DE1518097B1

DE1518097B1 - Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden

Info

Publication number: DE1518097B1
Application number: DE19641518097
Authority: DE
Inventors: Hess Hans-Juergen Ernst
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1963-07-01
Filing date: 1964-06-10
Publication date: 1972-08-03
Also published as: CH482649A; US3330857A; US3422083A; GB1048086A

Description

CH(CH₃)₂

CH,

in. JNfH .N CO Γνχα"" CH" CO R₁

in der R Wasserstoff, den L-Arginyl- oder L-Aspartyl-L-arginylrest und R₁ den L-Valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninrest bedeutet, sowie deren Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, "dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise a) N-[2-Isopropyl-3-(tert.-butyloxycarbonyl) - carbazoyl] - O - benzoyl - tyrosinäthylester nach Entfernung der 3-tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Carbobenzoxy-nitro-L-arginin kondensiert, den erhaltenen N-[2-Isopropyl-3-(carbobenzoxy - nitro - L - arginyl) - carbazoyl] - O - benzoyl-tyrosinäthylester nach hydrolytischer Entfernung der Benzoyl- und Äthylestergruppe mit L -Valyl - L - histidyl -L- prolyl - L - phenylalaninmethylester kondensiert und den erhaltenen N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro -L- arginyl) - carbazoyl] - L- tyrosyl - L - valyl - L - histidyl-L - propyl -L- phenylalaninmethylester durch Hydrierung unter sauren Bedingungen und Anionenaustausch in N - [2 - Isopropyl - 3 - (l - arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin überführt oder b) den N- [2-Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro -L- arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl - L - histidyl - L - prolyl-L-phenylalanin-methylester nach Entfernung der Carbobenzoxygruppe mit Carbobenzoxy-L-asparaginsäure - β - benzylester kondensiert und den erhaltenen N - {2 - Isopropyl - 3 - [carbobenzoxy- (ß - benzyl) - L - aspartyl - nitro - L - arginyl] - carbazoyl} -L-- tyrosyl -L- valyl - L - histidyl - L - propyl-L-phenylalaninmethylester durch Hydrierung unter sauren Bedingungen und Anionenaustausch in N - [2 - Isopropyl - 3 - (l - aspartyl - L - arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl- L - phenylalanin überführt bzw. daß man c) den N - [2 - Isopropyl - 3 - (tert. - butyloxycarbonyl)-carbazoyl] - O - benzoyl - tyrosinäthylester nach Entfernung der O-Benzyl- und Äthylestergruppe mit L-Valinmethylester kondensiert, den erhaltenen N - [2 - Isopropyl - 3 - (tert. - butyloxycarbonyl)-carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valinmethylester nach Entfernung der Methylestergruppe mit L-Histidyl-L - prolyl - L - phenylalaninmethylester kondensiert und aus dem erhaltenen N-[2-Isopropyl-3-(tert.-butyloxycarbonyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl-L - histidyl - L - prolyl - L - phenylalaninmethylester die S-tert.-Butyloxycarbonyl- und die Methylestergruppe entfernt und diese Polypeptide gewünschtenfalls in ein Salz mit einer physiologisch verträglichen Säure überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kondensation zur Bildung der Polypeptidkette in Gegenwart eines Kondensationsmittels durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kondensationsmittel N₅N^Dicyclohexylcarbodiimid ist.

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der allgemeinen Formel

CH(CH₃)₂

R-NH-N-CO-NH-CH-CO-R₁

in der R Wasserstoff, den L-Arginyl- oder L-Aspartyl-L-arginylrest und R₁ den L-Valyl-L-histidyl-L-pro-IyI - L - phenylalaninrest bedeutet, sowie deren Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man in an sich bekannter Weise a) N-[2-Isopropyl-3-(tert.-butyloxycarbonyl)-carbazoyl] - O - benzoyl - tyrosinäthylester nach Entfernung der S-tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Carbobenzoxy - nitro - L - arginin kondensiert, den erhaltenen N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro-. L - arginyl) - carbazoyl] - O - benzoyl - tyrosinäthylester nach hydrolytischer Entfernung der Benzoyl- und Äthylestergruppe mit L - Valyl - L - histidyl - L - prolyl-L-phenylalaninmethylester kondensiert und den erhaltenen N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro-L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl - L - histidyl-L - prolyl - L - phenylalaninmethylester durch Hydrierung unter sauren Bedingungen und Anionenaustausch in N-[2-Isopropyl-3-(L-arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin überführt oder b) den N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro - L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl-L - valyl - L - histidyl - L - prolyl - L - phenylalaninmethylester nach Entfernung der Carbobenzoxygruppe mit Carbobenzoxy -L - asparaginsäure - β - benzylester kondensiert und den erhaltenen N - {2 - Isopropyl-3-[carbobenzoxy-(jö-benzyl)-L-aspartyl-nitro-L-argi- nyn-carbazoyty-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-pro-IyI-L-phenylalaninmethylester durch Hydrierung unter sauren Bedingungen und Anionenaustausch in N - [2 - Isopropyl - 3 - (l - aspartyl - L - arginyl) - carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin überführt bzw. daß man c) den N - [2 - Isopropyl - 3 - (tert. - butyloxycarbonyl) - carbazoyl]-O - benzoyl - tyrosinäthylester nach Entfernung der O-Benzoyl- und Äthylestergruppe mit L-Valinmethylester kondensiert, den erhaltenen N-[2-Isopropyl - (tert. - butyloxycarbonyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valinmethylester nach Entfernung der Methylestergruppe mit L-Histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninmethylester kondensiert und aus dem erhaltenen N - [2 - Isopropyl - 3 - (tert. - butyloxycarbonyl)-carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl - L - histidyl - L - prolyl-

. L-phenylalaninmethylester die S-tert.-Butyloxycarbonyl- und die Methylestergruppe entfernt und diese Polypeptide gewünschtenfalls in ein Salz mit einer physiologisch verträglichen Säure überführt.

In den letzten Jahren stieg das Interesse für biologisch aktive Polypeptide und insbesondere für die Hypophysenhormone, wie z. B. Oxytocin, Vasopressin, die melanocyt-stimulierenden Hormone und ACTH

sowie für Angiotensin und Bradykinin, den aus dem Blutplasma gewonnenen Peptiden. Diese Polypeptide haben zahlreiche wertvolle Eigenschaften. Dem Angiotensin, Bradkinin, Oxtocin, Vasopressin, Eledoisin und Kallidin gemeinsam ist ihre kontrahierende Wirkung auf die Herzgefäße und Glattmuskeln. Oxytocin ist nützlich für die Herbeiführung von Wehen und Verhütung von Nachgeburtblutungen, Angiotensin wird zur Schockbehandlung verwendet; Bradykinin dient zur Gefäßerweiterung und Vasopressin ist ein Mittel zur Herabsetzung des Harndranges. Eine andere Gruppe von Peptiden sind die von Insulin abgeleiteten, welche den Blutzuckerspiegel beeinflussen. >

Ein Hauptproblem bei der praktischen therapeutisehen Anwendung der biologisch aktiven Polypeptide ist die kurze Dauer ihrer Wirkung, welche auf dem enzymatischen Abbau, d. h. Hydrolyse von Amidbindungen im Körper, beruht. Die Angriffstelle hängt ab von dem entsprechenden Enzym und Polypeptid; z. B. können endständige Aminosäuren vom Polypeptid durch Epopeptidasen, wie z. B. Leucinaminopeptidase und Carboxypeptidase abgespalten werden, und Spaltung kann auch entlang der Kette stattfinden, z. B. am Carboxylende von basischen und aromatisehen Aminosäuren durch die Wirkung von Enzymen, welche mit Typsin bzw. Chymotrypsin verwandt sind.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Peptidstruktur auf eine Weise zu ändern, daß die enzymatische Beständigkeit verstärkt und die Wirkung verlängert wird, ohne die biologische Wirksamkeit zu zerstören. Diesen unerwarteten Vorteil erreicht man dadurch, daß man die a-Methylidingruppe (d. h. = CH) von mindestens einem enthaltenen Aminosäurerest carbonylrest und R" den Isopropylrest bedeutet, mit einer Verbindung der Formel

CH,-/^V- O—R'"

— NH-CHR¹-C:O —
durch ein Stickstoffatom ersetzt:

— NH- NR¹- C:O —

Wenn R¹ etwas anderes als Wasserstoff bedeutet, ist der α-Kohlenstoff ein Asymmetriezentrum, welches in den neuen Produkten ausgeschaltet wird, was ebenfalls einen bedeutenden Vorteil bei der synthetischen Herstellung dieser Stoffe bietet.

