DE2737287A1

DE2737287A1 - Verfahren zur hydrolyse von blutserumtriglyceriden und/oder blutserumphospholipiden

Info

Publication number: DE2737287A1
Application number: DE19772737287
Authority: DE
Inventors: Theodore Walter Esders; Charles Thomas Goodhue; Christine Ann Michrina
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1976-08-19
Filing date: 1977-08-18
Publication date: 1978-02-23
Also published as: CA1091559A; FR2362399B1; JPS5747484A; JPS5326382A; GB1590737A; JPS5739158B2; FR2362399A1; US4179334A

Description

Dipl.-Chem. Dr. Brandes

Dr.Hng.HeW

Dipl.-Priys.Wotff

8 München 22, ThierschstraBe 8

Reg. Nr. 125 353

^ö Tel.(089)293297

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außer samstags

12. August 1977 25/2

EASTMAN KODAK COMPANY, 343 State Street, Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Hydrolyse von Blutserumtriglyceriden und/oder Blutserumphospholipiden

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Verfahren zur Hydrolyse von Blutserumtriglyceriden und/oder

Blutserumphospholipiden

Üie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Blutseruratriglyceriden und/oder Blutserumphospholipiden, ferner ein Bestimmungsreagenz sowie ein analytisches Element zur Durchführung des Verfahrens.

Bei der Untersuchung von Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutserum auf ihren Triglyceridgehalt, besteht die Anfangsstufe des Verfahrens in einer Hydrolyse der vorhandenen Triglyceride, beispielsweise in einer Hydrolyse der Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin.

Bekannte Verfahren zur Hydrolyse von Triglyceriden verwenden eine starke Base (z.B. KOH oder NaOH) oder aus Gründen der Einfachheit und Selektivität ein Hydrolase-Enzym, d.h. eine Lipase. Die Verwendung von kaustischen Stoffen, wie beispielsweise starken Basen ist unpraktisch und unzweckmäßig. Die bekannten enzymatischen Methoden können demgegenüber für die Hydrolyse von "freien" Triglyceriden geeignet sein, d.h. solchen, die nicht an Proteine gebunden sind. Im Falle von protein-gebundenen Triglyceriden sind die bekannten enzymatischen Methoden jedoch entweder in-effektiv oder sie laufen nur außerordentlich langsam ab. Ganz offensichtlich inhibiert die Bindung der Triglyceride an Proteine die Einwirkung der Hydrolase, weshalb es erforderlich ist, den Protein-Triglyceridkomplex aufzubrechen, bevor die Hydrolase auf die Triglyceride einwirken kann.

Aus der US-PS 3 703 591 ist es bekannt zur Hydrolyse von SErum-Triglyceriden, d.h. protein-gebundenen Triglyceriden eine Kombination aus einer Lipase und einer Protease zu verwenden. Der Patentschrift ist keinerlei Hinweis darauf zu entnehmen, daß sich anstelle der Protease auch eine oberflächenaktive Verbindung verwenden läßt.

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Aus der US-PS 3 759 793 ist des weiteren die Hydrolyse von Serum-Triglyceriden unter Verwendung einer Lipase von Rhizopus arrhizus bekannt, bei der es sich ganz offensichtlich um die gleiche Lipase handelt die auch in dem Verfahren der US-PS 3 703 591 verwendet wird. Zur Durchführung des aus der US-PS 3 759 793 bekannten Verfahrens ist jedoch die Verwendung einer Protease nicht erforderlich . Die Gründe hierfür sind nicht bekannt. Aus der GB-PS 1 395 126, die auf den gleichen Patentinhaber zurückzuführen ist, ergibt sich jedoch, daß das in der US-PS 3 759 793 bekannte llydrolyseverfahren sehr langsam abläuft. In der GB-PS 1 395 126 wird ein verbessertes Verfahren zur Hydrolyse von Triglyceriden mit Lipase von Rhizopus arrhizus beschrieben, bei dem die Triglyceride mit der Lipase in einem Puffer sowie in Gegenwart von Carboxylesterase und einem Alkalimetall- oder Erdalkalialkylsulfat mit einem Alkylrest von 10 bis 15 C-Atomen in Kontakt gebracht werden. Die Patentwürdigkeit des in der GB-PS 1395 126 beschriebenen Verfahrens wird damit begründet, daß es schneller abläuft als die früher bekanntgewordenen enzymatischen Verfahren, insbesondere das in der US-PS 3 759 793 beschriebene Verfahren. Das bevorzugt verwendete Alkylsulfat ist das Natrium-Dodecylsulfat. In der Patentschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß die Verwendung der oberflächenaktiven Verbindung allein in Abwesenheit von Carboxylesterase die Lipase-Aktivität stimuliert. Tatsächlich wird in den später folgenden Beispielen gezeigt, daß die Verwendung von mindestens einigen der hier beschriebenen stimulierenden oberflächenaktiven Verbindungen die Aktivität von Lipase von Rhizopus arrhizus inhibiert.

Aus der Zeitschrift Biochemistry, Band 10, 1971, Nr. 13 ist des weiteren ein Verfahren zur Entfernung der wesentlichen Lipide aus menschlichem Plasma-Lipoprotein niedriger Dichte bekannt, das darin besteht, daß man das menschliche Plasma mit einer hohen Konzentration an natürlichen und synthetischen oberflächenaktiven Verbindungen behandelt. Die Lipid-Entfernung erfolgt dabei zum Zwecke der Charakterisierung der Üpid-freien Proteingruppe des im menschlichen Plasma vorhandenen Lipoproteins niedriger Dichte.

