DE2315501A1 - Verfahren zur bestimmung von cholesterin - Google Patents
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Description
.Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Wsicilmanx
Dipl.-Ing. HJ^eickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A."Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 86, DEN HEW " POSTFACH 860 820
int. Hr. 1883 möhlstrasse 22, rufnummer 983921/22
BOEHRIUGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim 51, Sandhofer Str.112-132
Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
Zusatz zu Patent .... ... (Patentanmeldung P 22 24 132.3-52)
Gegenstand des Hauptpatentes ist ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Cholesterin
in wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes HpOp bzw.
Gholestenon bestimmt wird. Um nach diesem Verfahren auch gebundenes
Cholesterin bestimmen zu können, wird in einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens in einem Ansatz
zunächst freies Cholesterin bestimmt, dann Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt.
Das Vorkommen einer Cholesterinesterase ist z.B. für Pankreas,
leber und andere Organe sowie für Mikroorganismen bereits bekannt. Durch die Verwendung einer derartigen Cholesterinesterase
ergibt sich gegenüber einer Verseifung von gebundenem
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Cholesterin durch alkalische Hydrolyse, beispielsweise mit
alkoholischer Kalilauge, der Vorteil einer vollenzymatisehen und damit der medizinischen Routinediagnostik besser zugänglichen
Methode. Bei der chemischen Hydrolyse ergeben sich nämlich Schwierigkeiten bei der anschließenden enzymatischen
Bestimmung, welche eine sorgfältige Aufarbeitung des Hydrolysate vor Durchführung der enzymatischen Bestimmung erfoxderten.
Durch die Verwendung von Chole sterinesterase konnte zwar dieser Nachteil beseitigt werden. Es bestand jedoch bisher die
Schwierigkeit, daß es mehrere Esterasen gibt, die. für die Abspaltung der verschieden langen Pettsäurereste, mit denen das
Cholesterin z.B. im Serum verestert vorliegt, spezifisch sind. Da die bekannten Cholesterinesterasen vor einer Verwendung
in einem Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin erst gereinigt werden mußten, ergab sich hierbei eine Trennung dieser
unterschiedlichen Aktivitäten und eine quantitative Erfassung
des Gesamteholesterins im Serum mit derartigen Chole sterinesterasepräpara ten erwies sich als schwierig.
Hinzu kommt, daß die Reinigung der meist in lipoidmembranen
gebundenen Enzyme umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das schon aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik
kaum in Betracht kommt,
Aufgabe der Erfindung war die Beseitigung dieser^Schwierigkeit
und die Schaffung eines Präparates mit Cholesterinesterasewirksamkeit,
welches auf einfachste Weise erhältlich ist und aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit.· auch für
die Routinediagnostik in Betracht kommt. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Präparat der genannten Art
zu schaffen, welches in der Praxis die .verschieden langen
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lettsäuren am Cholestex^Ln mit-gleicher Geschwindigkeit abspaltet
und diese Abspaltung in so kurzer Zeit vollzieht, daß hierdurch keine merkliche Verzögerung im Routinetest
gegenüber der für die Bestimmung von freiem Cholesterin benötigten Zeit erforderlich ist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin den Mikroorganismus
Candida cylindracea oder ein aus demselben hergestelltes Aufschlußprodukt mit Cholesterinesteraseaktivität zusetzt. Bevorzugt
wird hierbei die Verwendung eines direkt aus dem genannten Mikroorganismus erhaltenen Acetontrockenpulvers.
Bs kann aber auch nicht aufgeschlossener Mikroorganismus oder
eine daraus angereicherte Cholesterinesterase verwendet v/erden.
Bei Candida cylindracea handelt es sich um einen großtechnisch produzierten Mikroorganismus, der seit Jahren aufgrund seiner
Iripaseaktivität im Handel erhältlich ist und technologisch angewendet wird. Die gebräuchliche Handelsform dieses Mikroorganismus
in Form eines mit Lactose stabilisierten Trockenpulvers (Acetontrockenpulver) erwies sich als besonders gut
geeignet für das Verfahren der Erfindung.
Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Peststellung, daß der genannte Mikroorganismus eineCholesterinesterase von
außerordentlicher Aktivität enthält. Es ist ohne weitere !Reinigung dieses Mikroorganismus möglich, durch Zusatz .
einer sehr geringen Menge desselben unter pH-Wert- und Temperaturbedingungen wie sie bei der enzymatischen CholesterinbeStimmung
zur Anwendung kommen, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung von Cholesterin aus seinen
Estern zu erzielen.
