DE2754770C2

DE2754770C2 - N-Acyltetrapeptidamide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2754770C2
Application number: DE2754770A
Authority: DE
Inventors: Lajos Dr. Budapest Kisfaludy; József Dr. Szeged Náfrádi; István Dr. Schön; László Dr. Varga; Vince Dr. Varró
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1976-12-24
Filing date: 1977-12-08
Publication date: 1986-05-22
Also published as: SE7714291L; US4183909A; JPS6223000B2; BE862053A; SU664560A3; DE2754770A1; FR2375192B1; NL7714045A; GB1580674A; JPS53111059A; HU175151B; SE441834B; FR2375192A1

Description

B Methionyl, Leucyl, Norleucyl oder Norvalyl;
A Methylen, Ethylen oder Ethyliden;
E tert-Butoxycarbonyl;

wobei die nicht gesondert genannten Aminosäurereste L-Konfiguration haben, Phenylglycyl jedoch D- oder L-Konfiguration hat und A in der Bedeutung Ethyliden D-Konfiguration hat, sowie deren physiologisch verträgliche Saize und übliche Komplexe mit verlängerter Wirksamkeit.

2. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1 sowie derSäureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Tetrapeptide der allgemeinen Formel II

H-Trp-B-Asp-Phg-NH₂ (II)

worin B die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt, mit einer eine (Aminooxy)-acylgruppe enthaltenden Verbindung der folgenden Formel HI

E—N —O —A —C —X (HI)

I Il

H O

worin E und A die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X für eine aktivierende Gruppe, die Pivaloyloxygruppe oder eine Gruppe der Formel R-O-CO₂- steht, worin R eine niedere Alkylgruppe bedeutet, X ferner für eine gegebenenfalls durch Nitro oder Halogen substituierte Phenoxygruppe oder für eine N-Succinimidoxygruppe steht, in an sich bekannter Weise umsetzt und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in an sich bekannter Weise in ein physiologisch verträgliches Säureadditionssalz oder in einen Komplex überführt oder aus einem der Salze ein physiologisch verträgliches anderes Salz oder inneres Salz in an sich bekannter Weise bildet oder aus einem Salz in an sich bekannter Weise die Säure freisetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Hydroxylgruppe oder ein Halogenatom bedeutet.

4. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft Phenylglycin enthaltende Peptide mit Gastrinwirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel gemäß den Patentansprüchen.
Gegenstand der Erfindung sind N-Acyltetrapeptidamide der allgemeinen Formel I

E—N —O —A —C—Trp—B—Asp—Phg —NH₂ (I)

I Il

H O

mit den folgenden Bedeutungen von B, A und E:
55

B Methionyl, Leucyl, Norieucyl oder Norvalyl;
A Methylen, Ethylen oder Ethyliden;
E tert.-Butoxycarbonyl;

wobei die nicht gesondert genannten Aminosäurereste L-Konfiguration haben, Phenylglycyl jedoch D^j oder L-Konfiguration hat und A in der Bedeutung Ethyliden D-Konfiguration hat, sowie deren physiologisch verträgliche Salze und übliche Komplexe mit verlängerter Wirksamkeit.

Die in der Formel mit Phg bezeichnete Phenylglycylgruppe bedeutet in jedem Falle das L- oder D-Enantiomer.

Zum Gegenstand der Erfindung gehören ferner die mit Säuren gebildeten Additionssalze der neuen Peptide und deren Komplexe.

Es ist bekannt, daß der für die biologische Wirkung verantwortliche Teil, das aktive Zentrum, des aus 17 Aminosäuren bestehenden Gastrins (des die Magensäureproduktion anregenden Peptidhormons) das am Carhf-

oxylende befindliche Tetrapeptidamid
H-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂

ist, dessen die Säureproduktion anregende Wirkung um etwa eine Größenordnung geringer ist als die des Ge- s samthormons. Für die Synthese dieses Tetrapeptidamides sind mehrere Verfahren bekannt: J. C. Anderson u. a.: J. Chem. Soc. C 108 (1967), Smirnow u. a.: Himija prirodni sojedinjenij 7 94 (1971), M. Portelli, G. Renzi, G. E. Borin: Il Farmaco Ed. Sei. 28,322 (1973), J. M. Davey u. a.: J. Chem. Soc. C 555 (I960), HU-PS 153 299, M. Dabrowska u. a.: Roczniki Chemii 46 1295 (1972). Später wurden mehr als hundert substituierte Derivate und Analoge dieses Tetrapeptidamides beschrieben (J. M. Davey u. a.: J. Chem. Soc. C 555 (1966), J. S. Morley: Proc. Roy. Soc. 170B 97 (1968), Portelli u. Renzi: Il Farmaco Ed. Sei. 28 316 (1973), HU-PS153 375). Von diesen erwies sich das Pentapeptidamid

BOC-jS-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NHj

(Pentagastrin) als das wirksamste. Es befindet sich unter der Bezeichnung Peptavlon im Handel und wird zur Bestimmung der maximalen Magensäureproduktionsfähigkeit als Diagnostikum verwendet.

Sowohl von dem oben genannten Tetrapeptidamid als auch vom Pentagastrin wurden zahlreiche Analoge beschrieben, in denen einzelne Aminosäuren durch andere ersetzt sind: J. Morley: Proc. Roy. Soc. 170 B 97 (1968), E. Wünsch u. K.-H. Deimer: Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 353 1246 (1972), Morley u. a.: J. Chem. Soc. C 522,726,910,809,715 (1968),Kenneru. a.: J. Chem. Soc. C 762 (1968), A. von Dungen u. a.: Liebigs Ann. Chem. 860 (1976), JA-PS 71 17234 und 16 743/1971. Die Wirkung aller dieser Verbindungen ist geringer als die des Pentagastrins.

Die eine a-(Aminooxy)-carbonsäure enthaltenden Peptide sind gegen zahlreiche Enzyme beständig (L. Kisfaludy, M. Löw, T. Devenyi: Acta Biochem. Biophys. Acad. Sei. Hung. 6 393 (1971)). So ist zum Beispiel die Langzeitwirkung der am Aminoende eine a-(Aminooxy)-carbonsäure enthaltenden ACTH-Analogen wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß die am Aminoende befindliche ar-(Aminooxy)-acylgruppe das Molekül gegen Enzyme vom Typ der Aminopeptidase schützt (HU-PS 167 655).

Es wurde nun gefunden, daß die am Aminoende eine (Aminooxy)-carbonsäure enthaltenden Pentagastrin-Analogen sehr wirksame Verbindungen sind. Besonders wirksam sind die (Aminooxy)-acetyl-, a-D-(Aminooxy)-propionylundjff-(Aminooxy)-propionyl-Derivate. Die Wirkung einiger dieser Derivate übertrifft die des Pentagastrins.

Erfindungsgemäß werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hergestellt, indem man Tetrapeptidamide der allgemeinen Formel (II)

35 H-Trp-B-Asp-Phg-NH₂ (II)

worin die Bedeutung von B die gleiche wie bei Formel (I) ist, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (III) E-N-O-A-C-X (ffl)

H O

worin E und A die oben gegebene Bedeutung besitzen,

X für eine aktivierende Gruppe, besonders für Hydroxyl, Halogen, vorzugsweise Chlor, für die Pivaloyloxygruppe oder eine Gruppe der Formel R-O-CO₂- steht, worin R eine niedere Alkylgruppe, vorzugsweise Äthyl- oder Isobutylgruppe, bedeutet, X ferner für gegebenenfalls durch Nitro oder Halogen substituierte Phenoxygruppe, vorzugsweise p-Nitro-, 2,4,6-Trichlor-, 2,3,5-TrichIor-, Pentachlor- oder Pentafluorphenoxygruppe, oder für N-succinimidoxygruppe steht,

umsetzt.