Enzymatische Versuche zeigen, daß die Polypeptidkettenstelle, an welcher der Kohlenstoff durch Stickstoff ersetzt wurde, gegenüber enzymatischem Angriff immun ist, wobei — besonders überraschend — die benachbarten Stellen ebenfalls immun sind. Dennoch wurde gefunden, daß die neuen Produkte die biologischen Wirkungen der Ausgangspolypeptide zeigen, wodurch zum ersten Mal bewiesen wird, daß in einer Polypeptidkette eine Nicht-Aminosäureeinheit substituiert werden kann, ohne daß die Wirksamkeit zerstört wird. Darüber hinaus äußert sich die verstärkte Stabilität gegen enzymatischen Abbau in einer verlängerten Dauer dieser Wirksamkeit.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der allgemeinen Formel besteht zunächst darin, daß man eine Verbindung der Formel

R'NH—NHR"
in welcher R' eine Schutzgruppe, wie den t-Butyloxy-OCN-CH-COX

umsetzt, in welcher R'" eine Schutzgruppe, wie den Benzoylrest, und X einen niederen Alkoxyrest, wie den Äthoxyrest, bedeutet, und die erhaltene Verbindung wie angegeben unter Herstellung eines Polypeptides kondensiert und ein Säureanlagerungssalz des Polypeptids herstellt, falls das genannte Polypeptid als freie Base vorliegt.

Erfindungsgemäß werden von den biologisch wirksamen Polypeptiden, in welchen mindestens eine a-Methylidingruppe durch ein Stickstoffatom ersetzt ist, wegen ihrer hervorragenden Eigenschaften besonders solche bevorzugt, deren Ausgangspolypeptid

Rinder-Angiotensin II

HAsp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-PheOH;

Pferde-Angiotensin II

HAsp-Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-PheOH;

Rinder-Oxytocin

HCyS-Tyr-Ileu-Glu(NH₂)-Asp(NH₂)-CyS-Pro-Leu-' GIy(NH₂); '

Bradykinin HArg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-ArgOH;

oder Rinder-Vasopressin

HCys-Tyr-Phe-Glu(NH₂)-Asp(NH₂)-CyS-_; Pro-Arg-' GIy(NH₂) '

ist.

Die vorstehenden Formeln verwenden die bekannten Abkürzungen, die sich auf die folgenden Reste beziehen:

GIy Glycyl

GIy(NH₂) Glycinamid

/yäi Valyl

\i-m ' Leucyl

lieu Isoleucyl

Phe Phenylalanyl

Tyr Throsyl

Asp Asparagyl

Asp(NH₂) Asparaginyl

GIu(NH₂) Glutaminyl

Ser Seryl

, CySH Cysteinyl

His Histidyl

Arg Arginyl

Lys Lysyl

Pro Prolyl

Wie bereits erklärt wurde, wird die a-Methylidingruppe mindestens einer Aminosäureeinheit durch ein Stickstoffatom in den neuen Polypeptiden ersetzt. Wird z. B. eine Phenylalanyleinheit für diese Substi-

tuierung ausgewählt, dann erhält das Polypeptid die Sequenz

— NH — N(CH₂C₆H₅) — CO — an Stelle der üblichen Phenylalanylgruppe

-NH-CH(CH₂C₆H₅)-CO-

Wird in ähnlicher Weise eine Arginylgruppe für die Substituierung gewählt, so enthält das Polypeptid die Sequenz

—NH-N(CH₂CH₂CH₂NHCDNH]Nh₂)-CO-

an Stelle von

—NH-CH(CH₂CH₂CH,NHC[:NH]NH₂)—CO-

Gewöhnlich lassen sich die besten Ergebnisse dadurch erzielen, daß man die Substituierung an den Hauptstellen des beobachteten enzymatischen Abbaus oder an unmittelbar benachbarten Stellen vornimmt.

Die Herstellung der Polypeptide wird in dem folgenden Fließschema erläutert, worin R', R", R'" und X die oben beschriebene Bedeutung haben und R"" einen R"-Rest darstellt, aus welchem ein Wasserstoffatom entfernt wurde.

RTSf-NH₂ II

R'NH—N=R"" III

R'NH—NHR" IV

CH₂-<\~~V~ O—R"'

H,N—CH-COX

OCN-CH-COX
VI

R" CH₂-\/— O— R"'

R'NH—N — CONH —CH-COX I

CH₇

R'NH—N—CONH—CH-COR₁

OH

Im vorstehenden Reaktionsschema bedeutet:

II—III die Kondensation von Hydrazin II mit einer Carbonylverbindung O=R", am zweckmäßigsten in Gegenwart einer kleineren Menge Säure, wie Eisessig;

III-IV eine Hydrierungsreaktion, vorzugsweise mit einem Edelmetall-Katalysator;

II-IV die Kondensation von Hydrazin II mit R"X, worin R" die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und X eine Tosyl-, Chlor-, Brom- oder Jodgruppe darstellt, wobei vorzugsweise ein Hydrazinüberschuß verwendet wird, um die Di-Substitution herabzusetzen;

V-VI die Umsetzung der Aminosäureverbindung V (als solche oder gegebenenfalls in der Form eines leicht erhältlichen Säureanlagerungssalzes, wie ¹Z. B. des Hydrochloride oder Hydrobromids) mit Phosgen oder Trichlormethylchloroformat (Diphosgen);

II+VI—Ί die Kondensation des Isocyanats VI mit IV+VI—KI einer Hydrazinverbindung, zweckmäßigerweise unter basischen Bedingungen, z. B. in einem Lösungsmittel wie Pyridin, und

deren weitere Reaktionen zu Polypeptiden, wie anschließend näher beschrieben i[ wird.

Die neuen biologisch aktiven Polypeptide lassen sich aus den obengenannten Verbindungen (1) durch bekannte Verfahren herstellen, wie in den folgenden Beispielen noch näher erläutert wird. Die einzelnen Aminosäuren können nacheinander verknüpft werden, oder es können zuerst kleinere Peptidsequenzen gebildet und an diese Zwischenprodukte gebunden werden.

Die beschriebenen Umsetzungen lassen sich nach den üblichen, dem Fachmann wohlbekannten Verfahren durchführen. Es ist häufig zweckmäßig, die Reaktion in einem inerten Lösungsmittel durchzuführen, d. h. in einem Lösungsmittel, welches unter den

6c angewandten Bedingungen keine nachteilige Wirkung auf die Reaktionsteilnehmer und Produkte zeigt. Beispiele für Lösungsmittel, welche oft geeignet sind, sind Alkohole, wie z. B. Äthanol, aromatische Stoffe, wie z. B. Toluol; chlorierte Lösungsmittel, wie z. B.

Chloroform, und Säuren, wie z. B. Eisessig. Für die Kondensation von Aminogruppen mit Carboxylgruppen bei der synthetischen Herstellung der Polypeptidkette ist es häufig von Vorteil, die Reaktion in Ge-

genwart eines Kondensationsmittels, wie z. B. Ν,Ν¹ - Dicyclohexylcarbodiimid durchzuführen, zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittelsystem, wie Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid-Acetonitril.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich durch übliche Verfahren isolieren, z. B. durch Eindampfen des Reaktionsmediums oder Ausfällen durch Zusatz von Äther oder einem anderen Nichtlösungsmittel. Gegebenenfalls kann man die Verbindungen weiter durch übliche Verfahren reinigen, z. B. durch Verreiben mit Äther, Äthylacetat, Hexan, Mischungen aus diesen od. dgl.; Lösungsmittelverteilung in Systemen, wie Butanol zu Wasser, Butanol zu Essigsäure, Methanol zu Wasser zu Chloroform zu Benzol; oder durch Umkristallisation, z. B. aus Hexan, Hexan-Äthylacetat, Hexan - Methylenchlorid, Cyclohexan-Methylenchlorid oder Mischungen aus Alkoholen, wie z. B. Methanol oder Äthanol mit Wasser, Äther, Isopropyläther, Äthylendichlorid od. dgl. Andere Verfahren und/oder Lösungsmittel ergeben sich für den Fachmann leicht von selbst.

