktionsabfall Reaktionsfarbe mit 100 bis 1000 mg % Acetessigsäure und nach 30 Tagen bei 6O⁰C Glucose im Harn 2000 mg % ^-Hydroxy

buttersäure im Harn

MES, 0,5 m
(vgl. Beispiel 1)

Phosphat, 0,25 m
Citrat, 0,25 m
Citrat, 0,5 m
Tris-Citrat, 0,5 m
Imidazo!, 0,25 m
3-Aminopyridin, 0,5 m
Malonat, 0,5 m
Maleat, 0,125 m
Pyrophosphat, 0,25 m

Vergleich mit pH 5:
Citrat, 0,25molar

hellgrün bis blauschwarz

hellgrün bis graugrün
hellgrün bis graugrün hellgrün bis dunkelgrün hellgrün bis grün
hellgrün bis graugrün
grüngelb bis hellgrün
graugrün bis dunkelgrün hellgrün bis graugrün
hellgrün bis dunkelgrün

dunkelgrün bis blauschwarz keine Störung

mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
geringe Störung
starke Störung
geringe Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung

starke Störung

praktisch kein Abfall

sehr starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
sehr starker Abfall
keine Reaktion mehr
starker Abfall
mäßiger Abfall
sehr starker Abfall

geringer Abfall

3 4

Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, liefert nur MES Glucoseoxidase 222 mg

ais Puffersubstanz in jeder Hinsicht optimale Test- Peroxidase 28 mg

papiere. Mit den übrigen gebräuchlichen und auch MES-Puffer

ungewöhnlichen Puffersubstanzen erhält man Test- (pH 6,0; 1,0 M wäßrige Lösung) ... 50 ml

papiere, die eine zum Teil beträchtliche Störung durch 5 Tartrazin 80 mg

Acetessigsäure und Hydroxybuttersäure (d. h. bei o-Tolidin 420 mg

Ketoacidose) aufweisen und außerdem weniger emp- Äthanol 33 ml

findlich und/oder weniger haltbar sind. Wasser, destilliert ad 100 ml

Der erfindungsgemäß verwendete MES-Puffer wird

in Konzentrationen von 25 bis 75 mMol, Vorzugs- io Das Testpapier reagiert mit Urinen, die von 50 bis

weise 5OmMoI, pro 100 ml Imprägnierlösung ein- 1000 mg % Glucose enthalten, mit hellgrünen bis

gesetzt. Man erhält den gewünschten pH-Bereich von blauschwiirzen Farbtönen in guter Farbabstufung.

5,8 bis 6,2, vorzugsweise 6,0, wenn man die wäßrige Urine, die zusätzlich 25ümg% Acetoacetat und etwa

Aufschlämmung von 2-(N-Morpholino)-äthansulfon- 2000 mg % /?-Hydrcxybuttersäure enthalten, zeigen

säure mit der nötigen Menge konzentrierter Natron- »5 praktisch die gleichen Farbreaktionen. Keine Ände-

lauge versetzt. Im gewünschten pH-Bereich resultiert rung wird außerdem beobachtet, nachdem das Test-

dabei eine homogene Lösung. Neben Glucoseoxidase, papier 15 Tage bei 6O⁰C oder 4 Monate bei 40⁰C

Peroxidase und einem Indikator (vorzugsweise o-Toli- gelagert wurde, din), die in den üblichen Konzentrationen eingesetzt

werden, können auch noch Hilfsstoffe wie Lösungs- ao B e i s ρ i e 1 2 Vermittler (z. B. Polyvinylpyrrolidon oder Polyäthylen-

glykol) und Netzmittel (z. B. Natriumlauroylsarkosinat Filterpapier (Whatman Nr. 6) wird mit einer

oder Natriumlaurylsulfat) bei der Herstellung der Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und

Testpapiere Verwendung finden. Desgleichen ist ein bei 5O⁰C getrocknet: Zusatz von gelben Farbstoffen (z. B. Tartrazin oder 35

Naphtholgelb S) zweckmäßig, da sie den Farbum- Glucoseoxidase 222 mg

schlag deutlicher sichtbar machen. Peroxidase 28 mg

Als saugfähige Träger kommen vor allem Filter- MES-Puffer

papiere in Frage, aber auch Vliese und Filze aus (pH 5,8; 1,0 m wäßrige Lösung) ... 65 ml

Cellulose oder Kunststoffen können verwendet werden. 30 Tartrazin 80 mg

Zur Herstellung der neuen diagnostischen Mittel Polyvinylpyrrolidon 300 mg

wird in bekannter Weise ein saugfähiger Träger, vor- o-Tolidin 420 mg

zugsweise Filterpapier, mit einer Lösung getränkt, Äthanol 30 ml

welche die oben angegebenen Bestandteile enthält, Wasser, destilliert ad 100 ml

und anschließend getrocknet. 35

Als Lösungsmittel für die Imprägnierlösung kommen Das Testpapier hat praktisch die gleichen Eigen-

vor allem Gemische aus Wasser und leichtflüchtigen schäften wie das Testpapier gemäß Beispiel 1. organischen Lösungsmitteln, z. B. niederen Alkoholen,

in Frage. Beispiel 3

Die auf diese Weise erhaltenen Teststreifen können 40

als solche verwendet werden, nachdem sie in Streifen Filterpapier (Schleicher und Schüll 595) wird mit

geschnitten sind. Gewünschlenfalls kann man die einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt

Papierstreifen aber auch zwischen Kunststoff-Folien und bei 50°C getrocknet:

einsiegeln (vgl. DT-PS 15 46 307) oder auf derartige Glucoseoxidase 222 mg

Folien aufsiegeln bzw. aufkleben; vorzugsweise wer- 45 Peroxidase 28 mg

den sie zwischen einer Kunststoff-Folie und einem j^gg Puffer

feinmaschigen Netzwerk gemäß DT-PS 2118455 (pH 6,2; 1,0 m wäßrige Lösung) ... 25 ml

eingesiegelt. Natriumlauroylsarkosinat 100 mg

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung Naphtholgelb S 100 mg

näher erläutert. 50 o-Tolidin 420 mg

Beispiel 1 Äthanol ■· · 33 ml

„._u . ,„.... . _o . .... ,„„ _XTr,_x . . Wasser, destilliert ad 100 ml

Filterpapier (Schleicher und Schüll 597 NF) wird

mit einer Lösung folgender Zusammensetzung ge- Auch dieses Testpapier besitzt praktisch die gleichen

tränkt und bei 50⁰C getrocknet: 55 Eigenschaften wie das Testpapier gemäß Beispiel

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Urin, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit Glucoseoxidase, Peroxidase, einem Indikator und einem Puffer imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer 2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure verwendet.

2. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Puffers zwischen 5,8 und 6,2 liegt.

3. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Puffers 6,0 beträgt.