Steht X für Hydroxyl, so wird die Acylierung vorzugsweise mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid ausgeführt. Die erhaltene Verbindung wird gewünschtenfalls zu einem physiologisch verträglichen Säureadditionssalz oder Komplex umgesetzt, oder es wird aus einem ihrer Salze ein physiologisch verträgliches anderes Salz oder inneres Salz gebildet oder aus einem ihrer Salze die Säure freigesetzt.

Die reaktionsfähige Verbindung der allgemeinen Formel

E—N —O —A —C —X

I Il

H O

ist zweckmäßig ein mit Pivalinsäure oder einem Kohlensäurehalbester bereitetes gemischtes Anhydrid oder ein aktiver lister. Von den letzteren sind die halogenierten Phenylester, insbesondere die Pentachlor- und Pentafluorphcnylester, besonders bevorzugt.

Die als Ausgangsstoff verwendeten Tetrapeptidamide der allgemeinen Formel

H-Trp-B-Asp-Phg-NH₂ (II)

werden in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch schrittweise Kettenverlängerung mittels der Azid-, der gemischten Anhydrid-, der Dicyclohexylcarbodiimid- und der Aktivestermethode oder mittels sonstiger bekannter Aktivierjngsverfahren hergestellt

Die an der Reaktion nicht teilnehmenden funktioneilen Gruppen werden notwendigenfalls geschützt, insbesondere durch mittels Hydrolyse, Acidolyse oder katalytische Hydrierung entfernbare Gruppen. Die Carboxylgruppe kann zum Beispiel duieh Verestern mit Benzylalkohol, tert-Butanol oder p-Chlorbenzylalkohol geschützt werden. Zum Schutz der (Aminooxy)- und der Aminogruppe können folgende Gruppen verwendet werden: Formyl-, Tosyl-, Trityl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrosulfenyl-, Phthalyl-, p-Chlorcarbobenzoxygruppe, besonders bevorzugt jedoch die Carbobenzoxy- und die tert-Butyloxycarbonylgruppe. Das Stickstoffatom am ίο Indolgcrüst des Tryptophans kann fallweise durch eine Formylgruppe geschützt werden.

Durch eine entsprechende Kombination der Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese durch an sich bekannte Methoden (zum Beispiel Hydrolyse, Acidolyse, katalytische Hydrierung) selektiv oder gleichzeitig entfernbar sind

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird zum Einbau der geschützten (Aminooxy)-acylgruppe am Aminoende die Pentahalogenphenylester-Methode angewendet; der aktive Ester wird mit dem carboxylends tändigen

H-Trp-B-Asp-Phg-NH₂

zur Reaktion gebracht. Zur Synthese des letzteren geht man von Z-L-Phg-OH oder Z-D-Phg-OH (Z = Schutzgruppe) aus und baut nach Entfernen der Schutzgruppe mit geschützten Aminosäure-(N-hydroxysuccinimid)-estern oder -(pentahalogenphenyl)-estern schrittweise das Tetrapeptidamid

H-Trp-B-Asp-D-Phg-NH₂

H-Trp-B -Asp-L-Phg-NHj

auf. Die Schutzgruppe Z wird durch Behandeln mit eisessigsaurem Bromwasserstoff oder durch katalytische Hydrogenolyse entfernt. An Stelle der Schutzgruppe Z kann auch die BOC-Gruppe verwendet werden, die durch mildere saure Behandlung entfernbar ist.

Die die jö-Cairboxylgruppe der Asparaginsäure schützende Esterbindung kann in der Dipeptid-, Tripeptid- oder Tetrapeptidphase selektiv oder zusammen mit der die Aminogruppe schützenden Gruppe durch Acidolyse, oder auch durch katalytische Hydrogenolyse, entfernt werden.

Die Endprodukte können durch Kristallisation, Umfallen, Säulenchromatographie an Silikagel oder Ionenaustauschchromatographie mit Carboxymethylcellulose gereinigt werden.

Die neuen Verbindungen werden, abhängend von der bei der Herstellung angewendeten Methode, als freie Säuren oder als Salze erhalten. Die mit organischen oder anorganischen Säuren gebildeten Salze können mit an sich bekannten Methoden oder bei der Reinigung zu inneren Salzen umgebildet werden. Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind:

2-(tert.-BuiLyloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid_t 2-(tert.-Bui:yIoxycarbonylaminooxy)-acetyI-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid_t 2-D-(tert.-ButyloxycarbonyIaminooxy)-propionyI-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycinamid,

2-D-(teR.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin'· amid,

2-(tert.-Bu1:yloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid, 2-(tert.-But;yloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid, 2-D-(tert.-ButyIoxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-D-phenylglycinamid,

2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyI-L-phenylglycinamid,
2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-norleucyl-L-asparagyl-D-phenylgIycinamid,

2-D-(tert.-Elutyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyI-L-norvalyI-L-asparagyl-D-phenylglycinamid.

Die biologische Wirkung der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen wurde mit der Methode von Gosh und Schild (Br. J. Pharmac. Chemoth. 13,54 /1958/) untersucht, wobei die Modifizierung durch Pissidis und Clark (Gut. 8,196 /1967/) berücksichtigt wurde. Wie die Tierversuche ergaben, steigern die Verbindungen bei intravenöser Applikation die Säureproduktion bedeutend. Besondere bemerkenswert ist, daß die neuen Verbindungen im Gegensatz zu Pentagastrin auch im Dünndarm resorbiert werden und in einigen Fällen ihre die Säuresekretion stimulierende Wirkung bei einer Dosis von 20 ug/100 g Körpergewicht größer ist als die des in einer Dosis von 0,2 μg/100 g Körpergewicht intravenös applizierten Pentagastrins, welches bei enteraler Anwendung auch in größeren Dosen die Säureproduktion nicht stimuliert. Ebenfalls hervorzuheben ist, daß einige Derivate bei Resorption im Mastdarm eine stark anregende Wirkung auf die Säuresekretion ausüben. Diese Wirkune ist in

einigen Fällen größer als die des als Kontrolle verwendeten Pentagastrins. Das Maß der Wirkung sowohl bei Resorption im Dünndarm wie auch im Mastdarm ermöglicht eine neuartige Anwendung der Verbindungen.

Tabelle 1

Die von den enteral beziehungsweise parenteral applizierten Verbindungen auf die Säureproduktion ausgeübte steigernde Wirkung, ausgedrückt in % der Wirkung von 0,2 μ§/100 g i. v. Pentagastrin

Verbindung A

Phg

Applikationsort und Dosis ^g/100 g)

Vene Dünndarm Mastdarm

BOC-OGIy BOC-OGIy BOC-OGIy BOC-OGIy BOC-D-OAIa BOC-D-OAIa BOC-D-OAIa BOC-D-OAIa

Met	D
Leu	D
Met	L
Leu	L
Met	D
Leu	D
Met	L
Leu	L

0,2 28

36

45

180

2,0
50

116

20

20 μg

—	60
124	38
-	17
-	22
146	41
48	43

20

25

Unter physiologisch verträglichen Komplexen sind hier Verbindungen zu verstehen, die sich beim Umsetzen der erfindungsgemäßen Peptide mit bestimmten organischen oder anorganischen Verbindungen bilden und eine retarde Wirkung der Peptide gewährleisten. Als organische Verbindungen sind zum Beispiel gewisse GeIatinen, Carboxymethylcellulose^ Alginsäureester, Poly(floretinphosphat), Aminosäurepolymere und sonstige Polymere und Copolymere geeignet. Von den anorganischen Verbindungen kommen die Hydroxyde bestimmter Metalle, so zum Beispiel das Zinkhydroxyd, sowie schwer lösliche Metallsalze, zum Beispiel Phosphate und Pyrophosphate, in Frage. Zum Erreichen der retarden Wirkung sind ferner bestimmte Silikate geeignet, die mit den Peptiden ebenfalls unlösliche Komplexe bisher ungeklärter Struktur bilden.