Selbstverständlich sollte man mit Besonnenheit vorgehen, wenn man gewisse Verbindungen den oben beschriebenen Reaktionsstufen unterwirft. Zum Beispiel sollten die freien Amino- und Carboxygruppen gegen eine Umsetzung in den ersten Stufen geschützt und die Maskierungsgruppen entfernt werden, wenn die Kondensation durchgeführt werden soll. In ähnlicher Weise können für die direkte Acylierung der Amine Phenoxy- und p-Nitrophenoxyester Verwendung finden, wie anschließend noch beschrieben wird, und können aus der freien Carbonsäure in der entsprechenden Stufe hergestellt werden.

Von den Amino-Maskierungsgruppen unterliegt die Tritylgruppe in Hydrierungsreaktionen und unter sauren Bedingungen einer Spaltung und sollte daher in den Reaktionen III-IV und V-VI vorzugsweise vermieden werden. Gegebenenfalls kann man derartige Gruppen leicht nach diesen Stufen einführen oder in den anderen angegebenen Weisen vorgehen. Auch Cyclopentyloxycarbonyl-, Formyl- und t-Butyloxycarbonylgruppen erleiden Spaltung in Säure und werden am besten in der Reaktion V-VI vermieden; das gleiche gilt für Benzyloxycarbonyl-, p-substituierte Benzyloxycarbonyl- und Tosylgruppen in Reaktion III-IV. Von den Carboxy-Maskierungsgruppen sind t-Butoxyester der Säurespaltung ausgesetzt und , werden daher in der Reaktion V-VI vorzugsweise vermieden. Sind sie in diesem Teil des Moleküls für anschließende Reaktionsstufen erwünscht, so lassen sie sich leicht aus den entsprechenden freien Säuren durch Behandlung mit Isobutylen in Gegenwart von Mineralsäure herstellen, wie es in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert wird. In ähnlicher Weise können Amidgruppen Schwierigkeiten bei der Herstellung von Isocyanaten VI bereiten, können jedoch in einer späteren Stufe aus den entsprechenden Alkylestern durch Behandlung mit Ammoniak in Alkohol hergestellt werden, wie es in den Beispielen gezeigt wird.

Zusätzlich zu den obengenannten Vorsichtsmaßnahmen werden freie Hydroxyl- und Mercaptogruppen vorzugsweise maskiert, z. B. als Alkoxy- bzw. Benzylthioäther für die Reaktion V-VI, und anschließend regeneriert.

Gegebenenfalls lassen sich Maskierungsgruppen durch eine Anzahl verschiedener Verfahren entfernen, einschließlich der in den folgenden Beispielen beschriebenen. Zum Beispiel ist Hydrolyse mit Mineralsäure wirksam zur Umwandlung von Carboxylestern in die entsprechenden Säuren und kann außerdem unter bekannten geeigneten Bedingungen zur Abspaltung verschiedener Amino-Maskierungsgruppen, wie z. B. Formyl-, Trityl-, Cyclopentyloxycarbonyl- und t-Butyloxycarbonylgruppen, verwendet werden. Carboxylester außer t-Butylestern lassen sich in die entsprechenden Carbonsäuren durch alkalische Hydrolyse umwandeln, welche ebenfalls wirksam zur Abspaltung von Alkanoyloxy- und Benzoyloxy-Schutzgruppen ist. Die Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak ist ein bevorzugtes Verfahren zur Abspaltung von Tosyl-Amino-Maskierungsgruppen und kann außerdem zur Entfernung von Benzylcarbonylgruppen und zur Spaltung von Benzylthioäthern verwendet werden. Alkyl- und Benzyläther werden durch Behandlung mit Bromwasserstoff in Eisessig gespalten, und dieses Verfahren entfernt außerdem bestimmte Amino-Maskierungsgruppen, wie z. B. Cyclopentyloxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- und t-Butyloxycarbonylgruppen, Nitroarginylgruppen lassen sich durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wie z. B. Palladium, in Arginylgruppen umwandeln; dies ist außerdem ein bevorzugtes Verfahren zur Spaltung von Benzyläthern, Benzyloxycarbonyl- und Trityl-Amino-Schutzgruppen werden ebenfalls auf diese Weise entfernt. Die veränderte Stabilität der Maskierungsgruppen gegenüber verschiedenen Mitteln erlaubt die selektive Entfernung einer Schutzgruppe von zweifachen geschützten Aminosäuren, wie z. B. Ornithin, Lysin oder Arginin, vorausgesetzt, daß zwei verschiedene Schutzgruppen verwendet wurden. Außerdem bieten Na, Nt-Tritylysinpeptide insofern eine nützliche Flexibilität, als die Na-Tritylgruppe durch Säure, unter Beibehaltung der Nf-Tritylgruppe, abgespalten werden kann.

Außer den oben beschriebenen Maskierungssystemen kann man auch andere äquivalente Schutzgruppen verwenden. Bei Arginylgruppen ist manchmal Schutz in der Form des Dibenzyloxycarbonylderivates erwünscht. Andere Systeme ergeben sich für den Fachmann von selbst.

Je nach den Reaktionsbedingungen werden die neuen Produkte der vorliegenden Erfindung als freie Basen oder als deren Salze erhalten. Die Erfindung umfaßt auch die Säureanlagerungssalze der neuen Polypeptide und jene Verbindungen mit einer freien Aminogruppe, z. B. solchen, bei denen R der allgemeinen Formel ein Wasserstoff bedeutet. Diese Salze lassen sich nach bekannten Verfahren, welche in den Beispielen weiter erläutert werden, sowohl mit pharmazeutisch verwertbaren als auch pharmazeutisch nicht verwertbaren Säuren herstellen. »Pharmazeutisch verwendbar« sind solche salzbildenden Säuren, welche die Toxizität der Polypeptide nicht wesentlich erhöhen. Die pharmazeutisch verwertbaren Säureanlagerungssalze der neuen Polypeptide eignen sich für die Therapie. Sie lassen sich durch Umsetzung der Basen mit Mineralsäuren, wie z. B. Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Metaphosphor-, Salpeter- und Schwefelsäuren, sowie mit organischen Säuren, wie z. B. Wein-, Essig-, Citronen-, Apfel-, Milch-, Fumar-, Benzoe-, Glycol-, Glucon-, Gulon-, Bernstein-, Acrylsulfonsäuren, z. B. p-Toluolsulfonsäure u. dgl. herstellen.

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Die pharmazeutisch nicht verwertbaren Säureanlagerungssalze, einschließlich jener, die mit Fluorwasserstoff- und Perchlorsäuren hergestellt wurden, sind zwar nicht nützlich für die Therapie, aber wertvoll für die Isolierung und Reinigung der neuen Polypeptide und Zwischenprodukte. Ferner eignen sie sich für die Herstellung der freien Basen sowie der pharmazeutisch verwertbaren Salze. Es versteht sich von selbst, daß die pharmazeutisch verwertbaren Säureanlagerungssalze der neuen Polypeptide außer in der Therapie auch für die Isolierung und Reinigung nützlich sind. Besonders bevorzugt werden die Mineralsäure-Anlagerungssalze der Verbindungen I a und die pharmazeutisch verwertbaren Säureanlagerungssalze der neuen biologisch aktiven Polypeptide. Solche Stoffe, die viele freie Aminogruppen enthalten, lassen sich in der Form von Mono- oder Poly-Säureanlagerungssalzen oder als gemischte Salze mehrerer Säuren erhalten.

IO

und Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich vorteilhaft für Verwendungszwecke einsetzen. In Tests mit üblichen Versuchstieren zeigen sie eine starke biologische Wirksamkeit, welche qualitativ jener der Naturprodukte ähnlich, jedoch von größerer Dauer ist. Zum Beispiel zeigen die Polypeptide

HAsp ■ Arg · NHN[CH(CH₃)₂]CO ·

Tyr · VaI · His -Pro · PheOH (A)

HArg · NHN[CH(CH₃)₂]CO ·

Tyr · VaI · His ■ Pro · PheOH (B)

die gleiche blutdruckerhöhende Wirkung bei Ratten wie Rinder-Angiotensin II.

HAsp · Arg · VaI · Tyr · VaI · His · Pro · PheOH

Bei wirkungsgleichen Dosierungen ist jedoch die Wirkungsdauer gegenüber jener des Naturproduktes etwa verdoppelt.