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In der Literaturstelle findet sich kein Hinweis darauf, daß die kombinierte Anwendung einer oberflächenaktiven Verbindung und einer Lipase zu einem analytischen System führen würde, bei dessen Anwendung sich die Bestimmung des Triglyceridgehaltes des Serums vereinfachen würde, und zwar durch Schaffung einer schnell und genau arbeitenden Hydrolysemethode und eines stabilen Bestimmungsreagenzes.

Aus der US-PS 3 689 364 ist des weiteren ein Verfahren zur Bestimmung des Lipasegehaltes von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blutserum bekannt, das eine "freie" Triglycerid-Emulsion als Substrat für die Lipase verwendet. Der Patentschrift ist zu entnehmen, daß die Gallensalze, die die Substrat-Emulsion von "freiem" Triglycerid (d.h. Triglyceriden, die nicht an Protein gebunden sind) stabilisieren, gleichzeitig einen "aktivierenden Effekt" auf die zu bestimmende Lipase ausüben, wenn diese eine pancreatische Lipase ist. Der aktivierende Effekt bewirkt dabei ganz offensichtlich eine Verstärkung der hydrolytischen Aktivität der Lipase auf die freien Triglyceride der Substrat-Emulsion. In der Patentschrift findet sich jedoch kein Hinweis darauf, daß derartige Gallensalze einen Effekt auf Lipase-Präparate ausüben, wenn sie mit an Proteine gebundenen Lipiden in Kontakt gebracht werden, wie sie im Blutserum vorkommen.

Aus der US-PS 3 898 130 ist des weiteren ein Verfahren zur Hydrolyse von Triglyceriden bekannt, das darin besteht, daß man die Triglyceride mit einem Reagenz in Kontakt bringt, das aus einer Mischung aus einer mikrobiologischen Lipase, insbesondere Candida-Lipase, einer pancreatischen Lipase und einem Gallensalz besteht. Sowohl das mikrobiologische wie auch das pancreatische Lipase-Enzym sind kritische Komponenten des Hydrolysereagenzes.

Aus der UT-OS 2 522 432 ist weiterhin ein enzymatisches Verfahren zur Hydrolyse von Cholesterinestern unter Verwendung einer Cholesterin-Esterase von Pseudomonas fluorescens bekannt.

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Die Hydrolyse von Cholesterinestern unter Verwendung einer Cholesterin-Bsterase von Candida rugosa, Rhizopus und Aspergillus ist ferner aus der US-PS 3 925 164 bekannt. Der Patentschrift ist zu entnehmen, daß der Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung die Aktivität der Esterase erhöht.

Aus der US-PS 3 862 009 ist überdies ein Triglycerid-Hydrolysereagenz bekannt, das als wesentliche Bestandteile eine Lipase, eine Carboxylesterase und ein Alkylsulfat enthält. In Beispiel 2 dieser Patentschrift werden die verschiedensten Kombinationen der angegebenen drei Komponenten getestet. Dabei wird der Schluß gezogen, daß die Verwendung einer Lipase und einer oberflächenaktiven Verbindung (Dodecylsulfat) allein zu keinen verwertbaren Ergebnissen führt.

Aus der US-PS 3 894 844 schließlich ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden bekannt, bei dem eine Behandlung mit Isopropanol zur Dissoziierung der Lipide vom Lipoprotein erfolgt.

Der Erfindung lag nun die Erkenntnis zugrunde, daß sich proteingebundene Blutserumtriglyceride und Blutserumphospholipide leicht in einer vergleichsweise kurzen Zeitspanne in einer Größenordnung von weniger als 10 Minuten (vorzugsweise in etwa 5 Minuten) hydrolysieren lassn, wenn man sie mit einer verträglichen Mischung aus einem Lipase-Präparat, das Triglycerid-Hydrolase-Aktivität aufweist und einem aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor in Kontakt bringt.

Die Erfindung ermöglicht die Venvendung von beträchtlich mehr Lipase-Präparaten als hydrolysierende Agenzien als es bei dem bekannten Verfahren des Standes der Technik bisher möglich war. Infolgedessen ist es erfindungsgemäß möglich, vergleichsweise billige Substanzen dazu zu verwenden, um Reaktionszeiten und Reaktionsabläufe zu erreichen, die mindestens gleich sind den Reaktionszeiten und Reaktionsabläufen, die nach den bekannten Methoden des Standes der Technik· tu erzielen sind.

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Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß es eine große Anzahl von Enzym-Präparaten, insbesondere Lipase-Präparaten gibt, welche, obgleich sie die Hydrolyse von freien Triglyceriden zu katalysieren vermögen, offensichtlich nicht in der Lage sind, die Hydrolyse von an Protein gebundenen Triglyceriden, wie sie beispielsweise im Blutserum vorliegen, zu hydrolysieren. i)ies ist ganz offensichtlich die Folge der Protein-I.ipid-Birdung, welche die Lipasa daran hindert, katalytisch auf die Hydrolyse einzuwirken.

In der Literatur wird die Verwendung von so?. "Effektoren" vorgeschlagen, d.h. Verbindungen, die den Grad, zu dem Lipase-Prüparate protein-gebundene Lipide zu hydrolysieren vermögen, erhöhen. Obgleich der Reaktionsmechanismus, nach dem derartige Verbindungen wirksam werden,noch nicht bekannt ist, wird angenommen, dai3 sie die Proteinbindungen angreifen oder auf diese einwirken und die Triglyceride für eine Hydrolyse in üblicher Weise "freimachen. Bekannt für diesen Zweck sind Protease-Enzyme.

