NL8102346A

NL8102346A - Enzymoplossingen en werkwijze voor de bereiding daarvan.

Info

Publication number: NL8102346A
Application number: NL8102346A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1981-05-13
Publication date: 1982-12-01
Also published as: DE3265789D1; EP0065800B1; EP0065800A1; ATE15224T1; DK153499C; DK212182A; DK153499B; JPS5886084A

Description

, * \

Enzymoplossingen en werkwijze voor de bereiding daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op enzymoplossingen en werkwijze voor de bereiding daarvan.

Voor de toepassing van enzymen , in het bijzonder in industrieele enzymatische processen, is stabilisering nood-5 zakelijk.Een hoge levensduur is daarbij uit economische overwegingen van belang.Tot nu toe zijn hiervoor in principe twee methoden bekend.De ene methode bestaat'uit het immobiliseren van een enzym op een daartoe geschikte drager, d.w.z. een katalysator op drager.De andere methode bestaat uit stabili- *r· 10 satie in oplossing.De uitvinding heeft nu betrekking op deze tweede mogelijkheid.Verschillende varianten van het stabiliseren in oplossing worden beschreven in het artikel "Enzyme stabilization without carriers", Enzyme Microb.Technol.1979, Vol.1,april, blz.74-82.Als voorbeeld van een daarvoor ge-15 schikte stabilisator wordt albumine, een proteïne uit kippe-eieren, genoemd.Daarbij wordt een enzym opgelost in een buf-feroplossing, waaraan albumine is toegevoegd.Ondanks een verbeterde stabiliteit van aldus verkregen oplossingen, blijkt de stabiliteit toch met verloop van tijd aanmerkelijk terug 20 te lopen.

Volgens de uitvinding wordt nu een en2ymoplossing met veel grotere stabiliteit verschaft, waarbij het enzym is opgelost in de gehele wit-fraktie van eieren, in het bijzonder kippe-eieren.De witfraktie van eieren is een uitstekende sta-25 bilisator gebleken te zijn voor enzymen, zoals b.v. oxyderende reducerende en hydrolyserende enzymen; voor proteolytische enzymen biedt de witfraktie van eieren geen significahte voor delen.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op 30 een enzymoplossing, die geheel of gedeeltelijk bestaat uit een oplossing van één of meer enzymen in de ongedenatureerde witfraktie van eieren.Zoals boven vermeld is de witfraktie van kippe-eieren in het bijzonder geschikt gebleken voor het genoemde doel.

35 Stabiele enzymoplossingen zijn voor verschillende toe passingen van belang, zoals b.v. bij de omzetting van macromoleculaire substraten, waarbij het gebruik van een op een drager geïmmobiliseerd enzym in het algemeen in zijn .resultaat nadelig wordt beïnvloed door fysische, in het bijzonder 8102346 - 2 · sterische hindering, die resulteert in een ongewenst lage enzymaktiviteit.Bovendien kan een dragermatrix, in het bijzonder bij medische toepassingen, een storende invloed hebben op de werking van het enzym.

5 De enzymoplossing volgens de uitvinding is vooral van belang bij gebruik in enzymreaktoren, waarbij met opgeloste enzymen wordt gewerkt.Een voorbeeld van enzymreaktoren zijn membraanreaktoren, waarvan het membraan alleen voor het gevormde produkt doorlaatbaar is.

10 De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het stabiliseren van enzymen, al dan niet in oplossing, waarbij men één of meer enzymen oplost in de ongedenatureerde witfraktie van eieren, bij voorkeur de witfraktie van een kippe-ei.

15 Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een werk wijze voor het uitvoeren van een enzymatisch proces, waarbij men als katalysator een enzymoplossing als hierboven beschreven, of een enzymoplossing verkregen met de hierboven beschreven werkwijze, gebruikt.

20 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de onderstaande voorbeelden, waarin ongëdenatureerde witfrak-ties van kippe-, ganze- en eende-ei naast elkaar zijn gebruikt.

Voorbeeld I

Hydrolyse van laktose met behulp van laktase.

25 Laktose ^a^---S-eglucose + galactose.

Laktase(ft -galactosidase) werd in een hoeveelheid van 250 mg opgelost in respektievelijk 50 ml witfraktie van kippe eieren, 50 ml witfraktie van eendeëieren en 50 ml witfraktie van ganzeëieren, die allen tot pH 7 waren geneutraliseerd 30 met melkzuur.Nadat enige druppels tolueen waren toegevoegd ter bescherming tegen microbiële infektie, werden de oplossingen bij 5° C bewaard.Met tussenpozen van één week werden van deze enzymoplossingen steeds 0,5 ml gemengd met 25 ml laktoseoplossing( 5 g laktose, opgelost in een mengsel van 35 90 ml gedemineraliseerd water en 10 ml 0,05 molaire fosfaat- buffer, pH 7).Na een reaktieduur van 5 uur bij 25° C werd in alle gevallen de omzetting gemeten met behulp van een AutoAnalyzer-methode, waardoor het totale reducerende vermogen 8102346 - 3 - wordt gemeten.