Die Schwellendosierungen für die Wirksamkeit sind wie folgt:

Peptid	A	B
Blutdruck bei Ratten (pro Kilogramm Körpergewicht Kontraktion des isolierten Meerschweinchen-Ileum .. Kontraktion des isolierten Ratten-Uterus^b)	2μg 0,1 μg/ccm 0,05 μg/ccm	10 μg 0,5 μg/ccm 0,5 μg/ccm

") HeIv. Chem. Acta, 44, S. 671 (1961). *) Amer. J. Physiol., 201, S. 51 (1961).

Setzt man diese Peptide einem Abbau durch verschiedene Enzyme aus, so erhält man die folgenden Ergebnisse:

Peptid
B

Pepsin

Chymotrypsin

Leucin-Aminopeptidase

im wesentlichen

beständig beständig beständig

°) An der Val³-Tyr-Bindung.

^b) An der Tyr-Val^s-Bindung.

^c) An der N-Endsäure.

beständig

beständig
beständig

Spaltung³)

Spaltung¹³) Spaltung⁰)

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

In den Beispielen werden optische Drehungen in l%iger äthanolischer Lösung gemessen, falls nicht anders angegeben. Die Ultraviolettspektren werden in Methanol bestimmt. Die Papierchromatographiesysteme sind

(1) Cyclohexan-Formamid (gesättigt);

(2) Benzol-Cyclohexan-Formamid (1:1);

(3) Benzol-Diäthylamin-Formamid (9:1);

(4) Benzol-Chloroform-Formamid (1:1);

(5) Tetrachlorkohlenstoff-Diäthylamin-Formamid;

(6) Chloroform-Diäthylamin-Formamid (95:5);

(7) Methylisobutylketon-Ameisensäure (88%)-Wasser(2:l:l);

(8) Benzol-Aceton-Ameisensäure (88%)-Wasser (10:5:2:6);

(9) sek.-Butanol-Ameisensäure (88%)-Wasser (7:1:2);

(10) Chloroform-Ameisensäure (88%)- Äthanol (95%) (2:2:1);

(11) n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1);

(12) sek.-Butanol-Essigsäure-Wasser (7:1:2);

(13) n-Butanol-Methyläthylketon-Ammoniak (29%)-Wasser (5:3:1:1);

(14) Äthylacetat-Pyridin-Wasser (12:3:4);

(15) n-Butanol-Pyridin-Wasser (6:4:3);

(16) Chloroform-Methanol-Diäthylamin-Wasser (9:5:1:5; untere Phase);

(17) Butanol-Dioxan-Ammoniak (29%).

Whatman Nr. 4 chromatographisches Papier wird verwendet, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1 Isopropyliden-t-butyl-carbazat

Einer Lösung von 10 g t-Butyl-carbazat in 15 g Aceton werden 2 Tropfen Eisessig zugesetzt, worauf die Temperatur sofort ansteigt. Das Gemisch wird in einem Eisbad gekühlt, und man läßt es 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Der Acetonüberschuß wird dann im Vakuum entfernt, wobei man 13,0 g eines zähflüssigen Öls erhält, welches bei längerem Stehen kristallisiert. Dieses Material wird aus heißem

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η-Hexan umkristallisiert; Ausbeute 10,55 g; (82%) in Form von Nadeln. Für die Analyse wird eine Probe noch einmal umkristallisiert, Schmelzpunkt 103 bis 105° C.

Analyse für C₈H₁₆O₂N₂:

Berechnet ... C 55,79, H 9.36, N 16,27; gefunden .... C 55,94, H 9,12, N 16,48.

Beispiel 2 t-Butyl-3-isopropyl-carbazat

Isopropyliden-t-butyl-carbazat (2 g) wird in 60 ecm absolutem Äthanol gelöst, und 0,3 g Platinoxyd werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei einem Druck von 3 Atmosphären hydriert, wonach man feststellt, daß der berechnete Wasserstoff verbraucht ist. Der Katalysator wird dann durch Filtrieren abgetrennt, und das Lösungsmittel wird verdampft. Man erhält einen kristallinischen Rückstand (2 g) mit einem Schmelzpunkt von 47 bis 51° C und trocknet ihn 24 Stunden bei 25° C für die Analyse. Analyse für C₈H₁₈O₂N₂:

Berechnet ... C 55,14, H 10,41, N 16,08; gefunden .... C 55,01, H 10,25, N 16,06.

Beispiel 3 O-Benzoyl-L-tyrosinäthylesterhydrobromid

O - Benzoyl - N - carbobenzoyl -L- tyrosinäthylester (10,6 g) wird in 50 ecm 1,2 n-Bromwasserstoffsäure in Eisessig gelöst. Die Kristallisation beginnt bald, und nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch in Äther gegossen und der Niederschlag filtriert; die Ausbeute beträgt 8,7 g (93%); Schmelzpunkt 223° C. Eine Probe wird zur Analyse aus Methanol—Äther umkristallisiert. Schmelzpunkt 221bis223°C;[a]_D= +11°.

Analyse für C₁₈H₁₉O₄N · HBr:

Berechnet ... C 54,83, H 5,11, N 3,55, Br 20,27; gefunden .... C 54,89, H 5,20, N 3,44, Br 20,08.

Beispiel 4 O-Benzoyl-L-carbonyl-tyrosinäthylester

Eine Suspension von 8,6 g feinpulvrigem O-Benzoyl-L-tyrosinäthylesterhydrobromid in 150 ecm wasserfreiem Toluol wird auf einem ölbad auf 150⁰C erhitzt, und ein Phosgenstrom wird so lange eingeführt, bis, im allgemeinen nach 45 Minuten, eine klare Lösung erzielt ist. Das Lösungsmittel wird dann im Vakuum entfernt, und das zurückbleibende hellgelbe öl wird im nächsten Beispiel ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 5

N-[2-Isopropyl-3-(t-butyloxycarbonyl)-carbozoyl]-O-benzoyl-L-tyrosinäthylester

t-Butyl-3-isopropyl-carbazat(2,12 g, Beispiel 2) wird in 50 ecm wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Lösung werden bei 0° C unter Rühren 4,26 g O-Benzoyl-L-carbonyltyrosinäthylester zugesetzt. Man läßt das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt es 1 Stunde. Das Pyridin wird dann im Vakuum entfernt, und das zurückbleibende braune öl wird in 30 ecm Methylenchlorid gelöst. Diese Lösung wird nacheinander mit eiskalter 1 n-Chlorwasserstofflösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird dann verdampft, wobei man 6,27 g gelben Schaum erzielt, welcher aus Methylenchlorid/n-Hexan umkristallisiert wird; Ausbeute 5,13 g (81%); Schmelzpunkt 124,5 bis 125,5°C, [α] I^s =+ 6,5°. Eine Probe wird noch einmal zur Analyse umkristallisiert; Schmelzpunkt 125 bis 126°C; [α] = 6,1°; Papierchromatographie: R_f(l) = 0,2, R_f (2) = 0,65; Indikator: HCl/p-Dimethylamino-Zimtaldehyd-Spray.

Analyse für C₂₇H₃₅O₇N₃:

Berechnet ... C 63,14, H 6,87, N 8,18; gefunden .... C 63,40, H 7,00, N 8,33.

Beispiel 6

N-[2-Isopropylcarbozoyl]-O-benzoyl-L-tyrosinäthylesterhydrochlorid

N - [2 - Isopropyl - 3 - (t - butyloxycarbonyl) - carbozoyl] - O - benzoyl - L - tyrosinäthylester (5,13 g) wird in 50 ecm 6 η-Chlorwasserstoff in Dioxan gelöst. Nach 30 Minuten wird Äther zugesetzt, und das kristallinische Material wird filtriert. Ausbeute 4,11 g (96%); Schmelzpunkt 136 bis 137° C; Papierchromatographie: R_f(2) = 0,78, R{(4) = 0,85; Indikator: p-Dimethylaminozimtaldehyd-Spray.

Analyse für C₂₂H₂₇O₅N₃ · HCl:

Berechnet
gefunden .

C 58,73, H 6,27, N 9,34, Cl 7,88; C 59,00, H 6,35, N 9,57, Cl 7,81.

Beispiel 7

N-(2-Isopropyl-carbozoyl)-O-benzoyl-L-tyrosinäthylester

Das Hydrochlorid des vorhergehenden Beispiels (4,49 g) wird in 400 ecm Chloroform gelöst, welches eine kleine Menge Äthanol enthält, dann wird auf 0° C abgekühlt, mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung und anschließend mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft, wobei man 4,04 g (98%) eines kristallinischen Rückstandes mit einem Schmelzpunkt von 146 bis 148° C erzielt. Die Umkristallisation aus Äthanol—Wasser ergibt 3,62 g (87%) Substanz mit einem Schmelzpunkt von 146 bis 147° C; [α]έ⁵- +20°.

Analyse für C₂₂H₂₇O₃N₃:

Berechnet ... C 63,90, H 6,58, N 10,16; gefunden .... C 63,73, H 6,59, N 9,97.

Papierchromatographie: *R_f(2) = 0,78; Indikator: p-Dimethylaminozimtaldehyd-Spray.

Beispiel 8

N-[2-Isopropyl-3-(carboxybenzoxy-nitro-L-arginyl)-carbazoyl]-O-benzoyl-L-tyrosinäthylester

Einer Lösung von 3,05 g N - (2 - Isopropyl - carbazoyl) - O - benzoyl -L- tyrosinäthylester und 2,62 g Carbobenzoxynitro-L-arginin in 9 ecm Dimethylformamid und 15 ecm Tetrahydrofuran bei 0° C wird 1,53 g Dicyclohexylcarbodiimid in 11 ecm Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei Raum-

temperatur gerührt, und der Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff (1,12 g, Schmelzpunkt 227 bis 229° C) wird filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum verdampft, das zurückbleibende öl wird mit wasserfreiem Äther verrieben, und das kristallinische Material (3,3 g, 58%) wird filtriert. Es wird aus Methanol-Isopropyläther umkristallisiert, wobei man 1,28 g (23%) Produkt mit einem Schmelzpunkt von 156 bis 157° C erhält.

Die analytische Probe wird noch einmal aus dem gleichen Lösungsmittelsystem umkristallisiert; Schmelzpunkt 156 bis 158⁰C; [a]f = -8,9°; λ,,_ιαχ 231, 268 πΐμ {ε = 22050; 17800); Papierchromatographie: Rf(I) = 0,87; Indikatoren: SnCl₂-Diacetyl-Reagenz undp-Dimethylaminozimtaldehyd-Spray.

Analyse für C₃₆H₄₅O₁₀N₈:

Berechnet ... C 57,66, H 6,04, N 14,97; gefunden .... C 57,46, H 5,99, N 14,66.

Beispiel 9

N-[2-Isopropyl-3-(carbobenzoxy-nitro-L-arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosin

Zu 4,12 g N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxynitro - L - arginyl) - carbazoyl] - O - benzoyl - L - tyrosinäthylester in einem Gemisch von 37 ecm Dimethylformamid und 20 ecm Wasser bei 0° C werden während einer Zeit von 5 Minuten 30,4 ecm 1 n-Natriumhydroxydlösung zugesetzt. Man läßt die klare Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Um den pH-Wert auf 8 einzustellen, wird Trockeneis zugesetzt, und das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in Wasser gelöst, und eine Spur von unlöslichem Material wird abfiltriert. Die Lösung wird auf 0⁰C abgekühlt, mit 2 n-Chlorwasserstofflösung angesäuert, der amorphe Niederschlag wird filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Kristallisation aus Methanol—Äthylendichlorid ergibt 2,0 g (60%) winzige Blättchen; [VJ₀ ⁵ = 13,2°. Die Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittelsystem ergibt 1,35 g (40%) Material von [a\f = -16°. Die analytische Probe wird aus Äthanol—Äthylendichlorid umkristallisiert, Schmelzpunkt 116 bis 126° C (ungenau); [VJ₀ ⁵ = 16°; A_mex 225, 271 τημ (ε = 13000, 16900); Papierchromatographie: R_{(10) = 0,48; Indikatoren : SnC^-diacetyl-Reagenz FeCl₃-K₃Fe(CN)₆-Spray.

Analyse für C₂₇H₃₆O₉N₈:

Berechnet ... C 52,59, H 5,89, N 18,17; gefunden .... C 52,53, H 5,81, N 18,10.

Beispiel 10

N-P-Isopropyl-S-icarbobenzoxy-nitro-L-arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-

1-phenylalaninmethylester

Eine Lösung von 1,85 g N-[2-Isopropyl-3-(carbobenzoxynitro - L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosin und 1,85g L- valyl - L - histidyl - L - prolyl - L - phenylalaninmethylester in einem Gemisch von 15 ecm Dimethylformamid und 15 ecm Acetonitril wird auf 0⁰C abgekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (0,74 g) in 2 ecm Dimethylformamid wird zugesetzt, und man läßt die Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Danach wird Eisessig (0,2 ecm) zugesetzt, um nicht umgesetztes Dicyclohexylcarbodiimid zu zerstören, und der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff (0,47 g) wird nach 1 Stunde filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum (Bad-Temperatur <40^c) eingedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhält, welcher mit Äthylacetat verrieben wird. Das erstarrte Material wird filtriert: Ausbeute 3,0 g [VJd⁵⁰ = —36°, Schmelzpunkt 105 bis 109⁰C. Dieses Material wird in dem System Methanol— Wasser — Chloroform — Benzol (3:1:3:1) bei 43 Übertragungen verteilt, Phasenvolumen 20 ecm. Der Inhalt der Becher 11 bis 24 wird vereinigt und eingedampft, wobei man 2,0 g (60%) des gewünschten Produktes erhält; [α]Γ =43^C; A„„«, 271 ma U = 16 850); Papierchromatographie: R_t(6) = 0,15, Rf(IO) = 0,4; Indikatoren: SnCl₂-Diacetyl-Reagenz, FeCl₃ - K₃Fe(CN)₆ und ρ - Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Sprays.

Analyse für C₅₃H₇₀O₁₃N₁₄ · CH₃OH:

Berechnet ... C 56,74, H 6,53, N 17,16; gefunden .... C 56,46, H 6.27, N 17,37.

Eine Probe wird mit Äthylacetat verrieben: Analyse für C₅₃H₇₀O₁₃N₁₄:

Berechnet ... C 57,29, H 6,32, N 17,65; gefunden .... C 57,60, H 6,50, N 17,44.

Beispiel 11

N-[2-Isopropyl-3-(nitro-L-arginyl)-carbazoyl]-

L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-propyl-L-phenylalanin-

methylester N - [2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy - nitro - L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl - l - histidyl-L - prolyl - L - phenylalaninmethylester (1,2 g) wird in 30 ecm 1,2 η-Brom wasserstoff in Eisessig gelöst, und man läßt die Lösung 70 Minuten bei Raumtemperatür stehen. Dann wird Äther zugesetzt, der Niederschlag wird filtriert und gut mit Äther gewaschen. Der amorphe Feststoff wird dann in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung auf den pH-Wert 7,5 gebracht. Durch Extraktion mit n-Butanol und anschließendes Verdampfen des Lösungsmittels erhält man einen Rückstand, welcher mit Äthylacetat verrieben wird. Ausbeute 0,825 g (82%); Schmelzpunkt 124 bis 130° C (Schaum), [α] Γ = -57°.

Die Papierchromatographie beweist, daß dieses Material homogen ist, R_f(ll) = 0,5, R_f(7) = 0,7; Indikatoren: SnC^-Diacetyl-Reagenz und FeCl₃-K₃Fe-(CN)₆-Spray.

Analyse für C₄₅H₆₄O₁₁N₁₄:

Berechnet ... C 55,31, H 6,60, N 20,07; gefunden .... C 55,32, H 6,39, N 19,50.

Beispiel 12

N-[2-Isopropyl-3-(carbobenzoxy-{/3-benzyl}-

L-asparagylnitro-L-arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl-alanin-

methylester

Eine Lösung von 1,2 g N-[2-Isopropyl-3-(nitro-L - arginyl - carbazoyl) - l - tyrosyl - L - valyl - l - histidyl-L - prolyl - L - phenylalaninmethylester in einem Gemisch von 7 ecm Dimethylformamid und 8 ecm Acetonitril wird auf O⁰C abgekühlt; danach werden 0,412 g KN'-Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ecm Dimethylformamid und anschließend 0,628 g Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-ß-benzylester in 5 ecm Dimethylformamid zugesetzt. Man läßt die Lösung 16 Stunden

bei Raumtemperatur stehen und setzt dann 0,2 ecm Eisessig zu. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und der Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert (0,217 g, Schmelzpunkt 229 bis 231⁰C). Durch Einengen des Filtrats erhält man einen Rückstand, welcher mit Äthylacetat verrieben wird. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet. Ausbeute 1,5 g (91%); [_a]² ₀ ⁴ = —38°; Papierchromatographie: R_f(16) = 0,7; Indikatoren: FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Sprays.

Für die Analyse wird eine Probe aus Äthanol— Äther ausgefällt, Schmelzpunkt 136 bis 142⁰C; [α]? = -39,6°.

fUrC₆₄H₈₁O₁₆N₁₅-H₂O:

Berechnet ... C 57,61, H 6,27, N 15,75; gefunden .... C 57,29, H 6,35, N 15,56.

Beispiel 13

N-[2-Isopropyl-3-(L-aspartyl-L-arginyl)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin

Zu 1,2 g N - .[2 - Isopropyl - 3 - (carbobenzoxy- {ß - benzyl} -L- asparagyl - nitro - L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valyl - L - histidyl - L - prolyl-L-phenylalaninmethylester in 25 ecm Äthanol werden 0,7 ecm 5,3 normale methanolische Chlorwasserstofflösung und 0,220 g 5% Palladium-auf-Kohle-Katalysator zugesetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur und Normaldruck 48 Stunden hydriert, wonach die Wasserstoffaufnahme aufhört. Der Katalysator wird dann filtriert, gut mit Methanol gewaschen und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand (0,862 g) wird in 5 ecm konzentrierter Salzsäure gelöst und die Lösung 1 Stunde bei 40° C gehalten. Die Verdampfung ergibt 0,82 g Rückstand [α]2 = -16,5°, welcher bei 50 Übertragungen einer Gegenstromverteilung im n-Butanol-Wassersystem (Phasenvolumen 10 ecm) unterworfen wird. Die Fraktionen 0 bis 6 (0,3 g) werden vereinigt, (die späteren Fraktionen enthalten zusätzliches Material mit der gleichen Polarität, wie die Papierchromatographie beweist), in Wasser gelöst und durch ein Polystyrol-Amin-Anion-Austauscherharz im Acetatkreislauf (Amberlite CG-45, erhältlich von der Rohm und Haas Company, Philadelphia) filtriert. Durch Verdampfen des Wassers erhält man 0,258 g Material, welches durch Gegenstromverteilung im System s.-Butanol—Wasser (100 Übertragungen) weiter gereinigt wird. Der Inhalt der Becher 11 bis 22 liefert nach der Verdampfung 0,111 g reines Octapeptid [α] 2° = -33° (Wasser). Wie die Papierelektrophorese und auch die Papierchromatographie beweisen, ist dieses. Material homogen: R_f(9) = 0,38, R_f(14) = 0,3, R_f(17) = 0,19; Indikatoren: FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Sprays.

Für die saure Totalhydrolyse werden 2 mg des Peptids mit halb konzentrierter HCl bei 115° C 24 Stunden hydrolysiert. Die Lösung wird dann zur Trockne eingedampft und in dem System n-Butanol—Essigsäure—Wasser (5:1:4) auf Whatman-Papier Nr. 1 und 4 chromatographiert. Die Papier-Chromatogramme werden mit Ninhydrin entwickelt und die einzelnen Flecke mit einem 1:1-Gemisch von n-Propanol—Wasser ausgewaschen. Die Messung der Absorption bei 565 ηΐμ im Vergleich mit jener eines Gemisches der erwarteten Aminosäuren von ähnlicher Konzentration, welche am gleichen Tag chromatographiert und entwickelt wurden, zeigt die Anwesenheit von Asparaginsäure, Arginin, Tyrosin, Valin, Histidin und Phenylalanin in etwa äquimolaren Mengenverhältnissen. Das ebenfalls anwesende Prolin wird nicht ermittelt.

Beispiel 14

N-[2-Isopropyl-3-(L-arginyl)-carbozoyl]-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin

Einer Lösung von 0,96 g N-[2-Isopropyl-3-(carbobenzoxy - nitro - L - arginyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl-L - valyl - L - histidyl -L- prolyl - L - phenylalaninmethylester (Beispiel 10) in 20 ecm Methanol werden 0,64 ecm 5,3 normale methanolische HCl und anschließend 0,214 g 5% Palladium-auf-Kohle-Katalysator zugesetzt. Das Gemisch wird unter Rühren bei Raumtemperatur und 1 Atmosphäre Wasserstoffdruck 41 Stunden hydriert. Der Katalysator wird dann abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, wobei man 0,786 g erhält. Die Papierchromatographie (System 9) zeigt zwei neue Flecke. Dieses Material wird in 6 ecm konzentrierter HCl gelöst und 1 Stunde bei 40° C gehalten. Die anschließende Verdampfung zur Trockne im Vakuum ergibt 0,84 g Rückstand, welcher in wenig Wasser gelöst und durch eine kurze Kolonne mit Amberlite-Anionenaustauscherharz CG-45 im Acetatkreislauf geleitet wird. Die Verdampfung der abfließenden Lösung im Vakuum ergibt 0,675 g eines Rückstandes, welcher zwei starke Flecke bei der Papierchromatographie zeigt (System 9), R_f: 0,55, 0,45. Dieses Material wird nun im Gegenstromsystem verteilt: sek.-Butanol—Wasser (70 Übertragungen) und jeder Becher (Phasenvolumen 10 ecm) wird getrennt isoliert. Das stärker polare Material (Fraktion I) wird in den Bechern 15 bis 22 (0,223 g) gefunden, während das weniger polare Material (Fraktion II) aus den Bechern 23 bis 40 isoliert wird. Die Fraktion I wird durch ihre Wirksamkeit auf isolierten Meerschweinchen-Ileum als das gewünschte Produkt identifiziert und wird zu weiterer Reinigung behalten. Die Fraktion II (0,276 g) wird durch ihre starke Ultraviolett-Absorption bei 270 ηΐμ = 12500 und mangelnde Wirksamkeit auf isolierten Meerschweinchen-Ileum als das Nitro-Arginyl-heptapeptid identifiziert (Material aus den Bechern 28 bis 29, 55 mg, [α]ο⁴ = —37° [Methanol]). Diese Identifizierung wird durch weitere Reduktion der Fraktion II in ein biologisch aktives Produkt, welches den gleichen R_f-Wert wie die Fraktion I zeigt, noch erhärtet.

Die Fraktion I wird noch einmal dem Gegenstromsystem ausgesetzt: sek.-Butanol—Wasser (100 Übertragungen) und reines Material wird aus den Bechern 21 bis 28 (0,067 g), [α] ²i = -29° (Methanol), isoliert. (Eine weitere Gegenstromverteilung mit 50 Übertragungen im System sek.-Butanol—0,5% Essigsäure führt zu keiner Steigerung der Wirksamkeit, wenn der aus den Bechern 3 bis 7 isolierte Stoff am isolierten Meerschweinchen-Ileum getestet wird.) Dieses Material ist homogen, wie die Papierelektrophorese und die Papierchromatographie mit den Systemen 9, 14 und 17 zeigt, R_f = 0,45, 0,7 und 0,55; Indikatoren FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitro-benzoldiazonium-fluorborat-Sprays.

Die saure Totalhydrolyse bei 115° C während einer Zeit von 24 Stunden zeigt die Anwesenheit von Arginin, Tyrosin. Valin, Histidin und Phenylalanin in

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etwa äquimolarem Mengenverhältnis; das ebenfalls anwesende Prolin wird nicht festgestellt.

Die Fraktion II (0,276 g) wird in 13 ecm Methanol gelöst und 0,40 ecm 5,3 normale methanolische HCl zugesetzt, anschließend 0,064 g 5% Palladium-auf-Kohle-Katalysator. Nach 40 Stunden Hydrieren wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand (0,236 g), [aJi = -30° (Methanol), wird in 2 ecm Wasser gelöst und durch eine Kolonne mit Amberlite-Anionen-Austauscher- ro harz CG-45 in der Acetatform geleitet. Die ausfließende Lösung ergibt nach dem Verdampfen 0,260 g Material, welches durch Gegenstromverteilung im System sek.-Butanol—0,5% Essigsäure (100 Übertragungen) gereinigt wird. Die Becher 12 bis 22, zusam-0,140 g, liefern ein Material, welches mit der gereinigten Fraktion I identisch ist, wie durch Papierchromatographie, optische Drehung, Elektrophorese und biologische Wirksamkeit gezeigt wird.