Die erfindungsgemäßen Peptide sowie deren Salze und Komplexe können in der Pharmazie in Form der üblichen Arzneimittelpräparate verwendet werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen in Begleitung von zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können zum Beispiel feste Lyophilisate sein, die als Trägerstoffmit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Kohlenhydrate, enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ferner zum Beispiel als verdünnte oder konzentrierte Suspensionen oder Emulsionen formuliert werden, welche unterschiedliche indifferente Konservierungs- und Stabilisierungsmittel enthalten können.

Die Arzneimittelpräparate können zur Bestimmung der maximalen Magensäureproduktion als Diagnostikum eingesetzt werden. Ihre Anwendung in der Therapie ist dann angezeigt, wenn die Säureproduktionsfahigkeit des Magens vermindert ist oder fehlt. So ist bei präatrophischer Gastritis und bei subaciden Beschwerden eine gute Wirkung zu erwarten. Da das Pentagastrin eine die Regenerierung der Magenschleimhaut begünstigende trophische Wirkung aufweist, ist die Anwendung der Arzneimittelpräparate auch bei atrophischen Prozessen der Magenschleimhaut günstig.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der chemischen Fachliteratur (J. Biol Chem. 5« 247,977 /1972/) verwendeten Abkürzungen. Für ö--(Aminooxy)-essigsäure wird das Symbol OGIy,
nooxy)-propionsäure das Symbol OAIa benutzt Weitere Abkürzungen:

DCC = Dicyclohexyl-carbodiimid

PCPOH = Pentachlorphenol

PFPOH = Pentafluorphenol

SuOH = N-Hydroxysuccinimid

DMF = Dimethylformamid

HMFA = Hexamethylphosphorsäuretriamid

60

Der Schmelzpunkt der Verbindungen wurde mit dem Schmelzpunktmeßgerät nach Tottoli (Büchi) bestimmt. Die Dünnschichtchromatogramme wurden auf nach Stahl angefertigten Silikagelschichten (Handelsbezeichnung: Kieselgel G) aufgenommen. Zum Entwickeln der Chromatogramme wurden folgende Lösungsmittelgemische verwendet:

65

1. Chloroform

2. Chloroform

3. Chloroform

4. Äthylacetat

5. Äthylacetat

6. Äthylacetat

7. Äthylacetat

8. Äthylacetat ;

9. Äthylacetat:
10. Äthylacetat:

Methanol Methanol

η-Hexan : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure (Pyridin : Essigsäure

95

Wasser = 20 Wasser = 20 Wasser = 20 Wasser = 20 Wasser = 20 Wasser = 20 Wasser = 20

H) 11) H) H) 11) H) H)

85

1 : 1 1

Zum Entwickeln der Dünnschichtchromatogramme wurde Ninhydrinlösung verwendet. Die Platten wurden nach dem Einsprühen bei 105⁰C etwa 5 Minuten lang getrocknet. Danach wurden die Chromatogramme in Chlorgas eingebracht und nach dem Lüften mit o-Tolidin-KJ-Lösung behandelt.

Zur säulenchromatographischen Reinigung der Substanzen wurde Silikagel (Kieseigel G) eines Korngrößebe·¹ reiches von 62-200 μπι verwendet.

Beispiel 1
a) N-iBenzyloxycarbonylJ-D-phenylglycin-amid

24,0 g (84 mMol) Z-D-Phg-OH werden in 170 ml Chloroform gelöst und 11,6 ml (84 mMol) Triäthylaminzu der Lösung gegeben. Anschließend werden bei - 1O⁰C 8,9 ml (84 mMol) Chlorkohlensäureäthylester zugetropft. Die Lösung des gemischten Anhydrides wird bei - 10⁰C noch 10 Minuten lang gerührt, nach Abnahme der Kühlung wird eine Stunde lang Ammoniakgas eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tag im Vakuum eingedampft und der feste Rückstand mit Wasser isoliert. Das Rohprodukt wird aus Äthanol kristallisiert. Aul" diese Weise werden 11,8 g (49,4%) chromatographisch einheitliches Z-D-Phg-NH₂ erhalten, das bei 171-173⁰C schmilzt. R? = 0,75; [a]_D = -76,8° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C|₆H,₆O₃N₂ (M = 284,30): Berechnet: C 67,59% H 5,67% N 9,85%; gefunden: C 67,43% H 5,70% N 9,98%.

b) D-Phenylglycin-amid-hydrobromid

20,0 g (70 mMol) Z-D-Phg-NH₂ (Verfahrensstufe a) werden in 40 ml Essigsäure gelöst und zu der Losung 70 ml essigsaurer 8 η Bromwasserstoff gegeben. Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt und vom Hydrobromid abfiltriert. Das einen großen Überschuß an HBr enthaltende Salz wird aus der zehnfachen Menge Äthanol umkristallisiert. Man erhält 14,15 g(87,5%7 H-D-Phg-NH₂ · HBr. Schmelzpunkt: 263,0-263,5⁰C (bestimmt mit dem Koffler-Apparat); R? = 0,40; [a]_D = -75,6° (c = 1,0; in Dimethylformamid)

Analyse füT C₈H₁₀ON₂Br (M = 231,10): Berechnet: C 41,60% H 4,77% N 12,13%; gefunden: C 41,40% H 4,82% N 12,01%.

c) N-tBeizyloxycarbonylVL-asparagyl-jß-ftert.-butylesteO-D-phenylglycin-amid

6,31 g Z-Asp(0'Bu)-OSu, 3,89 g (16,8 mMol) H-D-PHg-NH₂ · HBr (Beispiel i, Stufe b) und 2,iO mi (15 mMol) Triäthylamin werden in 150 ml Chloroform suspendiert und miteinander umgesetzt. Am nächsten Tag wird die dicke Suspension im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Man erhält 5,02 g (73,6%) chromatographisch einheitliches Z-Asp(O'Bu)-D-Phg-HN₂, das bei 179-181°C schmilzt Eine kleine Probe wird aus Äthylacetat umkristallisiert und schmilzt danach bei 188-189°C. R? = 0,75; [a]_D = -59,5° (c = 1 in Dimethylformamid).

Analyse Tür C₂₄H₂₉O₆N₃ (M = 455,50): Berechnet: C 63,28% H 6,42% N 9,23%; gefunden: C 63,22% H 6,60% N 8,96%.

d) L-Asparagyl-jS-itert.-butylesterJ-D-phenylglycin-amidhydrochlorid

12,83 g (28,2 mMol) Z-Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe c) werden in 200 ml DMF gelöst. Unter Kühlen werden zu der Lösung zuerst 2,46 ml (28,2 mMol) konzentrierte Salzsäure, dann 2 g Palladiumakli vkohle gegeben. Unter Rühren wird 2,5 Stunden lang Wasserstoff durch die Suspension geleitet. Dann wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in Äthanol gelöst. Die Lösung wird geklärt, das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther verfestigt. Man erhält 10,0 g (99%) chromatographisch einheitliches H-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ · HCl, das bei 169-17O⁰C schmilzt. R? = 0,15.

e) N-itert.-ButyloxycarbonyO-L-methionyl-L-asparagyl-jS-itert.-butylesteO-D-phenylglycin-amid

5,0 g (14 mMol) H-ASp(O¹Bu)-D-PlIg-NHj · HCl (Beispiel 1, Stufe d) und 4,85 g (14 mMol) BOC-Met-OSu werden in 60 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 1,96 ml (14 mMol) Triäthylamin gegeben. Die Suspension wird am nächsten Tag im Vakuum ejngedampft und der Rückstand mit Wasser isoliert. 7,83 g Rohprodukt werden erhalten. Dieses wird in 40 ml Äthanol heiß geklärt und in der Siedehitze durch Zugabe von 40 ml Wasser ausgefällt. Man erhält 6,57 g (84%) chromatographisch einheitliches BOC-Met- Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂, das bei 194- 196°C schmilzt. Eine kleine Probe wird aus Äthanol umkristallisiert und schmilzt danach bei 197-198⁰C. R? = 0,75; [a]_D = -67,2° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₂₆H₄₀O₇N₄S (M = 552,69): Berechnet: C 56,51% H 7,30% N 10,14% S 5,78%;
gefunden: C 56,81% H 7,34% N 9,98% S 5,69%.