409847/0443
Wie bereits erwähnt, sind die"handelsüblichen Formen von
Candida cylindracea für das Verfahren der Erfindung besonders
geeignet. Diese handelsüblichen Formen sind üblicherweise mit Kohlehydraten wie Lactose stabilisiert. Bei den
im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommenden sehr geringen Mengen des Mikroorganismus bzw. seines
Trockenpräparates stören derartige Stabilisierungsmittel die
Cholesterinbestimmung nicht und können vernachlässigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann im Rahmen der Erfindung auch ein angereichertes Proteinpräparat mit Cholesterinesterase verwendet
werden. Eine derartige Anreicherung kann beispielsweise vom handelsüblichen Acetontrockenpulver ausgehen und
aus einer Dialyse, Behandlung mit'schwach-basischem Anionenaustauscher
und Ammoniumsulfatfraktionierung bestehen., Auf
diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 30-faehe Anreicherung der Cholsterinesterase. Günstige Ergebnisse wurden erzielt,
wenn zuerst eine Behandlung mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizierten Dextranpräparat, anschließend
eine Ammoniumsulfatfraktionierung, bei der die Fraktion
1,8 bis 2,4 molar gewonnen wurde, und anschließende Chromatographie' dieser Fraktion auf dem vorstehend genannten
Austauschermaterial durchgeführt wurde.
Die erfindungsgemäß verwendete Cholesterinesterase aus Candida cylindracea weist im schwach-sauren Bereich zwischen
pH 5 und 6,5 sehr gute Stabilität auf. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,5. Eine Besonderheit des Enzyms liegt
darin, daß ein besonders guter Ablauf der katalytischen Reaktion bei relativ hohem Salzgehalt des Reaktionsmediums
erfolgt. Vorzugsweise wird daher in einer 0,2 bis 0,8 M, insbesondere
0,4 bis 0,6 M, Pufferlösung gearbeitet. Der pH-Wert kann im Bereich zwischen 4,5 un<i 7,5 liegen, vorzugsweise
im oben erwähnten Bereich pH 5 bis 6,5·
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Die verschiedenen Möglichkeiten zur Ausführung der CholesterinbeStimmung
sind im oben erwähnten Hauptpatent ausführlich beschrieben. Prinzipiell kann der Sauerstoffverbrauch, die
HpOp-Bildung oder die Cholestenonbildung gemessen werden.
Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise gaschromatographiseh, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren
erfolgen. Dies'e Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann titrimetrisch,
potentiometriseh, polarograph!sch und colorimetrisch
sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase,
insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen wie Acetylaceton und niedrigen Alkoholen
oder die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens wie 2,2f-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon
wird mit Hilfe von Ketoreagenzien, z.B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin bestimmt.
Gegenstand der Erfindung ist weiter auch ein Reagens zur Bestimmung
von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von H2Op oder einem System zur
Bestimmung von Cholestenon und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, bei dem das Mittel zur Verseifung
von verestertem Cholesterin aus Candida cylindracea, insbesondere in Form eines Acetontrockenpulvers desselben
oder einer aus demselben erhaltenen Proteinfraktion mit Cholesterinesteraseaktivität besteht. In einer ersten bevorzugten
Ausführungsform besteht dieses Reagens aus Choleste-.rinoxydase,
einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit,
Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform besteht das Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterin-
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esteraseaktivität, Peroxydase,· Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure
bevorzugt.
Gemäß einer v/eiteren bevorzugten Ausführungsforra besteht
das erfindungsgemäße Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirk-·
samkeit und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden
Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer.
Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen können
außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächen,
aktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind
dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxyd
bzw. Cholestenon üblich.
Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:
1. 13 bis 150 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Aeetontrockenpulver (bezogen auf das Protein),
2 χ 104 bis 5 x 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionenhaltigem
Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise
Hydroxypolyäthoxydodecan. ·
■f
2. 3 bis 40 TJ Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida eylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein),
409842/0443
sowie 2 χ 102 bis 1 χ 10* U Peroxydase, 50 bis 200 mg
2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls
0,05 bis 0,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise
Hydroxypolyäthoxydodecan, in 100 ml Puffer pH 6 bis 8.
3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein),
1 bis 5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitropheny!hydrazin
sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel.
4. 2 bis 100 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindraeea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein),
sowie gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml
Puffer pH 5 bis 9» vorzugsweise in 0,5 m Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem
Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedingungen der CholesterinbeStimmung mit Cholesterinoxydase
erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem
Zusatz von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 und 0,3 mg erzielt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
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In Serum wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 der deutschen
Patentanmeldung P 22 24 152.3-52 beschriebenen Verfahrens der Gehalt an freiem Cholesterin zu 63 mg$ (63 mg in
100 ml) bestimmt. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin wurde eine Vergleichsprobe des Serums 30 Minuten mit alkoholischer
Kalilauge bei 7O0C behandelt. Nach Neutralisation und erneuter Messung des vorhandenen Cholesterins ergab sich
ein Gesamtgehalt von 181 mg$ Cholesterin. Hieraus ergibt sich,
daß 118 mg Cholesterin/100 ml in gebundener Form vorlagen.
