DE1802671A1 - Verfahren und Vorrichtung zur selbsttaetigen Bestimmung der osmotischen Resistenz roter Blutkoerperchen - Google Patents

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Verfahren und Vorrichtung zur selbsttätigen Bestimmung der osmotischen Resistenz roter Blutkörperchen

Wenn rote Blutkörperchen in isotonischer Kochsalslösung suspendiert werden, bleibt ihre Forst unverändert. Wenn sie aber in einer Kochsalzlösung von ständig abnehmender Salzkonzentration suspendiert werden, nehmen die roten Blutkörperchen allmählich kugelförmige Gestalt an und zerbersten sohliesslich, wobei sie das lösliche rote Pigment Hämoglobin freigeben und selbet zu durchsichtigen Hüllen werden. Diese Erscheinung, die als Hämolyse bezeichnet wird, besteht in der freigäbe des Hämoglobins der roten Blutkörperchen an das suspendierende Medium und ist eine Folge des osmotisohen Druckes, der sich im Inneren der Membran des roten Blutkörperchens entwickelt. Die Messung der osmotisohen Resistenz ist von Danen und Mitarbeitern in "Transfusion¹¹, Band 4

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(1964), Seite 339, als Routinetest für Blutbanken vorgeschlagen worden, und Valerie land Mitarbeiter haben in "Transfusion", Band 5 (19655» Seite 267, die Beziehung zwischen der osrnotisehen Resistenz und dem Überleben dee Blutes in vivo aufgezeigt. Der "Gesundheitszustand" von roten Blutkörperchen kann daher bestimmt werden, indem man ihre osmotisohe Resistenz beobachtet. Ursprünglich wurde dieser lest in einer Reihe von Reagenzgläsern durchgeführt, von denen jedes das gleiche Volumen an Kochsalzlösung von fortschreitend niedrigerer Konzentration enthielt, wobei jeden Reagenzglas die gleiche Menge'rote Blutkörperchen zugesetzt wurde· Dann wurde die Hämolyse beobachtet, die in Jedem Reagenzglas stattfand. In "Journal of Clinical Pathology", Band 16 (1963), Seite 377* hat Danon einem fmt beschrieben, bei des die Verminderung der Salzkonzentration durch Dialyse eines gegebenen Volumens einer Blutsuspension in isotonisoher Kochsalzlösung gegen destilliertes Wasser hervorgerufen wurde. Bei dem Danon'sehen Test wird eine bestimmte Verdünnung von ganzem Blut in isotonischer Kochsalzlösung in eine Zelle eingegeben, die zwei Wände aus Dialysiermembran aufweist. Diese Behälterzelle wird dann in einen durchsichtigen Benälter mit planparallelen Wänden eingesetzt, der mit destilliertem Wasser gefüllt ist, und dieser Behälter wird seinerseits in ein Gerät eingesetzt, das im wesentlichen aus eines] Kolorimeter und einem Registriergerät besteht. Die Messung des

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Grades der stattfindenden Hämolyae beruht auf der zunehmenden Lichtdurchlässigkait der Suspension mit fortschreitender Häfflolyse. Diese zunehmende Liohtdurohlässigkeit wird als funktion der Zeit verzeiohnet.

Dl· bei den erfindungsgemäseen Verfahren verwendete Vorrichtung enthält vier grundlegende Gruppen von Bestandteilen: (a) die notwendigen Rohrverbindungen, um eine Kochsalzlösung alt den erforderlichen Konzentrationegefälle zu erhalten, Cb) einen elektronischen Stromkreis, um erforderlichenfalls die abgeleitete funktion der Summenkurve zu berechnen,

(c) einen Programmgeber, um für jede Probe ganzen Blutes selbsttätig und nacheinander eine frische Salzlösung von fortschreitend sinkender Konzentration herzustellen, und

(d) elektrische Verbindungen für ein Kolorimeter, einen oder zwei Registrierkanäle, einen Probenehmer, eine Dosierpumpe, und hydraulische Verbindungen, wie nachstehend beschrieben.

Es wird ein Strom einer Kochsalzlösung von ständig abnehmender Salzkonzentration hergestellt, mit dem die roten Blutkörperchen gemischt werden. Durch Bestimmen der Lichtdurchlässigkeit der Suspension der roten Blutkörperchen kann man den Grad der stattfindenden Hämolyse messen. Bei der nachstehend beschriebenen Ausführungsforia wird das Blut im Verhältnis 25:1 mit der Kochsalzlösung von fortschreitend ab-

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nehmender Konzentration verdünnt. Die anfängliche Konzentration der Salzlösung beträgt 0,8 #, so dass die durch das Kolorimeter strömenden suspendierten roten Blutkörperchen einen nahezu undurchsichtigen Strom» bilden β Venn die Salz* konzentration der Kochsalzlösung sich 0,4 # annähert, nimmt die Anzahl der intakten roten Blutkörperchen rasch ab, und der Strom wird für rotes Licht (Wellenlänge 600 πιμ) durchlässiger. Bei noch niedrigeren Salzkonzentrationen zerber- sten die meisten roten Blutkörperchen, und die Lichtdurclilässigkeit nähert sich einem stetigen Zustand an. Ein Diagramm der Abhängigkeit der prozentualen Lichtdurohläesigkeit der Suspension von roten Blutkörperchen von der Salzkonzentration der Kochsalzlösung ergibt die Kurve 200 in Figo 5« Der Wendepunkt 201 dieser Kurve stellt den Punkt der maximalen Hämolysegeschwindigkeit der roten Blutkörperchen dar. Wie nachstehend erläutert, lässt sich dieser funkt viel genauer feststellen, wenn man die Kurve der abgeleiteten Punktion herstellt und untersucht.