0 L-Methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid-hydrochlorid

5,6 g (10,1 mMol) BOC-Met-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe e) werden in 10 ml Essigsäure gelöst und zu der Lösung 3,5 ml (35 mMol) Mercaptoäthanol und 50 ml eisessigsaure 4 η HCl gegeben. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der feste Rückstand mit wasserfreiem Äther isoliert. Man erhält 4,84 g H-Met-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl (Rj = 0,1), welches noch überschüssige Salzsäure enthält, jedoch ohne Reinigung weiterverarbeitet wird.

g) N-itert.-ButyloxycarbonyO-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

4,4 g (10,2 mMol) H-Met-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl (Beispiel 1, Stufe 0 und 4,10 g (10,2 mMol) BOC-Trp-OSu werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 2,85 ml (20,4 mMol) Triäthylamin gegeben. Die Suspension wird am nächsten Tag im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Wasser isoliert. Man erhält 6,66 g (95,8%) BOC-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂, das bei 216-218°C unter Zersetzung schmilzt. Eine kleine Probe wird aus 80%igem Äthanol umkristallisiert und weist danach einen Zersetzungspunkt von 222°C auf. R? = 0,3; [a)_D = -65,5° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₃H₄₂O₈N₆S (M = 682,81):
Berechnet: C 58,05% H 6,20% N 12,31% S 4,68%;
gefunden: C 58,23% H 6,30% N 12,60% S 4,86%.

h) L-Tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

6,0 g (88,8 mMol) BOC-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe g) werden in Gegenwart von 3,1 ml (44 mMol) Mercaptoäthanol mit 60 ml salzsaurem Dioxan behandelt. Das Reaktionsgemisch wird nach 15 Minuten mit wasserfreiem Äther verdünnt Durch Filtrieren werden 6,23 g viel überschüssige Salzsäure enthaltendes Hydrochlorid isoliert. Dieses wird in 150 ml Wasser suspendiert, der pH-Wert der Suspension mit Triäthylamin auf 7 eingestellt, dann gerührt und derNiederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 4,0 g (78%) H-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂, das unter Zersetzung bei 230-232⁰C schmilzt. R? = 0,3.

i) tert.-Butyloxycarbonylaminooxy-essigsäure-pentachlorphenylester

8,0 g (41,8 mMol) BOC-OGIy-OH und 11,1 g (42,0 mMol) Pentachlorphenol werden in 160 ml wasserfreiem Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf wenigstens 5°C gekühlt und dann mit 8,6 g (42,0 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid (DCC) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und dann vom ausgefallenen Dicyclohexylcarbamid (DCU) abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der feste Rückstand aus einem Gemisch von Dioxan und Äthanol umkristallisiert. Auf diese Weise werden 13,7 g (74,3%) BOC-OGIy-OPCP erhalten. Schmelzpunkt: 167-168⁰C. R? = 0,7.

Analyse Tür C₃Hi₂O₅NCl₅ (M = 439,51):
Berechnet: C 35,52% H 2,75% N 3,18% Cl 40,33%;
gefunden: C 35,37% H 2,90% N 3,31% Cl 40,12%.

j) 2-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

l,50g (2,57 niMoI)H-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe h) werden in 15 ml Dimethylformamid

suspendiert und zu der Suspension 2,26 ml (5,14 mMol) Triäthylamin und 1,20 g (2,73 mMol) BOC-OGIy-OPCP (Beispiel 1, Schritt 9) gegeben. Die Suspension wird gerührt, bis alles in Lösung gegangen ist, und dann über Nacht stehen gelassen. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand mit Äther verfestigt. Es werden 2,12 g Rohprodukt erhalten, was mehr ist als die theoretische Ausbeute. Das Rohprodukt wird in wenig des Lösungsmittelgemisches 5 gelöst und auf eine aus 20 g Siiikagel bereitete Säule aufgebracht. Eluiert wird mit

' dem Lösungsmittelgemisch 5 bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/h. Die reinen Fraktionen werden zweimal

ίο aus 20 ml 80%ig;em Äthanol umkristallisiert. Auf diese Weise werden 0,82 g (41,4%)

; BOC-OGly-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂

erhalten, das bei 199-200⁰C unter Zersetzung schmilzt. Rf = 0,15; Rf = 0,40; [a]_D = -40,3° (c = 1,0 in DMF).

Analyse für C_3j,H₄₅O₁₀N₇S (M = 755,86):

\ Berechnet: C 55,62% H 6,00% N 12,97% S 4,24%;

gefunden: C 55,91% H 6,18% N 13,35% S 4,16%.

Beispiel 2

; a) N-iBenzyloxycarbonyO-L-phenylglycin-amid

27,6 g (97 mMol) Z-L-Phg-OH werden in 300 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Zu der Lösung werden 13,55 ml (97 mMol) Triäthylamin und danach bei -10⁰C 12,1 ml (97 mMol) Pivaloylchlorid gegeben. Die Suspension des gemischten Anhydrids wird bei -10⁰C 10 Minuten lang gerührt. Nach Abnehmen der Kühlung wird eine Stunde lang Ammoniakgas in die Suspension eingeleitet. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand ähnlich wie im Falle des D-Enantiomers aufgearbeitet. Man erhält 18,90 g (68,7%) Z-L-PhIg-NH₂, das bei 172-173°C schmilzt. Rf = 0,75; [a]_D = +80,7°(c = 1,0 in Dimethylformamid).

ι b) L-Phenylglycin-amid-hydrobromid

Man arbeitet auf die im Beispiel 1, Verfahrensstufe b, beschriebene Weise, verwendet aber als Ausgangsstoff Z-L-Phg-NHj. Das Hydrobromid wird in 88,8%iger Ausbeute erhalten. Rf = 0,25; [a)_D = +76,5° (c = 1,0 in DMF).

c) N-iBenzyloxycarbonyO-L-asparagyl-jiHtert.-butylestert-L-phenylglycin-arnid

8,65 g (37,5 mMol) H-L-Phg-NH₂ · HBr (Beispiel 2, Stufe b) werden mit 21,6 g (37,5 mMol) Z-Asp(O'Bu)-OPCP in 160 ml DMF in Gegenwart von 5,15 ml (37,5 mMol) Triäthylamin umgesetzt. Nach 30minütigem Rühren werden zu der Suspension weitere 5,15 ml (37,5 mMol) Triäthylamin gegeben. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der ölartige Rückstand mit Äther isoliert. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und das Rohprodukt (13,9 g) aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert. Auf diese Weise werden 10,6 g (65,8%) chromatographisch einheitliches Z-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₂ erhalten, das bei 207-208°C schmilzt. Eine kleine Probe wird aus Äthanol urnkristallisiert und schmilzt danach bei 209⁰C. Rf = 0,75; [a]_D = +21,6° (c = 1,57 in DMF).

Analyse für C₂₄H^O₆N₃ (M = 455,50)
Berechnet: C 63,28% H 6,42% N 9,23%;
gefunden: C 63,50% H 6,38% N 9,23%.