Das Verfahren wurde mit unbehandeltem Serum wiederholt, jedoch wurden zu Beginn der Bestimmung 0,3 mg (bezogen auf
das Protein) Candida cylindracea-Acetontrockenpulver in handelsüblicher
Form zugesetzt. Nach 3 Minuten ergab die polarographische Bestimmung einen Gehalt von 183 mg$ Gesamt-Cholesterin.
Das Verfahren von Beispiel 2 des Stammpatentes wurde wiederholt unter Zusatz von 0,1 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver.
Die erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich des Gehaltes an gebundenem Cholesterin standen in guter Übereinstimmung
mit den durch alkalische Verseifung erhaltenen Resultaten. Dies zeigt, daß keine Störung der üblichen Wasserstoff
peroxydnachweisreaktion vorliegt.
Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn gemäß Beispiel 4 des Stammpatentes gebildetes Cholestenon bestimmt
wurde und in Gegenwart von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver
gearbeitet wurde. . ■ . .
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Zur Anreicherung der Cholesterinesteraseaktivität wurde handelsübliches Acetontrockenpulver von Candida cylindracea
in Kaliumphosphatpulver pH 6,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach Entfernung der als Stabilisierungsmittel
enthaltenen Lactose ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 0,3 U/mg Protein in der dialysierten
Lösung.
Die so erhaltene Lösung wurde mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen
modifizierten Ionenaustauscher auf Dextranbasis verrührt, der Austauscher abgetrennt und mit 0,2 M
Phosphatpuffer pH 6,0 eluiert. Im-Eluat ergab sich eine spezifische
Cholesterinesteraseaktivität von 1,2 U/mg.
Die so erhaltene Lösung wurde einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die zwischen 1,8 und 2,4 M Ammoniumsulfat ausfallende
Proteinfraktion wurde abgetrennt. Sie wies eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 2,5 U/mg auf.
Das erhaltene Produkt wurde erneut in Phosphatpuffer pH 6,0
aufgelöst, gegen den gleichen Puffer bis zur Salzfreiheit dialysiert und dann über eine Säule, die mit dem gleichen
Anionenaustauscher wie oben angegeben gefüllt war, chromatographiert.
Die Elution erfolgte wiederum mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0. In der Fraktion mit Cholesterinesteraseaktivität
ergab sich eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein.
Das so erhaltene angereicherte Cholesterinesterasepräparat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in der Cholesterinbestimmung
eingesetzt. Die eingesetzte Menge betrug jedoch lediglich 0,001 mg, bezogen auf Protein. Das Ergebnis entsprach dem
von Beispiel. 1.
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- ΊΟ -
Die Cholesterinesterase aus Candida cylindracea kann, nach den
üblichen Methoden der Enzymfeinreinigung weiter gereinigt werden. Anstelle der oben genannten Anreicherungsschritte
können auch andere übliche biochemische Reinigungsschritte '
wie z.B. Fällung bzw. Fraktionierung mit Polyäthylenimin,
organischen Lösungsmitteln oder Salzen, Chromatographie über Molekularsiebmaterialien oder schwache Anionenaustauscher mit
anderen funktioneilen Gruppen als Diäthylaminoäthanolgruppen, Protaminsulfatfällung und dgl. angewandt werden.
Das Aeetontrockenpulver wird unter der Bezeichnung MY-Lipase
von der Firma Welding in Deutschland vertrieben. , Eine Probe dieses Produktes ist in verschlossenem Umschlag
beigefügt.
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Claims (4)
- PatentansprücheVerfahren zur Bestimmung von Cholesterin, wobei dieses n. wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes HpOp oder Cholestenon bestimmt wird gemäß Patent (Patentanmeldung P 22 24 132.3-52), dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit zusetzt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Candida cylindracea in Form eines Acetontrockenpulvers zugesetzt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch Herstellung eines Acetontrockenpulvers aus Candida cylindracea, Behandlung mit einem Anionenaustauscher, Ammoniumsulf atf raktionierung zwischen 1,8 und 2,4 M und Chromatographie über Anionenaustauscher erhaltene Cholesterinesterase zugesetzt wird.
- 4. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von HpOp oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin gemäß Patent . ... ... (Patentanmeldung P 22 24 132.3), dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus Candida cylindracea oder einem daraus hergestellten Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit besteht.409842/0443
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