DE2809257C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Eine derartige Methode ist bekannt. Sie beruht auf der Verwendung eines Farbstoffes, der nach seinem Zu­ satz zu einer Blutprobe von dem Zellenanteil nicht aufge­ nommen wird, sondern den Plasmaanteil färbt. Je größer die Farbdichte des Plasmaanteils in der Probe nach dem Zentri­ fugieren ist, um so größer ist der Volumenanteil der Zellen in der Probe, wie von Eric Ponder, Hemolysis and Related Phenomena, Grune & Stratton, New York 1948, Seiten 51-33 beschrieben. Die von Ponder beschriebene kolorimetrische Methode besteht aus der Zugabe eines bestimmten Volumens eines Farbstoffes von bekannter Konzentration zu einem be­ kannten Volumen einer Blutprobe von unbekanntem Zellvolu­ men. Bei der Methode wird der flüssige oder Plasmaanteil von den Zellen durch Zentrifugieren der Probe abgetrennt, und die Farbstoffkonzentration im Plasma wird kolorime­ trisch bestimmt. Wenn die Endkonzentration des Farbstoffs in dem Plasma sowie die Anfangskonzentration des Farb­ stoffes und die Volumina der Probe und des Farbstoffes feststehen, läßt sich das Volumen der Erythrocyten berech­ nen. Ein bedeutender Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung erzielt wird, besteht darin, daß die Zentrifu­ gierung der Probe vermieden werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer kolorimetrischen Methode zur Bestimmung des Volumens von Erythrocyten in einer Blutprobe unter Verwen­ dung eines Farbstoffes, bei der eine Zentrifugation vermieden wird und die sich auf die Flüssigkeits­ probenanalyse vom kontinuierlichen Durchflußtyp anwenden läßt.

Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren.

Das Agglutinierungsmittel besitzt vorzugsweise eine verhältnis­ mäßig hohe positive elektrische Ladung, und der Farbstoff ist vorzugsweise wasserlöslich, dringt nicht in die Zellen ein und bildet mit dem Agglutinierungsmittel oder mit lös­ lichen Bestandteilen der Probe keinen Niederschlag. Ferner löst er die Zellen nicht auf und ändert auch nicht ihr Vo­ lumen.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnung näher erläutert, worin die einzige Figur die schematische Darstellung einer zur Durchführung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung ist.

Gemäß der Zeichnung ist eine Pumpe 10 vorgesehen, die eine peristaltische Pumpe sein kann und zusammendrück­ bare Pumpenrohre 12, 14 und 16 aufweist, die sich durch sie hindurch erstrecken. Mit dem Einlaß von Rohr 16 ist das Auslaßende einer Probensonde 18 verbunden, deren Einlaß­ ende in jedes einer Reihe von Probengefäßen eintauchen kann, die verschiedene frische Gesamtblutproben (live whole blood specimens) enthalten, die mit einem Antikoa­ gulans versetzt wurden. Ein derartiges Gefäß ist mit der Bezugszahl 20 bezeichnet. Die Probengefäße können der Reihe nach der Sonde 18 zugeführt werden, damit ihr Inhalt durch das Pumpenrohr 16 aufgenommen werden kann. Das Pumpenrohr 14 besitzt ein mit einem Flüssigkeitsvorrat 22 verbundenes Einlaßende, durch das ein Agglutinierungsmittel im Gemisch mit einem Farbstoff herangeführt wird, wie weiter unten im einzelnen beschrieben wird. Das Pumpenrohr 12 besitzt ein gegenüber der Atmosphäre ofenes Einlaßende, damit Luft durch das Rohr 12 hindurchgefördert werden kann. Das Aus­ laßende von Rohr 12 ist an das Rohr 14 unterhalb der Pum­ pe 10 angeschlossen, damit die Luft dem Strom aus Reagenz- und Farbstoffgemisch im Rohr 14 zugeführt und dieser Strom in Abschnitte unterteilt werden kann. Der Auslaß von Rohr 16 ist ebenfalls mit dem Rohr 14, wie dargestellt, verbunden, damit die Probe dem erwähnten, unterteilten Strom zugeführt werden kann. Der Strom aus den vereinigten Substanzen wird durch eine im Rohr 14 eingeschaltete Mischschlange 24 strö­ mengelassen, damit die Substanzen miteinander vermischt werden können. Durch das Mischen werden die Erythrocyten der Probe agglutiniert. Anschließend an die Agglutinierung wird der Storm aus der Schlange 24 durch eine Absetzschlan­ ge 26 in Rohr 14 geleitet, in der sich die agglutinierten Erythrocyten aus dem Gemisch absetzen. Stromabwärts von Schlange 26 ist ein Dekantierrohr 28 einer nicht dargestell­ ten herkömmlichen Dekantiereinrichtung vorgesehen, dessen Einlaßende mit dem Rohr 14 verbunden ist, wobei das Rohr 28 zusammendrückbar ist und sich durch die Pumpe 20 hindurch erstreckt, um sich in einen Abfallbehälter zu entleeren. Annähernd sämtliche agglutinierten Zellen im Rohr 14 werden durch das Rohr 28 aus dem Rohr 14 dekantiert.

Der Rest des Stromes in Rohr 14 strömt durch die eingeschaltete Mischschlange 30, in der noch verbliebene freie Erythrocyten erneut mit dem Agglutinierungsmittel vermischt werden. Der Strom gelangt aus der Mischschlange 30 im Rohr 14 in eine zweite Absetzschlange 32, die in dem Rohr 14 angeordnet ist, wo sich noch verbliebene aggluti­ nierte Zellen absetzen. Stromabwärts von Schlange 32 ist ein dem Rohr 28 ähnliches Dekantierrohr 34 angeordnet, dessen Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen ist, wobei das Rohr 34 ebenfalls zusammendrückbar ist und sich durch die Pumpe 20 hindurch erstreckt, um sich in ein Abfallge­ fäß zu entleeren. Das Rohr 34 dient dem Abtransport der zuvor agglutinierten Zellen aus dem Rohr 14. Der Rest des Stromes in Rohr 14 strömt durch eine weitere Mischschlange 36, in der immer noch verbliebene Erythrocyten in der Probe mit Agglutinierungsmittel vermischt werden, um sie zu agglu­ tinieren. Danach gelangt der Strom in Rohr 14 zu einer dritten Absetzschlange 31 für die Abtrennung agglutinierter Zellen aus dem Gemisch. Stromabwärts von Schlange 38 ist ein weiteres zusammendrückbares Dekantierrohr 40 angeord­ net, dessen Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen ist und das sich durch Pumpe 20 hindurch erstreckt und sich in ein Abfallgefäß entleert. Durch das Rohr 40 werden die jetzt noch verbliebenen agglutinierten Zellen aus dem Rohr 14 entfernt. Stromabwärts von der Verzweigungsstelle der Rohre 14 und 40 ist ein zusammendrückbares Pumpenrohr 42 mit seinem Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen, damit ein Teil des restlichen Stromes in Rohr 14 abgezogen werden kann, wobei sich das Rohr 42, wie dargestellt, eben­ falls durch Pumpe 20 hindurch erstreckt. Der Anteil des ver­ bliebenen Stromes, der nicht durch Rohr 42 abgeleitet wird, gelangt im Rohr 14 zu einem Abfallgefäß.

Zusammendrückbare Pumpenrohre 44 und 46 erstrecken sich ebenfalls durch die Pumpe 20 hindurch. Das Rohr 44 ist mit seinem Einlaßende an einen Vorrat 45 aus Verdün­ nungsmittel, wie beispielsweise Salzlösung, angeschlossen. Das Rohr 46 besitzt ein gegenüber der Atmosphäre offenes Einlaßende, während das Auslaßende stromabwärts von der Pumpe an das Rohr 44 angeschlossen ist, wodurch der Strom des Verdünnungsmittels mittels Luft in Abschnitte unter­ teilt wird. Stromabwärts der Einmündung des Rohrs 46 in das Rohr 44 ist das Auslaßende des obenerwähnten Rohres 42 an das Rohr 44 angeschlossen, wodurch der Strom aus Rohr 42 demjenigen in Rohr 44 zugeführt wird. Durch das Rohr 42 strömen im wesentlichen keine Erythrocyten, da diese Zel­ len agglutiniert und aus dem Rohr 14 abdekantiert worden sind. Der Strom im Rohr 42 enthält Plasma aus der Probe und den obenerwähnten Farbstoff. Die im Rohr 44 strömenden Sub­ stanzen werden in der Mischschlange 48 vermischt, und das Gemisch fließt danach durch eine im Rohr 44 eingeschaltete Kolorimetriedurchflußzelle 50. In Verbindung mit der Durchflußzelle sind in üblicher Weise eine Lichtquelle 52 und ein Fotodetektor 54 angeordnet. Der Detektor 54 be­ sitzt einen Ausgang über Leitung 56 zu einem herkömmlichen Aufzeichnungsgerät 58, das die in der Durchflußzelle 50 er­ mittelte Farbstoffkonzentration anzeigt. Da das Probenvolu­ men sowie die Volumina der anderen genannten Substanzen vorbestimmt und bekannt sind und auch die Farbstoffkonzen­ tration in dem Vorratsbehälter 22 bekannt ist, kann der prozentuale Volumenanteil der Erythrocyten in der Probe auf herkömmliche Weise berechnet werden. Das Ergebnis ist in dem Ausmaß fehlerhaft, als Leukocyten in der Probe vorhanden sind, jedoch ist dieser Fehler in Blutproben, die keinen anomal hohen Anteil an Leukocyten enthalten, unbedeutend.

Die Fließgeschwindigkeiten in den Pumpenrohren 12, 14, 16, 28, 34 und 40 können beispielsweise mit Strömungs­ geschwindigkeiten von 0,42, 0,80, 0,80, 0,60, 0,16 bzw. 0,16 ml/min durchströmt werden. Analog können die Pumpen­ rohre 42, 44 und 46 mit Strömungsgeschwindigkeiten von 0,16, 4,0 bzw. 0,32 ml/min durchströmt werden. Das oben­ erwähnte, dem Rohr 44 zugeführte Verdünnungsmittel dient dazu, das Volumen des Stroms aus dem Rohr 42 zu vergrößern, und das Rauschen bei der Messung der Farbstoffkonzentration zu verringern.

Wichtig ist es, daß der Farbstoff und das Agglutinie­ rungsmittel nicht miteinander reagieren und der Farbstoff an den Erythrocyten nicht anhaftet oder in sie eindringt. Zum Agglutinieren der Erythrocyten oder roten Blutzellen kann ein Reagenz, wie ein kationischer Polyelektrolyt oder ein Protamin verwendet werden. Ein derartiger kationischer Polyelektrolyt ist z. B. Hexadimethrinbromid. Dieses Agglu­ tinierungsmittel besitzt eine verhältnismäßig hohe positive elektrische Ladung, so daß es mit Erythrocyten, die eine verhältnismäßig hohe negative elektrische Ladung aufweisen, reagieren kann. Gewünschtenfalls können zur Agglutinierung der Erythrocyten ein Agglutinierungsantikörper für alle Arten von Erythrocyten wie beispielsweise ein gegen menschliche Erythrocyten wirksamer Antikörper von der Ziege oder dem Kaninchen, oder andere Agglutinierungsmittel wie beispielsweise Pflanzenlectine verwendet werden.

In der obengenannten Literaturstelle von Ponder ist die Verwendung von zwei Farbstoffen erwähnt, von denen keiner in dem vorliegenden Verfahren zur Bestimmung eines Volumens an Erythrocyten geeignet ist, da sie z. B. mit dem Agglutinierungsmittel unter Ausbildung eines Nieder­ schlags reagieren. Eine derartige Umsetzung würde die vor­ liegende Methode undurchführbar machen.

Bevorzugt ist der ausgewählte Farbstoff wasserlöslich und besitzt eine verhältnismäßig niedrige elektrische Ladung. Außerdem sollte der Farbstoff eine andere Farbe als rot aufweisen, da die Hämolyse der Erythrocyten ein natürli­ cher Vorgang ist. Es wurde gefunden, daß als geeigneter Farbstoff für die Verwendung bei dem oben beschriebenen Verfahren ein Diphenyl- oder Triphenylmethanderivat wie Erio Blue Glasssine A, das auch als Triphenylmethan C. I. 42090 bekannt ist, oder ein Farbstoff wie Fast Green FCF (C. I. 42053) verwendet werden kann.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Volumens an Erythro­ cyten in einer Blutprobe durch Zusatz einer bekannten Menge eines den Plasmaanteil der Probe färbenden, vom Zellanteil der Probe nicht aufnehmbaren Farbstoffs zu einem bekannten Volumen der Probe, Abtrennung des Zell­ anteils, kolorimetrische Bestimmung der Farbstoffkon­ zentration im Plasma und Berechnung des Zellanteils, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein bekanntes Volumen der Probe ein bekanntes Volumen eines Agglutinierungsmittels und ein bestimmtes Volumen des Farbstoffes einführt, wobei der Farbstoff bei seiner Einführung in bekannter Konzentration vorliegt, die genannten Substanzen zur Agglutinierung der Erythro­ cyten vermischt, die agglutinierten Erythrocyten durch Dekantieren entfernt und die kolorimetrische Bestimmung der Konzentration des Farbstoffes in dem Plasma vornimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchführt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem zur Unterteilung des flüssigen Stroms ein Gas einleitet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Agglutinierungsmittel und den Farbstoff aus einem gemeinsamen Vorratsbehälter einleitet.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agglutinierungsmittel ein solches mit ver­ hältnismäßig hoher positiver Ladung und als Farbstoff einen solchen verwendet, der wasserlöslich ist und mit dem Agglu­ tinierungsmittel oder mit löslichen Bestandteilen der Probe keinen Niederschlag bildet sowie die Zellen weder auflöst noch ihr Volumen verändert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agglutinierungsmittel einen kationischen Polyelectrolyten, insbesondere ein Hexadimethrinbromid, oder ein Protamin verwendet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Triphenylmethan C. I. 42090 oder Fast Green FCF (C. I. 42053) verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agglutinierungsmittel einen alle Arten von Erythrocyten agglutinierenden Antikörper oder ein Planzen­ lectin enthaltendes Mittel verwendet.