Die geringe Menge Niederschlag, die aus der ätherischen Mutterlauge des Rohproduktes ausfällt, wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Äthanol umkristallisiert. Dabei werden 0,47 g (2,9%) Z-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ erhalten. Schmelzpunkt: 188-189⁰C; Rf = 0,75; [a]_D = -59,0° (c = 1 in DMF).

d) L-Asparagyl-Xtert.-butyleste^-L-phenylglycin-amid-hydrochlorid

Von 9,6 g (21 mMol) Z-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₂ (Beispiel 2, Stufe c) wird auf die gleiche Weise wie beim D-Diastereomer (Beispiel 1, Schritt 4) die Schutzgruppe entfernt. Auf diese Weise werden 8,03 g chromatographisch einheitliches H-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₃ · HCl erhalten, das noch überschüssige Salzsäure enthält. Rf = 0,35.

e) N-iterL-BuryloxycarbonyO-L-methionyl-L-asparagyl-^-itert-butylesteri-L-phenylglycin-amid

3,95 g (10,5 mMol) 1,-ASp(O¹Bu)-L-PlIg-NHj · HCl (Beispiel 2, Stufe d) und 5,22 g (12,6 mMol) BOC-Met—OPFP werden in 50 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 2,94 ml (21 mMol) Triäthylamin gegeben. Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit η-Hexan isoliert und mit Wasser gewaschen. Die 5,38 g Rohprodukt werden kochend in 25 ml Methanol gelöst und mit 25 ml Wasser ausgefällt Auf diese Weise werden 4,70 g (81%)

BOC-Met- ASp(O¹Bu)-L-PlIg-NH₂

erhalten. Eine kleine Probe davon wird durch Umfallen aus einem Methanol-Äther-Gemisch gereinigt und schmilzt dann bei 162-163°C. R? = 0,75; [a]_D = -5,5° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₂₆H₄₀O₇N₄S (M = 552,69):

Berechnet: C 56,51% H 7,30% N 10,14% S 5,7%; gefunden: C 56,70% H 7,34% N 10,35% S 5,68%.

0 L-Methionyl-L-asparagyi-L-phenylglycin-amid-hydrochlorid ^!?·

4,2 g (7,6 mMol) BOC-Met-Asp(O^lBu)-L-Phg-NH₂ werden auf die gleiche Weise behandelt wie das Diastereomer. Auf diese Weise werden 3,2 g (97%) H-Met-Asp-L-Phg-NH₂ · HCl erhalten, das bei 198-200°C schmilzt. R? = 0,25 (vgl. den Wert des D-Diastereomers).

g) N-itert.-ButyloxycarbonylJ-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

3,45 g (8 mMol) Η-Met-Asp-L-Phg-NH₂ · HCl (Beispiel 2, Stufe f) werden auf ähnliche Weise wie das D- '

Diastereomer (Beispiel 1, Schritt 7) gekuppelt. Auf diese Weise werden 4,77 g (97,9%)

BOC-Trp-Met-Asp-L-Phg-NH₂

erhalten, das bei 191-193⁰C unter Zersetzung schmilzt. Eine kleine Probe davon wird aus 80%igem Äthanol umkristaiiisiert und schmilzt danach unter Zersetzung bei 200⁰C. Rf = 0,35; [a]_D = 0° (c = 1,0 in DMF).

35 Analyse für C₃₃H₄₂O₈N₆S (M = 682,81):

Berechnet: C 58,04% H 6,20% N 12,31% S 4,68%;

gefunden: C 58,05% H 6,21% N 12,64% S 4,77%.

40 h) N-Tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

Man geht von 4,4 g (6,33 mMol) BOC-Trp-Met-Asp-L-Phg-NH₂ (Beispiel 2, Stufe g) aus und arbeitet auf die im Beispiel 1, Schritt 8, beschriebene Weise. Es werden 2,90 g (76,5%) H-Trp-Met-Asp-L-Phg-NH₂ erhalten, das bei 210⁰C unter Zersetzung schmilzt. R? = 0,30.

i) 2-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

Dieses wird in ähnlicher Weise wie das D-Diastereomer (Beispiel 1, Stufe j) bereitet, wobei man von 1,0 g (1,71 mMol) H-Trp-Met-Asp-L-Phg-NHj (Beispiel 2, Schritt 8) ausgeht. Das Rohprodukt wird auf einer Silikagelsäule durch Eluieren mit dem Lösungsmittelgemisch 10 gereinigt. Man erhält 0,48 g (37,2%) BOC-OGly-Trp-Met-Asp-L-Phg-NH₂, das unter Zersetzung bei 169-17O⁰C schmilzt. Rf = 0,35; [a]_D = +8,2° (c = 1,0 in DMF).

55 Analyse für C₃₅H₄₅Oi₀N₇S (M = 755,86):

Berechnet: C 55,62% H 6,00% N 12,97% S 4,24%;

gefunden: C 55,11% H 6,23% N 13,04% S 4,10%.

Beispiel 3
a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-D-propionsäure-pentachlorphenylester

4,10 g (20 mMol) BOC-D-OAIa-OH und 5,32 g (20 mMol) Pentachlorphenol werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und mit 4,12 g (20 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0⁰C eine halbe Stunde lang gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit was-

serfreiem Äther verrührt, und dann filtriert. Das erhaltene Rohprodukt (6,25 g) wird aus Äthanol umkristallisiert Auf diese Weise werden 5,80 g (64%) BOC-D-OAIa-OPCP erhalten. Schmelzpunkt: 123-124°C; R? = 0,85; U] = +68,95° (c = 1,0 in Dioxan).

Analyse für Ci₄H₁₄O₅NCIs (M = 453,54):

Berechnet: C 37,10% H 3,10% Cl 39,10%;
gefunden: C 37,16% H 3,29% Cl 39,01%.

b) 2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-

phenylglycin-amid

1,50 g (2,57 mMol) H-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe h) werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst Zu der Lösung werden 2,26 ml (5,14 mMol) Triäthylamin und 1,24 g (2,73 mMol) BOC-D-OAIa-OPCP (Beispiel 3, Schritt 1) gegeben. Nach fünf Stunden wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Die 1,90 g Rohprodukt werden aus 100 ml 96%igem Äthanol umkristallisiert. Es werden 1,06 g (53,5%) chromatographisch einheitliches BOC-D-OAla-Trp-Met-Asp-D-Phg-NH₂ erhalten, das bei 200-204°C unter Zersetzung schmilzt R? = 0,15; R? = 0,30; [a]_D = -24,9° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₆H₄₇Oi₀N₇S (M = 769,89):
Berechnet: C 56,16% H 6,15% N 12,74% S 4,16%;
gefunden: C 56,33% H 5,88% N 12,70% S 4,09%.

Beispiel 4

2-D-(tert.-Butyloxycarbonyloxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

1,0 g (1,71 mMol) H-Trp-Met-Asp-L-Phg-NH₂ (Beispiel 2, Stufe h) wird in 30 ml DMF gelöst Zu der Lösung werden 0,24 ml (1,71 mMol) Triäthylamin und 0,85 g (1,88 mMol) BOC-D-OAIa-OPCP (Beispiel 3, Schritt 1) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tag im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit wasserfreiem Äther isoliert. Das Rohprodukt (1,45 g) wird in einer geringen Menge des Lösungsmittelgemisches 10 gelöst und auf eine aus 100 g Silikagel bereitete Säule aufgebracht. Eluiert wird mit dem Lösungsmittelgemisch 10 und einer Geschwindigkeit von 15 ml/h. Aus den reinen Fraktionen erhält man 0,74 g (56%) BOC-D-OAIa-Trp-Met-Asp-L-Phg-NHj, das bei 167-168°C schmilzt. Rf = 0,30; Ia]₀ = +29,8° (<· = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₅H₄₇O₁₀N₇S (M = 769,89):
Berechnet: C 56,16% H 6,15% N 12,74% S 4,16%;
gefunden: C 56,40% H 6,31% N 12,65% S 4,01%.

