DE2804356A1

DE2804356A1 - Verfahren zur hydrolyse von protein-gebundenen cholesterinestern

Info

Publication number: DE2804356A1
Application number: DE19782804356
Authority: DE
Inventors: Theodore Walter Esders; Charles Thomas Goodhue; Christine Ann Michrina
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1977-02-03
Filing date: 1978-02-02
Publication date: 1978-08-10
Anticipated expiration: 1998-02-03
Also published as: SE7801248L; BE863657A; SE468093B; JPS6237957B2; CA1104041A; FR2379815A1; SE8303292D0; FR2379815B1; DE2804356C2; GB1592632A; SE8303292L; JPS5396378A; SE462047B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Proteingebundenen Cholesterinestern, ein Reagens für die Hydrolyse sowie ein analytisches Element für die Bestimmung von Cholesterinestern in wäßrigen Medien.

Bei der Untersuchung von Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutserum, auf ihren Gehalt an Cholesterin, besteht die einleitende Verfahrensstufe in der Regel in einer Hydrolyse der vorhandenen Cholesterinester zu freiem Cholesterin.

Bei den üblichen bekannten Cholesterinester-Hydrolyseverfahren werden starke Basen (z.B. KOH und NaOFI) verwendet, oder aus Gründen der Vereinfachung und Selektivität Hydrolaseenzyme (d.h. eine Cholesterinesterase). Das Arbeiten mit ätzenden Stoffen wie beispielsweise Alkalien ist bekanntlich unvorteilhaft und nicht wünschenswert, wohingegen enzymatische Verfahren zwar für die Hydrolyse von "freien" Cholesterinestern geeignet sein können, d.h. solchen, die nicht an Protein gebunden sind, wohingegen diese enzymatischen Verfahren ineffektiv oder vergleichsweise wenig wirksam sind, wenn es gilt an Proteine gebundene Cholesterinester zu hydrolysieren. Die Bindung des Esters an ein Protein inhibiert ganz offensichtlich die Einwirkung der Esterase, weshalb ein Hilfsmittel erforderlich ist, um den Protein-Esterkomplex aufzuspalten, bevor das Enzym auf den Ester einwirken kann.

Aus der US-PS 3 869 349 ist ein verbessertes Verfahren für die Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern bekannt, bei dem zur Hydrolyse ein Reagens mit einem Lipasepräparat verwendet wird, das Cholesterinesterase-Aktivität aufweist sowie eine Protease. Der Patentschrift ist kein Hinweis darauf zu entnehmen, daß anstelle der Protease auch eine oberflächenaktive Verbindung verwendet werden kann.

Aus der US-PS 3 703 591 ist ferner die Verwendung einer Kombination aus einer Lipase und einer Protease für die Hydrolyse von Serum- (d.h. Protein-gebundenen) Triglyceriden bekannt. In der

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Patentschrift findet sich kein Hinweis auf die Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung entweder in Kombination mit oder als Ersatz für die Protease bei der Hydrolyse der Cholesterinester.

Aus der US-PS 3 759 793 ist des weiteren die Hydrolyse von Serumtriglyceriden unter Verwendung einer Lipase von Rhizopus arrhizus bekannt, die offensichtlich identisch ist mit der Lipase, die in der US-PS 3 703 591 vorgeschlagen wird. Jedoch besteht im Falle der US-PS 3 759 793 nicht das Erfordernis der Verwendung einer Protease. Die Gründe für diese offensichtliche Anomalität sind unklar. Aus der GB-PS 1 395 126, die auf die gleiche Patentinhaberin zurückgeht, ergibt sich jedoch, daß die in der US-PS 3 759 793 vorgeschlagene Hydrolysemethode sehr langsam verläuft. In der GB-PS 1 395 126 wird ein verbessertes Verfahren für die Hydrolyse von Triglyceriden mit der vorerwähnten Rhizopus arrhizus-Lipase beschrieben, bei dem die Triglyceride mit der Lipase in einem Puffer sowie in Gegenwart einer Carboxylesterase und einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetallalkylsulfat, dessen Alkylrest 10 bis 15 Kohlenstoffatome aufweist, in Kontakt gebracht werden. Als bevorzugtes Alkylsulfat wird Natriumdodecylsulfat angegeben. In der Patentschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß die Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung allein in Abwesenheit einer Carboxylesterase die Hydrolase-Aktivität von Triglyceriden stimuliert.