Dadurch, dass das erfindungsgemässe Verfahren eine Kochsalzlösung von ständig abnehmender Salzkonzentration verwendet, in die die roten Blutkörperchen eingeführt werden, wird erreicht, dass ein einzelnes Blutkörperchen nur einer einzigen Salzkonzentration ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu bisher bekannten Verfahren, bei denen jedes gegebene Blut-

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körperchen in seiner Vergangenheit einen ständig abnehmenden Tonus ausgesetzt wurde, da jedes Blutkörperchen mit dem Tollen Bereich der Salzkonzentration in Berührung kam. Bei dem vorliegenden Verfahren gibt es keinen "Vergangenheits"-Effekt, weil jedes gegebene Blutkörperchen nur einer einzigen Salzkonzentration ausgesetzt wird, und zwar der Konzentration, die die Salzlösung beim Vermischen mit dem betreffenden Blutkörperchen aufweist. Hierdurch wird es möglich, die Wirkung andere? Stoffe auf die osmotische Resistenz roter Blutkörperchen zu bestimmen, was bei den bisher bekannten Methoden nicht möglich war. Zum Beispiel kann man die Wirkung von Saponiu oder anderen Stoffen auf die Zellenhämolyse bestimmen* indem man Blut kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 0,10 ml/Min, aus einem mit Rührer versehenen Gefass, statt aus einer Probenahmevorrichtung, herauspumpt und gleichzeitig Saponin oder den sonstigen Stoff mit der gleichen Geschwindigkeit aus dem Probenehmer pumpt. Das Blut und das Saponin treten an derselben Stelle in den Ström der Kochsalzlösung von ständig abnehmender Konzentration ein, so dass die Wirkung des Saponine oder des betreffenden sonstigen Stoffes auf die Zellenhämolyse bestimmt werden kann. Bei Anwendung zusammen mit einem Probenehmer gestattet dieses Verfahren auch die Bestimmung der osmotischen Resistenz einer Reihe von Blutproben, wobei die Be-

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Stimmungen selbsttätig und nacheinander durchgeführt werden·

Zur weiteren Erläuterung der Erfindimg wird auf die Zeichnungen Bezug genommen.

Fig. 1 ist eine scliematische Sarstellung der Anordnung der Vorrichtung und der Strömung der Flüssigkeiten bei. der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

2 zeigt die Einzelheiten eines Stromkreisdiagramms desjenigen Teiles des Programmgebers und Rechners, der zum Berechnen der abgeleiteten Funktion der BtusmenkurYe verwendet wird ο

Figo 3 ist ein Strciakreis&iagraiBi clea Programiogeberteiles der Vorrichtung*

Fig» 4 zeigt in schematischer Barstellung Einzelheiten einer f Vorrichtung zur Herstellung der KoehsalslösiHig von ständig abnehmender Konzentration.

Figo 5 zeigt im Ma.graMa die AMisagigkeit der Melitdurehlässigkeit einer Susp@:ision von roten Blutkörperchen von dar Salzkonzentration dor Kochsalzlösung.

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Pig. 6 zeigt zwei Kurrenpaare, und zwar ßumaankurven \χηά Ableitungskurven.

Figo 7 zeigt vier Kurvenp&are♦ die in einer Temperaturspanne von 35° C aufgenommen sind.

Pig. 8 zeigt vier Kurven, die bei verschiedenen Bndkonzentrationen an roten Blutkörperchen erhalten worden sind.

Die in fig. 1 dargestellte Torrichtung 10 zur Bestimmung der oemotiechen Resistenz roter Blutkörperchen nach dem er-» findungsgemäasen Terfahren enthält einen Probenehmer 20, in den die su untersuchenden und anschlieseend nacheinander Bit der Kochsalzlösung von fortschreitend abnehmender SaIskonzentration zu mischenden und in dem Kolorimeter 100 auf die Lichtdurchlässigkeit der Suspension roter Blutkörperchen zu untersuchenden Blutproben eingebracht werden, ein System 40 zur Herstellung einer Kochsalzlösung von fortschreitend abnehmender Konzentration, das im einzelnen in Pig. 4 dargestellt und nachstehend beschrieben ist und aus der Pumpe 41 und den zugehörigen Bohrleitungen 42-52 besteht, die in ihren Grossen so aufeinander abgestimmt sind, dass ein bestimmtem Strömungeverhältnir, zwischen dem einströmenden Wasser und der ausströmenden Kochsalzlösung innegehalten wird, einen Programmgeber 60, der im einzelnen in

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Pig. 3 dargestellt und nachstehend näher beschrieben ist» und der die Ventila für die Herstellung der Kochsalzlösung steuert, eine Anfangslirjie auf dea Registri^rpapier festsetzt, die Betriebsart bestimmt und für die Synchronisierung mit dem ProbeaeJimer sorgt, einen Rechner 80, der «las Signal des Kolcrimeters empfängt, und swei Registriergeräte 110 und 120o Wenn nur eine einzige Summenkurve gewünscht wird, wird das Signal 101 von dem Kolorimeter 100 durch den Rechnerstromkreis SO dem ersten Registriergerät 110 zugeführt. Wenn sowohl eine Summenkurve als auch eine Ableitungskurve aufgenommen werden soll, berechnet der Rechner ' 80 das Signal der abgeleiteten Funktion und führt ee dem zweiten Registriergerät 120 zu. Gewtinschtenfalle kann man auch ein mit zwei Registrierfedern arbeitendes Registriergerät verwenden. Bei der nachstehend beschriebenen Aueführungsform werden genormte Teile, wie Probenehmer» Programmgeber, Kolorimeter und Registriergeräte, verwendet, die von der Technicon Corporation zur Verwendung in Verbindung mit der "Auto Analyzer¹¹-Anlage hergestellt werden.