Beispiel 5

a) N-iBenzyloxycarbonyO-L-leucyl-L-asparagyl-Xtert.-butylesterJ-D-phenylglycin-amid

5,0 g (14,0 mMol) H-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ · HCI (Beispiel 1, Stufe d) und 5,13 g (14,2 mMöl) Z-Leu-OSu werden in 60 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 1,96 ml (14,0 mMol) Triäthylamin gegeben. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Verreiben mit Wasser isoliert. Die erhaltenen 7,32 g Rohprodukt werden in Äthanol gelöst, geklärt und kristallisiert. Man erhält 6,05 g (77,7%) Z-Leu- ASp(O¹Bu)-D-PlIg-NH₂, das bei 192- 194°C schmilzt. Rf = 0,75. Eine kleine Probe wird aus Äthanol umkristallisiert und schmilzt danach bei 195-196°C. [a]_D = -69,5° (c = 1,0 in DMF).

Analyse für C₃₀H₄₀O₇N₄ (M = 568,67):

Berechnet: C 63,36% H 7,09% N 9,8%;
gefunden: C 63,54% H 7,38% N 10,07%.

b) L-Leucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

5,20 g (9,15 mMol) Z-Leu- Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂ (Beispiel 5, Stufe a) werden eine Stunde lang mit 50 ml

essigsaurem η HBr umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und mit wasserfreiem

Äther das Hydrobromid isoliert. Die 5,33 g Hydrobromid werden in 50 ml Chloroform suspendiert. Der pH· Wert

der Suspension wird mit Triäthylamin auf 7 eingestellt, dann das gelartige Produkt abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Man erhält 2,45 g (70,5%) H-Leu-Asp-D-Phg-NH₂, das bei 218-220⁰C schmilzt. R? = 0,25.

c) N^terL-ButyloxycarbonyO-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

2,25 g (5,93 mMol) H-Leu-Asp-D-Phg-HN₂ (Beispiel 5, Stufe b) werden in einem Gemisch aus 50 ml DMF und 10 ml HMFA gelöst und zu der Lösung 0,84 ml (5,93 mMol) Triäthylamin und 2,65 g (6,6 mMol) BOC-Trp-OSu gegeben. Das Reaktionsgemisch wird nach vierstündigem Rühren klar, es wird über Nacht ste- s hen gelassen. Dann wird das Dimethylamid im Vakuum abgedampft, das zurückbleibende Gemisch mit Wasser verdünnt, der Niederschlag kalt stehen gelassen und schließlich abfiltriert. Das Rohprodukt (4,31 g) wird mit Äthylacetat zweimal aufgekocht und dann die Suspension heiß filtriert. Man erhält 2,87 g (72,8%) BOC-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NHz, das bei 195-200⁰C schmilzt R? = 0,55. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung aufgearbeitet.

d) L-Tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

2,8 g (4,2 mMol) BOC-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NH₂ (Beispiel 5, Stufe c) werden in Gegenwart von 0,59 ml (8,4 mMol) Mercaptoäthanol mit 30 ml salzsaurem Dioxan behandelt. Nach 15 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit wasserfreiem Äther verdünnt Die 2,60 g Hydrobromid werden in 150 ml Wasser suspendiert, der pH-Wert der Suspension wird mit Triäthylamin auf 7 eingestellt, der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Auf diese Weise erhält man 2,22 g (93,7%) H-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NH₂, das bei 246-248°C unter Zersetzung schmilzt. R? = 0,35.

e) 2-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

.1,10 g (1,95 mMol) H-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NH₂ Beispiel 5, Stufe d) und 0,28 g (2,0 mMol) Triäthylamin werden in 10 ml DMF gelöst und zu der Lösung 0,92 g (2,10 mMol) BOC-OGIy-OPCP (Beispiel 1, Schritt 9) gegeben. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben. Das Rohprodukt (1,46 g) wird aus der zehnfachen Menge Äthylacetat heiß filtriert. Die erhaltenen 1,31 g Substanz werden in einer geringen Menge des Lösungsmittelgemisches 10 gelöst und auf eine aus 80 g Silikagel bereitete Säule aufgebracht. Eluiert wird mit dem Lösungsmittelgemisch 10 und einer Geschwindigkeit von 8 ml/h. Aus den reinen Fraktionen werden 0,52 g Produkt isoliert, das aus 80%igem Äthanol umkristallisiert wird. Auf diese Weise erhält man 0,45 g (31,3%)

BOC-OGly-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NH₂

35 das bei 206-208⁰C schmilzt. Rf = 0,75; [a]_d = -51,7° (c = 0,5 in DMF).

Analyse für C₃₆H₄₇O₁₀N₇ (M = 737.82):
Berechnet: C 58,60% H 6,42% N 13,29%;
gefunden: C 58,70% H 6,65% N 13,51%.

Beispiel 6
a) N-iBenzyloxycarbonyO-L-leucyl-L-asparagyHtert-butylesterJ-L-phenylglycin-amid

Man geht von 4,0 g (11,2 mMol) H-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₂ · HCl (Beispiel 2, Stufe d) aus und arbeitet auf die in Beispiel 5, Schritt 1, angegebene Weise. Das Rohprodukt (5,42 g) wird aus Äthanol geklärt. Man erhält 3,0 g (47%) Z-Leu-Asp(O'Bu)-L-Phg-HN₂, das bei 193-194°C unter Zersetzung schmilzt. Rj = 0,70, R? = 0,65. [a]_D = 0° (c = 1,0; in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₀H₄₀O₇N₄ (M = 568,67):
Berechnet: C 63,36% H 7,09% N 9,85%;
gefunden: C 63,79% H 7,30% N 9,59%.

b) L-Leucyl-L-asparagyl-jß-ttert.-butylesterJ-L-phenylglycin-amid-hydrochlorid

2,75 g (4,84 mMol) Z-Leu-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₂ (Beispiel 6, Stufe a) werden in 50 ml DMF gelöst und in Gegenwart von 0,45 ml (5,2 mMol) konzentrierter Salzsäure mit 0,5 g Palladiumaktivkohle als Katalysator mittels Durchleiten von Wasserstoff reduziert. Nach zwei Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit wasserfreiem Äther isoliert. Es werden 2,25 g (98,5%) H-Leu-Asp(O'Bu)-L-Phg-NH₂ · HCl erhalten, das bei 182-183°C schmilzt. R? = 0,15.

c) L-Leucyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid-hydrochlorid 2,25 g (4,80 mMol) H-Leu-Asp(O^lBu)-L-Phg-NH₂ · HCl (Beispiel 6, Stufe b) werden mit 20 ml salzsaurer

Essigsäure umgesetzt Nach 40 Minuten wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Auf diese Weise werden 2,0 g (99%) H-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ - HCI erhalten, das bei 21O⁰C unter Zersetzung schmilzt R? = 0,20.

d) N-itert.-Butyloxycarbonyy-L-tryptophyl-L-methionyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

2,2 g (5,3 mMol) H-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ · HCl (Beispiel 6, Stufe c) werden in 50 ml DMF in Gegenwart von 1,48 ml (10,6 mMol) Triäthylamin mit2,32 g (5,8 mMol) BOC-Trp-OSu umgesetzt Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Wasser verrieben. Das Rohprodukt (3,30 g) wird in 70 ml 80%igem Äthanol gelöst, geklärt und dann kristallisiert. Man erhält 2,30 g (65%)

BOC-Trp~Leu-Asp-L-Phg-NH₂
das bei 205-207⁰C unter Zersetzung schmilzt R^ = 0,4Q-. [d[_D = -7,3° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

e) L-Tryptnphyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

2,23 g (3,25 mMol) BOC-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ (Beispiel 6, Stufe d) werden in Gegenwart von 0,47 ml (6,7 mMol) Mercaptoäthanol mit 25 ml salzsaurem Dioxan umgesetzt. Nach 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit wasserfreiem Äther verdünnt. Das Hydrochlorid wird abgetrennt, in Wasser suspendiert, der pH-Wert der Suspension mit Triäthylamin auf 7 eingestellt der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Auf diese Weise erhält man 1,16 g (61%) H-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NH^, das bei 214-215°C unter Zersetzung

schmilzt. R? = 0,40.