Aus einer Arbeit von Ari, Helenius und Kai Simons, veröffentlicht in der Zeitschrift "Biochemistry", Band 10, Nr. 13 (1971) ist ferner ein Verfahren zur Entfernung aller hauptsächlicher Lipide aus menschlichem Plasma mit Lipoproteinen vergleichsweise geringer Dichte bekannt, bei dem das menschliche Plasma mit einer hohen Konzentration an natürlichen und synthetischen oberflächenaktiven Stoffen behandelt wird. Die Lipid-Entfernung erfolgt aus Gründen der Kennzeichnung der Lipid-freien Proteingruppe von Lipoproteinen vergleichsweise niedriger Dichte menschlichen Plasmas In der Literaturstelle findet sich kein Hinweis darauf, daß die Kombination einer oberflächenaktiven Verbindung und einer Lipase zu einem vorteilhaften analytischen Reagens führt, das die Be-

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Stimmung des Cholesteringehaltes von Serum vereinfacht und das durch die Kombination dieser beiden Komponenten ein schnell durchführbares und genau arbeitendes Hydrolyseverfahren ermöglicht wird sowie ein stabiles Reagens herstellbar ist.

Aus der US-PS 3 689 364 ist schließlich, ein Verfahren zur Bestimmung von Lipase in Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blutserum bekannt, bei dem eine "freie" Triglyceridemulsion als Substrat für die Lipase verwendet wird. Aus der Patentschrift ergibt sich des weiteren, daß die Gallensalze, welche die Substratemulsion von "freien" Triglyceriden stabilisieren (d.h. Triglyceriden, die nicht an Proteine gebunden sind) gleichzeitig einen "aktivierenden Effekt" auf die zu analysierende Lipase ausüben, sofern es sich bei dieser um eine pancreatische Lipase handelt. Der aktivierende Effekt führt dabei ganz offensichtlich zu einem Anstieg der hydrolytischen Aktivität der Lipase auf die freien Triglyceride der Substratemulsion. In der Patentschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß derartige Gallensalze einen Effekt auf Lipasepräparate haben, wenn diese mit Lipid-gebundenen Proteinen in Kontakt gebracht werden, wie sie im Blutserum vorliegen. Insbesondere findet sich in der Patentschrift kein Hinweis darauf, daß derartige Lipasen an Proteine gebundene Cholesterinester zu hydrolysieren vermögen.

Aus der US-PS 3 898 130 ist schließlich ein Verfahren zur Hydrolyse von Triglyceriden bekannt, bei dem Triglyceride mit einem Reagens in Kontakt gebracht werden, das im wesentlichen aus einer Mischung aus einer mikrobiologischen Lipase, insbesondere Candida Lipase (sie.)» einer pancreatischen Lipase und einem Gallensalz besteht. Das Gallensalz kann dabei bestehen aus Natriumtaurodeoxycholat, Taurocholat, Taurochenodeoxycholat oder Taurodehydrocholat. Sowohl die mikrobiologischen als auch die pancreatischen Lipaseenzyme sind kritische Komponenten des Hydrolyse-Reagens.

Aus der DT-OS 2 522 432 ist weiterhin ein enzymatisches Verfahren für die Hydrolyse von Cholesterinestern bekannt, bei dem eine Cholesterinesteras· von Pseudotonas fluorescens verwendet wird.

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In der Offenlegungsschrift findet sich jedoch kein Hinweis auf die Verwendung oder auf die Notwendigkeit der Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung, um eine Hydrolyse der Proteingebundenen Cholesterinester zu erreichen.

Aus der FR-PS 2 223 696 und der US-PS 3 925 164 ist weiterhin ein Verfahren für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von Blutserum bekannt, bei dem Cholesterinester mit einem Enzympräparat aus Candida rugosa, Rhi ζopus oder Aspergillus in Gegenwart einer oberflächenaktiven Verbindung hydrolysiert werden. Die einzige in den Patentschriften vorgeschlagene oberflächenaktive Verbindung ist Hydroxypolyäthoxydodecan. Wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt, sind oberflächenaktive Verbindungen dieses Typs nicht so wirksam wie die erfindungsgemäß zur Hydrolyse vorgeschlagenen Verbindungen, möglicherweise aufgrund ihrer Unverträglichkeit mit der Cholesterinesterhydrolase.