Bei der Durchführung des Verfahrens wird eine in dem Probenehmer 20 aufbewahrte Blutprobe gemischt und dann durch leitung 48 über die Einmündungestelle 130 in die Kochsalzlösung von etändig abnehmender Salzkonzentration eingeführt, die in dem System 40 hergestellt wird. In dem System 40 geht man

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τοη Kochsalzlösung der höchsten Konzentration, im allgemeinen etwa 0,8 Ms 0,9 j6 Kochsalz, aus und führt diese durch leitung 43 dem KUchgefäss 55 zu. Gleichzeitig wird Wasser durch Leitung 42 in das Hischgefäse 55 eingeleitet und dort ■it der Kochsalzlösung gemischt. Die so erhaltene Lösung -wird durch Leitung 44 abgezogen und gelangt durch die Leitungen 45 und 46 sur Einmündungsstelle 130, wo sie mit den roten Blutkörperchen gemischt wird.. Durch geeignete Wahl der Weiten der Rohrleitungen, durch die das Wasser zugeführt und die Salzlösung abgezogen wird, wird ein geeignetes Konzentrationsgefälle aufrechterhalten, so dass die Salzkonzentration der Kochsalzlösung ständig abnimmt. Die Gesamtmenge aus der anfänglich in das Mischgefäss 55 eingegebenen Kochsalzlösung und dens in jeder Arbeitsperiode hinzugefügten Wasser muss etwas grosser sein als die Menge der je Arbeiteperiode abgezogenen Kochsalzlösung von ständig sinkender Konzentration, da sonst die Arbeiteperiode nur auf eine sehr kleine Konsentrationsänderung beschränkt istο Bei der hier beschriebenen Ausf Uhrungsform werden 10 ml der ursprünglichen Kochsalzlösung in das Hisohgefäss eingegeben, 9 ml Wasser werden je Periode zugesetzt, und 18 al Kochsalzlösung τοη sinkender Konzentration werden abgezogen. Die genauen Mengen sind zwar nicht ausschlaggebend; die Strömungsgeschwindigkeiten dea einströmenden Wassers und der abströmen-

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den Kochsalzlösung müssen jedoch so gewählt und innegehalten werden, dass man das gewünschte Konzentrationegefälle erhält. Nach dem VDr^isehen der roten Blutkörperchen und der Salzlösung an ier Verbindungsstelle 130 der betreffenden Rohrleitungen *ird die Suspension in der Rohrschlange 50 weiter gemischt, wodurch den StroQ eine ausreichende Verweilzeit gegeben wird, damit die Hänolyse bis zu dem gewünschten Grad vor sich, gehen kann, und dann wird die Suspension durch Leitong 49 dem Kolorimeter 100 zugeführt, wo ihre Lichtdurchläs3igkeit bestimmt wird. Gegebenenfalls kann man durch Lei fcung 47 in die Suspension eine geringe Menge luft einführen, um die Probe in unversehrtem Zustand zu halten. Geschieht dies nicht, so kann es zu einem unerwünschten Vermischon kommen, da die Flüssigkeit an den Rohrwandungen mit eine;? anderen Geschwindigkeit strömt als die Flüssigkeit in der Mitte des Rohres. Wenn die Liohtdurohläseigkeit der Probe bestimmt worden 1st, wird die Probe durch die Abflussleitung 5! abgezogen. Der Programmgeber und Rechner ist durch einen einzigen elektrischen Anschluss 140 an das Stromnetz angeEohlossen. Alle anderen Vorrichtungsteile erhalten ihre Seron zufuhr durch die Innenleitungen 150, 160, 170, 180 und 190 ir. dem Programmgeber und Rechner, so dass der Programmgeber 60, wenn die gewünschte Anzahl von Proben durch den Probenehmer 20 zugeführt, gemessen und registriert

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worden ist, alle ieile der Anlage automatisch abschaltet.

Hachetehend wird die Arbeitsweise des Systems 4-0 zur Herstellung der Kochsalzlösung von fortschreitend sinkender Konsentration an Hand von Fig. 1 und 4 beschrieben. Dieses System hat die Aufgabe, einen Strom von ständig sinkender SaI»konzentration herzustellen, in den die Blutprobe so hineingepumpt wird, dass die Salzkonzentration der Lösung, in die das Blut hineinfliesst, innerhalb einer Periode von 7 1/2 Minuten sich dem Wert Hull annäherte Pur die hier beschriebene Ausführungsform wurde eine Periode von 7 1/2 Minuten gewählt; man kann jedoch auch mit Perioden von anderer länge arbeiten. Sie Salzkonzentration «u einer gegebenen Zeit (Cj₁) lässt sich aus der Gleiohung *

ΊΗ, - t (B₁ - S₂)N

berechnen, in der Oq die Anfangskonzentration, I die Dauer der Periode, t die abgelaufene Zeit, R₁ die Abströmgesehwindigkeit des Gemisches, B₂ die Einströngeschwindigkeit des Wassers und R₅ die Zuftihrungsgeschwindigkeit des Salzes bedeuten*

Bin Verfahren zur Herstellung einer Salzlösung von ständig sinkender Salskonzentrstion, das hier angewandt wird, besteht darin, dass man eine erste Flüssigkeit mit einer be-