Ter vergelijking werd een oplossing van 250 mg laktase in 50 ml 0,05 molair fosfaatbuffer, pH 7 bereid en op dezelfde wijze bewaard en wekelijks bemonsterd en gemeten.

5 In onderstaande Tabel A zijn de aldus verkregen resulta ten van de gemeten omzetting na 5 uur weergegeven voor de verschillende bewaartijden, te beginnen met twee weken, _Tabel A_

Bewaartijd Gemeten omzetting na 5 uur( in % van aanwezig 10 in dagen_laktose_

Laktase in witfraktie van Laktase in kippe-· · ganze- eende-ei fosfaatbuffer_ 0 55 50 52 60 14 55 50 52 40 15 21 55 50 52 32 28 55 50 52 25 35 55 49 51 15 42 55 49 51 15 49 55 49 50 12 20_56_55 . 48_50_10_

Uit deze tabel blijkt dat de aktiviteit van laktase in de witfraktie van kippe-, ganze-.'.en eende-ei onverkort gehandhaafd blijft, terwijl die van laktase in fosfaatbuffer na acht weken nog maar een zesde van de oorspronkelijke aktiviteit 25 bedraagt.

Voorbeeld II

Oxidatie van ethanol tot ethanal met behulp van alcohol- dehydrogenase(ADH) ._ ADH werd in een hoeveelheid van 2 mg opgelost in 10 ml 30 witfraktie van kippe-ei, geneutraliseerd op pH 7.Deze oplossing werd bij 5°c bewaard en met gezette tussepozen werd een hoeveelheid van 0,2 ml ervan toegevoegd aan een mengsel van 0,2 ml NAD+-oplossing (0,01 mmol NAD+/10 ml), 0,1 ml ethanol en 2 ml 0,1 molaire fosfaatbufferoplossing met pH 7,0.Deze oplossing 35 werd in zijn geheel snel gehomogeniseerd en vervolgens werd de enzymaktiviteit gemeten door de omzetting van NAD+ in NADH te meten bij 340 nm.

Ter vergelijking werden ook gelijke hoeveelheden ADH opgelost in 10 ml 0,1 molaire fosfaatbuffer, pH 7, onder toevoe- 81 0 2 3 4 6 - 4 - voeging van verschillende hoeveelheden albumine.Deze oplossingen werden eveneens op de boven beschreven wijze bemonsterd en gemeten op stabiliteit van het enzym.

Ter voorkoming van microbiële infekties in de te onderzoe-5 ken enzymoplossingen werd daaraan bij het bewaren een kleine hoeveelheid butylacetaat toegevoegd.

De metingen van de aktiviteit werden uitgevoerd bij 20°C. De verkregen resultaten zijn samengevat in Tabel B.

_Tabel B ____ 10 Gemeten initiële aktiviteit van ADH(in % van

Bewaartijd de oorspronkelijke aktiviteit)_ in dagen ADH in wit- ADH in fosfaatbuffer + fraktie van x mg/10 ml albumine _kippe-ei_x=0 0,5 1,0 2,0 5,0 _ 15 0 100 100 100 100 100 100 1 98 96 96 96 96 96 2 96 94 90 92 92 91 5 91 90 85 86 86 87 10 80 75 78 80 81 80 20 15 72 67 52 55 58 59 20 60 56 34 40 40 43 30_45_30 8 12 13 14 _

Uit deze tabel blijkt duidelijk dat de stabiliteit van ADH door witfraktie van kippe-ei aanzienlijk wordt verbeterd.

25 Voorbeeld III

Reduktie van cortison tot 20β-dihydrocortison met behulp van 20 β-hydroxysteroidedehydrogenase(20 β -HSDH)_

Een hoeveelheid van 0,9 mg 20/# -HSDH werd opgelost in 10 ml witfraktie van kippe-ei, geneutraliseerd op pH 7.Deze op-30 lossing werd bewaard bij 5°C en met gezette tussenpozen werd een hoeveelheid van 0,1 ml van deze oplossing toegevoegd aan een mengsel van 0,2 ml NADH-oplossing, die 0,01 mmol NADH/10 ml bevat, en 2 ml van een 0,1 molaire fosfaatbufferoplossing met pH 7, waarin cortison in een concentratie van lSOmg/1 is 35 opgelost.Deze oplossing werd in zijn geheel snel gehomogeniseerd en vervolgens werd de enzymaktiviteit gemeten door de omzetting van NADH in NAD+ te meten bij 340 nm.