Berechnet
gefunden .

C 58,27, H 7,74, N 11,32;
C 58,43, H 7,71, N 11,44.

Beispiel 17

N-[2-Isopropyl-(3-t-butyloxycarbonyl-)-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valin

Beispiel 15

N-P-Isopropyl-S-io-butyloxycarbonylJ-carbazoyl]-L-tyrosin

Berechnet ,
gefunden .,

Einer Lösung von 3,4 g N-[2-Isopropyl-3-(t-butyloxycarbonyl) - carbazoyl] - O - benzoyl - L - tyrosinäthylester (Beispiel 5) in 25 ecm Methanol bei 0⁰C
werden 19,8 ecm 1 n-Natriumhydroxydlösung züge-30 Analyse für C₂₅H₃₆O₇N₄: setzt und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Es wird dann auf 0⁰C abgekühlt, der pH-Wert
wird mit verdünnter Salzsäurelösung auf 3 eingestellt
und das Gemisch 4mal mit je 30 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser 35
gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergibt einen amorphen Rückstand, welcher in 10 ecm
Methylenchlorid gelöst und durch Zusatz von Cyclohexan kristallisiert wird; Ausbeute 2,2 g (91%), 40
Schmelzpunkt 64,5 bis 67,5° C (Schaum), [<z]_D = + 20°;
Papierchromatographie: R_f(8) = 0,50; Indikator:
FeCl₃-K₃Fe(CN)₆.

Eine Lösung von 4,94 g N-[2-Isopropyl-3-(t-Butyloxycarbonylcarbazoyl] - L - tyrosyl - L - valinmethylester in 100 ecm Methanol wird auf 0° C abgekühlt, und 30 ecm 1 n-Natriumhydroxydlösung werden unter Rühren zugesetzt. Man läßt das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen, säuert es nach dem Zusatz von 200 ecm Wasser mit verdünnter HCl bis auf pH 4 an und extrahiert dann mehrere Male mit Äthylacetat. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft. Wenn man den Rückstand mit Äthylacetat-n-Hexan verreibt, kristallisiert er und ergibt 3,77 g (79%) des N-geschützten Tripeptide, Schmelzpunkt 61 bis 65°C; [a]²£ = —5°; Papierchromatographie: R_f(8) = 0,3, Rf(Il) = 0,5; Indikator FeCl₃-K₃Fe(CN)₆-Spray.

C 57,48, H 7,55, N 11,66;
C 57,74, H 7,80, N 11,79.

B e i s p.i e 1 18

N-P-IsopropyW-it-butyloxycarbonylj-carbazoyl]-

L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl-

alaninmethylester

Beispiel 16

N-P-Isopropyl-S-it-butyloxycarbonylJ-carbazoyl]-L-tyrosyl-L-valinmethylester

N - [2 - Isopropyl - 3 - (t - butyloxycarbonyl) - carbazoyl] - L - tyrosyl - L - valin (4,8 g) wird in 150 ecm Tetrahydrofuran gelöst und auf 0⁰C abgekühlt. 45 L - Histidyl - l - prolyl - L - phenyl - alaninmethylester (4,56 g) wird dann in 80 ecm Tetrahydrofuran gelöst, und die beiden Lösungen werden vereinigt. 2,06 g KN'-Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ecm Tetrahydrofuran werden nun bei 0° C zugesetzt und die erhaltene Eine Lösung von 2,23 g N-[2-Isopropyl-3-(t-butyl- 50 Lösung bei Raumtemperatur 18 Stunden gelagert. oxycarbonyI)-carbazoyl]-L-tyrosin in 30 ecm Tetra- Der ausgefällte N,N'-Dicycloharnstoff (0,8 g) wird abhydrofuran wird auf 0⁰C abgekühlt. In 10 ecm Tetra- filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum (<45°) hydrofuran gelöster L-Valinmethylester (0,79 g) wird verdampft. Der übrigbleibende Schaum wird in Acedann zugesetzt und anschließend 1,24 g Ν,Ν'-Di- ton gelöst, zusätzlicher (0,53 g) Ν,Ν'-Dicyclohexylcyclohexylcarbodiimid in 10 ecm Tetrahydrofuran. 55 harnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel er-Man läßt das Gemisch 18 Stunden bei Raumtempera- neut verdampft. Der Rückstand (9,2 g) wird aus Äthyltur stehen, dann wird der ausgefällte Ν,Ν'-Dicyclo- acetat—ri-Hexan ausgefällt, wobei man 5,86 g (67%) hexylharnstoff (0,950 g) filtriert und das Lösungsmittel des geschützten Hexapeptids erhält. Eine weitere Ausverdampft. Der erhaltene Rückstand wird in Aceton fällung aus dem gleichen Lösungsmittelsystem ergibt gelöst, unlösliches Material wird abfiltriert und das 60 4,53 g Produkt mit einem Schmelzpunkt von 136 bis Aceton im Vakuum entfernt. Der zurückbleibende 139°C (Schaum); [α]? = —36°; Papierchromatogra

Schaum (3,06 g) wird aus Äthylacetat—η-Hexan kristallisiert und ergibt 2,0 g (70%) des geschützten Tripeptids, Schmelzpunkt 134,5 bis 137°. Die analytische Probe wird noch einmal aus Äthylacetat—n-Hexan umkristallisiert, Schmelzpunkt 135 bis 136°C, [ei]" = -6°; Papierchromatographie: R_f(8) = 0,9, R_f(10) = 0,9; Indikator:

65

phie: R_f(8) = 0,55, R_f(6) = 0,68; Indikator: FeCl₃-K₃FeCn₆ und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Sprays.

Analyse für C₄₄H₆₁N₉O₁₀:

Berechnet ... C 60,32, H 7,02, N 14,40;
gefunden .... C 60,50, H 6,85, N 14,60.

Beispiel 19

N-(2-Isopropyl-carbazoyl)-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin

Einer Lösung von 1,4 g N-[2-Isopropyl-3-(t-butyloxycarbonyl) - carbazoyl - ] - L - tyrosyl - L - valyl-L - histidyl -L- prolyl -L- phenylalaninmethylester in 10 ecm Methanol bei 0° C werden 4,8 ecm 1 n-Natriumhydroxydlösung zugesetzt, und das Gemisch wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird Wasser zugesetzt, die Lösung auf den pH-Wert 4 gebracht und mehrere Male mit methanolhaltigem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand (1,25 g) wird mit Äthylacetat verrieben, wobei man 1,07 g des am endständigen N geschützten Hexapaptids erzielt; Schmelzpunkt 160 WsIoS⁰CiCa]I"= -14°.

Zur Entfernung der N-endständigen Schutzgruppe werden 0,5 g dieses Materials in 6 ecm 6 n-Salzsäure in Dioxan gelöst, und man läßt die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Danach wird Äther (20 ecm) zugesetzt, der Niederschlag wird filtriert, gut mit Äther gewaschen und über P₂O₅ getrocknet, wobei man eine Ausbeute von 0,47 g erzielt; Schmelzpunkt 166 bis 174⁰C (Schaum); [a]|⁴ = -14°.

Das Dihydrochlorid wird in 10 ecm Wasser gelöst und dann durch eine kleine Kolonne geleitet, welche 4 g »Amberlite«-phenolisches Amin-Anion-Austauscherharz IR-4B (erhältlich bei Rohm und Haas) enthält. Der wäßrige Ausfluß wird im Vakuum eingeengt (Badtemperatur <45°C), und der Rückstand wird in Äthanol gelost. Durch Ausfällen mit Äther, Filtrieren und Trocknen über P₂O₅ erhält man 0,3 g des gewünschten Hexapeptids, Schmelzpunkt 182 bis 186° C (Schaum). Die Ausfällung aus Äthanol—Äther ergibt ein Material mit dem gleichen Schmelzpunkt [α]!,⁴ = -25°; Papierchromatographie: R_f(7) = 0,8, Rf(Il) = 0,55, R_f(14) = 0,62, R_f(15) = 0,75; Indikatoren: FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitrobenzol-diazoniumfluorborat-Sprays.