Es wurde gefunden, daß bestimmte oberflächenaktive Verbindungen wirksame Effektoren darstellen und als Ersatz oder Substituenten für Protease verwendet werden können und daß sie Enzym-Präparate, die normalerweise die Hydrolyse von Triglyceriden nicht katalysieren oder höchstens sehr langsam katalysieren, in wirksame Enzym-Präparate für die Hydrolyse von protein-gebundenen Lipiden, beispielsweise Triglyceriden, überführen können. Da des weiteren Protease dazu neigt, Bindemittel auf Proteinbasis, beispielsweise Gelatine abzubauen, welche zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente des aus der BE-PS 801 742 bekannten Typs geeignet sind, eignen sich die im folgenden beschriebenen Bestimmungsreagenzien insbesondere zur Herstellung derartiger analytischer Elemente.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Hydrolyse von Blutserumtriglyceriden und/oder Blutserumphospholipiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Triglyceride und/oder Phoipholipide mit einem Reagenz, bestehend aus einer verträglichen Mischung aus einer Lipase und einem aus einer

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ohcrflächenukti ναι \ erbi nduiitf bestehenden HfTeKtOi ir, Kontakt hriujt.

(lemäf einer besonders vorteilhafter. Ausgestal ttinj' clnr hrfindunⁿ Ii ri ii?» t iiian zur iiydroJyse von orotein-^ehimdenen Triglyceriden diese in einem KüTirigen Mediuu ni t einem Reagenz bestehend aus einer vcrtr.v',1 ichen .Misc'iun·; aus einer Lipasc und ei η ei:; aus einer synthetischen oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor in Kontakt

1: i Ii er f i ndunj'.s^ei.iiii'es llydrolysereae.enz besteht somit im wesentlichen aus einer verträglichen 1ischun<> aus einem !!niyn-Pr.'inarat mit Lipid-ilydrolase-Akt i vi t;i t, I>ei spi elsv.eise Triglyccri d-HydroIyse-Aktivität und einem Effektor, der aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestellt.

Lrfindunj;s^emäß verwendbare Hnzym-I'räparate sind solche, die eine hydrolytische Aktivität bei freien, d.h. nicht proteiη-gebundenen Triglyceriden entfalten. .Ms besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Lipase-PrHparaten erwiesen, die eine solche Aktivität entfalten.

Aufgrund ihrer Natur katalysieren Lipase-Präparate die Hydrolyse von freien Ί riolyceriden. Infolgedessen ist ein jedes I.ipasel'räparat i)rinzipiell für die Durchführung des erfindunjis«emäßen Verfahrens und die Herstellung eines erfindungsgemä'^en Bestimmunesreagenzes geeignet.

Geeignete ünzym-PrcMparate für die Lipid- oder Tri^lycerid-IIydrolyse können pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß Präparate mikrobiologischen Ursprungs verwendet, beispielsweise von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum und variant paralipolyticum, roh oder gereinigt. Weitere geeignete linzym-Präparate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind beispielsweise aus den US-PS 2 888 385, 3168 448, 3 189 529, 3 262 863 und 3 513 073 bekannt.

In vorteilhafter Weise verwendbare Lipase-Präparate sind auch im Handel erhältlich, beispielsweise W'eizenkeim-Lipase, die beispielsweise von der Firma Miles Laboratories of Llkhart, Indiana,

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in den Handel gebracht wird oder d i e Lipase 3000, Hersteller Alison Laboratories, oder das Präparat Stensin, Hersteller Signa Chemical Company (die beiden zuletzt genannten linzyme sind pancroatische linzyme) und forner die Lipase M von Candida rugus_n, die beispielsweise von der Firma linzyme Development Company, I'SA, in den ilandel gebracht wird.

Des weiteren ist praktisch eine jede oberflächenaktive Verbindung ein geeigneter kandkät für die Durchführung des Verfahrens der i-.rfindung und die Herstellung eines erf indungsgemrißen Bestimmungsreagenzes.

Bestimmte oberflächenaktive Verbindungen jedoch inhibieren die llydrolase-Aktivität von bestimmten Lnzym-I'räparaten. So wird beispielsweise das mikrobiologische Hnzyin von Rhizopus arrhizus durch oberflächenaktive Verbindungen bestehend aus Octylphenoxypolyäthoxyäthanolen inhibiert.

Infolgedessen ist wichtig, dai.» bevor ein Versuch unternommen wird, ein linzym-l'rüparat mit einer oberflächenaktiven Verbindung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwenden, die beiden Komponenten auf ihre Verträglichkeit miteinander zu testen. i)ie Verträglichkeit der beiden Komponenten läßt sich in einfacher und vorteilhafter Weise durch einen Test ermitteln, der im folgenden beschrieben wird.

liin Jinzym-l'räparat und eine oberflächenaktive Verbindung, die diesen Test bestehen, bilden eine im Sinne der Hrfindung "verträgliche" Mischung, d.h. die Komponenten einer solchen Mischung sind miteinander verträglich.