Ter vergelijking werd ook een gelijke hoeveelheid 20 Λ-HSDH opgelost in 10 ml van een 0,1 molaire fosfaatbuffer met 81 0 2 3 4 6 - 5 - pH 7 onder toevoeging van verschillende hoeveelheden albumine waarbij de aktiviteit eveneens op de hierboven beschreven wijze werd bepaald.

Ter voorkoming van microbiële infekties in de te onder-5 zoeken oplossingen werd daaraan voor het bewaren een kleine hoeveelheid butylacetaat toegevoegd.

Alle aktiviteitsmetingen werden uitgevoerd bij 20°C.

De verkregen resultaten zijn vastgelegd in onderstaande Tabel C.

10 _Tabel C_- -

Bewaartijd Gemeten initiële aktiviteit van 20(ü-HSDH(in % in dagen van oorspronkelijke aktiviteit)__ 20/3-HSDH in 20/3-HSDH in fosfaatbuffer + witfraktie van x mg/10 ml albumine 15 _kippe-ei_x=0 0,5 lfQ 2,0 5/0_.

0 100 100 100 100 100 100 1 98 53 94 94 96 95 2 96 38 90 91 93 93 5 92 9 65 66 68 68 20 10 88 1 32 34 36 38 15 83 0 12 18 19 22 20 79 0 3 2 8 14 30_70_0 10 14_

Uit deze tabel blijkt, dat de stabiliteit van 20/^-HSDH 25 door witfraktie van kippe-ei duidelijk wordt verbeterd.

Voorbeeld IV

Reduktie van cortison tot 20 β -dihydrocortison met behulp van 20/%-HSDH met regeneratie van het co-enzym NADH uit NAD+.

30 Een enzymoplossing werd bereid door 50 μΐ 2θβ -HSDH sus- pensie(0,5 units), 5 mg ADH(2000 units) en 5 mg NAD+ op te lossen in 10 ml witfraktie van kippe-ei, geneutraliseerd tot pH 7 met melkzuur, bij 25°C, en bij deze temperatuur bewaard. Ter voorkoming van microbiële infektie werden enige druppels 35 tolueen toegevoegd.Van deze enzymoplossing werden steeds 0,5 ml gemengd met 25,0 ml substraatoplossing om de aktiviteit als funktie van de tijd te bepalen(de temperatuur tijdens de bepaling wordt op 25°C gehouden).De samenstelling van de substraatoplossing was: 0,1 g cortison +10 ml ethanol per liter 40 gedemineraliseerd water.

8102346 - 6 -

Ter vergelijking werd een overeenkomstige enzym-coenzym oplossing bereid in 10 ml van een 0,05 molaire fosfaatbuffer met pH 7,0 bij 25°C, die daarna bij dezelfde temperatuur werd bewaard,Van deze oplossing werd op overeenkomstige wijze de 5 aktiviteit als funktie van de tijd bepaald bij een temperatuur van 25°e,

De resultaten zijn samengevat in Tabel D. _Tabel D__ ...

Omzetting na 5 uur(in %, bepaling via TLC- 10 Bewaartijd analyse/dunne laag chromatografie/)_' ~ - in dagen_In witfraktie van ei_In fosfaatbuffer 0 100 100 5 97 25 12 30 10 15 19 50 5 26 40 0 33_30_0_

Uit de tabel blijkt duidelijk de stabiliserende werking van de witfraktie van kippe-ei voor het betreffende enzym-20 systeem.

8102346

Claims

1. Enzymoplossing, met het kenmerk, dat deze geheel of gedeeltelijk bestaat uit een oplossing van ëén of meer enzymen in de ongedenatureerde witfraktie van eieren.

2. Enzymoplossing volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de witfraktie die van een kippe-ei is.

3. Werkwijze voor het stabiliseren van enzymen, al dan niet in oplosmiddel, met het kenmerk, dat men ëén of meer enzymen oplost in de ongedenatureerde witfraktie van eieren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men de ongedenatureerde witfraktie van een kippe-ei gebruikt.

5. Werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatisch proces, met het kenmerk, dat men als katalysator een enzymoplossing volgens conclusie 1 of 2 gebruikt.

6. Werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatisch proces, met het kenmerk, dat men als katalysator een enzymoplossing, verkregen met de werkwijze volgens conclusie 3 of 4 gebruikt. 81 0 2 3 4 6