Aus der DT-OS 2 509 156 ist ferner ein enzymatisches Verfahren für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes einer Flüssigkeit bekannt, bei dem als Cholesterinester-Hydrolysemedium Cholesterinesterase und eine Gallensäure oder ein Salz einer Gallensäure verwendet wird. Die Cholesterinesterase ist dabei identifiziert als EC 3.1.1.13, die sich von Nocardia restrictus ableitet. In der Offenlegungsschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß die hier beschriebenen synthetischen oberflächenaktiven Verbindungen vorteilhafte Effektoren für Cholesterinesterase sind.

Aus der BE-PS 811 728 schließlich ist ein Reagens für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes biologischer Flüssigkeiten bekannt, das besteht aus (1) einer Mischung aus einem chemischen System mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem chemischen System mit Cholesterinoxidase-Aktivität sowie (2) Mitteln für die

4 Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder _Δ -Cholesten-3-on. In der Patentschrift wird angegeben, daß dem Reagens vorzugsweise eine oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wird, die praktisch sämtliches vorhandenes freies Cholesterin in der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe löslich macht, da freies Cholesterin nur wenig

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löslich in Flüssigkeiten, beispielsweise wäßrigen Lösungen ist. In der Patentschrift wird dann jedoch des weiteren angegeben, daß das Enzym Cholesterinesterhydrolase die Verwendung eines Enzym-co-Faktors auf Gallenbasis erfordert und daß, wenn die Cholesterinesterhydrolase und ein Co-Faktor auf Gallenbasis verwendet wird, die Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung nicht zweckmäßig ist.

Im übrigen findet sich in der BE-PS 811 728 kein Hinweis auf die Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung des Typs, der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß Protein-gebundene Cholesterinester in einer vergleichsweise kurzen Zeitspanne einer Größenordnung von weniger als etwa 10 Minuten (vorzugsweise in etwa 5 Minuten) hydrolysiert werden können, wenn man die Proteingebundenen Cholesterinester mit einer verträglichen Mischung aus einem Lipasepräparat mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette mit weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Protein-gebundene Cholesterinester in einem wäßrigen Medium mit einer verträglichen Mischung aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Verwendung einer beträchtlich größeren Anzahl von Enzympräparaten als Cholesterinesterhydrolyseagenzien, als es bei den bekannten Verfahren des Standes der Technik möglich ist. Infolgedessen können Materialien geringerer Kosten dazu verwendet werden, um Reaktionszeiten zu erreichen und vollständige Reaktionsablaufe, die mindestens gleich sind und oftmals vorteilhafter als jene, die sich bei Verwendung der bekannten Methoden und bekannten Reagenzien erreichen lassen.

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-TO-

Wie im Vorstehenden erörtert, gibt es Enzympräparate, welche die Hydrolyse von freiem Cholesterin katalysieren. Diese Präparate katalysieren jedoch die Hydrolyse von Cholesterinestern, die an Proteine gebunden sind, wie sie beispielsweise im Blutserum vorkommen, nur in sehr geringem Umfange oder unvollständig. Die Ursache hierfür ist ganz offensichtlich wenigstens zum Teil auf den Protein-Lipidkomplex zurückzuführen, der das Enzym daran hindert, die Hydrolyse in üblicher Weise zu katalysieren. In der Literatur wird die Verwendung von als "Effektoren" bezeichenbaren Substanzen vorgesdilagen, d.h. Verbindungen, welche die Geschwindigkeit erhöhen, mit der Lipase-Materialien Protein-gebundene Cholesterinester zu hydrolysieren vermögen. Obgleich der Mechanismus, nach dem derartige Verbindungen wirken, noch nicht restlos geklärt ist, wird doch angenommen, dnß sie den Ester-Proteinkomplex in gewisser Weise aufzuspalten vermögen und den Ester für die Hydrolyse in üblicher Weise "befreien". So wurden beispielsweise für diesen Zweck Proteaseenzyme vorgeschlagen.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bestimmte oberflächenaktive Verbindungen Effektoren darstellen und anstelle von Protease verwendet werden können, um Enzympräparate in wirksame Hydrolysier-Reagenzien für Protein-gebundene Cholesterinester zu überführen, die normalerweise nicht in der Lage wären die Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern zu katalysieren oder die eine solche Hydrolyse lediglich mit unerwünscht niedrigen Reaktionsgeschwindigkeiten zu katalysieren vermögen. Da des weiteren Protease dazu neigt Bindemittel auf Protelnbasis, wie beispielsweise Gelatine, abzubauen, die zur Herstellung mehrschichtiger Elemente verwendet werden, die wiederum für die Bestimmung bestimmter Substanzen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der BE-PS 801 742 beschrieben werden, eignen sich die erfindungsgemäß verwendbaren Mischungen insbesondere für die Herstellung derartiger analytischer Elemente.

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Gegenstand der Erfindung ist demzufolge des weiteren ein Reagens für die Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern, gekennzeichnet durch eine verträgliche Mischung aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterase-Aktivität und einer oberflächenaktiven Verbindung aus einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten als Effektor.

Erfindungsgemäß verwendbare Enzympräparate sind solche, die eine Hydrolaseaktivität gegenüber freien (d.h. Nicht-Proteingebundenen) Cholesterinestern aufweisen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei Lipasepräparate erwiesen, die eine derartige Aktivität aufweisen.

Ein geeignetes Auswahlverfahren für die Bestimmung der Cholesterinesterhydrolase (Esterase)-Aktivität eines Enzympräparates, insbesondere eines Lipasepräparates besteht darin, eine bestimmte Menge des Enzympräparates zu einer standardisierten Cholesteryllinoleatlösung eines pH-Wertes von 7,0 zuzugeben, die Mischung bei 37⁰C unter Stickstoff 2 Stunden lang zu inkubieren und die Estermenge zu bestimmen, die in der Lösung verblieben ist, und zwar unter Anwendung der Hydroxylamin-Methode, die von J. Vonhoeffmyr und R.Fried in der Zeitschrift Z. Klin. Chem. U. Klin. Biochem., 8: (1970), 134 beschrieben wird. Nach dieser Methode wird jedes Präparat, das eine Cholesterinesterase-Aktivität aufweist, die über etwa 25 mg/dl Cholesterin in dem Auswahlverfahren freisetzt, als geeigneter Kandidat für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angesehen.

Geeignete Enzympräparate für die Cholesterinesterhydrolyse können pflanzlichen wie auch tierischen Ursprungs sein. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von mikrobiologischen Präparaten erwiesen, beispielsweise von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum, und zwar in roher als auch gereinigter Form. Andere vorteilhafte Enzympräparate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung werden beispielsweise in den US-PS 2 888 385, 3 168 448, 3 189 529, 3 262 863 und 3 513 073 beschrieben.

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Besonders vorteilhafte, im Handel erhältliche Enzympräparate für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind Weizenkeim-Lipasepräparate, beispielsweise der Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana, USA, das Präparat Lipase 3000 von der Firma Wilson Laboratories, das Präparat Steapsin von der Firma Sigma Chemical Company (bei den beiden zuletzt genannten Präparaten handelt es sich um pancreatische Enzyme) und das Präparat Lipase M (von Candida rugosa) von der Firma Enzyme Development Company, USA.

Gewisse oberflächenaktive Verbindungen inhibieren die Cholesterinesterase-Aktivität von bestimmten Enzympräparaten. Infolgedessen ist es wichtig, daß bevor ein Enzympräparat mit einer oberflächenaktiven Verbindung kombiniert wird, die Verträglichkeit der beiden Komponenten miteinander festzustellen. Die Verträglichkeit läßt sich in vorteilhafter Weise nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren ermitteln.

Eine Mischung eines Enzympräparates und einer oberflächenaktiven Verbindung, die den im folgenden beschriebenen Testbedingungen genügt, wird hier als verträgliche Mischung bezeichnet, wobei jede Komponente der Mischung mit der anderen Komponente verträglich ist.

Hydrolysepräparate der Erfindung sind durch das Testverfahren gekennzeichnet, das in dem später folgenden Vergleichsbeispiel II beschrieben wird.

Die zu untersuchende oberflächenaktive Verbindung wird normalem menschlichen Serum zugesetzt. Eine Probe des zu untersuchenden Enzympräparates wird dann zugesesetzt, worauf die Mischung etwa 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 37⁰C inkubiert wird. Dann werden gleiche Teile (0,1 ml) der Lösung mit Wasser auf 1,9 ml verdünnt und 10 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad gebracht. Cholesterin wird in einem Gesamtvolumen von 1,2 ml nach dem bekannten Cholesterinoxidase-Bestimmungsverfahren, das im folgenden noch beschrieben werden wird, bestimmt. Gleichzeitig wird ein entsprechen-

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der Vergleichs-"test" durchgeführt, bei dem lediglich das Enzympräparat ohne die oberflächenaktive Verbindung getestet wird. Bei Durchführung des Testverfahrens hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen des weiteren einen Test mit einer Lösung durchzuführen, die alle Komponenten der Mischung bis auf das Enzympräparat enthält, so daß eine jede Reaktion, die auf freies Cholesterin zurückzuführen ist oder auf andere Komponenten des Serums subtrahiert werden kann. Die bevorzugten Enzympräparate bewirken eine Hydrolyse von mindestens 701 der verfügbaren Cholesterinester in weniger als 10 Minuten. Besonders vorteilhaft sind solche Präparate, die zu einer noch weitgehenderen und praktisch vollständigen Hydrolyse führen, d.h. einer Hydrolyse von mindestens etwa 90S der verfügbaren Cholesterinester in weniger als etwa 10 Minuten.

Aus Versuchen dieses Typs ergab sich, daß Phenoxypolyäthoxyäthanole besonders überlegene Effektoren sind. Als besonders vorteilhaft haben sich solche Veriindungen und Stoffe erwiesen, die im Handel unter den Handelsbezeichnungen Triton X-114, 100, 102 und Triton n-101, Hersteller Rohm und Haas Company, USA, erhältlich sind.

Besonders vorteilhafte Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole sind solche mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten.

Wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt, bewirken Verbindungen ähnlicher Struktur nicht die erfindungsgemäß erzielbare vorteilhafte Hydrolyse.

Als besonders vorteilhafte Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens haben sich solche erwiesen, deren Alkylreste entweder 8 oder 9 Kohlenstoffatome aufweisen.

Wie in den später folgenden Beispielen gezeigt werden wird, führen oben erwähnte oberflächenaktive Verbindungen de;; Standes der Technik nicht zu einer praktisch venvendbaren starken Dissoziation, wenn sie mit Enzympräparaten kombiniert werden. Zu diesen nicht geeigneten oberflächenaktiven Verbindungen gehören beispielsweise die Hydroxypolyäthoxydodecane, wie sie beispielsweise aus der

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FR-PS 2 223 696 und der US-PS 3 925 164 bekannt sind. (In der später folgenden Tabelle I sind Beispiele für geeignete Hydrolysepräparate zusammengestellt.)

Die Konzentration der Enzympräparate und oberflächenaktiven Verbindungen in den erfindungsgemäß verwendbaren verträglichen Mischungen kann sehr verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale Konzentration kann von verschiedenen Faktoren abhängen, wie beispielsweise der Reinheit der Enzympräparate, der Aktivität der Enzympräparate, der Natur des gebundenen Cholesterinesters, der im Einzelfalle verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und dergleichen. Ganz allgemein jedoch hat sich gezeigt, daß vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten werden, wenn die Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung bei etwa 0,25 bis etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des wäßrigen Mediums oder der analytischen Lösung liegt. Ganz besonders vorteilhafte Konzentrationen liegen bei etwa 0,5 bis 5 Gew.-S oberflächenaktive Verbindung, bezogen auf das Gewicht des wäßrigen 'lediums oder der analytischen Lösung.

Die Konzentration des Enzympräparates kann ebenfalls verschieden sein. Als besonders vorteilhaft haben sich Konzentrationen von etwa 10 bis etwa 80 mg Enzympräparat pro ml wäßrigen Mediums oder analytischer Lösung erwiesen, beispielsweise dann, wenn handelsübliche Präparate verwendet werden.

Die erfindtingsgemäß verwendbaren Hydrolysepräparate können in Form von üblichen bekannten analytischen Elementen mit einer oder mehreren absorbierenden Schichten oder anderen analytischen Elementen (beispielsweise Testpapieren) des Standes der Technik verwendet werden, i\robei nach üblichen bekannten Methoden gearbeitet v/erden kann.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die erfindungsgemäß verwendbaren Hydrolysepräparate in einer oder mehreren Schichten eines mehrschichtigen analytischen Elementes des Typs untergebracht, der beispielsweise aus der BE-PS 801 742 und der US-Pii" 3 902 158 bekannt ist. Derartige Elemente sind für die Analyse von Flüssigkeiten bestimmt und weisen vorzugsweise

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eine nicht-fasrige Ausbreitschicht auf, die eine gleichförmige Konzentration der aktiven Komponenten der zu analysierenden Probe einer Reagens-Schicht zuführt, die mindestens einen Teil der Verbindungen enthält, die in Gegenwart der zu analysierenden Substanz zu reagieren vermögen,und zwar unter Erzeugung eines bestimmbaren Reaktionsproduktes oder einer bestimmbaren Veränderung. Dabei befinden sich die Schichten unter den Verwendungsbedingungen des Elementes in Strömungskontakt miteinander.

Unter einem "Strömungskontakt" zwischen Schichten eines analytischen Elementes ist gemeint, daß ein Strömungsmittel, gleichgültig, ob es sich um eine Flüssigkeit oder ein Gas handelt, in einem solchen Element von übereinanderliegenden Bereichen von der Ausbreitschicht in die Reagens-Schicht gelangen kann. Anders ausgedrückt: Unter einem "Strömungskontakt" ist gemeint, daß die Komponenten eines Strömungsmittels, z.B. einer Flüssigkeit von einer Schicht in die andere Schicht übertreten können, sofern sich die Schichten in Strömungskontakt miteinander befinden. Obgleich derartige Schichten in vorteilhafter Weise einander benachbart sind, ist es doch auch möglich, daß diese Schichten durch Zwischenschichten voneinander getrennt sind. Jedoch verhindern derartige Zwischenschichten, die eine Ausbreitschicht und eine Reagens-Schicht physikalisch voneinander trennen, liicht den Durchtritt eines Strömungsmittels, z.B. einer Flüssigkeit,zwischen den sich in Strömungskontakt befindlichen Ausbreit- und Reagens-Schichten.

Ein "Strömungskontakt" zwischen den Schichten läßt sich erreichen durch Herstellung von Elementen mit Schichten, die von Anfang an einander benachbart/ oder von Anfang an den Übergang von Komponenten der zu analysierenden Probe von einer Schicht in die andere Schicht ermöglichen. Andererseits kann es jedoch auch zweckmäßig sein, Elemente herzustellen, die Schichten aufweisen, die zunächst einander nicht benachbart sind, die vielmehr beispielsweise in einem Abstand voneinander vorliegen und beispielsweise durch Zwischenschichten voneinander getrennt sind, wie es beispielsweise aus der US-PS 3 511 608 bekannt ist oder durch ein elastisches oder zurückspringendes absorbierendes Material oder deformierbare Schichtträger, wie sie beispielsweise, aus den US-PS 3 917 453 und 3 933

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bekannt sind. Weist ein Element zunächst einander nicht benachbarte Schichten auf, so kann es erforderlich sein einen Druck anzuwenden oder andere Maßnahmen zu treffen, um die Schichten des Elementes zum Zeitpunkt der Verwendung des Elementes in einen Strömungskontakt zu bringen.

Gemäß einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Hydrolysepräparat oder Hydrolysereagens in der Ausbreitschicht untergebracht, während ein Bestimmungssystem oder Bestimmungsreagens für die Bestimmung von Cholesterin, beispielsweise eine Cholesterinoxidase und ein Indikator, der auf Wasserstoffperoxid anspricht, in der Reagens-Schicht untergebracht wird.

Die folgende Beschreibung von standardisierten Verfahren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Standard-Verfahren:

Quantitative Bestimmung des Gesamt-Serum-Cholesterins.

Cholesterinester müssen zunächst zu freiem Cholesterin hydrolysiert werden.

Die verwendeten Inkubierungsmischungen enthielten bei einem Gesamtvolumen von 8 ml:

2,4 Einheiten Cholesterinoxidase (N. cholesterolicum), 0,768 mg 4-Aminoantipyren . HCl, 0,256 mg 1,7-Dihydroxynaphthalin, 0,22 mg Peroxidase (125 Purpurogallin-Einheiten/mg), 6,4 mg eines rohen Lipasepräparates und entweder 0,48 mg Protease (B.subtilis (Sigma Corporation Type VII)) oder 160 mg Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-100).

Die Gleichgewichtseinstellung erfolgte durch 5 Minuten langes Erwärmen der Inkubierungsmischungen auf 35⁰C, worauf die Reaktion durch Zusatz von 20 μΐ menschlichen Serums eingeleitet wurde. Nach

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10 Minuten wurde die Absorption bei 490 nm gemessen. Vergleichsröhrchen enthielten sämtliche Komponenten außer dem Serum. Die Gesamt-Cholesterinkonzentrationen ergaben sich aus einer Standardkurve, die erhalten wurde durch Verwendung von gleichen Teilen einer wäßrigen Cholesterin-Standardlösung (Fermco Test Aqueous Cholesterol Standard), Hersteller Fermco Laboratories, Chicago, Illinois, anstelle des Serumsubstrates.

Die angewandte Vergleichsmethode war die Liebermann-Burchard-Methode, die beispielsweise beschrieben wird in "Hawk's Physiological Chemistry", Herausgeber B.L. Oser, 14. Ausgabe,S. 1062-64 Verlag McGraw-Hill Book Company, New York, (1965). Bei dieser Methode erfolgt eine Extraktion des Cholesterins und der Cholesterinester aus dem Serum vor der quantitativen Bestimmung.

Beispiel 1:

Enzymatisch katalysierte Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern in Gegenwart von Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol als oberflächenaktive Verbindung.

Menschliches Serum (20 1) wurde zu 8 ml eines Pufferreagenzes (Gleichgewichtseinstellung bei 37°C), das entweder ein Enzympräparat und eine Protease oder das Enzympräparat und eine oberflächenaktive Verbindung zum Zwecke der Hydrolyse der Cholesterinester enthielt, zugegeben. Nach 10 Minuten wurde die Absorption bei 490 nm gemessen und der Gesamt-Serum-Cholesteringehalt wie oben beschrieben ermittelt.

Der Serum-Cholesteringehalt wurde unter Verwendung des Cholesterinoxidase-Peroxidasesystems quantitativ bestimmt.

Im Falle dieses Systems werden die Cholesterinester zunächst zu freiem Cholesterin hydrolysiert, das dann zu Cholestenon oxidiert wird, unter gleichzeitiger Erzeugung von H₂O₂. Das H₂O₂ wird dann über eine Peroxidasereaktion zur Erzeugung eines Farbstoffes verwendet.

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Es ist bekannt, daß ein rohes Lipasepräparat die Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern hydrolysiert, wenn eine Protease zur Inkubierungsmischung zugegeben wird.

Die in der folgenden Tabelle I zusammengestellten Daten zeigen, daß in Gegenwart von S-I (d.h. einem Octylphenoxypolyäthoxyäthanol mit etwa 10 Äthoxyeinheiten und einer hydrophilen-lipophilen Ausgleichszahl (HLB) von 13,5) eine vollständige Hydrolyse von Cholesterinestern erfolgt. Die oberflächenaktive Verbindung ersetzte die Protease wirksam, wodurch die Notwendigkeit der Verwendung dieses Proteins ausgeschaltet wurde, welches in unerwünschter Weise (1) Proteinkomponenten des Cholesterin-Bestimmungssystems hydrolysieren kann oder (2) den pH-Wert des Systems verändern kann.

Die quantitative Bestimmung des Serum-Cholesteringehaltes mit einem Lipasepräparat und S-1 als hydrolytisches System führte zu Ergebnissen (vergleiche Tabelle I) die in vorteilhafter Weise vergleichbar waren mit der Vergleichsmethode.

Tabelle I

	Gesamt-Serum-Cholesteringehalt	(mg/dl)	Vergleichsmethode
		Lipase 2% S-1	232
Probe	Lipase-Protease (Vergleich)	225	190
1	225	185	176
2	150	180	220
3	150	230
4	240

* Bei dieser Vergleichsmethode handelte es sich um eine halbautomatische Liebermann-Burchard-Methode.

Eine 2lige Konzentration an oberflächenaktiver Verbindung (S-1) führte zu einer vollständigen Hydrolyse, wobei die oberflächenaktive

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Verbindung keine nachteiligen Effekte ausübte. Nachteilige Effekte wurden auch bei Konzentrationen von beispielsweise 41 nicht beobachtet. Obgleich die End-Färbdichten nach 10 Minuten ermittelt wurde, waren die Reaktionen doch bereits nach etwa 5 Minuten bei 37°C vollständig abgelaufen.

Vergleichsbeispiel I

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, unter Verwendung von Alkylphenoxypolyäthoxyäthanolen mit Polyoxyäthylenketten von über etwa 20'Jxyätnyleneinheiteu.Es zeigte sich, daß derartige oberflächenaktive Verbindungen die Cholesterinesterase-Aktivität des Enzymes in gewisser Weise inhibierten.

Vergleichsbeispiel II

Es wurden direkte Vergleichsteste mit einer Cholesterinesterase von Candida rugosa und (a) einer oberflächenaktiven Verbindung wie in der FR-PS 2 223 696 beschrieben und (b) erfindungsgemäß verwendbaren oberflächenaktiven Verbindungen durchgeführt.

Es wurden Inkubierungsmischungen hergestellt, die in einem Gesamtvolumen von 0,6 ml enthielten:

0,5 ml normales menschliches Serum

20 mg Cholesterinesterase (handelsübliche Lipase M von Candida rugosa)

5 μΜοΙβ Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert = 7,0) 10 mg eines Effektors.

Die Umsetzung erfolgte innerhalb von 10 Minuten bei 37°C, worauf 0,1 ml Anteile zu 1,9 ml Wasser zugegeben wurden. Die Mischungen wurden dann 10 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad gebracht. Das Cholesterin wurde dann quantitativ unter Verwendung des Cholesterinoxidase-Peroxidasesystems bestimmt, und zwar unter Verwendung von wäßrigen Cholesterin-Standardlösungen zur Herstellung einer Vergleichskurve. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

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	- 20 -	(4)	lauryl- 157	2,4	% der vorhandenen Menge
	Tabelle II	(23)	lauryl- 157	157	1,5
Effektor		(12)	lauryl- 157	3,4	100
ohne		103	2,2
	mg/dl Cholesterinester tatsächlich gefunden vorhanden	0	65,7
	157		0
	Octylphenoxypolyäthoxy- äthanol 157
	Polyoxyäthylen äther
Polyoxyäthylen äther
Polyoxyäthylen äther

( Die Zahlen in Klammern stehen für die Anzahl der Oxyäthyleneinheiten)

Aus der Tabelle ergibt sich, daß die aus der FR-PS 2 223 696 bekannten Polyoxyäthylenlauryläther, keine ivirksamen Effektoren im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind.

Claims

Reg. Nr. 125 529 PATENTANWÄLTE —- 2 8 O A 3 H.Bartels Dipl.-Chem. Dn Brandes Dr.-lng.Held EASTMAN KODAK COMPANY, 343 State Street, Dipl.-Phys. Wolff Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten VOn Amerika SMÜncl^^ThierschstraBeS Tel.(089)293297 Telex 0523325 (patwo d) Telegrammadresse: Verfahren zur Hydrolyse von Protein-gebundenen woiffpatent,manchen Postscheckkonto Stuttgart 7211 Cholesterinestern (blz 60010070) Deutsche Bank AG, 14/28630 (BLZ 60070070) Bürozeit: 8-12 Uhr, 13-16.30 Uhr außer samstags PATENTANSPRÜCHE 16. Januar 1978 25/2

1.JVerfahren zur Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein-gebundene Cholesterinester in einem wäßrigen Medium mit einer verträglichen Mischung aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Blutserum vorliegenden Protein-gebundenen Cholesterinester hydrolysiert und demzufolge als wäßriges Medium Blutserum verwendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Enzympräparat ein Esterasepräparat mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Esterasepräparat mikrobiologxschen Ursprungs von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum oder Rhiζopus arrhizus verwendet.

ORIGINAL INSPECTED

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5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterasepräparat eine pancreatische Esterase verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit etwa 7 bis etwa 13 Äthoxyeinheiten verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol Octylphenoxypolyäthoxyäthanol verwendet.

8. Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von Blutserum, bei dem die vorhandenen Cholesterinester zunächst hydrolysiert werden und daraufhin der Gesamt-Cholesteringehalt bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cholesterinester in einem wäßrigen Medium mit einer verträglichen Mischung aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzympräparat ein Esterasepräparat mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Esterpräparat mikrobiologischen Ursprungs von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterasepräparat eine pancreatische Esterase verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit etwa 7 bis etwa 13 Äthoxyeinheiten verwendet.

8O9832/07B8

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol verwendet.

14. Reagens für die Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern, gekennzeichnet durch eine verträgliche Mischung eines Enzympräparates mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer PoIyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten.

15. Reagens nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Esterasepräparat mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs enthält.

16. Reagens nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Esterasepräparat mikrobiologischen Ursprungs von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum oder

Rhizopus »rrhizus enthält.

17. Reagens nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es als Esterasepräparat eine pancreatische Esterase enthält.

18. Reagens nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit etwa 7 bis etwa 13 Äthoxyeinheiten enthält.

19. Analytisches Element für die Bestimmung von Cholesterinestern in einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es in mindestens einer Schicht ein Reagens für die Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesttrinestern aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkttte von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten enthält.

20. Element nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ·» «ine Ausbreitschicht und eine Reagens-Schicht aufweist.

21. Element nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzympräparat ein Esterpräparat mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs enthält.

22. Element nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es

als Esterasepräparat ein Präparat mikrobiologischen Ursprungs von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus enthält.

23. Element nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es als Esterasepräparat eine pancreatische Esterase enthält.

24. Element nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es

ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit etwa 7 bis etwa 13 Xthoxyeinheiten enthält.

25. Element nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol enthält.

8U9832/0768