Der Testversuch kann wie folgt durchgeführt werden:

Die zu testende oberflächenaktive Verbindung wird in verschiedenen Konzentrationen von 0 bis 10 (ieiv.-s einem nicht-gepufferten, synthetischen (reconstituted) Serum zugesetzt, beispielsweise einem im

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liaiiJel unter der tiniulelshezeichnun.t! "Validate", erlii 111 ichen Standard-Serum, Hersteller General Diagnostics division of Uarner Lambert Company, Morris Plains, N.J., USA, wnnuf die Lösungen 5 Minuten bei 3 7 ⁰C inkubiert werden. Hariufliin u i rd eine Probe des uiizym-Pränarates zugesetzt, worauf nochmals etwa ZO Minuten lang inkubiert wird. Dann werden ",2 ml Anteile der erhaltenen Lösungen durch Zusatz von Wasser mit einem (Ίο-halt von 1,3 111.Ί CaCl₇ zum Zwecke der Unterstützung einer Niederschlaysb i ldung auf ein Volumen von 1,6 nl verdünnt, worauf die Prüflinge IO Minuten lan», in ein siedendes Wasserbad gebracht werden. Anschl ieiiend werden sie zentrifugiert, bis sie klar sind (z. li. ()°C, 37 (Vh) Χα, IO Minuten).

Das in eine.u 0,4 ml Anteil der überstehenden klaren Lösung enthaltene Glycerin wird dann in einem Gesamtvolumen von 1,2 ml nach der Methode von P.J. Garland und P.B. Pandle, veröffentlicht in der Zeitschrift Nature, 196 (1962), Seiten 987 bis 983, quantitativ bestimmt.

Des weiteren wird ein "Vergleichs"-test durchgeführt, bei dem lediglich das linzym-Präparat ohne die oberflächenaktive Verbindung verwendet wird.

Als ertindungsgemäß geeignet oder"verträglich" wird jede Mischung angesehen, welche die Freisetzung von Glycerinmengen stimuliert, die größer sind als die Menge, die im Falle des Vergleichsversuchs freigesetzt wird.

Bei Durchführung des beschriebenen Testes hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, einen weiteren Versuch mit einer Lösung durchzuführen, die sämtliche Komponenten bis auf das Hnzym-Prüparat enthält, so daß jede Reaktion, die aufgrund des freien Glycerins oder aufgrund anderer Komponenten des Serums abläuft, abgezogen werden kann.

Besonders vorteilhafte Bestimmungsreagenzien nach der Erfindung bewirken eine Hydrolyse von mindestens etwa 7(H der zur Verfügung stehenden Triglyceride in weniger als 10 Minuten. Besonders

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vorteilhaft sind solche Bestimmunnsreagenzien, mit weichen sich eine praktisch vollständige Hydrolyse, d.h. eine Hydrolyse von mindestens etwa ⁽.)'ΐ"β der verfügbaren Tri;',lyceride in weniger als H) Minuten erreichen läßt.

hrfinduii<;s£C];wi.'ü verwendbare oberflächenaktive Verbindungen, welche die Ilydrolase-Aktivität der linzyra-l'räparate zu stimulieren vernähen sind ni cht - iono;;cne und anionische oberflächenaktive Verbindungen oder Substanzen, einschließlich natürl i clier oberflächenaktiver Verbindungen, wie beispielsweise (lallensalzcn, cinschlieP.-lich Deoxycholat, Chenodeoxychol.it, Cholnt und rohen (!al ler.salzliiisciiuiigeii sowie synthetische oberf lächenakt i ve Verbindungen, wie l>eispi clsweise die tfatriumsalze von Alkylarylpolyätliersul fonatcn, vie sic beispielsweise im Handel erhältlich sind unter den Handelsbezeichnungen Iriton X-200 (Hersteller Uohrc und Haas) und Alkinol XC (Hersteller Ii. I. Dul'ont DeWemours und Company). Besonders vorteilhafte synthetische oberflächenaktive Verbindungen sind des weiteren Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole, die im Handel beispielsweise unter den Handelsbezeichnungen Triton X-114, 100, 102 und Triton n-101 (Hersteller Rohm und Haas Company) erhältlich sind. Synthetische oberflächenaktive Verbindungen haben sich deshalb als besonders vorteilhaft erwiesen, weil von diesen Verbindungen eine große Anzahl zur Verfügung steht und weil sie spezifischen Bedürfnissen und l.rfordcrnissen angepaßt werden kiinnen. Besonders vorteilhafte Alkylphenoxypolynthoxyäthanole sind solche mit einer I'olyoxyäthylenkettc von weniger als 20 Oxyäthyleneinheiten und einer hydropliilen-1 ipopliilen Balancezahl von unter 15. Weitere vorteilhafte oberflächenaktive Verbindungen werden in den später folgenden Beispielen beschrieben.

Wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt, führen zahlreiche oberflächenaktive Verbindungen, die getestet wurden, nicht zu einer annehmbar starken Dissoziation, wenn sie mit bestimmten getesteten Lipase-Präparaten kombiniert wurden. Hierzu gehört beispielsweise das Natriumdodecylsulfat, was in der bereits zitierten GB-PS 1 395 126 erwähnt wird. Beispiele für Hydrolysemischungen sind in der später folgenden Tabelle I zusammengestellt.