Analyse für C₃₈H₅N₉O₈ -H₂O:

Berechnet ... C 58,52, H 6,85, N 16,17;
gefunden .... C 58,39, H 6,86, N 15,84.

Die Totalhydrolyse mit 1:1 konzentrierter Salzsäure zu Wasser in 24 Stunden bei 115⁰C und anschließende quantitative Aminosäureermittlung zeigen die Anwesenheit von Tyrosin, Valin, Histidin und Phenyalanin in etwa äquimolaren Verhältnissen. Das ebenfalls anwesende Prolin wird nicht festgestellt.

Beispiel 20

Carbobenzoxy-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninmethylester

Eine Lösung von 8,48 g Carbobenzoxy-L-histidinhydrazid in 83,7 ecm 1 η-Salzsäure wird mit 100 ecm Äthylacetat gemischt und auf 0° C abgekühlt. Eine eiskalte Lösung von 1,93 g Natriumnitrit in 8 ecm Wasser wird dann zugesetzt. Nach 2 Minuten werden 38 ecm kalte 50%ige Kaliumcarbonatlösung zugesetzt, das Gemisch wird heftig geschüttelt und die Äthylacetatschicht abgetrennt. Die wäßrige Phase wird mit 20 ecm Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Dieser Lösung werden bei 0° C 7,7 g L-Prolyl-L-phe-

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55 nylalaninmethylester in 20 ecm Äthylacetat zugesetzt, und die neue Lösung wird 5 Stunden bei 0° C und dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Eine kleine Menge eines Niederschlages wird abfiltriert, die Lösung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft, wobei man 14,0 g (91%) des gewünschten Produktes als schaumigen Rückstand erhält; [a]F = —34° (Aceton); Papierchromatographie: Rf(3) = 0,20; Indikator: p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Spray. Eine mit n-Hexanäthylacetat verriebene Probe schmilzt bei 65 bis 70⁰C; [α]?,⁵ = -35° (Aceton).

Analye für C₂₉H₃₃N₅O₆:

Berechnet ... C 63,60, H 6,07, N 12,79; gefunden .... C 63,60, H 6,37, N 12,59.

Beispiel 21

L-Histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninmethylesterdihydrobromid

Eine Lösung von 13,5 g Carbobenzoxy-L-histidyl-L - prolyl -L- phenylalaninmethylester (Beispiel 20) in Ί52 ecm l,2n-HBr in Eisessig wird 90 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. Sie wird dann in 1,51 Äther gegossen, die ausgefällten Feststoffe werden filtriert, gut mit Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd getrocknet. Das hygroskopische Material wird in kaltem Methanol gelöst und dann mit Äthylacetat ausgefällt, wobei man 11,9 g (82%) eines kristallinen Produktes erhält, Schmelzpunkt 170 bis 174°C; [α]ϊ = -39° (H₂O). Die analytische Probe wird noch einmal aus Methanol—Äthylacetat umkristallisiert, Schmelzpunkt 169 bis 1710⁰C; [α]? = -38°(H₂O); Papierchromatographie: R_f (6) = 0,44; Indikator: ρ - Nitrobenzol - diazoniumfluorborat-Spray.

Analyse für C₂₁H₂₇N₅O₄:

Berechnet ... C 42,44, H 5,43, N 11,69, Br 26,89; gefunden .... C 42,38, H 5,39, N 11,93, Br 26,89.

Beispiel 22 L-Histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninmethylester

Das im Beispiel 21 hergestellte Dihydrobromid wird in 15 ecm Wasser gelöst, 50 ecm Chloroform werden zugesetzt und das Gemisch auf O⁰C abgekühlt. Dann wird es in einen vorgekühlten Scheidetrichter übergeführt, 20 ecm eiskalte gesättigte Kaliumcarbonatlösung werden zugesetzt, das Gemisch wird heftig geschüttelt und die Chloroformschicht abgetrennt. Die Wasserphase wird zweimal mit 20 ecm Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft, wobei man 4,2 g (100%) des gewünschten Produktes als flaumigen Rückstand erhält, der sich für die Verwendung im Verfahren von Beispiel 18 eignet.

Beispiel 23

Bestimmung der enzymatischen Stabilität A. Chymotrypsin

Das Peptid (1 mg) wird in 0,200 ecm einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,6 gelöst, und 0,020 ecm einer 0,25-Gew./Vol.-%-Lösung kristallinen Chymotrypsins (Worthington) werden zugesetzt (En-

zym zu Substrat = 1:20). Nach 24 Stunden Inkubation bei 38° C wird das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf 100⁰C erhitzt, und anschließend durch Papierchromatographie im System 9 geprüft.
Das Hexapeptid

L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-PheOH

wird quantitativ zu dem Dipeptid L-Valyl-L-tyrosin (R_f = 0,65; positive Reaktionen mit FeCl₃-K₃Fe- to (CN)₆, p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Spray und Ninhydrin) und dem Tetrapeptid L-Valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin (R_f = 0,4; positive Reaktionen mit Ninhydrin und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Spray) hydrolysiert. Auf ähnliche Weise wird das entsprechende Hexapeptid, in welchem die Valyleinheit am endständigen N durch eine N-Isopropylglycyleinheit (R_f = 0,48) ersetzt ist, in das gleiche Tetrapeptid L - valyl -L- histidyl -L- prolyl -L- phenylalanin und das Dipeptid N-Isopropylglycyl-L-tyrosin (R_f = 0,55, positiv gegenüber FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat) gespalten.

Unter gleichen Reaktionsbedingungen erweisen sich die Produkte der Beispiele 13, 14 und 19 als vollkommen beständig gegenüber des enzymatischen Abbaus durch Chymotrypsin.

B-Pepsin

Das Peptid (1 mg) wird in 0,18 ecm 0,02 n-Salzsäure gelöst, 0,16 ecm von 0,25%igem kristallinen Pepsin (Worthington) in 0,02 n-Salzsäure werden zugesetzt (Enzym zu Substrat-Verhältnis 1:2,5), und die Lösung wird 24 Stunden bei 38° C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird eine wäßrige Pufferlösung mit dem pH-Wert 8 zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird dann durch Papierchromatographie in System 17 untersucht.

Valin wird unter diesen Bedingungen aus dem Hexapeptid

L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-PheOH

frei, und ein neuer Fleck, offensichtlich das Penta-• peptid, entsteht mit einem etwas geringeren R_f = 0,5 als das Ausgangsmaterial (R_f = 0,56).

Das Heptapeptidprodukt von Beispiel 14 ist unter den gleichen Reaktionsbedingungen vollkommen beständig, und das Produkt von Beispiel 19 (R_f = 0,55) wird teilweise abgebaut (10 bis 20%), so daß zwei neue Flecke von R_f (17) = 0,4 (FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ positiv) und R_f (17) = 0,33 (p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat positiv entstehen. In ähnlicher Weise wird das Octapeptidprodukt von Beispiel 13 in geringem Umfang (10 bis 20%) zersetzt.

C. Leucine aminopeptidase

Das Enzym (Worthington) wird vor der Verwendung 3 Stunden bei 40⁰C aktiviert. Das Aktivierungsgemisch besteht aus 0,20 ecm einer 0,025molaren MnCl₂-Lösung, 0,50 ecm Puffer (ph 8), 0,50 ecm Wasser und 0,20 ecm einer 0,5%igen Leucin-Aminopeptidase-Lösung.

Das Peptid (2 mg) wird zu 0,2 ecm der oben aktivierten Leucin-Aminopeptidase zugesetzt und die erhaltene Lösung 24 Stunden bei 38° C inkubiert. Das Gemisch wird dann auf Papier in Systemenil und 17 chromatographiert, und die Flecke werden mit den Indikatoren Ninhydrin, FeCl₃-K₃Fe(CN)₆ und p-Nitrobenzoldiazoniumfluorborat-Spray identifiziert. Das Hexapeptid

L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-PheOH

wird unter diesen Bedingungen zu Valin, Tyrosin und dem Tripeptid L-Histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin gespalten. Keine Spaltung wird bei den Produkten von Beispielen 13, 14 oder 19 beobachtet.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der allgemeinen Formel

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid-Acetonitril als Lösungsmittel durchführt.