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stimmten Kanfcer. trat ion in eine zwei te Hüssdgkeit von einer anderen Konsentration einfHessen läset, beids miteinander vermiacht und das Gemisch, das die Salzlösung von fortschreitend abnehmender Konzentration darstellt* absaieht. Bock lind Mitarbeiter beschreiben in der Zeitschrift "Analytical Chemistry", Band 26 (1954), Seite 1543, die Konzentrationsgefälle, die man bei Verwendung von Gefässen von verschiedenen Querachnittsflachen erhält j aus denen Flüssigkeiten mit verschiedenen Geschwindigkeiten ausströmen, und auf diese Veröffentlichung wird hier für die mathematischen Einzelheiten Bezug genommen» Wenn die Geochwindigkeit des Ausströmens eines Gemisches aus einem· Behälter doppelt so gross ist wie die Geschwindigkeit des zuströmenden Wassers, dann ist das Konzentrationsgefälle linear. Wenn die AfoströB« geschwindigkeit mehr ale das Doppelte der ZustrÖiUjgeechwindigkeit dea Wassers beträgt, ist die Kurve des Koneentrationßgefälles konvex; wenn die Abströmgeschwindigkelt weniger als das Doppeita der Zu&tröiageachwincUgkeit beträgt j iet die Kurve des Konsentrationsgefalles konkav. Vfenn das Virhälttiie der beiden Geschwindigkeiten genau gleich 1 ist, besteht; ein logarithmisches Koneentrationsgefälle, und eine Kurve» dit die Abhängigkeit eir.es logarithmischan KonBenträtionsgfefäliee von der Zeit wiedergibt/ ist linear. Um die Wendepunkte der erhaltenen. Kurven für die Zwecke der Erfindung besser den betreffenden Salzkonzentratioaen fc-oordhen ζυ Minnen, ist es

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zweckmässig, mit einem linearen Ealakonaen^rationsgefälle au arbeiten. Bs ist daher wichtig, dase dio Abströmungsgeschwindigkeit der Salzlösung genau doppelt so groes ist wie die Einströmungsgaschwindigkeit des Waaeere, Eine Methode, um dies zu erreichen, besteht darin, daoc /ian Rohrleitungen von gleicher C-röeoe verwendet, da zwei solche Rohrleitung on, wenn sie parallel geschaltet sind, die doppelte Förderleistung haben wie die restliche Rohrleitung. Ein Rohr wird verwendet, um Wasser einzuleiten, und u-wei Rohre werden verwendet, um die Kochsalzlösung abzuziehen«. Eine Vorrichtung, um dies zu bewerkstelligen, ist in Pig, 4 3t;uematisoh dargestellt. Eine bestimmte Menge Kochsalzlöeung von der höchsten, zu verwendenden Konzentration, gewöhnlich 0,8 bis 0,9 i>_t wird durch leitung 43 aus einem (niclit dargestellten) Vorratsgefäss dem Miechgei'äso 55 zugeführt und dort mit Wasser

gemischt. Wenn das Ventil 53 geschlossen ist, wird dia Sale's

lösung in dao 25 t-si fausande Vorratsrolir 54 gügen einen Luftgegendrutik eingepumpt, Wenn das Magnetventil 53 dann einige Sekunden geöffnet wird, wi;?tf. die in Ium Rohr 54 gelagerte Kochsalzlösung rasch in daa 10 cur fassende Mlaohgefäse 55 eingespritzt. Unmittelbar vor diesem Vorgang öffnet sioh jedoch das zweite Magnetventil 56 einige Sekunden, eo daea das Misohgsfääs 55 vollständig von der LöBung der vor^ hergehanden Probe antleert wird. Die in dem Miechgefäss 55

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hergestellte Salzlösung von forts^hrsx-^nd abnehmender Konzentration v;iru durch leitung 44 abgezogen* Dadurch, dass das Wasser au der Salalösiaig la dem Miscügefäsn 55 langsamer zugesetzt wird. al3 ä±e Salzlösung abgezogen wrd, entsteht ein Strom mit einem Konten trat ionage.Cälle, in den die roten Blutkörperchen ο ingaführt werden. Während die Lösung seit fortschreitdnd abnshrasniur Salzkonzentr&tion abgezogen wird und beide Ventile |G9chlcasen sind, wirfi Ae? Abfluesbehälter 57 entleert, so dass die Lösung aus dem Miauhgeiäas 55, sobald das Ventil 5δ gsöffnet wird, in den Abflueabehältsr 57 strömt. Wenn sich da3 Ventil 56 geschlossen hat, wird die Abflusslöoung durch Leitung 51 abgezogen. Eine Mischvorrichtung 59 wird verwendet, uai die Salzlösung mit dorn Wassar zu mischen. Dao Wa^sei* v<ird in den Miashbehälter 55 durch Leitung 42 mit oiner Geschwindigkeit von 1₅2 mn/I4in. eingeleitet , Da jodes oer beiden Rohre 45 und 4-6, durch die die Lösung mit dar abr.ehtienden Salzkcnsentration abgeführt wird, ebenso groas ist wie das Rohr, durch das das Wasser eingeleitet wird, wird die Salzlösung mit einer Geschwindigkeit von 2,4 ml/Min, abgezogen, so dass man das gewünschte lineare Konzentrationsgefälle erhält. Die Linearität des Konzentrationsgefälles kann kontrolliert werden, indem man in die Zuführungsleitung 43 fUr die Salzlösung Kaliumbichroraat oder einen sonstiger. Stoff, der dem Se-sr'sehen Gcj'etz gehorcht,

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einführt und das Iiclitabeorptiohsvermögen der durch leitung 44 abgezogenen Salslüsixng bei der entsprechenden Wellenlänge mit einem lineariaierten "Registriergerät überwacht. Das Registriergerät wird dann so GynehroniBiert, dasa die Anzahl der senkrechten Linien, die man erhält, gleich der Anzahl der Konsentratlcncvcrte der Salzlösung ist, die angewandt werden Dolle.i. Zweckmäßig liegen diese Werte im Bereich von 0,8 Ma 0,3 $> Salz in Einheiten von 0,1 #; für gewisse Zwecke ist allerdings der Bereich von 0,7 $> bie 0,2 $ besser geeignet. Bann wird kontinuierlich Wasser sowohl in die Leitung 42 als auch in die Leitung 43 eingeleitet und das Registriergerät auf 100 ^ige Lichtdurchlässigkeit eingestellt. Das Kaliunfbichronat oder der betreffende soneüge Stoff wird dann in die SalzlösungesufÜhrungsleitung 43 so lange eingeleitet, bia mindestens eine Periode des Konzentrationsgefälles boendeic ist. Schliesslich wird der gleiche Stoff in beide leitungen, die Wasserzufülirungsleitung und die SalzlÖBungezuführungsleitung, eingeführt, bis ein stetiger Zustand (A) erreicht ist. Da das Konzentrationegefälle linear ist, müssen die hierbei erhaltenen Werte der Gleichung y -.tax + b f Ür eine gerade Linie entsprechen, in der ι und y die gemessenen Werte für die Lichtdurchlässigkeit bzw« Eoneentration bedeutet., und in, die Steigung der Linie, sowie b, der Schnittpunkt π:· 1 der y-Koordnnaio, !.treehnet werden