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Die im Einzelfalle optimale Konzentration nn Enzym-Präparat und oberflächenaktiver Verbindung in einer erfindun,f;sgemäH verwendbaren verträglichen Mischung kann sehr verschieden sein. So können beispielsweise verschiedene Faktoren wie die Reinheit des Enzym-Präparates die Aktivität des Enzym-Präparates, die Natur des gebundenen Triglycerides, die im Einzelfalle verwendete oberflächenaktive Verbindung oder Substanz und dergleichen eine Rolle spielen. Als zweckmäßig hat es sicli erwiesen, die oberflächenaktiven Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,25 bis etwa 10 Gew.-t, bezogen auf die analytische Lösung zu verwenden. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden dann erhalten, wenn die Konzentration an oberflächenaktiver Verbindung oder Substanz bei etwa 0,5 bis 5,0 Gew.-^ei liegt.

üie im Einzelfalle optimale Konzentration an Enzym-Präparat kann entsprechend sehr verschieden sein. Als zweckmäßig hat es sich doch erwiesen, das Enzym-Präparat in Konzentrationen von etwa 10 bis 80 mg/ml der analytischen Lösung zu verwenden.

In vorteilhafter Weise können die erfindungsgemäß verwendeten Bestiramungsreagenzien zur Herstellung einschichtiger oder mehrschichtiger Testelemente aus saugfähigem Material, beispielsweise Testpapier oder zur Herstellung einschichtiger oder mehrschichtiger analytischer Elemente des aus der Literatur bekannten Typs verwendet werden. Derartige Testelemente und analytischen Elemente lassen sich dann für die Bestimmung von protein-gebundenen Lipiden einsetzen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die Bestimmungsreagenzien in eine oder mehrere Schichten eines mehrschichtigen analytischen Elementes des beispielsweise aus der US-PS 3 992 158 und der BE-PS 801 742 bekannten Typs eingearbeitet. Derartige analytische Elemente weisen in vorteilhafter Weise eine nicht-fasrige Ausbreitschicht auf, die die Aufgabe hat eine gleichförmige Konzentration der zu bestimmenden aktiven Komponente einer Reagenzschicht zuzuführen, die eine Verbindung oder einen Stoff enthält, die bzw. der in Gegenwart der zu analysierenden Substanz¹ ein bestimmbares Reaktionsprodukt

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zu erzeugen vermag. Die Schichten eines solchen Elementes stehen dabei bei der Verwendung des Elementes in einem Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt miteinander.

Unter einem solchen "Flüssigkeitskontakt" oder "Strömungskontakt" ist geraeint, daß ein strömendes Medium, sei es nun eine Flüssigkeit oder ein Gas in Bezirken, in denen Je beiden Schichten übereinanderliegen, aus der Ausbreitschicht in die Reagenzschicht übertreten kann. Obgleich Reagenzschicht und Ausbreitschicht einander benachbart sein können, können sie doch auch durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Derartige Schichten, die die Aushreit· schicht von der Reagenzschicht trennen, verhindern jedoch nicht den Übergang von der einen Schicht, d.h. der Ausbreitschicht in die Reagenzschicht oder Reagenzschichten.

liin solcher Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt zwischen den Schichten läßt sich dadurch erreichen, daß man Elemente herstellt, deren Schichten aneinander anstoßen. Andererseits ist es jedoch auch möglich Elemente herzustellen, die Schichten aufweisen, die zunächst nicht ar-einanderstoßen oder einander nicht benachbart sind und die des weiteren beispielsweise durch Zwischenschichten voneinander getrennt sind, wie es beispielsweise aus der US-PS 3 511 608 bekannt ist. Des weiteren können beispielsweise Elemente unter Verwendung von federnden (resilient) absorbierenden Materialien oder deformierbaren Schichtträgern hergestellt werden, wie es beispielsweise aus den US-PS 3 917 453 und 3 933 594 bekannt ist. Weisen die Elemente zunächst keine einander benachbarten oder aneinander anstoßenden Schichten auf, so kann es erforderlich sein Druck anzuwenden oder andere Maßnahmen zu treffen, um die Schichten des Elementes in den Flüssigkeits- oder Strömungskontakt miteinander zu bringen, wenn die Elemente benützt werden.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Bestimmungsreagenz, d.h. die Hydrolysemischung in der Ausbreitschicht untergebracht, während die Reagenzschicht ein Bestimmungssystem enthält, beispielsweise NAD und Glycerin-Dehydrogenase im Falle der Triglyc<ä>rid-Bestimmung.

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Die folgende Beschreibung von Standard-Verfahren und Beispielen soll die Erfindung weiter veranschaulichen.

Standard-Verfahren:

Quantitative Bestimmung von Glycerin durch Hydrolyse von Scruni-Tri^lyceriden

Zunächst wurden Inkubierungsmischungen mit einem Gesamtvolumen von 1 bis 1,5 ml hergestellt aus einer Mischung aus (1) einem Puffer oder einer Puffersubstanz (2) einer bestimmten Menge an Serum oder Serumersatz als Triglycerid-Lieferant (die Triglycerid-Konzentration betrug 1 bis 1,6 pMole/ml), (3) einem möglichen Effektor der hydrolytischen Reaktion und (4) einem Lipase-Präparat, das zugesetzt wurde, um die Reaktion einzuleiten, nach dem die Mischung der übrigen Komponenten zur Einstellung eines Gleichgewichtes auf 37 C erwärmt worden war. Proben der Inkubierungsiniscliungen wurden dann bei 37⁰C inkubiert, worauf gleiche Anteile (0,2 ml) der Mischungen durch Zusatz von Wasser mit 1,3 niM CaCl^ zur Unterstützung der Niederschlagsbildung, falls Serum als Substrat verwendet wurde, auf 1,6 ml verdünnt wurden. Die Proben wurden dann 10 Minuten lanp, in ein siedendes Wasserbad gebracht und daraufhin bis zur Klärung (O⁰C ,37000 Xg, 10 Minuten) zentrifugiert. In 0,4 ml Anteile (41 bis 67 nMole bei Annahme einer vollständigen Hydrolyse) der überstehenden klaren Lösung wurden dann zu einer quantitativen Glycerin-Bestimmung bei einem Gesamtvolumen von 1,2 ml verwendet. Die Bestimmung erfolgte nach der Methode von Garland und Rändle, die in der Zeitschrift Nature, 196 (1962), Seiten 987 bis 988,beschrieben wird. Glycerin-Kinase, Pyruvat-Kinase, Lactat-Dehydrogenase, ATP, MgSO., Phosphoenolpyruvat und ΝΑΠΗ waren sämtlich im Überschuß vorhanden. Die Glycerin-Konzentration steht in stöchiometrischem Verhältnis zur NADH-Oxidation, die spektrometrisch bei 340 nm bestimmt wurde. In sämtlichen Fällen wurden SxHKXXHKkK Null-Versuche durchgeführt und Reaktionen aufgrund von freiem Glycerin oder anderen Komponenten im Serum wurden abgezogen. Infolgedessen beziehen sich die Ergebnisse auf die Glycerinmengen, die durch die hydrolytische Reaktion freigesetzt

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wurden. Im Falle der Null-Versuche enthielten die Proben sämtliche komponenten mit Ausnahme der Lipase.

Vergleichsversuche: Verseifung der Triglyceride

0,2 ml der zu verseifenden Probe wurden in ein Teströhrchen gemeinsam mit 0,5 ml einer 0,5 N äthanolischen KOH-Lösung eingebracht, worauf das Röhrchen 30 Minuten lang bei 70⁰C inkubiert wurde. Has Teströhrchen hatte einen Schraubverschluß.

Die Probe wurde dann abgekühlt, worauf 1,0 ml einer 0,15 molaren MgSO.-Lösung zugesetzt wurden. Nach Zentrifugieren wurde der ülyceringehalt in einer 0,2 ml großen Probe der überstehenden Flüssigkeit bei einem Gesamtvolumen von 1,2 ml nach der Methode von Garland und Rändle bestimmt. Des weiteren wurden Null-Versuche mit Serum und iithanolischem KOU-Reagenz durchgeführt, deren Ergebnisse bei der Bestimmung des Triglycerid-Glycerins abgezogen wurden.

In sämtlichen der im folgenden beschriebenen Beispiele wurde Lipase von C. rugosa verwendet.

Beispiel 1: Durch Lipase katalysierte Hydrolyse von Serum-Triglyceriden in Gegenwart einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung oder ot-chymotrypsin

Zu Proben von nicht-gepufferten synthetischen Serum (reconstituted serum) wurden Octylphenoxypolyöthoxyäthanol (Triton X-IOO), End-Konzentration 0,7%, oder a-Chymotrypsin (Protease), End-Konzentration 20 mg/ml zugesetzt, worauf nach einer 1-minütigen Gleichgewichtseinstellung bei 37°C die Reaktion durch Lipase-Zusatz (End-Konzentration 40 mg/ml) eingeleitet wurde. Nach der in Figur 1 angege-

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benen Zeitspanne wurde die Reaktion beendet und die dlycerinmenge quantitativ bestimmt. In der Figur 1 sind des weiteren die ülycerinmengen angegeben, die durch chemische Verseifung freigesetzt wurden. Aus Figur 1 ergibt sich, daß die Geschwindigkeit mit der Glycerin in Gegenwart der oberflächenaktiven Verbindung freigesetzt wurde Q größer ^war als die Geschwindigkeit, die bei Verwendung von α-Chyinotrypsin als DissoziierungsmittelO festgestellt wurde.

Beispiel 2: Serum-Triglycerid-Hydrolyse als Funktion der Konzentration an oberflächenaktiver Verbindung

Nicht gepuffertes synthetisches (reconstituted) Serum wurde in Gegenwart von 0,5 bis etwa 4 Vol.-* Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-100) 5 Minuten lang bei 37⁰C vorinkubiert, worauf die Reaktion durch Enzym-Zugabe (End-Konzentration 40 mg/ml) eingeleitet wurde. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion beendet und Glycerin quantitativ wie oben beschrieben bestimmt.

Des weiteren wurde die durch chemisches Verseifen freigesetzte Glycerinmenge in einem anderen Anteil der Seruinprobe bestimmt.

Aus Figur 2 ergibt sich die Stimulierung der Enzym katalysierten Triglycerid-Hydrolyse durch verschiedene Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung. Eine maximale Glycerin-Freisetzung wurde bei einer Konzentration an der oberflächenaktiven Verbindung von über 1,01 festgestellt. Des weiteren ergab sich, daß das Ausmaß der enzymatischen Reaktion bei über 96% einer chemischen Verseifung der gleichen Serumprobe lag.

Beispiel 3: Durch Lipase katalysierte Serum-Triglycerid-Hydrolyse in Gegenwart von anionischen oberflächenaktiven Verbindungen

Proben von nicht gepuffertem synthetischen (reconstituted) Serum (Validate) und Effektoren wurden 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden Reaktionen durch Enzym-Zusatz (40 mg/ml) End-Konzentration eingeleitet. Die Mischungen wurden 20 Minuten lang stehen gelassen.

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i)ie Glycerin-itestimmung erfolgte in der beschriebenen Weise.

Anioiiische oberfläciienaktive Verbindungen, welche eine Seruia-Triglycerid-Iiydrolyse stimulierten,sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Sämtliche der Gallensalze stimulierten eine iiydniyse in einem vergleichsweise hohem Ausmaß. Cine nicht gereinigte Probe von Natriumtaurocholat erwies sich als besonders effektiv (HXHige Hydrolyse) während eine stark gereinigte Probe Jes Gallensalzes weniger effektiv war (41Oige Hydrolyse). Die nicht gereinigte Probe enthielt Glycochol-, Chol-, Heoxychol- und andere Gallensäuren außer Taurocholsäure.

bine handelsübliche anionenaktive oberflächenaktive Substanz (Alkanol XC, Hersteller Ii. I. DuPont) führe zu einer praktisch vollständigen Hydrolyse (99'eige Hydrolyse).

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Tabelle I

Zusätze

Freigesetzes Glycerin (yMole/ml Serum)

tatsächlich theoretisch/ ο Gewinnung

α-Chymotrypsin (20 mg/ml) _a>rohe Gallensalzmischung (2,5%) ODeoxycholate (0,5%)

oeChenodeoxycholat (0,5%) ^ (2,51) ^Glycocholat (2,5%) «eTaurocholat (1,01) ^Alkanol XC (0,5«₀)

Natriumsalz von Alkylarylpolyäthersulfonat (1 ,3%) Na-Dodecylsulfat (1,01) N-Coco-Beta-Aminopropionsäure (1%)

0,08

1 ,43

0,8	0,8
1 ,04	1,22
0,7	0,92
0,9	1,17
0,66	1 ,02
0,47	1,15
1,19	1,2
0,95	1,22
0,62	1,22
0,215	1,4

97 100 S5 76 77 ö4 41 99

78 51 15

tsJ I

"theoretisch" bedeutet die Glycerinmenge, die von einer entsprechenden Serumprobe durch Verseifung bei 70⁰C in 30 Minuten freigesetzt wurde;

a-Chymotrypsin wurde als Vergleichssubstanz nitgetestet; Durchschnitt von sämtlichen l\erten;

273728^²⁸⁷

das Taurocholat von Oxengalle enthielt Glycochol-, Chol-, Deoxychol- und andere Gallensäuren.

Beispiel 4: Durch Lipase katalysierte Serum-Triglycerid-Hydrolyse in Gegenwart von nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindungen

Nicht-gepufferte synthetische (reconstituted) Serumproben (Validate) und Effektoren wurden 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Reaktionen durch Iinzym-Zusatz (40 mg/ml Rnd-Konzentration) eingeleitet. Die Mischungen wurden 20 Minuten lang stehengelassen. Die Glycerin-Bestimmung erfolgte in der beschriebenen Weise. Es wurden die in der folgenden Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse erhalten. Bei den oberflächenaktiven Verbindungen S-1 bis S-7 handelte es sich um Octylphenoxypolyoxyathylene mit Polyoxyäthylenketten verschiedener Länge.

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Tabelle II

Oberflächenaktive Verbindung

*t> Nonylphenylpolyglycidol
u> Saponin

Polyoxyäthylen- kettenlänge (n)	Freigesetztes Glycerin (yMole/ml Serum) tatsächlich theoretisch	0,74	% Gewinnung	I
7-8	0,78	0,74	105	(SJ A.
9-10	0,67	0,8	91	I
8-9	0,205	0,74	89
12-13	0,76	0,80	102
30	0,11	0,8	13,7
40	0,09	1 ,01	11,2
30	0,061	1,2	6
--	0,07	0,81	6
—	0,05	6

wie in Tabelle I

Wie sich aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt, stimulieren nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung auf Basis von Octylphenoxypolyoxyäthylenen eine Serum-Triglycerid-ilydrolyse in verschiedener Weise, je nach der Länge der I'olyoxyäthylenkette. Wenn die Länge der Kette ansteigt werden die Moleküle offensichtlich hydrophiler und büßen ihre Fähigkeit, die hydrophoben Lipoprotein-Komnlexe aufzubrechen ein, d.h. eine Aktivität, die für die Triglycerid-Mydrolyse erforderlich ist. Oberflächenaktive Verbindungen mit einem η-Wert von unter 7 sind im Wasser nicht löslich und wurden nicht getestet. Oberflächenaktive Verbindungen mit einer Polyoxyäthylen-Kettenlänge von 7 bis 13 Einheiten haben sich als besonders vorteilhaft zur Herbeiführung der Hydrolyse erwiesen.

Die für die Triglycerid-Hydrolyse beschriebenen Verfahren und Bestiminungsreagenzien eignen sich in entsprechender Weise für die Hydrolyse von Glycerophospholipiden. Bestimmungsreagenzen für derartige Hydrolysen bestehen aus einer verträglichen Mischung aus einem Enzym-Präparat mit Phospholipid-Hydrolyse-Aktivität und einem aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor.

Um dies zu veranschaulichen, wurde die Verträglichkeit von Enzym-Präparaten und oberflächenaktiven Verbindungen bestimmt, wozu ein Test verwendet wurde, der analog dem Test durchgeführt wurde, der zur Bestimmung geeigneter Mischungen für die Hydrolyse von Triglyceriden angewandt werden kann. Das folgende Beispiel 5 veranschaulicht die Anwendbarkeit der Erfindung zur Hydrolyse von Glycerophospholipiden.

Beispiel 5

Zu 1 ml Serum (Validate) wurde eine wäßrige Lösung mit 22,5 Einheiten Lipase von Candida rugosa und 11 der oberflächenaktiven Verbindung S-4 zugesetzt. Das Gesamtvolumen betrug 10 ml. Die Mischung wurde dann 20 Minuten lang auf 37°C erhitzt. Die Säure-Produktion wurde titrimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse dieses Testversuches sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle III

Analyt

Serum-Konzentration

Potentielle Säureproduktion

Clesamt-Siiureproduktion

Mole/ml

Triglycerid 0,62 Phospholipid 2,2

Mole/ml ,86 4,4 ⁺

Mole/ml 6,10

Unter der Annahme, daß die Hauptmenge an I'hospliolipiden aus Glycerophospholipiden bestand.

Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen ergibt sich, daß sich die erfindungsgemäß verwendete Kombination von Enzym und oberflächenaktiver Verbindung auch zur Hydrolyse von Phospholipiden eignet.

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Claims

.) Verfahren zur Hydrolyse von lUutseruintrujlyc?ride-η r.nd/eder blutseruupliosphol ipider., dadurch gekennzeichnet, daß man die Trii· lycerid«? und/oder Phospholipide ritt einem Reagenz bestellend aus einer vertraglichen Mi seining ins einer Lipase und einer.i aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestellenden Effektor in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daP man zur Hydrolyse von Blutsenuvtrii'lyceriden und/oder Blutserunphospholipit'an diese in einem wäf.'ripen Medium mit einen Reagenz bestellend aus einer verträglichen Mischung aus einer Lipase und einem aus einer synthetischen oberflächenaktiven Verbindung bestehender, litfektor in Kontakt bringt.

3. Verfahren nacli Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs verwendet.

4. Verfahren nach Ansprach 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lipasepräparat von Candida rugosa, Cliromobacteriunt viscosuri, variant paralipolyticum oder Tliizopus arrhizus verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß nan eine pancreatische Lipase verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß hian als liffektor eine nicht-iono^ene oder anionische synthetische oberflächenaktiv? Verbindung verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß map. als oberflächenaktive Verbindung ein "iatriumsalz eines Alkylarylpolyüthersulfonates oder sin Alkoxypolyüthoxyüthanol verwendet.

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BAD ORIGINAL

ίί. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als 20 Oxyäthyleneinheiten und mit einer hydrophilen-1iponhilen Balancezahl von unter 15 verwendet.

9. Verfahren nacli Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Octvlphenoxynolyäthoxyüthanol verwendet.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Gallensalz oder eine Mischung von Gallensalzen verwendet.

11. VerSiren nach Ansprüchen 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die in. Blutserum enthaltenen Triglyceride hydrolysiert und die Menge an durch Hydrolyse freigesetztem Glycerin bestimmt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Hydrolyse von Blutserum-Phospholipiden eine Serumprobe mit den Phospholipiden mit einer Mischung aus einem Enzympräparat mit Phospholipid-Hydrolase-Aktivitilt und einem aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor in Kontakt bringt.

13.Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzympräparat ein Lipasepräparat microbiologischen oder tierischen Ursprungs verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man

ein Lipasepräparat von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus verwendet.

15, Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Effektor eine nicht-ionogene oder anionische oberflächenaktive synthetische Verbindung verwendet.

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16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Natriumsalz eines Alkylarylpolyäthersulfonates oder ein Alkoxypolyäthoxyäthanol verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette mit weniger als 20 Oxyäthyleneinheiten und einer hydrophilen-lipophilen Balancezahl von unter 15 verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol verwendet.

19. Bestimmungsreagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer verträglichen Mischung eines Hydrolaseenzymes und einer synthetischen oberflächenaktiven Verbindung besteht.

20. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 19 für die Hydrolyse von protein-gebundenen Triglyceriden, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer verträglichen Mischung einer Lipase tierischen oder mikrobiologischen Ursprungs und einem aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor besteht.

21. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lipase mikrobiologischen Ursprungs enthält.

22. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Lipasepräparat von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus enthält.

23. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Natriumsalz eines Alkylarylpolyäthersulfonates oder ein Alkoxypolyäthoxyäthanol enthält.

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24. Bestimniungsreagenz nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Alkvlphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als 2ü Oxyäthyleneinheiten and einer hydrophilen-lipophilen Balancezahl von unter 15 enthält.

25. Bestiramungsreagenz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol enthält.

26. Bestimmungsreagenz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Gallensalz oder eine Mischung von Gallensalzen enthält.

27. Analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Schicht mit einer Mischung aus einem Lipasepräparat und einem aus einer oberflächenaktiven Verbindung bestehenden Effektor enthält.

28. Analytisches Element nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Ausbreitschicht- und eine Reagenzschicht aufweist.

29. Analytisches Element nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Lipasepräparat von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus enthält.

30. Analytisches Element nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es eine nicht ionogene oder anionische synthetische oberflächenaktive Verbindung enthält.

31. Analytisches Element nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Natriumsalz eines Alkylarylpolyäthersulfonates oder eines Alkoxypolyäthoxyäthanols enthält.

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32. Analytisches Hlement nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als 20 Oxyütliyleneinheiten und mit einer hydrophilen-lipophilen Balancezahl von unter 15 enthält.

33. Analytisches lilement nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol enthält.

34. Analytisches lilement nach Anspruch 27, dadurcli gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Gallensalz oder eine Mischung von Gallensalzen enthält.

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