DE2026942A1

DE2026942A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Durchfuh rung von Blutuntersuchungen

Info

Publication number: DE2026942A1
Application number: DE19702026942
Authority: DE
Inventors: der Anmelder GOIn ist
Original assignee: Hirsch, Nathan Myron, Brookhne, Mass (V St A )
Priority date: 1969-06-02
Filing date: 1970-06-02
Publication date: 1971-01-14
Also published as: ES380962A1; US3677710A; GB1316981A; FR2049765A5; CA923025A; BE751274A; NL7008010A

Description

Ο«.-IN·. DI^L.-IN·. M.SC. DIPl.-PHV*. DU. Olf»L -PHVS.

HÖGER - STELLRECHT - GRIESSBACH - HAECKER PATENTANWÄLTE IN STUTTGART

A 38 150 b

k - 71 '

25.5.1970

NATHAN MYRON HIRSCH

33 Pond Avenue

Brookline, Massachusetts, U.S.A.

Verfahren und "Vorrichtung zur Durchführung von Blutuntersuchungen

Die Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zur Durchführung von Blutuntersuchungen, bei dem rote Blutkörperchen in eines Waschvorgang von vorgegebenen:Substanzen, insbesondere von unspezifischera Eiweiß, befreit werden, und mit einer Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Insbesondere befaßt | sich die Erfindung mit einem Verfahren und einer Vorrichtung zum automatischen Waschen roter Blutkörperchen und mit der anschließenden Durchführung des Coorabs-Testes bzw. des Antihumanglobulin-Testes in einem kontinuierlichen Prozeß. Der Antihumanglobulin-Test bzw. der Coombs-Test ist eine Blutuntersuchung, die dazu dient, die Anwesenheit von Antikörpern auf roten Blutkörperchen und deren Stärke festzusteller., Bei diesem Test werden rote Blutkörperchen, die Antigene enthalten , und Serum, welches Antikörper enthält, miteir.ar.ier in Kontakt gebracht, so daß die Antikörper des Serums die Oberfläche derjenigen roten Blutkörperchen bedecken können,

-2-

00988 3/.U4O ·.· _BAD

A 38 150 b

25.5.1970 · y . .

welche komplementäre Antigene enthalten. Die roten Blutkörperchen, die mit Antikörpern bedeckt sind, werden zunächst gewaschen, um unspezifisches Eiweiß von ihnen zu entfernen, und dann mit Antihumanglobulin zur Reaktion gebracht. Bei dieser Reaktion bewirkt das Antihumanglobulin eine Agglutination derjenigen Zellen, welche mit Antikörpern bedeckt sind, so daß ein sichtbares Klumpen eintritt, während die nicht bedeckten Zellen dissoziiert bleiben. Die Anzahl der verbleibenden dissoziierten Zellen bei einer gegebenen Probe ist umgekehrt proportional zum Umfang der Antikörperbedeckung auf den agglitunierten Zellen. Ein kontinuierlich arbeitendes Verfahren zur Durchführung des Antihumanglobulin-Testes ist aber nur dann möglich, wenn es gelingt, die roten Blutkörperchen in einem kontinuierlichen Waschverfahren von dem an ihnen anhaftenden unapezifischeri Eiweiß zu befreien. Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die roten Blutkörperchen mit einer Waschlösung gemischt und darin zum Klumpen gebracht werden, und daß die gewaschenen verklumpten roten Blutkörperchen anschließend von einer verbleibenden Restlösung getrennt werden.

Bei diesem kontinuierlichen Verfahren wird also eine Mischung von roten Blutkörperchen zuerst mit einer Waschlösung gewaschen, die schwach ionisch sein kann oder schwach elektrolytisch, die auch einen niedrigen pH-Wert haben kann, oder die ganz allgemein in der lage ist, eine Aggregation der roten Blutkörperchen herbeizuführen. Wenn die Blutproben in eine solche Waschlösung gebracht werden, dann tritt ein Kluopen der roten Blutkörperchen ein. Diese verklumpten roten Blutkörperchen werden nun erfindungsgemäß unter dem Einfluß der Schwerkraft in einer Absetzvorrichtung zum Absetzen gebracht und aus dieser entnommen, um gegebenenfalls erneut gewaschen zu werden. Nach einer Serie von Waschvorgängen werden die roten Blutkörperchen mit einer hypertonischen oder hochelektrolyti-

-3-

_Ä ' BAD ORIGINAL

009883/UAO

A 58 150 b - 3 -

25.5.1970 2026942

sehen Lösung von Antihumanglobulin-Serum zur Reaktion gebracht. Es kann auch ein Antihumanglobulin-Serum mit hohen* pH-Wert verwendet werden. Diese hypertonische Lösung vereinzelt diejenigen roten Blutkörperchen, die nicht mit Antikörpern bedeckt sind, und führt zu einer Agglutination derjenigen Zellen, die eine Antikörperbedeckung aufweisen bzw. hält die bereits verklurnpten Zellen zusammen. An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, daß beim Verklurapen von roten Blutkörperchen infolge der Wirkung von Antihunsanglobulin von Agglutination gesprochen wird. J

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann nun entweder die Menge der vereinzelten bzw. dissoziierten Zellen oder die Menge der agglutinierten Zellen gemessen werden, um einen Hinweis auf die Stärke der Antigen-Antikörper-Reaktion zu erhalten. Es versteht sich, daß es eine Reihe von Keßverfahren gibt, um die Menge der agglutinierten oder der dissoziierten Zellen festzustellen, wobei sowohl direkte Methoden als auch indirekte Meßmethoden am.andbar sind. Auf jeden Fall zeigt die Menge der agglutinierten bzw. dissoziierten Zellen die Menge der Antikörperbedeckung auf den ursprünglichen roten Blutkörperchen an und damit das Vorliegen und die Stärke der kocplezentären Antigen-Bedeckungen auf diesen Zellen. Bei eir.ee Meßverfahren % werden die dissoziierten Zellen mit einem Häcolysator gemischt. Die optische Bichte des Käcolysats wird in eines Kolorimeter gemessen, welches die Menge des in der Lösung vorliegenden Hämoglobins anzeigt. Diese entspricht aber der Konzentration der dissoziierten roten Blutkörperchen bzw. der Konzentration der roten Blutkörperchen, die nicht mit Antikörpern bedeckt sind. Von dieser Konzentration kann auf die Menge der Antikörperbedeckung auf den Zellen in der verwendeten Seruc-Zeilen-Mischung geschlossen werden. Bei einem anderen Meßverfahren werden die dissoziierten Zellen nicht hämolysiert, sondern mittels eines Zellenzählers gezählt, um die Anzahl der agglu-

■ 009883/1440 bad.original

A 38 150 b

tinierten bzw. mit Antikörpern bedeckten roten Blutkörperchen zu ermitteln. Dieses Ergebnis wird erzielt, indem man die Anzahl der gezählten dissoziierten Zellen von der Gesamtzahl der Zellen in der ursprünglichen Probe abzieht. Diese Zahl ist proportional zum Umfang der Anitkörperbedeckung bei den ursprünglichen roten Blutkörperchen.

Eine andere Auswertung wird erreicht, wenn man sowohl die dissoziierten als auch die agglutinierten roten Blutkörperchen auf ein Filterpapier gibt. Dieses Filterpapier absorbiert die dissoziierten Zellen, so da3 nur die agglutinierten Zellen als direkter Hinweis auf die Antikörperbedeckung zurückbleiben. Alternativ können in einem Durchlauffilter auch die dissoziierten Zellen ausgefiltert werden, wobei nur die agglutinierten' Zellen als meßbarer Rückstand zurückbleiben.

Als besonders günstig hat sich gemäß vorliegender Erfindung ein kontinuierliches Waschverfahren erwiesen, bei dem ein Absetzenlassen der verklumpten roten Blutkörperchen unter dem Einfluß der Schwerkraft stattfindet und bei dem anschließend eine Trennung der verklumpten roten Blutkörperchen von der Restlösung erfolgt. Bei der Durchführung sowohl des direkten als auch des indirekten Coombs-Test muß nämlich unkombiniertes Serunglobulin, welches auch als unspezifisches Siwei3 bezeichnet wird, von den roten Blutkörperchen abgewaschen werden, so daß das Coombs-Serum bzw. das Antihumanglobulin wirksam werden und ein meßbares Klumpen der roten Blutkörperchen herbeiführen kann, wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion eintritt. Wenn die roten Blutkörperchen nicht gewaschen sind, dann wird das Coombs-Serum von dem unspezifischen Eiweiß absorbiert. Gemäß vorliegender Erfindung werden Absetzspiralen benutzt,um die gewaschenen verkluapten roten Blutkörperchen von der Restlösung zu trennen, die sich aus unspezifischem Eiweiß und aus der Waschlösung zusammensetzt. Die beim Ab-

- - BAD ORIGINAL

009883/UAO

A 38 150 b

setzvorgang wirksame Kraft ist die örtliche Schwerkraft, die ausreicht, um die/verklumpten roten Blutkörperchen von der leichteren Waschlösung zu trennen. Diese Trennung unter Zuhilfenahme der Schwerkraft ersetzt das nühsane probenweise Waschen, welches ein Zentrifugieren erforderlich nacht. Die erfindungsgemäße Methode ermöglicht somit eine kontinuierliche Aufbereitung gewaschener Zellen, die dann mit des Cooabs-Serum zur Reaktion gebracht werden können.

Der Coombs-Test ist einerseits im Labor eine wertvolle und wirksame Möglichkeit zur Ermittlung unterschiedlicher Bluteigenschaften. Andererseits wird der Cüombs-Test auch klinisch bei der Diagnose der Eorythroblastose,der erworbenen hämolytisehen Anämie und der Isoimmunisa.tion infolge einer Schwangerschaft benutzt und findet bei den rcutinesäSigen Kreuzproben vor Bluttransfusionen Anwendung. Die Autoisatie.ierung des Coombs-Tests, wie sie durch Anwendung der Lehre der vorliegenden Erfindung möglich wird, gestattet cie Benutzung dieses Tests sowohl zur Durchführung billiger Routineuntersuchungen als auch "zur Peststellung quantitativer Ergebnisse, wo bisher nur qualitative Ergebnisse gewonnen wurden.

In Weiterbildung der Erfindung hat es sich ferner als günstig erwiesen, das Absetzen „während des Waschvorgsnge» anstelle " durch Ausnutzung der Schwerkraft durch das Anlegen eines elektrostatischen !Feldes herbeizuführen.

-6-

009883/1440 bad original

A 38 1_5o b

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend anhand der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Arbeitsprogramm zur Durchführung des direkten und des indirekten Coombs-Tests; Fig. 2a Arbeitsprograame zweier Verfahren zur Ge-

„ j nt,

winnung von bedeckten roten Blutkörperchen, wie sie für den direkten und den indirekten Coombs-;Test erforderlich sind? Fig. 3a,Arbeitsprogramine zur Messung der Ergebnisse und 3d ^des

und 3d

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform zur automatischen Durchführung des Arbeitsprogramms gemäß Fig* 1;

Fig. 5a schematische Darstellungen der der Vorrichtung

^u ^ gemäß Fig. 4 zugeführten Materialien sowie der durch die Vorrichtung gemäß Fig. 4 gewonnenen Materialien! und zwar für den direkten und für den indirekten Coombs-Test;

Fig. 6 einen Querschnitt durch die Absetzspirale für eine Vorrichtung gemäß Fig. 4|

Fig. 7 einen Schnitt durch ein kaomerartiges Bauteil, Wie es bei den verschiedenen Ausführungeformen von Vorrichtungen zur Durchführung dee erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, um die Waschflüssigkeit zuzuführenj

Fig. 8 einen Querschnitt durch ein ?ropfrohr zur Verwendung in einer Vorrichtung gemäß Fig. 4 und

Fig. 9 «ine Vorrichtung aur Aufrechterhaltung eines elektrostatischen Feldes längs einer Absetzspirale,

.BADORIQINAL

009883/1440

A 38 1 5ob

k - 71

25.5.1970 T

Einleitung

In Ergänzung der bereits vorstehend gemachten Ausführungen sollen nachstehend noch einmal die dem Coombs-Test bzw. dem AHG-Test zugrundeliegenden Tatsachen ausführlich erläutert werden, um ein besseres Verständnis für die erfindungsgemäße Vorrichtung und deren Bedeutung zu ermöglichen.

Im Jahre 1901 zeigte K.Landsteiner, daß durch Agglutinierungsreaktionen verschiedene menschliche Blutgruppen festgelegt werden können. Bei diesen Untersuchungen reagieren Antigene, die g die roten Blutkörperchen bedecken, mit bestimmten Antikörpern in einem Serum. Wenn ein bestimmter Antikörper benutzt wird, dann tritt eine Agglutination, d.h. ein sichtbares Klumpen der roten Blutkörperchen ,ein und zeigt, daß in dem Blut ein spezifisches Antigen vorhanden ist. Es gibt ferner eine bestimmte Gruppe von Antikörpern, die als sogenannte "inkomplette Antikörper" bezeichnet werden, und die mit den Antigenen im Blute reagieren, ohne daß ein sichtbares Klumpen, d.h. eine Agglutination, eintritt. .

Das Coonbs-Seruc wirkt nun ic wesentlichen aT'S ein Bindemittel, wenn inkomplette Antikörper cit Antigenen reagieren. Dieses Serum gestattet aufgrund bis ietzt noch nicht völlig geklärter \ Vorgänge die Reaktion von inkompletten Antikörpern, die entweder einer Blutprobe künstlich zugesetzt werden oder in dieser auf natürliche Weise vorkcccen, mit spezifischen Antigenen, die die Blutzellen bedecken, in der Weise, daß eine Agglutination, d.h. ein sichtbares Klurpen, eintritt. Im allgemeinen werden die Anükörper-Antigen-Reaktionen in einer Salzsole durchgeführt. Es kennen aber auch höhere Eiweiße, wie Albumin und Enzyme, wie Branelain» Trypsin oder Picin benutzt werden. Inkomplette Antikörper, die fähig sind, Dit bestimmten Antigenen zu reagieren, die Blutkörperchen bedecken, tun dies nun in keiner der üblichen Lösungen. Wenn inkomplette Antikörper mit

009.883/1440

BAD OFUGtNAL

den komplementären Antigenen in einem solchen KediuE zur Reaktion gebracht werden, dann bildet sich eine Antikörperschicht um jedes rote Blutkörperchen, aber es tritt kein Klumpen oder eine Agglutination ein.

Die roten Blutkörperchen werden ferner von un spezifischen Eiweißen oder unkombinierteren Serumglobulinen bede-ckt. Da diese unkombiniert sind, können sie von der Oberfläche der Zellen abgewaschen werden. Sie müssen entfernt werden, damit sie nicht mit dem Coorcbs-Serum kombinieren und dieses als Bindemittel unwirksam machen. Wenn diese unspezifischen Proteine nicht entfernt werden, dann kann sich fälschlicherweise eine negative Reaktion auf den Coombs-Test ergeben. Bisher erfolgte das Waschen der Serum-Zellen-Kisctung probenweise, d.h. getrennt für jede Blutprobe in isotcniscnen Lösungen und anschließend erfolgte eine Zentrifugierung zur Entfernung des unspezifischen Eiweißes. Dies war jedcch ein mühsames Vorgehen, welches das Verfahren für eine Autccatisierung ungeeignet machte.

Gemäß der Erfindung wird nun das probenweise Waschen dadurch ersetzt, daß die einzelnen Blutproben durch Gasblasen oder Einheiten einer zähen Flüssigkeit voneinander getrennt werden und eine-Reihe von im Durchlaufverfahren betriebenen Acsetzeinrichtungen bzw. Absetzspiralen durchlaufen, in denen die unkombinierten Serucglobuline von den damit bedeckten Blutkörperchen entfernt werden. Die gewaschenen Zellen werden anschließend mit dem geeigneten Anti-Huinan-Globulin zur Reaktion gebracht.

Die im Durchlaufverfahren betriebene Absetzeinrichtung bzw. Absetzspirale wird auch anstelle der normalen Zentrifugier-, technik benutzt, um die agglutinierten Zellen abzusondern, nachdem die Reaktion der Antigen-Antikcrper-Eeschich'iungen

ORfGfMAL 009883/UAO

A 38 1 5o b

k - 71 -~9-~

25.5.1970 _AAAÄ

der gewaschenen Zellen mit dem Coombs-Serua stattgefunden hat.

Die agglutinierten Zellen werden dann zu einem Kolorimeter des Typs gepumpt, wie es beispielsweise in der USA-Patentschrift 3 031 917 beschrieben ist. Wenn dieses Kolorimeter benutzt wird, können quantitative Ergebnisse des Coombs-Testes festgestellt werden, wo bisher nur festgestellt wurde, ob der Test positiv (Klumpenbildung) oder negativ (keine Klumpenbildung) verlaufen war.

Die Möglichkeit einer Automatisierung des Coombs-Test hängt " davon ab, ob eine Möglichkeit besteht,, die verschiedenen Blutproben in einer Röhre oder Leitung so voneinander zu trennen, daß die einzelnen Proben nacheinander in,einem kontinuierlichen Prozeß getestet werden können. Eine Einrichtung, mit deren Hilfe Blutproben getrennt werden können, ist in der USA-Patentschrift 3 230 776 beschrieben sowie in der USA-Patentschrift 2 797 149. Die dort beschriebenen Einrichtungen werden als Autoanalysatoren bezeichnet. Der Coombs-Test konnte bisher in einem solchen System jedoch nicht durchgeführt werden, weil die Fachleute davon ausgingen, da8 ein probenweises Waschen und anschließendes Zentrifugieren erforderlich sei. Gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Druck erzeugte Gasblasen | zur Trennung des Blutes verwendet werden, wie dies in den oben zitierten Patenten gemacht wird. Das erfindungsgecäSe Verfahren muß jedoch nicht auf die Probentrennung mittels Luftblasen beschränkt werden. Es ist denkbar, daß auch zähe reaktionsträge Flüssigkeiten zur Trennung der Proben verwendet werden könnten. Ferner könnte ;}eweils nur eine Probe in der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt werden, wodurch die Notwendigkeit einer Probentrennung entfiele. Außer der Absetzspirale wurden zwei neue Arcaturen konstruiert, und zwar eine, die zum Mischen des Blutes mit der Waschflüssigkeit dient, und eine weitere» mit deren Hilfe

_Ä BAD ORIGINAL

009883/IUO

A 38 15o b

es möglich ist, große Luftblasen in dem System zu erzeugen. Zusätzlich dient ein Durchlauf von Waschflüssigkeit zwischen jeder Probe beim direkten Test und von Waschflüssigkeit mit bekannten roten Blutkörperchen beim indirekten Test der Verhinderung einer Verunreinigung einer Probe durch die vorhergehende infolge einer Verschmutzung der Innenseite der Röhren der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Diese zusätzlichen Bauelemente bzw, Maßnahmen helfen gleichfalls bei der Festlegung eines Normalniveaus, also bei einer Art Eichung, und ermöglichen somit eine quantitative Auswertung der Testergebnisse·

Verfahren

Pig. 1 zeigt ein neues Verfahren zur Durchführung sowohl des direkten als auch des indirekten Coombs-Test· ^v

Der direkte Coombs-Test wird in erster Linie aus geführt, um EU untersuchen, welche Antikörper die roten Blutkörperchen im lebenden Organismus bedeckt haben. Er ist ein direktes Diagnosemittel zur Erkennung der Eorythroblastose sowie bei Untersuchungen der erworbenen bämolytiscben Anämie, bei welcher vom Patienten erzeugte Antikörper seine eigenen Blutkörperchen bedecken können,und ferner bei der Prüfung der Unverträglichkeit einer Transfusion, bei der der Patient auf die Transfusion von ungeeignetem Blut reagiert.

Der indirekte Coorabs-Test wird benutzt, um die Anwesenheit von inkompletten Antikörpern im Serum von Personen zu entdecken, die bezüglich eines oder mehrerer Blutantigene sensibilisiert sind» Ferner wird der indirekte Coombs-Test benutzt bei Untersuchungen der Isoimmunisierung, die auf eine Schwangerschaft zurückgeht. Der indirekte Coombs-Test kann des weiteren benutzt werden bei sehr genauen Kreuzproben/ um festzustellen,

009883/1440

A 38 1 ^5o b

ob bei einer Transfusion infolge der Inkcopatibilität des Blutes Reaktionen auftreten würden, die durch andere Kreuzprobenverfahren nicht ermittelt werden können.

Der erste Schritt bei'dem vorliegenden Verfahren besteht darin, daß eine vorgegebene Serum-Zellen-Kischung 9 mit einer schwach ionischen Waschlösung 8 gemischt wird, um - wie dies bereits oben erwähnt wurde - unspezifisches Eiweiß von dez- Ober- · fläche der Zellen zu entfernen.

Diese Serua-Zellen-Mischung, die aus beschichteten roten Blutkörperchen zusammengesetzt wird, kann "mit einer der beiden Methoden gewonnen werden, die in den Fig. 2a und 2b dargestellt sind. Wie Fig. 2b zeigt, können beic indirekten Coombs-Test Proben oder Blutkörperchen 32 bei 28 mit einen Serum 31 gemischt werden, das einen speziellen Antikörper enthält, auf den die Zellen untersucht werden sollen. Die Proben der roten Blutkörperchen sind gewöhnlich in einer Lösung mit 0,7 i° NACL und 0,5 i> Ficol suspendiert, die auf einen pH-'.Vert von 7,2 gepuffert ist. Die Mischung von Serum und rcten Blutkörperchen wird bei 29 für eine Zeit zwischen 7 und 120 Minuten bei einer Inkubations-tetnperatur von 37° C gelagert. Die Temperatur kann innerhalb eines Bereichs von - 2 C schwanken, wenn eir.e optimale Inkubation erreicht werden soll. Während der Inkubation bedeckt das antikörperhaltige Serum diejenigen roten Blutkörperchen, die eine Bedeckung mit dem komplementären Antigen aufweisen. Hierdurch werden die bedeckten rc-en Blutkörperchen erzeugt, die bei 9 in Fig. 1 angedeutet sind, wenn in der Serum-Zellen-Mischung komplementäre Antigene und Antikörper vorhanden sind. Bei der Durchführung des Ccocfcs-Tests gecäQ der vorliegenden Erfindung wird entweder die I-üschur-g 30 gemäß Fig. 2b benutzt oder die Mischung 27 gecäS ?ig. 2a, die ebenfalls aus beschichteten roten Blutkörperchen besteht, die aus einer vollständigen Blutprobe 25 gewonnen werden, die bei 24

009883/U40* BAD ORIGÜ^ÄL

A 38 15o b
k - 71
25.5.1970

mit einer Salzsole oder einer anderen Lösung 26 gemischt wird. Nach dem Mischen der Serum-Zellen-Mischung und der Waschlösung wurde bei der Durchführung des Coombs-Tests ursprünglich eine Zentrifugierung vorgenommen, um das ·. unspezifische Eiweiß von der Oberfläche der Zelle zu trennen. Eei der vorliegenden Erfindung ersetzt ein Trennschritt, der unter Ausnutzung der Schwerkraft arbeitet, als zweiter Schritt die früher erforderliche Zentrifugierung. Bei diesem zweiten Schritt wird die Serum-Zellen-Mischung, die durch die Waschlösung verdünnt ist, in einem Absetzprozeß unter Ausnutzung der Sch.-.erkraft gewaschen. Bei diesem Absetzprozeß fließen die Zellen durch eine Spirale, deren Achse in Richtung -der Feldlinien des örtlichen Schwerkraftfeldes verläuft. Die Zellen kennen auch in einem geschlossenen Kreis beliebiger Geometrie zug Fließen gebracht werden, solange nur ein Absetzen unter der Wirkung der Schwerkraft erfolgen kann. Senkrecht orientierte Spiralen haben jedoch ein wirksameres Absetzen zur Folge, da senkrecht zur Richtung des örtlichen Schwerefeldes eine größere Länge der Leitungen innerhalb eines gegebenen Gehäuses erreicht werden kann.

' beet eck ίέ>η si)

roten Zellen, die durch diese Spirale fließen, klumpen wegen der Verwendung einer sehwach ionischen oder schwach elektrolytischen Waschlcsung oder einer A'aschlcsung mit niedrigem pH-Wert zusammen. Man nimmt an, daß eine schwach ionische Lösung außer der Abtrennung des nicht spezifischen Proteins ein dichteres Zusammenrücken der Zellen bewirkt, so daß das Coombs-Seruni wirksamer werden kann. Dies wird erreicht, indem die Ladungen auf den roten Blutkörperchen verringert werden.

Es gibt drei Klassen von Waschlösungen, die benutzt werden können. Die erste Klasse von Reagenzien schließt die schwach ionischen Lösungen^, wie beispielsweise Mannit und Sorbit, die

009883/1U0

A 38 t₅öb

k - 71

25.5.1970 .

extrazellulär wirksam sind und die Ladung der roten Blutkörperchen merklich herabsetzen. Glyzerin und Glukose sind zwei schwach ionische Waschlösungen, die interzellulär wirken und ein Klumpen herbeiführen. Eine weitere Klasse von Reagenzien, zu der Polyvinylpyrjjslidon, Polylicyn und Hexadimethrinbroaid, welches von der Firma Abbott,einer amerikanischen Arzneimittelfirma mit Sitz in Chicago, unter dem Warenzeichen Polybrene auf den Markt gebracht wird, gehören, reagiert mit den Zellwänden der roten Blutkörperchen in der Weise, daß diese zur Klumpung befähigt werden. Zu einer dritten Gruppe von Rea- i genzien gehören diejenigen, die einen schwachen pH-Effekt besitzen. Zu dieser Gruppe gehören Waschlösungen mit Enzymen, die entweder in die Gruppe der Eiweiße mit hohem Molekulargewicht fallen oder zu den proteolytischen Enzymen gehören. Zu den Eiweißen mit hohea Molekulargewicht gehorefr'A1burilhWie· Methylzelluiose'r Zu den prottolytieohen Eneyuen gehören Papein, Piatn, Nagerase, Trypsin und Bromelain. Es sei jedoch an dieser Stelle darauf hingewiesen, daß die Waschlösungen nicht auf die Verwendung der obengenannten Substanzen beschränkt sind, sondern daß vielmehr jede lösung verwendet werden kann, die geeignet ist, eine Aggregation der roten Blutkörperchen herbeizuführen.

; , ' ■ ■■ , ■ i

Während die Zellen durch die Absetzspirale wandern und klumpen, setzen sie sich auf dem Boden der Spirale ab, während die Restlösung Über ihnen fließt. Diese Restlösung besteht aus Waschlösung und unspezifischem Eiweiß und wird dekanfiert, wenn die verklumpten Zellen das Ende der Absetzspirale erreichen.

Der dritte Schritt des erfindungsgeeißen Verfahrene besteht darin, daß die verklumpten roten Blutkörperchen bei Erreichen des Endes der Absetzspirale von deren Boden unter dem Einfluß der Schwerkraft und mittels eines schwachen Sogs abgezogen werden, während die Restlösung in der Absetzspirale verbleibt,

000813/1440

A 38 1.5o b k - 71

um dekantiert zu werden. Die drei Schritte des Zellenwaschvorgangs, nämlich daa Mischen, das Absetzen und das Dekantieren, sind in Fig. 1 bei 1, 2 und 3 schematisch angedeutet.

Die verklumpten Zellen, die nunmehr von unspezifischem Eiweiß frei sind, werden mit einem hypertonisch wirkenden Volumen des Coombs-Serums bzw. des Antihumanglobulins bei 4 gemischt. Es soll darauf hingewiesen werden, daß die Verwendung eines Coombs-Serums mit hohem pH-Wert und einer Waschlösung oit niedrigem pH-Wert oder die Verwendung eines hoch elektrolytischen Coombs-Serums mit einer schwach elektrolytischen Waschlöeung die Coombs-Reaktion verstärkt . Andererseits können mit einer hypertonischen Löeung unabhängig von der benutzten Waschlösung stete angesessene Ergebnisse erzielt werden. Bas hypertonische Cooebs-Seru« bei 10 dient eines doppelten Zweck, Erstens sollen die Zellen ton dee verklucptenZellheufen abgelöst werden» die nicht mit Antikörpern bedeckt sind, und zweitens soll gleichzeitig die Bindung zwischen denjenigen verkluapten Zellen aufrechterhalten werden« die ait Antikörpern bedeckt sind. Gemäß einer Erklärung dieses Phänomene wirkt das Cooebe-Serue ale Brück» «wischen swei Zellen, wenn eich auf beiden eine entsprechende Beschichtung ton kötcplemtären An ti jenen und Antikörpern befindet. Ken vemuttt, da 3 das Antihumanglobulin-Molekül sich mit eeinem einen Ende mit einer bestimmten Stelle einer dieser Zellen verbindet und mit eeinem anderen Ende mit einer anderen Stelle auf der anderen der Zellen, so daß ein Klumpen bzw. eine Agglutination eintreten kann. Soweit die Benutzung normalen Antihuoanglobulins in Frage steht, ist es möglich, daß dieses mit den in den obengenannten chemisch aktiven Waeehlöeungen gewaschenen Zellen reagiert.

Nachdem das Coombs-Serum nit den durch den Waschvorgang erhaltenen verklumpten Zellen gemischt ist, wird das Heaktions-

0088Ö3/U40

BAD ORiGlMAL

A 38_1.5o b

produkt erneut einem Absetzschritt 5 unterworfen, für welchen " eine zweite Serie von Absetzspiralen zur Verfügung steht. Bei diesem Schritt werden die verklumpten Zellen wiederum unter Einfluß der Schwerkraft und mittels eines Sogs bei 6 entnommen. Die abgelösten Einzelzellen werden zu diesem Zeitpunkt dekantiert und die Zahl der Einzelzellen pro Volumeneinheit wird bei 7 gemessen und/oder aufgezeichnet, um den Umfang der Antikörperbeschichtung auf den ursprünglichen roten Blutkörperchen zu bestimmen.

In den Fig. 3b, 3c und 3d sind drei direkte Meßverfahren schematisch dargestellt, während in Fig. 3a ein indirektes Meßverfahren gezeigt ist. Bei diesem indirekten Meßverfahren wird der Umfang der Beschichtung der ursprünglichen roten Blutkörperchen, durch Hämolysation dieser vereinzelten Zellen bestimmt, die sich in der dekantierten Lösung befinden, die in dem Meßschritt 7 in Fig. 1 benutzt wird. Bei diesen Meßverfahren werden hämolysierte Zellen bei 11 durch ein Kolorimeter 12 des ob«n beschriebenen Typs geführt. Als Hämolysierungsmittel kann jedes geeignete Hämolysierungsnittel benutzt werden, welches mit Wasser gemischt ist. Bei Versuchen im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde beispielsweise Triton x100 benutzt.

Die hämolysierten Zellen, die jetzt dissoziiert und durch das obengenannte Kolorimeter geführt sind, offenbaren gewisse Aaplitudenspitzen und Einbrüche, die positive und negative Cocnbs-Teste offenbaren. Dies ist schematisch bei den Aufzeichnungsschritt 13 in Fig. 3a dargestellt. Zur Eichung dieser Vorrichtung wird eine Anzahl von Proben mit normalen, d.h. unbedeckten roten Blutkörperchen untersucht. Dabei ergeben sich die Spitzen, die sich in der Zeichnung an die Linie 14 anlegen. Die Lage dieser Spitzen legt also ein Grundniveau fest. Jede Spitze, die an der punktierten Linie 14 erscheint, ist ein Hinweis

009883/ IUO ^BAD

A 38 I50¹
k - 71

auf einen negativen Coombs-Test, während jede Spitze, die die Linie 14 nach unten überschreitet, einen positiven Coombs-Test anzeigt. In den Fällen, in denen nur eine sehr schwache Beschichtung mit Antigenen und Antikörpern auf den roten Blutkörperchen vorliegt, können sich Meßwerte ergeben, die oberhalb der Grundlinie liegen. Dies tritt"in seltenen Fällen auf, da das Coombs-Serum rote Blutkörperchen, die nur eine sehr schwache Bedeckung aufweisen, eher vereinzelt als agglutiniert.

Im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird ein Goombs-Test als positiv bezeichnet, wenn eine Menge eines spezifischen Antikörpers die ursprünglichen roten Blutkörperchen bedeckt und damit anzeigt, daß die roten Blutkörperchen einem spezifischen Typ angehören. Als negativ wird ein Coombs-Test dann bezeichnet, wenn keine von den in einem bestimmten Serum vorhandenen Antikörpemdie roten Blutkörperchen bedecken, womit ebenfalls gezeigt ist, daß die roten Blutkörperchen einem spezifischen Typ angehören.

Andererseits kann eine direkte volumetrische Bestimmung der Menge der dissoziierten Zellen erfolgen, indem die dissoziierten Zellen unmittelbar nach Mischung des Coombs-Serums mit den bedeckten roten Blutkörperchen in ein Durchlauffilter geführt werden. Dieser zusätzliche Schritt ist bei 15 angedeutet. Die Menge des Filtrats kann optisch untersucht werden durch Reaktion mit LackDuspapier oder.durch andere cromatographische Techniken. Andererseits kann auch eine elektronische volumetrische Zellenzählung bei der Mischlösung durchgeführt werden, die die verklumpten roten Blutkörperchen enthält. Dies erfolgt bei 16 in Fig. 3b. Ein elektronischer Zellenzähler des Typs, wie er beispielsweise in dem Katalog: Technical Instrument Corporation Autorized Federal Supply Schedule für die Zeit . vom 1. Juli 1968 bis zum 31. Januar I969 beschrieben ist, bestimmt die Menge und · damit die Anzahl der agglutinierten

_{Λ Λ Λ Ä Λ Λ} BAD ORSGIMAL

009882/UU-

A 38 Ί 5ό ^b

Zellen in einem gegebenen Volumen. Das Ergebnis dieser Untersuchung kann leicht mittels eines Streifenblattschreibers aufgezeichnet werden, so daß eine ähnliche Kurve erhalten wird, wie dies in dem Aufzeichnungsschritt 13 geschehen ist. Die Aufzeichnung erfolgt bei 17 in Fig. 3b.

Wenn ein Dekantierungsschritt vorgenommen wird, kann eine direkte volumetrische Zählung bei der Restlösung durchgeführt werden, und zwar mittels eines Zellenzählers. Dieser Schritt erfolgt bei 18 in Fig. 3c. Das Ergebnis der Zellenzählung I

, .' _Λ . ..,_ _". ,_ „ . , . _A„ .aufgezeichnet werden, kann bei 19 m ähnlicher Weise wie bei 17 in Fig. 3b / Bei den beiden vorstehend beschriebene'n direkten Verfahren wird entweder die Menge der dissoziierten oder die Menge der agglutinierten Zellen quantitativ gemessen. Eine qualitative optische Untersuchung kann erreicht werden, wenn, was bei 20 in Fig. 3d erfolgt, die Restlösung entweder bei 21 auf chromatographisches Papier tropft oder auf ein absorbierendes Filterpapier bei 22. Im Falle der Verwendung von chromatographischem Papier zeigt die Farbe die Stärke der Coombs-Reaktion an, während die Anzahl der verklumpten Zellen, die auf dem Filterpapier liegt, einen optisch auswertbaren qualitativen Maßstab für die Stärke der Reaktion darstellt.

Da gemäß der Erfindung das ältere Zentrifugierverfahren durch zwei aufeinanderfolgende Absetzschritte ersetzt ist, werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren quantitative Ergebnisse erreicht, die zuverlässiger sind als die optischen Untersuchungsmethoden, die bei Anwendung der probenweisen Zentrifugiertechnik erreicht wurden.

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist sehr nützlich bei der Vornahme von Kreuzproben. Damit eine kompatible Transfusion gegaben wird, muß ein Blut von im wesentlichen dem gleichen Typ gefunden werden, wie dae des Empfängers. Für die üblichen

; BAD ORIGINAL

009883/1U0

Bluttypengruppen stellt die Kreuzprobe eine Routinesache dar. Nachdem mehr und mehr über die Bluttypen bekannt ist, ist eine empfindlichere Kreuzprobentechnik erforderlich. Der Antihumanglobulin-Test, der gemäß dem vorliegenden Verfahren durchgeführt wird, ist eine solche empfindliche Technik. Bei diesem Verfahren werden rote Blutzellen von dem potentiellen Empfänger¹ mit dem Serum des Blutes zur Reaktion gebracht, das übertragen werden soll, so daß eine Serura-Zellen-Mischung erzeugt wird, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht wird. Eine negative Reaktion, die dadurch angezeigt wird, daß die Spitze der Aufzeichnung an der punktierten Linie 14 anliegt, zeigt an, daß das Blut, dem die Probe entnommen wurde, mit dem des Empfängers austauschbar ist. Wenn dagegen die Spitze unterhalb der Linie 14 liegt, dann ist damit gezeigt, daß die beiden Bluttypen nicht austauschbar sind_t/und es müssen entweder weitere Tests durchgeführt werden oder neue Proben untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet bei Benutzung der noch zu beschreibenden Vorrichtungen eine wirksame Untersuchung einer großen Anzahl von Proben, um eine zu finden, die mit dem Blut des Empfängers vollkommen austauschbar ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch Anwendung finden, wenn nach einer Blutübertragung die Austauschbarkeit untersucht werden soll. In diesem Falle bedecken bei fehlender Austauschbarkeit Minuten oder Stunden nach der Transfusion Antikörper des übertragenen Blutes die roten Blutkörperchen des Empfängers. Die Untersuchung einer dem Empfänger entnommenen Blutprobe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt dann entweder ein positives oder negatives Testergebnis. Sobald feststeht, daß der Test positiv ausgefallen ist, können schnell therapeutische Maßnahmen ergriffen werden. Wiederum gestattet das erfindungsgemäße Verfahren, wenn es in der Vorrichtung, die noch beschrieben werden soll, durchgeführt" wird, eine relativ umgehende Bestimmung der Kompatibilität. Fach-

0098S3/UA0

A 38 15o b
25.5.1970

stehend soll nunmehr die automatisch arbeitende Vorrichtung zur Durchführung des neuen Verfahrens zur Durchführung des Coombs-Tests beschrieben werden.

Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren am besten für eine •automatische Durchführung geeignet ist, versteht es sich, daß dieses Verfahren auch in einer Reihe von nicht automatisch aufeinanderfolgenden Schritten erfolgen kann, wenn die Anzahl der durchzuführenden Proben die Ausgaben für eine vollautomatische Anlage nicht rechtfertigen.

Vorrichtung

Die nachstehend zu beschreibende Vorrichtung wurde entwickelt, um das vorstehend beschriebene Verfahren in einem kontinuierlichen Prozeß durchzuführen. Mit Hilfe dieser Vorrichtung ist es möglich, mehr als 30 Blutproben innerhalb einer Stunde zu testen und zu analysieren. Obwohl die Vorrichtung, die nachstehend beschrieben werden soll, sowohl zur Durchführung des direkten als auch des indirekten Coombs-Tests verwendet werden kann, ist in Fig. 4 eine Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des indirekten Coombs-Tests gegeben, da dieser der kompliziertere von den beiden ist.

Beim indirekten Coombs-Test werden Serum-Proben, die entweder bestimmte Antikörper enthalten oder nicht, in den Kazzerr. eines ringförmigen Behälters vorgesehen. Diese Kammern sind nach oben offen, um das Einfüllen der Proben in die Öffnungen der Kamrcorn zu ermöglichen, während sich die Kammer uc eine zentrale Achse dreht. Ebenfalls in diesem Behälter und zwischen den Serumproben sind Proben roter Blutkörperchen untergebracht, die ein bekanntes Antigen enthalten. Der Zweck dieser Zellen besteht in erster Linie in einer Waschfunktion, die notwendig ist, um zu verhindern, daß eine Serumprobe durch die nächste

009883/1440

^ßÄD

A 38 15er b
k - 71 '

verschmutzt wird. Diese Zellen werden auch benutzt, um einen Grundpegel für quantitative Messungen zu erhalten. Beide Funktionen werden anschließend mit größerer Genauigkeit anhand der Fig. 5a und 5b beschrieben. Einzelheiten dieses Typs eines Testapparates sind in der US-Patentschrift 3 230 796 beschrieben. Diese Flüssigkeitstestvorrlchtung ist schematisch bei in Fig. 4 dargestellt. Die Vermeidung der vorerwähnten Verschmutzung ist außerdem dadurch sichergestellt, daß zwischen den einzelnen Proben in dem Behälter Waschlösung vorgesehen ist. Dies wird dadurch erreicht, daß z.B. ein / abwechselnd in die Serumproben und danach in das Waschbad getaucht , das von der Pumpe 54 in die Vorrichtung 40 eintritt. Proben aus dieser Vorrichtung werden mittels einer peristaltischen Pumpe 41 in das Oberteil eines T-förmigen Verbindungsstückes 42 gepreßt. Vom Boden des T-förmigen Verbindungsstückes 42 wird ein kontinuierlicher Fluß der gleichen roten Blutkörper-*. chln^ cne ein bekanntes Antigen &_eB _Ob_en erwähnten Typs enthalten.

Es versteht sich, daß auch unbekannte Zellen in der Vorrichtung 40 untergebracht werden könnten und mittels eines bei 43 eingepumpten Serums getestet werden könnten. In ähnlicher Weise könnten Zellen, die bekannte Antigene enthalten, in die Vorrichtung 40 eingeführt werden, sowie Seren mit unbekanntem Antikörpergehalt mittels einer Pumpe 43, obwohl dies etwas unwirksam wäre.

Es ist daher einleuchtend, daß die Vorrichtung 40 in unterschiedlicher Weise benutzt werden kann, je nachdem, von wo welche der für die Reaktion erforderlichen Komponenten für den direkten oder den indirekten Coombs-Test zugeführt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist somit in der Lage, nicht nur festzustellen, welches Serum einen vorgegebenen Antikörper enthält, sondern auch, welche roten Blutkörperchen ein vorge-

009883/1

A 38 1.5b b

gebenes Antigen enthalten.

Die Pumpe, die benutzt wird, um die Proben durch diese Vorrichtung zu pumpen, kann entweder als einzelne peristaltische Pumpe mit einer Vielzahl von durchlaufenden Linien ausgebildet sein, oder es können, wie in dem dargestellten Ausführungsbeispiel, zwei peristaltische Pumpen Pj und P^ vorgesehen werden. Es wurden zwei Pumpen benutzt, weil eine Pumpe, die eine ausreichende Vielzahl von Linien enthält, sich als unwirtschaftlich teuer erwiesen hat. Diese Pumpen wurden so eingerichtet, daß sie mit gleicher Geschwindigkeit liefen und i somit etwa synchron zueinander. Es versteht sich, daß auch einzelne Pumpen verwendet werden können. Zum Zwecke der Klarheit der Beschreibung sind in der Zeichnung einzelne Pumpgehäuse dargestellt.

In der Zeichnung ist ein Abschlußventil 42'dargestellt, welches die Durchführung des direkten Coombs-Tests gestattet. Dieses Abschlußventil ist geschlossen, wenn ein direkter Coombs-Test durchgeführt wird, da der Serum-Antikörper bereits die roten Blutkörperchen bedeckt, die aus dem menschlichen Körper entnommen sind. Sowohl beim direkten als auch beim indirekten Coombs-Test werden das Serum und die roten Blutkörperchen in ein Tropfrohr 44 eingeführt, das nachstehend I noch anhand der Fig. 6 genauer beschrieben werden soll. In dieses Tropfrohr wird die Blut-Serum-Hischung hineingetropft, und zwar an den Seiten des Tropfrohrs 44 entlang,bis eine Luftblase, die nach oben steigt, die Blutprobe in die Mischspirale 47 treibt. Die in das Tropfrohr 44 eindringende Luft wird periodisch in zeitlicher Übereinstimmung mit der Tätigkeit der Pumpe 41 eingeführt, so daß die Luftblase und die Blutprobe etwa zur gleichen Zeit bei dem Tropfrohr 44 eintreffen. Die Luft wird mittels einer periataltischen Pumpe geliefert und dem Tropfrohr 44 über eine Armatur 46 mit verkleinerter Öffnung zur Pulsunterdrückung zugeführt. Auf diese

009883/1440

A 38 I5ob

^{k w 71} « *

25.5.1970 *l 2026942

Weise entsteht eine gleichmäßige Trennung mittels Luftblasen, wenn die Pumpen 41V ^⁰ und 45 in geeigneter Weise synchroniert sind. Dieser Synchronismus ergibt sich autonatisch, wenn eine einzige peristaltische Pumpe benutzt wird. Wie nachstehend noch näher ausgeführt werden soll, verlängert das Tropfrohr 44 die luftblasen wirksam, wodurch eine noch größere Trennung der Proben erreicht wird. Bei einer praktischen Ausführungsform konnte ein Abstand von 10 und mehr Zentimetern zwischen den einzelnen Proben erreicht werden. Die voneinander getrennter Proben von Blut und Serum werden anschließend in einer Durchlauf-Mischvorrichtung gemischt, die aus einer horizontal liegenden Mischspirale 47 besteht, die von einem Typ ist, wie er in der USA-Patentschrift 3 427 135 beschrieben wird. Die Bezeichnung "horizontal" Wird benutzt, um die Kischspiralen von den Absetzspiralen, die nachstehend beschrieben werden sollen, zu unterscheiden. Darüber hinaus sind die Mischspiralen,selbst wenn sie vertikal angeordnet würden, im allgemeinen von so geringem Durchmesser, daß ein Absetzvorgang nicht stattfinden könnte. Im Anschluß an diesen Mischschritt wird die Flüssigkeit durch eine weitere T-förmige Armatur 48 geführt, wo ihr ein zusätzliches Reagens hinzugefügt werden kann, wenn sich ein Ventil 49 in seiner offenen Stellung befindet. Beil direkten Coombs-Test kann dieses zusätzliche Reagens eine Salzlösung sein. Auch ein gegebenenfalls erforderliches Schmiermittel kann durch diese Armatur zugeführt werden. Es kann jedoch auch an irgendeinem anderen Punkt in dem System zugefügt werden. Darüberhinaus kann jedes Reagens, welches die Coombs-Reaktion verstärkt, an diesem Punkt zugesetzt werden. Ein solches Reagens ist beispielsweise Albumin, obwohl seine Einführung in die erfindungsgemäße Vorrichtung normalerweise unnötig ist. Die horizontale Mischspirale 50 ist vorgesehen, um jedes an diesem Punkt beigefügte Mittel sorgfältig unterzumiscten. Ea versteht sich, daß eine weitere Mischung der vorerwähnten Flüssigkeiten die Trennung der Proben nicht ungünstig beein-

009883/HAO bad original

A 38 1 5öb

fIuBt₁ wenn seine Zuführung unter niedrigem Druck erfolgt. Von der Mischspirale 50 fließt die Mischung durch einen Inkubator 51, der aus einer Serie von horizontalen Spiralen und 53 besteht, die in einem Bad mit einer Temperatur von 37° C laufen. Eine andere Lösung besteht darin, daß an diesem Punkt ummantelte Spiralen verwendet werden. Die zeitliche Steuerung des Flüssigkeitsstromes wird so gewählt, daß die Blut-Serum-Mischung sich für etwa 12 Minuten innerhalb des Inkubators befindet. Diese Inkubationszeit, die durch die Länge der Spiralen 52 und 53 bestimmt wird, kann irgendwo in dem Bereich von 7 big 120 Minuten, bei einer Temperatur von I 37° (fliegen. Bei dem direkten Coombs-Test kann dieser Schritt ausgelassen werden.

Bis zu diesem Punkt hat die Vorrichtung Proben von bedeckten roten Blutkörperchen vorbereitet, die gewaschen werden müssen und mit dem oben erwähnten Coombs-Seruc zur Reaktion gebracht werden sollen.

Das Waschen der roten.Blutkörperchen findet in eisen Absetzschritt oder in einer Gruppe von Absetzschritten statt, je nachdem, welche Länge die Röhre aufweist, welche die noch zu beschreibende Absetzspirale bildet. Aus dem Inkubator 5.1 ge- ^ langen die Blutproben auf die eine Seite einer besonders aus- ■ gedehnten kanmerförmigen Armatur 551 die später noch anhand der Fig. 7 näher beschrieben werden soll. Diese karcerförmige Armatur kann als Teil der vorerwähnten Durchlauf-Xischvorrichtung betrachtet werden, wenn sie mit einer horizontalen Xischspirale des vorstehend beschriebenen Typs verbunden ist. Vom Boden dieser kammerförmigen Armatur wird eine schwach ionische Wasehlösung eingepumpt, wie dies vorstehend beschrieben wurde, und zwar mittels einer Pumpe 56. Zwischen der Pucpe 56 und der kammerförmigen Armatur 55 liegt ein anderer Typ eines Impulsunterdrückers „A^fTwelcher dazu dient, die Wascr-flüssig-

0098837IUO bad original

A 38 150 b .

keit sanft in die kammerartige Armatur 55 einströmen zu lassen. Der Impulsunterdrücker 57 besteht aus einer Kammer mit Eingangs- und Ausgangsöffnungen und ist bis zu einem Pegel oberhalb der Ausgangscffnung gefüllt. Die Ausdehnung der kammerförmigen Armatur 55 gestattet die Beimischung einer großen Menge von Waschlösung zu der Serum-Zellen-Mischung, so daß ein wirksameres Waschen stattfinden kann. Wenn die Waschmischung in diese kammerförmige Armatur eingeführt wird, werden die Luftblasen, die die einzelnen Proben voneinander trennen, nicht gestört. Dies tritt ein, weil der Luftblasendruck größer ist als der Druck der Waschlösung, die in diese kammerförmige Armatur eingeführt wird. Die verdünnte Blutprobe wird an der verkleinerten Ausgangsöffnung der karnmerförmigen Armatur verlängert, .während die Größe der Luftblase sich nicht ändert, wenn sie aus dieser kammerförmigen Armatur austritt. Die schwach ionische Lösung wird mit der Serum-Zellen-Mischung in einer horizontalen Mischspirale 58 gemischt und die gemischten Proben, die immer noch durch Luftblasen voneinander getrennt sind, werden in die Absetzspirale 59 hineingepreßt. Die Wirkungsweise der Absetzspirale 59 wird ausführlicher anhand der Fig. 6 erläutert. Die abgesetzten verklumpten Zellen werden mittels einer Dekantierarmatur 60, die T-förmig und mit einer verjüngten Basis ausgebildet ist, abgezogen. Die verklumpten roten Blutkörperchen werden durch diese verjüngte Basis abgelassen,während die Restlösung, die aus der Waschlösuug und unspezifischem Eiweiß besteht, am anderen Ende des kreuzförmigen Teils des "T" herausgetrieben wird. Diese Restlösung wird in einen Behälter 76 gepumpt, und zwar mittels einer Pumpe 82 mit einer Förderleistung, die klein genug ist, um die verklumpten Zellen nicht aufzuwirbeln. Es versteht sich, daß bei einer peristaltischen Pumpe der Pumpendruck durch die Größe der benutzten Röhren reguliert , werden kann. Bei· einer Ausführungsform werden die roten Blutkörperchen dreimal in einem Satz von drei Waschspirilen ge-

009883/mO

k - 7f ?C

25.5.1970 *·<*· 2026942

zusätzlich waschen, die in Serie zueinander liegen. Dies erfordert/die Benutzung von Pumpen 61 und 62,von Impulsunterdrückern 63 und 64, von kammerförmigen Armaturen 65 und 66, Mischspiralen 67 und 68, Absetzspiralen 69 und 70, Dekantierarmaturen 71 und 72 und Pumpen 83 und 84.

An diesem Punkt des Systems stehen nun gewaschene rote Blutkörperchen zur Verfügung, die mit dem vorerwähnten hypertonischen Coombs-Serum zur Reaktion gebracht werden können. Die geeignete hypertonische Lösung muß nur zugeführt werden, wenn | Proben gewaschener roter Blutkörperchen durch das T-förmige Verbindungsstück 85 laufen. Während in dieses Verbindungsstück 85 kontinuierlich Antihumanglobulin eingepumpt werden könnte, wird ein solches Vorgehen durch die relativ hohen Kosten für das Coombs-Serum verhindert. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird das Coombs-Serumin das obenerwähnte Verbindungsstück 85 nur dann eingepumpt, wenn gewaschene rote Blutkörperchen zugegen sind, die mit normalem Serum oder mit Serum, das möglicherweise Antikörper enthielt, behandelt wurden. Dies erfordert eine gewisse zeitliche Abstimmung für die Einführung des Coombs-Serum. Wie oben erwähnt, Bind die Proben von gewaschenen roten Blutkörperchen nicht die einzigen Proben, die durch die Absetzspiralen laufen. Beim indirekten Coombs- f Test passieren sowohl Proben der Waschlösung als auch Proben roter Blutkörperchen, die eine bekannte Antigenbedeckung haben, das System. Da es unnötig ist, diese Komponenten mit dem Coombs-Serum zur Reaktion zu bringen, werden sie mit einer hypertonischen Salzlösung zur Reaktion gebracht, die zu den gleichen Ergebnissen führt wie das Antihumanglobulin,und zwar bezüglich der Vereinzelung der Zellen,und dabei wesentlich billiger ist.

Damit das Coombs-Serum und die Salzlösung abwechselnd in das System eingeführt werden können, wurde ein Hybrid-Pumpsystem

009883/1440

A 38 1 50 b

entwickelt. In diesem Pumpsystem wird Antihumanglobulin mittels einer Pumpe 74 in die eine Hälfte eines DPDT-artigen Ventils 78 eingeführt. Die Salzlösung wird mittels einer Pumpe 77 der anderen Hälfte dieses Ventils zugeführt. Dieses Ventil, welches durch ein Ventilsteuerprogramm 79 gesteuert wird, nimot während der ersten Hälfte seines Arbeitszyklus eine Stellung ein, in der das Antihumanglobulin zu der Verbindungsleitung 73 gelangt, während zu gleicher Zeit das Fließen der Salzlösung durch diese Verbindungsleitung verhindert wird. Die Salzlösung wird zur gleichen Zeit mittels der Pumpe 77 durch das T-förcige Verbindungsstück 80 gepumpt. Zu einem geeigneten Zeitpunkt wird das Ventil 78 in seine andere Stellung umgeschaltet. In dieser Stellung wird das durch die Pumpe 74 fließende Antihumanglobulin durch das T-förmige Verbindungsstück 75 gepumpt, während die Salzlösung nunmehr durch die Verbindungsleitung 73 hindurchtreten kann. Auf diese Weise werden die obigen Reagenzien über das T-förmige Verbindungsstück 85 der aus den Absetzspiralen abfließenden Flüssigkeit beigemischt. Bei einer nicht dargestellten Ausführungsform ist das Ventil 78 als Vierkammersystem mit elektromagnetischer Betätigung ausgebildet. Ein solches Ventil enthält eine einzige Membran, welche die Verbindungsleitung 73 abwechselnd mit der Leitung für das Antihumanglobulin und mit der Leitung für die Salzlösung verbindet.

Das Coombs-Serum wird mit der aus den Absetzspiralen austretenden Flüssigkeit in einer horizontalen Mischspirale 86 des oben beschriebenen Typs .gemischt. Die sich dabei ergebende Mischung wird einer Absetzspirale 87 zugeführt, in der das Coombs-Seruts eine Agglutination der Zellen bewirkt. Diese Zellen setzen sich ab, wie dies auch die Zellen in den Spiralen 59» 69 und 70 taten. Die agglutinierten Zellen werden bei 88 mittels der Pumpe 154 über eine Leitung 119 zu einem Behälter 76 abgeführt und die dissoziierten Zellen werden dekantiert. Diese dekantierten Zollen werden in den Vorrichtungsteilen 89, 90

00III3/U40

A 38 15ο b

Τ ** 2θΤβ942

und 153 einem weiteren Absetz- und Dekantiervorgang unterworfen. Ee ist aber auch möglich, eine vollständige Coombs-Reaktion mit nur einem Absetzvorgang zu erreichen. Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel werden jedoch zwei aufeinanderfolgende Absetzvorgänge dargestellt, die üblicherweise auch in der Praxis vorgesehen werden, um die Zuverlässigkeit des Tests su erhöh· n. Die dissoziierten Zellen können nun einzeln in der Vorrichtung 91 gezählt werden, wie dies vorstehend in , Verbindung mit Fig. 3 beschrieben wurde. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß vor einer Dekantierung die dissoziier- | ten Zellen gefiltert und gemessen werden, wie dies ebenfalls anhand der Fig. 3 beschrieben wurde.

Bei einer Ausführungsform werden die dissoziierten Zellen hämolysiert. Das Hämolysierungsmittel wird bei 92 durch eine Armatur 93 eingepumpt, und zwar so, daß eine maximale Turbulenz bei der Durchmischung mit dsm Hämolysierungsmittel eintritt. Die Hamolysierung wird anschließend in einer horizontalen Mischspirale 94 des vorstehend beschriebenen Typs aufrechterhalten» Die hämolysierten Zellen werden weiterhin durch Luftblasen voneinander getrennt. Diese Luftblasen werden durch die Vorrichtung 95 entfernt, die aus einer T-förmigen Armatur mit verkleinerter Öffnung in Kombination mit einer Ar- f natur 96 mit verkleinerter Öffnung besteht. Die Armatur 95 ist so angeordnet-, daß der· Balken des "T" senkrecht verläuft. Wenn eine der Luftblasen nun die Verzweigmg dieses ¹¹T" durchläuft, dann steigt die Luftblase durch den^enkre#a¹ifen nach oben und trägt nur eine vernachlässigbare Flüssigkeitsnenge mit sich, die aus der Absetzspirale eindringt. Jede Flüssig-

, .. senkrechten

keit, die durch diesen Balken nach oben steigt, wird unter leichtem Pumpendruck durch die Armatur 96 mittels der Pumpe abgepumpt, während die Luft durch die verkleinerte Öffnung der Armatur 96 entweichen kann. Die hämolysierten Zellen werden bei 98 - weiteigepumpt, um den inneren V/iderstand des Röhren-

0098.83/1440' bad original

A38 15o b k - 71

systems zu überwinden und über die h-förmige Armatur 99 den Impulsünterdrücker 100 und die Pumpe 101 werden neue Luftblasen eingeführt. Die Einführung von Luft an diesem Punkt ist erforderlich, um die Blutproben zu trennen, bis sie an das Kolorimeter gelangen, wo die Luftblasen erneut mittels der Armatur 104 und der Pumpe 103 entfernt werden. Diese Lösung aus hämolysierten Zellen,' die durch Luftblasen in einzelne Proben aufgeteilt ist, wird bei 102 gemischt, um eine "einheitliche Mischung zu erreichen, wie sie der Durchflußröhre in einem Kolorimeter des Typs zugeführt wird, wie es in den USA-Patentschriften 3 427 135 und 3 031 917 beschrieben ist. Dieses Kolorimeter, welches die optische Dichte des Hämolysats mißt, ist aus einer Durchflußröhre 107, einer Lichtquelle 108 und einem Fotodetektor 109 zusammengesetzt. Die Ergebnisse des kolorimetrischen Tests werden mittels eines Streifenblattschreibers 106 des Typs gezeichnet, der ebenfalls in der USA-Patentschrift 3 031 917_f die bereits oben erwähnt wurde, beschrieben ist.

Bei einer Ausführungsform der erfindungsgecäßen Vorrichtung bestanden die Absetzspiralen 59, 69, 70, 87 und 89 aus 2 1/2 Windungen von 2,0 mm starken Röhren, wobei jede der Spiralen einen Durchmesser von etwa 60 cm besaß« Die Mischspiralen 47, 50, 58, 67, 68, 86, 94 und 102 bestanden aus einer Anzahl von Windungen aus 2,0 mm starken Röhren, wobei jede Windung einen ungefähren Durchmesser von 3 cm aufwies.

Die in die erfindungsgemäße Vorrichtung geiräß Fig. 4 eingeführten Ausgangsstoffe sind in Fig. 5a für den direkten Coombs-Test und in Fig. 5b für den indirekten Coombs-Test aufgezeichnet. In Fig. 5a ist eine Scheibe 110 dargestellt, die Abteilungen aufweist, die unbedeckte rote Blutkörperchen C₁, antikörperbedeckte rote Blutkörperchen Cg und Waschlösung W enthalten. Es versteht sich., daß die Waschlösung nicht innerhalb

009883/1U0

A 38 150 b

der Abteilungen der Scheibe 110 enthalten sein muß, sondern aus einem Waschbad in der Nähe dieser Scheibe erhalten werden kann. Die Waschlösungen sind in einzelnen Abteilungen der Scheibe 110 vorgesehen, damit die richtige zeitliche Aufeinanderfolge der Arbeitsgänge einfach verstanden werden kann. Die Vorrichtung 40 in Fig. 4 prüft jede dieser Substanzen in der Reihenfolge, die im oberen Teil der Säule unterhalb der Scheibe gezeigt ist. Zuerst werden unbedeckte Blutzellen.in die Vorrichtung eingeführt. Ihnen folgt die Waschlösung und eine weitere Serie von unbedeckten Blutzellen. Die unbedeckten Blutzellen dienen zur Ermittlung einer Grundlinie, gegenüber welcher sich die bedeckten Blutkörperchen unterscheiden. Nachdem eine Serie von unbedeckten roten Blutkörperchen getrennt durch Waschlösung das System durchlaufen hat, wird eine weitere Waschlösung eingeführt und Zellen, die auf ihre Antikörperbedeckung geprüft werden sollen, werden dann dem System zugeführt. Jede dieser Proben wird dann durch eine Anzahl von luftblasen getrennt. Die Zuführung der Luft ist bei 111 angedeutet. Auf diese Weise kann jede der Proben in 20 und mehr einzelne Teile aufgeteilt werden, und zwar in Abhängigkeit der Frequenz der Luftblasenpumpe. Diese getrennten Proben passieren die erfindungsgemäße Vorrichtung und erreichen den Punkt, an dem das Coombs-Serum oder die Salzlösung eingeführt wird. An diesem Punkt wird mittels des in der Vorrichtung 79 in Fig. 4 erzeugten Ventilsteuerprogramms die geeignete Substanz zugeführt. Diese Zeitsteuerung, ist durch Pfeile am unteren Ende der Säule angedeutet. Die Ergebnisse der Einführung der Proben in dieser Reihenfolge sind in dem Streifenblattdiagramm am unteren Ende der Fig. 5a gezeigt. Zn diesem Diagramm ist sowohl die Richtung der optischen Dichte aufgezeichnet als auch die Richtung der Bewegung des Streifenblattee. Die Linie 113 repräsentiert die optische Dichte dee Materials ₍ da· «ich bti 105 durch da8 Kolorimeter bewegt. Men erkennt, daö die unbedeokten roten Blutkörperchen,

009Ü3/1U0

£ 38 ^o b

die mit C₁ bezeichnet sind, eine bestimmte optische Dichte besitzen. Der Grund dafür besteht darin, daß die unbedeckten Zellen in Anwesenheit von Coorabs-Serum nur schwach oder gar nicht klumpen. Somit verbleibt eine große Anzahl dissoziierter Zellen in der Restlösung und wird dort häüolysiert. Wenn diese Zellen hämolysiert werden, klumpen sie stark, so daß sie verhältnismäßig undurchsichtig bzw. dicht sind. Wenn die Waschlösung durch das Kolorimeter geführt wird, schwirren in ihr notwendigerweise einige rote Blutkörperchen. Diese roten Blutkörperchen führen nach ihrer Hämolysierung, wenn sie durch das Kolorimeter laufen, zu der auf dem Streifenblatt aufgezeichneten Dichte. Da weniger Zellen in der Waschlösung sind, ist die optische Dichte der Waachlösung geringer als die Dichte der unbedeckten roten Blutkörperchen. Wenn dagegen rote Blutkörperchen, die eine Schicht von komplementären Antigenen und Antikörpern aufweisen, mit dem Cooirbs-Serum zur Reaktion gebracht werden, dann erfolgt eine Agglutination einer großen Anzahl dieser Zellen und diese werden abgesaugt. Dies führt zu einer relativ schwachen Konzentration von Zellen in der verbleibenden Restlösung, die hänolysiert wird. Bei der Hämolysierung dieser relativ wenigen Zellen und bei deren Durchführung durch das Kolorimeter i3t die optische Dichte, die bei C₂ dargestellt ist, gering.

Der gleiche Reaktionstyp ist für den indirekten Coonbs-Test dargestellt. Auf der Scheibe 114 sind jedoch zusätzlich zu dem Serum ohne Antikörper S₁, dam Serum nit Antikörpern Sp und der Waschlösung W Zellen mit einem bekannten Antigen angeordnet. Diese Zellen alnd alt des Besugazeichen .IA bezeichnet. Sowohl dia WaschlÖBung W als auch die bekannten Zellen KA helfen bei alner Verminderung der Varachsutzung air.er Serumprobe durch eine andere. Wie dies vorstehend beschrieben wurde, warden Serum und Zellen alt bekannten Antiganen nltalnand-er eur Rtaktion gefracht, ua> feateuateilen, ob daa

BAD

00*113/1440

Serum einen Antikörper enthält, der zu dem bekannten Antigen ■ komplementär ist. Zellen mit diesem bekannten Antigen werden bei 115 eingeführt. Proben, die S₁ + KA, W + KA, W + KA, KA + KA, W + KA und S₂ +KA enthalten, sind in der Säule unterhalb der Scheibe 114 angezeigt. Die Luft wird diesen Proben bei 116 zugeführt. Diese Proben sind bei dem dargestellten Auaführungsbeispiel jeweils durch zwei Luftblasen getrennt, Jede Probe ist also mit anderen Worten in zwei Proben der gleichen Substanz aufgeteilt. Es versteht sich, daß die Proben in eine beliebige Anzahl von Einzelproben aufgeteilt' werden können. Das Zeitdiagramm für die Einführung des Cootcbs-Serum und der Salzlösung ist auf der rechten Seite dieser Säule gezeigt. Die Ergebnisse, die erzielt werden, wenn die vorgenannten Proben die erfindungsgenäße Vorrichtung durchlaufen, sind auf dem Streifenblatt 117 aufgezeichnet, wobei die optische Dichte und die Bewegungsrichtung ebenfalls vermerkt sind. Die optische Dichte für die einzelnen Komponenten wird durch den Linienzug 118 verdeutlicht.

Es versteht sich, daß wenn z.B. jede der Proben in fünf Einzelproben aufgeteilt wird, der Verlust einer dieser Proben aufgrund einer wegen Verschmutzung unrichtigen Reaktion die Messung nicht entscheidend beeinträchtigen könnte. Der Grund dafür liegt in der Tatsache, daß die Luftblasen entfernt werden, ehe die Proben in das Kolorimeter eintreten. Die Entfernung der Luftblasen zwischen den oben erwähnten fünf Proben bewirkt eine Hittelwertbildung, wenn die Geschwindigkeit des Streifenblattes klein gehalten wird. Die optische Dichte der verlorenen Probe hat bei Addition zu den optischen Dichten der anderen vier Proben nur geringen Einfluß auf die Gesamtmessung. Das Serum ohne komplementäre Antikörper erzeugt die optische Dichte, die bei S₁ aufgezeigt ist. Dieses Niveau bildet die oben erwähnte Grundlinie für den indirekten Coeabs-Test und ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß keine Coombs-

. . · COPY

009883/HiO _BADOr,q,_Nal ' '

_A38 15o b

25.5.1970 si 2026942

Reaktion eintritt. Eine große Anzahl von dissoziierten Zellen wird an diesem Punkt erzeugt, da keine Agglutination eintritt. Die Waschlösung, die bei W der Probe S-j auf dem Streifenblatt folgt, ist durch rote BlutkÖrpercher auo der nachfolgenden KA + ΚΑ-Probe verschmutzt. Biese zusätzlichen roten Blutkörperchen addieren sich zu der optischen Dichte, während die Waschlösunp durch das Kolorimeter hindurchläuft. Die KA + ΚΑ-Proben, die keine Antikörperbedeckung besitzen und in denen kein verdünnendes Serum enthalten ist, zeigen eine sehr hohe optische Dichte. Die Höhe der optischen Dichte bei diesen KA + ΚΑ-Proben kann ebenfalls zur Eichung einer Grundlinie für den indirekten Coombs-Test verwendet werden. Bei Sp tritt wegen einer starken Coombs-Reaktion eine starke Überschreitung der Grundlinie auf. Die starke Reaktion ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die komplementären Antikörper in dem Serum S₂ die Zellen der KA-Prcbe bedeckt haben und daß eine starke Agglutination eingetreten ist. Nahezu sämtliche rote Blutkörperchen sind darum abgezogen worden und nur wenige dissoziierte Zellen wurden hämolysiert und in dem Kolorimeter gemessen.

Die Proben KA mit dem bekannten Antigen dienen gleichfalls zur Absorption von Restserum, das an den Wandungen der Röhren der erfindungsgesäßen Vorrichtung haften bleiben könnte. Auf diese Weise bewirken die ΚΑ-Proben in Kombination mit der Waschlösung eine Reinigung der Vorrichtung und reduzieren damit die Verschmutzung einer Probe durch die vorhergehende.

In Pig. 4 ist eine Absetzspirale "!20 dargestellt, die so orientiert ist, daß ihre Achse 131 parallel zu den Feldlinien des Örtlichen Gravitationsfeldes verläuft. Es ist dargestellt, wie eine Serum-Zellen-Mischung 122 von rechts in die Spirale eintritt. Diese Mischung ist unverdünnt und relativ dicht. Der Druck, der erforderlich ist, um in diese Probe Waschlösung

BAD Original

009883/U40

A 38 15o b

einzuführen, ist mit P_g bezeichnet. Während diese Probe in die erweiterte Kammer 123 der kammerförmigen Armatur 124 eindringt, wird kontinuierlich mit einem Druck Py durch die Röhre 125 Waschlösung nach oben in die Kammer 123 gepumpt, wo sie sich mit der Blut-Serum-Mischung vermischt. Es versteht sich, daß diese Waschlösung kontinuierlich in die Kammer 123 eingepumpt wird, ohne die als Trennelemente dienenden Luftblasen zu verwirbeln, weil der Purapdruck P,_Ä geringer ist als der Luftdruck P. in der als Trennelement dienenden Luftblase. Die verdünnte Blutprobe 126 wandert langsam weiter * durch die Spirale, wobei sich Klumpen roter Blutkörperchen bilden, die auf die Unterseite der Spiralenwandung absinken. Eine Spirale ist die wirksamste geometrische Form für die Verwendung bei den oben aufgezählten Absetzschritten. Es könnte jedoch ein gerades Rohrstück verwendet werden oder auch eine Röhre beliebiger anderer Form, solange die Unterseite der inneren Oberfläche im wesentlichen senkrecht zu dem örtlichen Gravitationsfeld verläuft.

Die verklumpten roten Blutkörperchen werden nach ihrem Absenken durch die verjüngte Öffnung 127 abgeführt, die von der Unterseite der Innenwand der Spirale 120 abgeht. Kan erkennt aus dieser Figur, daß die Trennung durch Luftblasen in ( der Leitung 127 aufrechterhalten bleibt. Die Restlösung, welche eine Lösung von unspezifischem Eiweiß in schwach ionischer Waschlösung enthält, wird bei 128 unter leichter Sog dekantiert. Der nach innen gerichtete Druck P_B, der sich aus der Druckdifferenz zwischen dem nach vorn gerichteten Pucipdruck Pj₁ und dem leichten Sog ergibt, wird genügend groß gehalten, um zu verhindern, daß die verklumpten Zellen zusammen mit der Restlösung dekantiert werden.

DievWirkung der Absetzspirale ist genau die gleiche, wenn die Reagenzien das Coombs-Serum einerseits und die gewaschenen

009883/1U0

A 38 15o b

* * ⁷¹ οι

25.5.1970 · Jif 2026942

Blutkörperchen andererseits sind. In diesem Pall werden jedoch die agglutinierten Zellen aus dem System entfernt und die dissoziierten Zellen, die sich in der Restlcsucg befinden, werden dekantiert, um gemessen zu werden.

Am oberen Ende dieser Spirale ist eine erweiterte kaismerartige Armatur des in Pig. 7 mit 130 bezeichneten Typs befestigt. Die kammerartige Armatur besitzt einen größeren Durchmesser als die Röhre, die für die Absetzspirale verwendet ist, so daß sichergestellt ist, daß genügend Waschlösung zur Verfügung steht, um die Serum-Zellen-Mischung zu verdünnen. Die kacoerartige Armatur ist im wesentlichen "T^ oder "h^M-förmig und ihre sämtlichen Zugänge sind von der gleichen Sröße. Eine derartige Armatur wird immer dann benutzt, wenn eine groSe Menge von Lösungsmittel gebraucht wird, um ein gegebenes Volumen eines löslichen Materials zu verdünnen. «

Pig. 8 zeigt eine vergrößerte Darstellung eines Tropfrohrs gemäß Fig. 4. Diese Armatur ist senkrecht angeordnet, wie dies die Zeichnung zeigt, so daß das Blut das Serum 140 unter der Wirkung der Schwerkraft durch die horizontale Zuleitung 141 hineinfließen und dann abwärts zu der verjüngten Öffnung 142, die innerhalb des äußeren Mantels 143 vorgesehen ist. Da das Blut oder Serum eine endliche Strecke abtropfen nuß, ehe es auf Luft trifft, ist mit dieser Vorrichtung eine weitere Trennung zwischen der Probe 142 und der unmittelbar- darauf folgenden Probe möglich.-

Die in den Pig. 7 und 8 dargestellten Armaturen erhöhen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wesentlich. Obwohl auch ohne diese Armaturen gearbeitet werden kann, ist es wünschenswert, sie bei der Trennung durch Luftblasen und bei den Waechoperationen zu benutzen, wenn eine grcSe Anzahl von Proben mit hoher Geschwindigkeit getestet werden soll.

009883/1U0

A 38 15o b

k -71 ^

25.5.1970 -*ί>- 2026942

Fig. 9 zeigt, daß die Wirksamkeit des unter den Einfluß der Schwerkraft stattfindenden Absetzvorgangs vergrößert werden kann, wenn man die Mischung aus Waschlösung und bedeckten Zellen einem elektrostatischen Feld aussetzt. Da die roten Blutkörperchen insgesamt eine negative Ladung aufweisen, kann die Präzipitation verstärkt werden, wenn man diese Zellen einen geeignet polarisierten elektrostatischer. Feld aussetzt. Darüber hinaus wird eine salzhaltige Y.'aschlösurg anstelle der schwach ionischen Lösung verwendet, die bei dec unter den: Einfluß der Schwerkraft stattfindenden Absetzvorgang Anwendung fand. Ein Querschnitt durch eine "schlanger.förnige" Röhre ist bei 150 gezeigte, 2s versteht sich jedoch, da3 jede Art von geschlossenem Behälter benutzt werden kann, us die Mischung von V/aschlösung, Serum und Zellen aufzunehmen, solange ein Fließen der Proben und ihre Trennung aufrechterhalten werden kann. Diese flache Schlangenröhre ist in des Ausfünrurgsbeispiel zwischen zwei flachen, im Querschnitt gezeigten Elektroden 152 und 153 angeordnet. Die untere Elektrode erhält eine positive Ladung und die obere Elektrode eine negative Ladung aus einer Gleichstromquelle 156. Die Ladungen auf diesen beiden Platten erzeugen ein elektrisches Feld, welches auf die negativ geladenen roten Blutkörperchen wirkt und sie nach unten zu bewegen sucht, während diese Zellen den Baus zwischen den Elektroden passieren. Die verklucpten Zellen, die schematisch bei 155 angedeutet sind, werden in der vorstehend erläuterten Weise mittels eir.er Dekantierarcatur, die bei 157 schenatisch dargestellt ist, abgezogen. Wie bei dem Absetzverfahren unter Ausnutzung der Schwerkraft wird die Restlösung bei 154 unter leichtem Sog dekartiert.

Elektrostatische Felder können sowohl während der Wsscczyklen als auch bei der Coombs-Reaktion bei der in Fig. 4 dargestellten, erfinäungsgecäßen Vorrichtung verwendet werden. Bei Einführung elektrostatischer Felder kann die Grc2e der Afcεetzspiralen verringert werden und die Anzahl der Wascfczyklen kann verkleinert werden.

009883/1440

BAD ORfGINAL

Claims

A 38 150 b

Patentansprüche ι

Verfahren zur Durchführung von Blutuntersuchungen, bei des rote Blutkörperchen in einem Waschvorgang von vorgegebenen Substanzen, insbesondere von unspezifischem Eiweiß, befreit werden, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen mit einer Waschlösung gemischt und darin zum Klumpen gebracht werden, und daß die gewaschenen, verklumpten roten Blutkörperchen anschließend von einer verbleibenden Restlösung getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung von gewaschenen,, miteinander verklumpten roten Blutkörperchen und Restlösung durch Absetzenlassen der roten Blutkörperchen und Dekantieren der Restlösung vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2„ dadurch gekennzeichnet, daß das Absetzenlassen in einem geschlossenen Durchlaufsystem durchgeführt wird«.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3₉ dadurch gekennzeichnet, daß das Absetzenlassen unter der Wirkung der Schwerkraft erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,, daß eine Wsschic'sung verwendet wird, welche der. negativen Ladung auf den roten Blutkörperchen, die normalerweise bewirkt, daS diese sich gegenseitig abstoßen, in der Weise entgegenwirkt, daß ein Verklumpen der roten Blutkörperchen eintritt. ' ·

-37-

BAD ORIGINAL

009883/UAO

A 38 150 b f
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine schwach ionische Waschlösung verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine schwach elektrolytische Waschlösung verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Waschlösung mit niedrigem pH-Wert verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Waschlösung verwendet wird, welche die vorgegebenen Substanzen von den roten Blutkörperchen ablöst, ohne die elektrischen Ladungen der roten Blutkörperchen zu verändern, und daß die Mischung aus roten Blutkörperchen und Waschlösung einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, das so polarisiert ist, daß eine Präzipitaticn der roten Blutkörperchen eintritt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gewaschenen roten Blutkörperchen zur Peststellung des Vorliegens und gegebenenfalls des Umfangs einer Beschichtung derselben mit vorgegebenen Antigenen mit Antihumanglobulin gemischt werden.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor decs Waschvorgang rote Blutkörperchen aus dem Blut eines Säugetiers und Serum aus dem Blut eines anderen Säugetiers miteinander zu einer Serum-Zellen-Mischung gemischt werden, daß diese Serum-Zellen-Mischung in einen Inkubator eingebracht und solange dort gelassen wird, bis eine Antigen-Antikör- ^per-Reaktion abgeschlossen ist, und daß die Serun-Zellen-Mischung anschließend gewaschen wird, und däß die durch

009883/U40 ■ " · bad griginau

A 38 150 b

den Waschvorgang erhaltenen gewaschenen» verkluinpten roten Blutkörperchen zur Bestimmung der Austauschbarkeit des Blutes des einen Säugetiers mit dem des anderen mit Antihumanglobulin gemischt werden, wobei das Eintreten einer über ein gewisses Maß hinausgehenden Agglutination anzeigt, daß keine Austauschbarkeit gegeben ist„
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die durch den Waschvorgang aus der Serura-Zellen-Kischung erhaltenen gewaschenen, verklumpten roten Blukörperchen zur Peststellung des Yorliegens und gegebenenfalls der Stärke einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit Antihumanglobulin gemischt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die in der das Antihumanglobulin enthaltenden Mischung agglitunierten roten Blutkörperchen von den in der Restlösung verbleibenden dissoziierten roten Blutkörperchen in einem zweiten Trennvorgang getrennt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung in einem zweiten Absetzvorgang wie beim Waschvorgang durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an den zweiten Absetzvorgang die Menge der agglutinierten .oder der dissoziierten roten Blutkörperchen ermittelt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ermittlung der Menge der in der Restlösung befindlichen dissoziierten roten Blutkörperchen in der Weise erfolgt, daß die Restlösung mit einem Hämolysator gemischt wird₉ und daß die optische Dichte des so gebildeten Häctolysats gemessen wird. -.^q«.

009883/mO

A 38 150 b
k - 71
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ermittlung der Menge der in der Restlösung befindlichen dissoziierten roten Blutkörperchen durch elektronische Zählung erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Ergebnisse der elektronischen Zählung graphisch aufgezeichnet werden.
19'. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ermittlung der Menge der in der Restlösung befind- " liehen dissoziierten roten Blutkörperchen in der Weise erfolgt, daß die Restlösung auf ein Material gegeben wird, das geeignet ist, die Anwesenheit von dissoziierten roten Blutkörperchen anzuzeigen.
I¹O. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß hypertonisches Antiglobulin verwendet wird.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der verangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der WaschVorgang mindestens zweimal durchgeführt wird. λ
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Waschvorgang so oft wiederholt wird, bis bei der Durchführung des zweiten Absetzvorgangs bei nehreren gleich großen Teilproben der gleichen Blutprobe jeweils im wesentlichen die gleiche Anzahl von agglutinierten und dissoziierten roten Blutkörperchen erhalten wird.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die die roten Blutkörperchen und die Waschlösung enthaltende

■ -40-

0 0 9 8 8 3 / U 4 0 ^BAD'^0R!GiNÄL

A 38 150 b -

Mischung als auch die die gewaschenen roten Blutkörperchen und das Antihumanglobulin enthaltende Mischung in einem Durchlaufsystem geführt werden, das zumindest eine aus einem Rohr gebogene Absetzspirale enthält, deren Achse kollinear zum örtlichen Feld der Schwerkraft verläuft, und daß die Trennung der verklumpten roten Blutkörperchen aus der Restlösung durch Absetzenlassen der roten Blutkörperchen in den Absetzspiralen und Dekantieren der Restlösung erfolgt.
24. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für den Waschvorgang eine Mischvorrichtung (z.B. 55, 58) und eine Absetzvorrichtung (z.B. 59, 60) mit je einem Einlaß und einem Auslaß vorgesehen sind, daß der Einlaß der Absetzvorrichtung (59» 60) mit dem Auslaß der Mischvorrichtung (55, 58) verbunden ist, wobei jedesmal, wenn ein Volumen von roten Blutkörperchen, die gewaschen werden sollen, und ein Volumen der Waschlösung unter Druck an der Einlaßseite der Mischvorrichtung (55, 58) eingeführt werden, eine verdünnte Mischung entsteht, die eine Anzahl von zusammengeklumpten roten Blutkörperchen enthält, was auf die Wirkung der Waschlösung zurückzuführen ist, und zwar am Auslaß der Mischvorrichtung, und diese verdünnte Mischung anschließend in die Absetzvorrichtung eintritt, in welcher diese roten Blutkörperchen, die sich in Gegenwart der Waschlösung miteinander verklumpt haben, sich am Boden dieser verdünnten Mischung absetzen und eine Restlösung entstehen lassen, die aus der Waschlösung und den darin gelösten, vorgegebenen Substanzen besteht, und daß an der Absetzvorrichtung Einrichtungen zum Entfernen der Restlcsung vorgesehen sind, so daß am Auslaß der Absetzvorrichturig die gewaschenen roten Blutkörperchen zur Verfügung stehen.

-41-

009883AUtO bad o_R,e,NAL

A 38 15Ob - 41-
25. Vorrichtung nach Anspruch 24» dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung weiterer Waschvorgänge weitere Mischvorrichtungen (65, 67; 66, 68) und Absetzvorrichtungen (69, 71; 70, 72) vorgesehen sind, wobei der Einlaß der zweiten Mischvorrichtung (67, 69) am Auslaß der ersten Absetzvorrichtung (59» 60) liegt usw.
26. Vorrichtung nach Anspruch 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischvorrichtung (58, 59) eine aus einem Rohr gebogene Mischspirale (58) mit mehreren Windungen enthält.
27. Vorrichtung nach Anspruch 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Absetzvorrichtung (59» 60) eine aus einem Rohr gebogene Absetzspirale (59) mit mehreren Windungen enthält.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Absetzspirale (59) aus dem gleichen Rohr wie die Kischspirale (58) gefertigt und größer als diese ist.
29. Vorrichtung nach Anspruch 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Absetzspirale (59) so angeordnet ist, da3 ihre einzelnen Windungen in im Abstand voneinander liegenden horizontalen Ebenen verlaufen.
30. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischverrichtung eine mit ihrem Auslaß am Einlaß der Kisccspirale liegende, kammerförmige Armatur (Fig. 7) enthält, deren innere Kammer zwischen einem ersten Einlaß und einem Auslaß liegt, und die einen zweiten Einlaß in der geometrischen Mitte der Kammer aufweist, wobei der erste Einlaß der Zuführung der roten Blutkörperchen und der zweite der Zuführung der Waschlösung dient, und da3 der Innendurchmesser der inneren Kammer größer ist als der Innendurchmesser der Mischspirale. " -42-

009883/1440 BADORIGiNAL

A 38 150 b - 42-

25.5.1970 2026942
31· Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Absetzvorrichtung eine dem Dekantieren dienende Armatur (60) enthält, die ein Gehäuse mit einem inneren Kanal besitzt, der den gleichen Innendurchmesser aufweist wie die Absetzspirale (59) und von dem eine nach unten gerichtete Abzweigung geringeren "Hunhmessers abzweigt, die zur Außenseite des Gehäuses führt.
32. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vorratsbehälter für die Waschlösung vorgesehen ist.
33. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung mehrerer V/aschvorgänge eine Anzahl von Mischvorrichtungen und eine gleiche Anzahl von Absetzvorrichtungen vorgesehen ist, die beginnend mit einer Mischvorrichtung alternierend aufeinanderfolgen, und daß an den Polen einer Gleichspannungsquelle liegende Elektroden vorgesehen sind, die in Bereich der Absetzvorrichtung ein derart gerichtetes Feld erzeugen, daß eine Präzipitation der roten Blutkörperchen eintritt und diese sich sammeln und daß am Auslaß jeder der Absetzvorrichtungen Einrichtungen zur Dekantierung der Restlösung vorgesehen sind, so daß am Ausgang der letzten Absetzvorrichtung mehrfach gewaschene rote Blutkörperchen zur Verfügung stehen.
34. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vorratsbehälter für Antihumanglobulin vorgesehen ist, und daß für die Mischung der gewaschenen Blutkörperchen und des Antihumanglobulins mindestens eine weitere Mischvorrichtung und eine weitere Absetzvorrichtung vorgesehen sind, die

-43-

009883/1440

BAD ORfGlMAL

A 38 15Ob - 43 -

25.5.1970 2026942

jeweils einen Einlaß und einen Auslaß aufweisen, wobei der Einlaß der ersten Absetzvorrichtung mit dem Auslas der ersten Mischvorrichtung verbunden ist, daß Einrichtungen vorgesehen sind, mit deren Hilfe dem Eingang der Mischvorrichtung jeweils ein vorgegebenes Volumen gewaschener Blutzellen, von denen einige mit Antikörpern bedeckt sein kennen, und ein Volucen von Antihumanglobulin aus dem Vorratsbehälter zugeführt werden, und zwar derart, daß ein vergegebenes Volumen der Mischung dieser beiden Substanzen durch die Mischvorrichtung fließt, wobei die roten Blutkörperchen, die bei diesem Kischvorgang sgglu- " tiniert werden, sich in der auf die Mischvorrichtung folgenden Absetzvorrichtung absetzen, wobei ac Ausgang der Absetzvorrichtung eine Restlösung entsteht, die dissoziierte rote Blutkörperchen enthält, und da3 oit den Auslaß der Absetzvorrichtung Einrichtungen verbunden sind, .. UBi die Restlösung abzuziehen und mit einen Hämolysator zu mischen, und daß ferner Vorrichtungen zur optischen Messung der Dichte des Hämolysats vorgesehen sind, welche ein Maß für die Stärke der Antigen-Antikcrper-Reakticn ist.
35· Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur aufeinander- ä folgenden automatischen Untersuchung nehrerer Blutproben diese automatisch von einem Vorbereitur.gsplatz (-0) in das System eingeführt werden.
36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (44, <*5) vorgesehen ist, weiche

/ · zur χInnung¹QeT einzelnen Blutproben in dss System einführt.
37. Vorrichtung nach Anspruch 35 und 36, dadurch gekennzeichnet, naß eine Steuerung vorgesehen ist, welche ge-

009883/IUO'

BAD ORIGINAL

A 38 150 b - 44 -

25.5.1970 2026942

währleistet, daß die einzelnen Arbeitsschritte bei jeder Blutprobe zu vorgegebenen Zeitpunkten durchgeführt werden.
38. Vorrichtung nach Anspruch 36» dadurch gekennzeichnet, dass das reaktionsträge Medium Luft ist.
39. Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktionsträge Medium eine Flüssigkeit ist.

l|o. Vorrichtung nach Anspruch 38₉ dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (U**,*I5) zur Einführung von Luft in Form trennender Gasblasen ein Tropfrohr (4*4; Fig.8) nit einer senkrecht orientierten inneren Kammer enthält, der an ihrem oberen Ende von der Seite die in Einzelproben zu trennende Flüssigkeit und an ihrem unteren Ende von unten über einen Einlass mit gegenüber dem Kammerdurchmesser verkleinerten Durchmesser Luft zugeführt wird.

BAD ORIGINAL

009883/ IUO