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Wenn unter Bezugnghme auf die mit der betreffenden Substanz erhaltene Kurve S die betreffende Anfangskonzentration (0,8 £ige Salzlösung) und E die betreffende Endkonzentration (0,3 £ige Salzlösung) bedeuten, OD die optische Dichte bein stetigen Zustand A ist, ferner die Kurve die Linie der Anfangekonzentration D in Punkt B schneidet, und die Kurve die Linie der Endkonzentration E in Punkt C schneidet; dann gilt die Gleichung η = , und b ■ 0 - nE. Daher iet

⁰MAX * ^^{210 3}MIN ⁼ " η * ^{Ftir einen} ^

Salz und die oben angegebenen Strömungsgeschwindigkeiten kann Ο^ΙΗ ^{so nane} ^eI ^Wul1 liegen, dass Wasser als Verdtinnungeflüssigkeit zufriedenstellend ist. Wenn Ο_ΜΙΪ negativ ist, soll die Gross© der Zuführungsleitung 43 für die Salzlösung vermindert werden.

Der in Fig. 2 dargestellte Stromkreis des Rechners 80 wurde in Verbindung mit einem Funktionsverstärker 81 (Burr-Brown Modell 1510) entworfen und maoht von einer normalen Schaltung Gebrauch. Während die abgeleiteten Funktionen von rasch wechselnden Signaion sich verhältnismässig einfach bereohnen lassen, vergehen in der vorliegenden Vorrichtung und bei den vorliegenden Verfahren 2 bis 3 Minuten, bis das Signal sich um nur wenige Millivolt ändert, und daher wird es ziemlich ausschlaggebend, dass man bestimmte Bauteile verwendet. Der

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Eingangekondensator 82 von 100 Mikrofarad soll ζ.B₀ ein Kon-

densator von hohem Gütegrad (für Rechner) sein, da Kondeneatoren von weniger hochgradiger Güte ein ungünstiges Verhältnis ▼on Signal zu Geräusch zur folge haben können. Gemäss fig* 1 und 2 wird das bei der Messung einer Probe erhaltene unveränderte Kolorinetersignal 83 (fig· 1) einen ersten Registriergerät 110 zugeleitet, wenn der Schalter 84 sich in der Sumoenstellung 90 oder in der Summen-/Ableitungsstellung 92 befindet. Wenn der Schalter 84 in der Stellung 91 für die abgeleitete funktion steht, empfängt das Registriergerät 110 ' das Signal 85 (fig* 1) ^{für die} abgeleitete funktion« Bas , zweite Registriergarät 120 wird nur dann verwendet, wenn · beide Kurven aufgenommen werden sollen, und empfängt nur das Signal 85 der abgeleiteten funktion. Lage und Grosse der Ableitungskurve werden durch den Nullregler 86 bzw. den Verstärkungsregler 87 gesteuert. Ein (nicht dargestellter) Aus- und Torheizschalter steuert die Doppelstromquelle 88, gibt dem funktionsverstärker 81 die erforderliche Aufheizperiode und stellt ausserdem den Strom für den Programmgeber 60 und andere Organe zur Verfügung,

Der in fig. 3 dargestellte Programmgeber 60 ist in Verbindung mit den beiden Zeitgebern 61 und 62 verdrahtet. Der eine Zeitgeber 62 arbeitet in einer Periode von 7 1/2 Minuten und steuert die Ventile 53 und 56 für die Herstellung der Salzlö-

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Bung von abnehmender Konzentration* die Anfaagßlinid der Registrierung und die Betriebsart? der andere Zeltgeber 61 arbeitet i:o einer Periode von 1 Minute und sorgt für die Synchronisierung mit dem Probenehmer 20. Wann der Betriebsartschalter 63 in das· "Kontinuierlich"- oder "Gaschlossen"-Stellung 64 steht, wiederholen die Zeitgeber 61 und 62 ständig die Arbeitsperioden, Wenn der Schalter 63 in der "Normal"- oder "Offen¹-Stellung 65 steht_s schalten die Zeitgeber 61 und 62 je nach der Stellung des Unterbreehungeeohaltere 66 alle Organe entweder mit der letzten Probe oder am Ende der nächsten Pericde ab; d.h. wenn derUntertesehimgeschalter

66 auf "geschlossen" steht® werden die Organe mit der letzten Probe abgeschaltet, und wann er auf "offen⁰ steht» werden die

4 ·

Organe am Ende dar nächsten Berioäe abgeschaltete Der Anlaseerknopf 67 wird durch den Magneten auf dem Sperxnooken 68 für einen Augenblick betätigt, so dass.eine Periode ablaufen kann, während deren die Betriebsart und die Art und Weiae der Unterbrechung nach Wunsch eingestellt werden können.

Sie Bezugszeichen in Hg. 3 haben die folgenden Bedeutungen: T-j = Zeitgeber 61, 1 -Minutenperiode, ein durch Hocken betätigter einpoliger Umschalter 69» ^2 ^s Zeitgeber 62, 7 1/2-Minutenperioäe, fünf durch Nocken betätigte einpolige Umschalter 70, eine Sperrung 71} V₁ = Magnstventil 56 zum

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Entleeren der Mieclikscaer 55; V₂ ■ Magnetventil 53 zum Stillen der Misehkeiaffier 55; S₁ = Schalter 631 einpoliger Kebelaueschalter für die Betriebsart; S₂ * Schalter 66» einpoliger Hebelausachalter für die Unterbrechung; S₅ = Schalter 67» normalerweise offener Tastenschalter zum Anlassen; O₁ β Auagangsleituiig 180 für den Probenehmer 20; Og « Ausgangoleit-mg 190 für alle übrigen Organe; A₂ * selbsttätiger Registrierpapierweehsler und Verstärkeraueechalter 72.

In der beschriebenen und dargestellten Ausführungeform sind die Zahnräder in des Registriergerät und den Zeitgebern oö gewählt, dass für jede Probe 7»62 ca Ee^istrierpapier zur Verfügung stehen. Wenn die Linier, auf den» Hegiatrierpepier sioh in Abständen von 12,7 mm voneinander befinden, ntehen für jecle Periode aecho 1-j.nien und uiithin sechs Abstände von ^e »2,V mi: zur V'eriu*ung. iSs ist zweclaaäasig, wenn das lineare Konzentj^-ViGnsgefälle sich über fiinf dieser Abstände erotrofOct, so dt-aa ier noch verbleibende Raiuu zwischen den beiden letzten liinisn für den Übergang zwischen Salzlösung und Probe zur Verfügung oteht. Ds das Registriergerät, der Probenehmer und die Zeitgeber eämtlioh mit Synchronmotoren ausgestattet sind, bleibt die Synchronisierung, wenn sie •rat einmal hergestallt ist, erhalten, bis irgendeiner dieser Vorrichtungsteile aus dem elektrischen Stromkreis auegesohaltet wird.

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Um die Synchronisierung herzustellen, lässt man dan Punkt, der die höchste Konzentration der Salzlösung (im allgemeinen 0,8 # Salz) darstellt, auf die erste dar seeks Linien des Registrierpapierß fallen. Nachdem das Ragistrierpapier so eingestellt worder ist, soll das Registriergerät nicht wie* der abgeschaltet werden, es sei denn durch den Programmgeber und Rechner. Auf fliese Weise werden die Salzlösung vo£ ständig sinkender Konzentration und das Regietriergerät zur Syn-P chronisierurg gebracht.

Dann wird der Probenehmer 20 folgenderiaaesca mit dem Registriergerät und der Salzlösung synchronisiert: Sa äan Ventil V₁ 56 langer offen ist, als erforderlich ist, um die Salzlösung der Torbergefcenden Periode vollständig abzulassen, wird oiYie kleine lüftblase in die Austrittsleitung 44 für die Salzlösung hineingezogen. Dies hat einen doppelten Zweck: (a) Alle rotan Blutkörperchen, die sich etwa in der Strömungszelle abgesetzt haben, werden dadurch beim Durchgang ,Her Luftblase aus der Strömingezelle entfernt, und (b) man erhält dadurch auf der Regietrierspur ein eiofttbares Anzeichen dafür, wo die Periode des Konzentratiönegefällee endet und die nächste Periode beginnt. Wenn der Probenehmer 20 auf di· Entnahme von 60 Proben je Stundjg oder eii&r Probe je Minute eingestellt ist, bedeuten 20 Sekunden die Zeitspanne, in der keine Probe durch die Zelle strömt, da ein Drittel der Gesamtzeit

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von einer Stunde normalerweise als tfasehperiodo verwendet wird. Der Hocken 71 auf dem ersten Zeitgeber 62, der den zweiten Zeitgeber 61 steuert, wird dann ao eingestellt, dass die Luftblase zwischen zwei Perioden das Konzentrationsgefälles und der Luftraum zwischen zwei Proben den Punkt, an dem diese beiden Ströme zusammentreffen, zur gleichen Zeit erreichen.

Wenn die Luftblas» durch die Strömungszelle dee Kolorimeter 100 strömt, entsteht in der Registrierepur ein "Dorn". Dies läest sich durch Kurzschliessen der L- und C-Leitungen 73 bzw. 74 (Fig. 3) von dem Kolorimeter 100 Über einen (nicht dargestellten) Widerstand von 150 0hm vermeiden. Wenn diese Leitungen kurzgeschlossen werden, bewegt sich die Regietrierfeder auf der Skala abwärts. Wenn alle Organe richtig synchronisiert sind, erhält man die folgende Zeitfolge der einzelnen Torgänge:

Zeit (Minuten: Sekunden) . Vorgang

0:00 Beginn (Probenehmer 20 In Wäsch

st ellung)

0:30 Probenehmer 20 rückt in Probenahnestellung vor

1:30 Zeitgeber T₁ 61 schaltet aus, Probe

nehmer 20 ausgeschaltet (Probenahme wird fortgesetzt)

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Zeit (Minuten: Sekunden) Toggang

3:00 Ventil V₁ 56 offen, Entleerung der

Migchkanrater 55

3s05 Ventil V^ 56 geschlossen, Ventil

V₂ 53 offen, ¥iederauffüllung der Mischkammer 55

c3;10 Ventil V₂ 53 geschlossen

4:00 Neue Probe wird in neuen Salzlösungs

strom eingespritzt

6:00 letzte Eichlinie auf Registrierpapier

6:15 Ij-C, 73 und 74 kurzgeschlossen, Re-

* gistrierfeder bewegt sich auf der Skala abwärts

6:25 Ende der Probe in der StrumungBzelle

(Kolorimeter)„

6:35 Luftblaue In*dar Strömung«zelle

(Kolorimeter)-

6:45 Neue Probe in der Strumu&gszelle

(Kolorimeter)

7i00 KurzschlusB L-O, 73 und 74 beendet,

Regietrierfeder erreicht neues Plateau

7:15 Erste Eichlinie auf dem Registrier

papier

7:30 Sie ganze Periode wiederholt sich.

Wie bereits erwähnt, ergibt ein Diagramm der Abhängigkeit der prozentualen Lichtdurchlässigkeit der Suspension von roten Blutkörperchen von der Salzkonzentration der Salzlösung die in Fig. 5 dargestellte Summenkurve 200, Aue der Form dieser

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Kurve ergibt BiCh₁ dass es schwierig ist» den Ort des Wendepunktes 201 auf dc>r Kurve genau au "bestimmen* Mit viel gröseerer Genauigkeit lässt sich der Wendepunkt 201, d.h.» der Punkt der höchster HämolysegeBchwinäigkeit, aus der Ableitungekurve 300 'Pig. 6) beetinen, da die Lage des Maximuas der Ableitungekurve auf der Salskonzentrations- oder Zeit-' achse mit derjenigen des Wendepunktes 201 zueamiienfällt. Wie dargestellt, fällt der Wendepunkt 201 der Sunaenkurre 200 I ■it dta MaxinuB der Ableitungekurre 300 zusammen, obwohl die· nicht iraer der fall ist« In TIg. 6 sind ewei Paar« τοη Suaaenkurven 200 rad Ableitungskurren 300 dargestellt, wobei, die ausgesogenen Linien den SiraenVurren und die gestriohelten Linien den Abl3itungslrorTen entsprechen, die gleichseitig duroh ein mit awei Regietrierfedern arbeitende· Registriergerät verzeichnet werden. In dieses besonderen Beispiel führt die Synchronisierung und die richtige Eichung «u sechs senkrechten Linien, die ein SalBkonsentrationsgefälle τοη I 0,7 )ί bis 0,2 i> in Abstanden τοη je 0,1 £ darstellen. Der Punkt 201 der maximalen HOBOlyeegeeohwindigkeit liegt in jeden Falle bei einer Salskonsentration τοη 0,34 ^. Die prozentuale Liohtdurchläesigkeit der Suspension τοη roten Blutkörperchen bei verschiedenen Seiskonsentrationen, wie sie aus diesen Surren ersichtlich ist, 1st in der folgenden Tabelle angegeben.

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Änderung der prosentualen Lieht&urchlässigkeit mit der Salzkonssntratdon

Salstkoaeentr&tion Prozentuale !floh »durchlässigkeit

0,7 $ ■ ■ 2.0

0,6 $> 2,2

"0,5 * 3*2

0,4 9t - 7,8 ■■ . .

.0, 3 1" 72,0

0,2 $ 82»0

Während das Ergebnis der oben beschriebenen Danon'sehen Methode weitgehend temperaturabhängig ist, da das Salzkonzentrationsgefälle durch Osmose durch eine Dialysiennembran erzeugt wird und der osmotische Druck eine Funktion der Temperatur ist, wird das erfindungsgemässe Verfahren kaum durch Temperaturschwsnkungen beeinflusst. Fig. 7 zeigt vier Kurvenpaare, die nach den Verfahren gemäßs der Erfindung innerhalb einer Temperaturspanne von 35° C erhalten worden sind. Aus den Kurven ist ersichtlich, dass der Wendepunkt 201 innerhalb einer Temperaturspanne von 5° 0 bis 40° C nur um eine Salzkonzentrations -spanne von 0,02 # schwankt, so dass bei der Durchführung den Verfahrens bei Raumtemperatur oder in dar Höhe der Eaumteiape^atur nur ein sehr geringer Fehler auftritt.

Von grösserer Bedeutung ist bei dem erfindungsgemässen Verfahren der Veraünmingsfaktoir, d_oh_o das Verhältnis der Konzen-

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BAD ORfQlNAL

tixation der rofeen Blutkörperchen zu der S&lBlöeiuitf· EaI dar beschriebenen Auöftihrungaforia wurde aifc einer BlutvorclLlnnung von 25« 1 (Oj, 10 al Blut au 2>4- ml 8alBlüeun£ aiyssotat) gearbeitet« In i'igö 8 sind vier Kurven dargastollu, die ndt Blut erhaltsn worden Sind» das in fsrsclaisdoiten Verliälfcnisaen von 2-fach t>is 16-faöfc verdiinnt worden ist. Wia mau aus den Kurven ersieh.6» räokt der Wendepunkt 201 innerhalb dieses Verdiinnungsbereichs von einer Salzkonzentration von 0,54 # bis ssu einer solchen von 0,46 ^, also um 0,12 #, nach oben* Wenn man daher die maximale Hämolysegesohwindigkeit verschiedener Proben von rotan Blutkörperchen vergleichen will, iab bd «weckmäar.ig, alle Bestimmungen bei dor gleu shen Verdünnung durehzufuhren.

Der Fachmann ist oane weiteres imstande, die Erfindung In anderen, besonderen Formen anzuwenden» indem es von einem oder mehreren der neuen Merkmale oder Äquivalenten derselben Gebrauch macht, z.B. indem er anstelle von roten Blutkörperchen I Stoffe verwendet, lie in ähnlicher Wcioe eine messbare Komponente in Freiheit 3etzen, gleich ob die Bestimmung im sichtbaren Licht, mit Ultrarotstrahlen oder mit Ultraviolettetrahlen durchgefülirt wird

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Claims (1)

1. ÄbboI;fe La^osiatoriee Ii, Oktöbfei* Ϊ96Β

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   .Ff, \; α a t a η s ρ r Ü c h ο

   1« Verfahren zur selbsttätigen Bestimmung dar öbhotischen Reaiatens roter Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, dass matt

   (a) eine bestimmte Menge einer anfänglichen Salzlösung von be at teilst 3i' Salskonsentration herstellt,

   (b) einen SaIsIbsungsatrom von ständig abnehmender Salakonzentration »ar^eusri, .indem man kontinuierlich zu dor Salzlösung Wasser zusetzt und eilten Teil dieses Gemiscaes kontinuierlich abfuhrt,

   (c) eine Suspension der roten Blutkörperchen in der abgeführten Lösung herstellt, indem nan gleichzeitig und kontinuierlich dem abgezogenen Strom der Salzlösung einen Strom roter Bliitkörperchen zumisent,

   (d) duroh die Suspension Licht hindurchfallen liest und

   (e) durch Messen der Lichtdurchlässigkeit der Suspension die osmotisohe Resistenz der roten Blutkörperohan als Funktion der Salzkonzentration bestimmt.

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   2. Verfehren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, öaen m?.n einen Salslö surges tr om von ständig abn6l-icj.uer Salzlrortsentration, zu dem die roten Blutkörperchen g,loi<\ ncitig zv&iOQtef, werden, mit einsin linearen Konsentrationnf off'lic lierstollt, indem man das Geaisch aus Stilslösung uM Werosi' mit einer Geschwindigkeit aussieht, dio doppelt se qvoüc ist wie die Geschwindigkeit, Kit der das Wasser zn der Sa^slösung zugesetzt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, das-α man mit einer Salzlösung mit einer enfänelicken Sslskonzentration von 0,7 bis 0,9 # und einer S&l:;~En<'i]s:oiT3ftntration von 0,0 bis 0,3 f> arbeitet.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gokcnnzetchnet, da&n nan der Suspension der roten Blutkörperchen in öer Salzlösung vor dem Hindurchleiten von licht durch die ö^sponsion Zeit nur Hämolyse zur Verfügung stellt.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekcurtsoicLiiiot, üasß man ein von dor Licätdurchläoeigkoit der Sv.-jpsnf ionen der rotsn Blutkörperchen abhängiges elektriaclieo Stigma! erzeugt wni duroh Regie tr ieran dea Signals avf Lc^iD uri^^oGricr· ein Ei&greiaia tier \"biiva:g Igkeit uer ^νολγαο acr rvstai. chen Ton ßozⁱ "i.'ikcnjsöntri'tion Ixc^v' ζ?.?..*-,

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   P 12 03 671o6 21. Januar 1969

   Abbott Laboratories 25^3

   6* Vorfahren nach Anspruch 1, dadurah gekennzeichnet, dass man mit mehreren Blutproben arbeitet, die bei der Messung der orston Probe nicht benutzte Salzlösung abzieht, einen £riocheri SalsQ9sungs3trom von sinkender Salzkonzentration herstellt, die zweite Blutprobe kontinuierlich mit diesem SaIzlösungaotroin mischt, dio osmotische Resistenz der zweiten Blutprobe bestimmt und das Verfahren in dieser Weise wiederholt, bis die osmotische Resistenz der letzten Blutprobe bestimmt worden ist*

   7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 6, gekennzeichnet durch ein Lagergefäss (5*) für eine bestimmte Menge der anfanglichen oder ersten Salzlösung, ein Mischgefäss (55) zum Mischen der ersten Lösung mit dem Wasser und zur Herstellung einer Lösung mit einem Konzentrationsgefälie, cane mit dem Lagergefäas (54) und dem Mischgefäss (!35) in Verbindung stehende erste Leitung (43), ein in der ersten Leitung (43) sv/ischen dam Lagergefäss (54) und dem Misehgoi'ass (55) angebrachtes eretee Ventil (53) zur Steuerung der Einführung einer bestimmten Lösungsmenge in das Misohgefäsra (55), eine mit dem Miechgefäss (55) in Verbindung otehenäe zweite Leitung (42) zum Einführen von Verdünnungsmittel in das Misohgofäss (55), eine mit dem Misengefass (55) in Verbindung stehende Leitung (44) sum Abziehen der das Konsentra-

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   ^dü BAD

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   tionagefällt aufweisenden Lösung aus dem Misnhgafäaa (55)». ein© ait dsm Mißöhgafäss (55) in Verbindung stehende Leitung {52) isuiö Abziehen überschüssiger Lösung aus dem Misohgofäas» ein in der letsfcgenanntun Leitung (52) angeordnetes awaitss Veni;il (56) und einen mit den beiden Ventilen (53, «56Ϊ derartverbundenen Zeitgeber (SS)₁ daaa ssuerst das swei'V* Ventil (56) geöffnst wird» bis dio überschüssige Lösung vollständig aus dom Miaahgöfäaa (55) abgelaufen ist, und dann da« erste Ventil (53) geöffnet wird» bis aioh das Misohgefi/sö (55) mit der in dem Lagergefäss (54) enthaltenen bestiemten Mengt der ersten Lösung gefüllt hat» wobei die relativen örössön der Leitung (4-2) bubi Einführen des Verdün-

   in das Misohgefäss (55) und der Leitung (44) Abziehen der das Konsen traUonsge fälle aufweisenden Lösung aus detn Misohgefäss so aufeinander eingestellt sind, dass die Strömungsgeschwindigkeiten bestimmte vier ¹^3 haben und aiöh das gewünschte KonsenfcrationsgefÜlU· ausbildet, mit einer Einrichtung zum Mischen roter· Blutkörperehen saife der abgeaogsnon Lösung und einer Einrichtung saum Messen «ier LiohtdurehlUsuigKftlfc der Mischung der ab&ezogeram Lösung asiu dem röten

   8c \Törriohtung nach Anspruch 7, dadurah gekennzeichnet* dass die Leitung (44) büh Abviehen dor das Konzentrat!onsgefalle Dsndeii Lüaung aue äu& l\ aehgü^äaa ·, 3*Ji airio πο.'<Χλϊ hat, dass dio StrömangageBefc vindigkei« dur !h d imii; doppelt βa großa iat wie äie.

   durt'h di© Laitur.g (42) lauffl SufUliron die Vordünnungüiai fetala, bo ύΆΒα die Verrichtung ein« Looting ffiit- ii fclonsgefälle

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   Leerseite