0 2-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-acetyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

0,57 g (1,0 mMol) H-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ (Beispiel 6, Stufe e) und 0,48 g (1,1 mMol) BOC-OGIy-OPCP (Beispiel 1, Schritt 9) werden in 15 ml DMF gelöst und zu der Lösung 0,14 ml (1,0 mMol) Triäthylamin gegeben. Am nächsten Tage wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther isoliert. Die erhaltenen 0,81 g Rohprodukt werden auf die beim D-Diastereomeren bereits beschriebene Weise gereinigt. Es werden 0,30 g (40,5%) BOC-OGly-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ erhalten.

Das Produkt schmilzt unter Zersetzung bei 196-198⁰C. R^ = 0,35. [a]_D = 0° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse fur C₃₆H₄₇O₁₀N₇ (M = 737,82):
Berechnet: C 58,60% H 6,42% N 13,29%;
gefunden: C 58,35% H 6,20% N 13,07%.

Beispiel 7
2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propiony!-L-tryptophyl-L-leucyI-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

1,15 g (2,03 mMol) H-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NH₂ (Beispiel 5, Stufe d) und 1,0 g (2,2 mMol) BOC-D-OAIa-OPCP (Beispiel 3, Schritt 1) werden in 10 ml Dimethylformamid umgesetzt. Das Reaktionsgemisch enthält 0,29 ml (2,03 mMol) Triäthylamin. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther isoliert. Das Rohprodukt (1,56 g) wird in 50 ml 80%igem Äthanol gelöst, das 0,3 ml Essigsäure enthält. Die Lösung wird vor dem Kristallisieren geklärt. Es werden 0,86 g (56%) BOC-D-OAla-Trp-Leu-Asp-D-Phg-NHj erhalten, das unter Zersetzung bei 213-214°C schmilzt. Rj = 0,2; R? = 0,4. [a]_D = -28,7° (c = 1,0 in DMF).

Analyse für C₃₇H₄₉O₁₀N₇ (M = 751,85):
Berechnet: C 59,11% H 6,57% N 13,04%;
gefunden: C 59,10% H 6,52% N 13,20%.

Beispiel 8
60

2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-Tryptophyl-L-Ieucyl-L-asparagyl-L-phenylglycin-amid

0,57 g (1,0 mMol) H-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NH₂ (Beispiel 6, Stufe e) und 0,50 g (1,1 mMol) BOC-OAIa-OPCP (Beispiel 3, Schritt 1) werden in 15 ml DMF in Gegenwart von 0,14 ml (1,0 mMol) Triäthylamin umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tag im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit Äther verrieben und das Rohprodukt (0,77 g) in einer geringen Menge des Lösungsmittelgemisches 10 gelöst und auf eine aus 30 g Silikagel bereitete Säule aufgebracht. Eluiert wird mit dem LösungSmittelgemisch 10 und einer Geschwindigkeit von 5 ml/h. Aus den reinen Fraktionen werden 0,46 g Produkt isoliert. Dieses wird in

10 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 70 ml Äther ausgefällt. Man erhält 0,26 g (34,2%)

BOC-D-OAIa-Trp-Leu-Asp-L-Phg-NHj '

das unter Zersetzung bei 184-185°C schmilzt. Rf = 0,4. [a]_D = +18,8° (c = 1,0; Dimethylformamid). S '

Analyse für C₃₇H₄₉Oi₀N₇ (M = 751,85):
Berechnet: C 59,11% H 6,57% N 13,04%;
gefunden: C 58,92% H 6,40% N 12,88%.

Beispiel 9 f

h a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-l-norleucin-pentafluorphenylester g

10,0 g (24,3 mMol) BOC-NIe-OH · DCHA werden in einem Gemisch aus 75 ml Äther und 25 ml 2 η Schwe- ί

feisäure so lange geschüttelt, bis alles in Lösung gegangen ist. Nach der Trennung der Phasen wird die organische *

Phase mit 25 ml 2 η Schwefelsäure und danach mit Wasser ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird im Vakuum eingedampft. Das ölartige Produkt (5,44 g) wird zusammen mit 4,42 g (24 mMol) Pentafluorphenol in 30 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C abgekühlt und mit 4,63 g (22,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Suspension wird eine Stunde lang in der Kälte stehen gelassen und dann filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 50 ml η-Hexan gelöst und die Lösung mit 5 x 20 ml 5%iger NaHCOi-Lösung, dann mit 2 x 20 ml Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der ölartige Rückstand erstarrt in der Kälte. Man erhält 8,12 g (91%) BOC-NIe-OPFP, das bei 55-57⁰C schmilzt. [a]_D = -26,8° (c = 1,0 in Dioxan); R? = 0,80; R? = 0,85.

Analyse Tür C₁₇H₂₀O₄NF₅ (M = 397,35):
Berechnet: C 51,39% H 5,07% F 23,91%;
gefunden: C 51,51% H 4,68% F 24,66%.

b) L-Asparagyl-(tert.-butylester)-D-phenylglycin-amid

10,6 g (23,2 mMol) Z-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ (Beispiel 1, Stufe c) werden in 350 ml Methanol suspendiert und in Gegenwart von 1,1 g 10%iger Palladiumaktivkohle unter Rühren mit Wasserstoff von Atmosphärendruck reduziert. Nach 3 Stunden wird die Suspension filtriert, der Katalysator mit DMF ausgewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Nach dem Eindampfen im Vakuum wird der feste Rückstand aus 100 ml ; Methanol umkristallisiert. Auf diese Weise werden 5,5 g (74,0%) H-Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂ erhalten, das bei 170-171⁰C schmilzt. R? = 0,15.

40 Analyse für C₆H₂₁O₄N₃ (M = 321,28):

Berechnet: C 59,79% H 7,21% N 13,08%;

gefunden: C 59,80% H 7,10% N 13,18%.

c) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-asparagyl-jS-Ktert.-butylesteri-D-phenylglycin-amid

1,60 g (5,0 mMol) H-Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂ und 1,99 g (5,0 mMol) BOC-NIe-OPFP werden in 10 ml DMF in Gegenwart von 0,70 ml (5,0 mMol) Triäthylamin umgesetzt Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der feste Rückstand wird in Äther aufgenommen und abfiltriert. Man erhält 2,45 g (91,9%) BOC-Nle-Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂, das bei 207-208⁵C schmilzt. R? = 0,75; [a]_D = -62,8° (c = 1,0, in Dimethylformamid). :

Analyse für C₂₇H₄₂O₇N₄ (M = 534,64):

Berechnet: C 60,65% H 7,92% N 10,48%; gefunden: C 60,63% H 8,04% N 10,18%.

d) L-Norleucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid-hydrochlorid

2,20 g (4,11 mMol) BOC-NIe-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ werden mit 15 ml 4 η salzsaurer Essigsäure behandelt Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der feste Rückstand wird mit Äther filtriert Man erhält 1,70 g (99%) H-NIe-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl, das bei 225°C unter Zersetzung schmilzt. R/ = 0,20, [a\_D = -63,7° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

e) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-norleucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

1,57 g (3,78 mMol) H-NIe-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl und 1,52 g (3,78 mMol) BOC-Trp-OSu werden in

50 ml DMF in Gegenwart von 1,06 ml (7,6 mMol) Triäthylamin umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tag im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Wasser filtriert. Man erhält 2,45 g (97,5%)

BOC-Trp-Nle-Asp-D-Phg-NH₂, das bei217°C unter Zersetzung schmilzt. Rf =0,35,[ff]_D = -32,7°(c = 1,0; in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₄H₄₄O₈N₆ (M = 664,77):
ίο Berechnet: C 61,43% H 6,67% N 12,64%;
gefunden: C 61,41% H 6,86% N 12,65%.

f) L-Tryptophyl-L-norleucyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid-hydrochlorid
15

2,20 g (3,32 mMol) BOC-Trp-Nle-Asp-D-Phg-NH₂ werden in Gegenwart von 1,20 ml (17 mMol) Mercaptoäthanol mit 25 ml 4 η salzsaurem Dioxan behandelt. Nach 15 Minuten wird die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther verfestigt. Nach dem Filtrieren erhält man 1,99 g (99,0%) H-Trp-Nle- Asp-D-Phg-NH₂ · HCl, das bei 217-221°C unter Zersetzung schmilzt. R? = 0,35 [a)_D = -54,2° (c = 1,0; in Dimethylformamid).

g) 2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-norleucyl-L-asparagyl-D-

phenylglycin-amid

1,80 g (3,0 mMol) H-Trp-Nle-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl und 1,36 g (3,0 mMol) BOC-D-O AIa-OPCP werden in Gegenwart von 1,26 ml (9,0 mMol) Triäthylamin in 30 ml DMF umgesetzt. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Wasser filtriert. Die Substanz wird chromatographisch gereinigt. Man erhält 0,99 g BOC-D-OAla-Trp-Nle-Asp-D-Phg-NHj, das bei 211-212°C unter Zersetzung schmilzt. R? = 0,35; Rj = 0,25. [a]_D = -22,8° (c = 1,0; in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₇H₄₉O₁₀N₇ (M = 751,85):
Berechnet: C 59,11% H 6,57% N 13,04%;
gefunden: C 59,10% H 6,30% N 13,21%.

Beispiel 10
a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-norvalin-pentafluorphenylester

8,0 g (20 mMol) BOC-Nva-OH · DCHA werden mit 60 ml Äther und 20 ml 2 η Schwefelsäure so lange geschüttelt, bis alles in Lösung gegangen ist. Die ätherische Lösung wird mit 20 ml 2n Schwefelsäure gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird zusammen mit 3,70 g (20 mMol) Pentachlorphenol in 25 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird bei O⁰C mit 3,92 g (19 mMol) DCC eine Stunde lang umgesetzt. Danach wird die Suspension filtriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 50 ml n-Hexan gelöst. Die Lösung wird mit 5 x 20 ml 5%iger NaHCO₃-Lösung und dann mit 2 x 20 ml Wasser gewaschen. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft. Der ölartige Rückstand kristallisiert in der Kälte. Man erhält 6,21 g (81%) BOC-Nva-OPFP, das bei 60-62⁰C schmilzt. R? = 0,70, [a]_D = -32,3° (c = 1,0 in Dioxan).

so Analyse für C₁₆H₁₈O₄NF₅:

Berechnet: C 50,14% H 4,73% F 24,78%;
gefunden: C 50,06% H 4,64% F 24,63%.

b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-asparagyl-jS-itert.-butylesteO-D-phenylglycin-amid

1,60 g (5,0 mMol) H-Asp(O'Bu)-D-Phg-NH₂ (Beispiel 9, Stufe b) und 1,91 g (5,0 mMol) BOC-Nva-OPFP

werden in 10 ml DMF in Gegenwart von 0,70 ml (5 mMol) Triäthylamin umgesetzt Am nächsten Tag wird das

Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äther filtriert. Man erhält 2,36 g (87,4%)

BOC-NVa-ASp-(O¹Bu)-D-Ph₈-NH₂, das bei 200-202⁰C schmilzt R? = 0,75; [a]_D = -66,7° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

Analyse für C₂₆H₄₀O₇N₄ (M = 520,61):

Berechnet: C 59,98% H 7,74% N 10,76%;
gefunden: C 60,08% H 7,68% N 10,96%.

c) L-Norvalyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid-hydrochlorid

2,0 g (3,84 mMol) BOC-Nva- Asp(O^lBu)-D-Phg-NH₂ werden mit 15 ml 4 η salzsaurer Essigsäure behandelt. Nach einer Stunde wird die Suspension mit Äther verdünnt und kalt filtriert. Es werden 1,52 g (98%) I I-Nva-Asp-D-Phg-NFV HCl erhalten. Das Hydrochlorid schmilzt unter Zerzetzung bei 204⁰C. R?= 0,15. 5 [a]p = -58,0° (c = 1,0 in Dimethylformamid).

d) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-norvalyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

1,50 g (3,74 mMol) H-Nva-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl und 1,50 g (3,74 mMol) BOC-Trp-OSu werden in 30 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 1,05 ml (7,5 mMol) Triäthylamin umgesetzt. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Wasser filtriert. Das Rohprodukt (2,36 g) wird aus 300 ml 80%igem Äthanol umkristallisiert. Man erhält 1,54 g (66,2%)

BOC-Trp-Nva-Asp-D-Phg-NHz'
das bei 240⁰C unter Zersetzung schmilzt. Rj = 0,35. [a]_D = -60,5° (c = 1,0; in Dimethylformamid).

Analyse für C₃₃H₄₂O₈N₆ (M = 650,71): 20

Berechnet: C 60,91% H 6,51% N 12,92%;
gefunden: C 60,66% H 6,59% N 12,57%.

e) L-Tryptophyl-L-norvalyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid-hydrochlorid 25

1,50 g (2,30 mMol) BOC-Trp-Nva- Asp-D-Phg-NH₂ werden mit 20 ml 4 η salzsaurem Dioxan behandelt, wobei 0,77 ml (11 mMol) Mercaptoäthanol zugesetzt werden. Nach 30 Minuten wird die Suspension im Vakuum eingedampft und der feste Rückstand mit Äther filtriert. Auf diese Weise werden 1,34 g (99,0%) H-Trp-Nva-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl erhalten, das bei 216°C unter Zersetzung schmilzt. R? = 0,30. 30 [a]_D = -53,3° (c = 1,0; in Dimethylformamid).

0 2-D-(tert.-Butyloxycarbonylaminooxy)-propionyl-L-tryptophyl-L-norvalyl-L-asparagyl-D-phenylglycin-amid

1,24 g (2,11 mMol) H-Trp-Nva-Asp-D-Phg-NH₂ · HCl und 0,95 g (2,10 mMol) BOC-D-OAIa-OPCP werden in 40 ml DMF in Gegenwart von 0,88 ml (6,3 mMol) Triäthylamin umgesetzt. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand mit Wasser filtriert, anschließend mit Wasser und Äther gewaschen. Das Rohprodukt (1,40 g) wird in einem im Verhältnis 20 : 6 : 11 bereiteten Gemisch aus Pyridin, Essigsäure und Wasser umkristallisiert. Man erhält 0,72 g BOC-D-OAla-Trp-Nva-Asp-D-Phg-NH₂, das 40 bei 210⁰C schmilzt. R^ = 0,28; [a]_D = -26,5° (c = 1,0; in Dimethylformamid)

Analyse für C₃₆H₄₇O₁₀N₇ (M = 737,79):
Berechnet: C 58,61% H 6,42% N 13,29%;
gefunden: C 58,57% H 6,20% N 13,17%. 45

Claims

Patentansprüche:

L N-Acyltetrapeptidamide der allgemeinen Formel I
E—N—O—A —C—Trp—B—Asp—Phg—NH₂ (I)

I Il

H O

mit den folgenden Bedeutungen von B, A und E: