DE2463205C2

DE2463205C2 - Octapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2463205C2
Application number: DE2463205A
Authority: DE
Inventors: Kengo Niiza Saitama Araki; Takafumi Tokio/Tokyo Nakamura; Shinro Narashino Chiba Tachibana; Mikio Urawa Saitama Uchiyama
Original assignee: EISAI Co Ltd TOKIO / TOKYO JP
Current assignee: EISAI Co Ltd TOKIO / TOKYO JP
Priority date: 1973-10-23
Filing date: 1974-10-23
Publication date: 1984-10-25
Also published as: GB1491017A; DE2450357C2; FR2248052B1; DE2450357A1; US3928306A; FR2248052A1

Description

in der R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ Wasserstoffatome oder übliche Schutzgruppen darstellen, wobei R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten, in an sich bekannter Weise abspaltet

Das erfmdungsgemäße Octapeptid der Formel
pyrGlu—Lys—Gly—Arg—Pro—Trp—lie—Leu—OH (I)

weist verschiedene pharmakologische- Wirkungen auf» insbesondere eine Aktivität bezüglich der Muskelkontraktion des Magenbodens und der Blutdruckdepression.

Xenopsin, ein Octapeptid, wird aus afrikanischen Fröschen gewonnen und zu seiner Isolierung sind komplizierte Extraktionsverfahren erforderlich. Bei dessen Synthese muß man beachten, daß acht verschiedene Aminosäuren in bestimmter Frequenz miteinander verbunden sein müssen.

Xenopsin hat folgende Formel

pyrGlu—Gly—Lys—Arg—Pro—Trp—lie—Leu—OH (Π)

Das erfindungsgemäße Octapeptid der Formel (I)

pyrGlu-Lys-Gly-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH (I)

jntcrscheidet sich von dem Octapeptid (Xenopsin) der Formel (II) insofern, als die zweite und dritte Aminosäuregruppe in umgekehrter Reihenfolge angeordnet sind.

Es wurde gefunden, daß das Octapeptid der Formel (I) eine ausgezeichnete pharmakologische Aktivität, wie eine kontrahierende Wirkung auf den Muskel des Magenfundus, eine Verringerung des Blutdrucks und dgl. zeigt, die mit jener des Xenopsins vergleichbar ist. Das neue Octapeptid der Erfindung kann deshalb anstelle von Xenopsin verwendet werden.

Das Octapeptid der Formel (I) wird durch Abspalten der Schutzgruppe oder der Schutzgruppen aus einem geschützten Octapeptid der Formel (III)

R⁴-pyrGIu-(N* - R5)Lys-G!y-(N<» - R6)Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OR' (III)

hergestellt.

In der Formel (III) bedeuten R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ Wasserstoffatome oder ein oder mehrere Schutzgruppen, die durch chemische Behandlung abgespalten werden können, die die Octapeplidkette, d. h.

pyrGlu-Lys-Gly—Arg— Pro-Trp— Ile-Leu-OH (I)

des Octapeptides nicht beeinträchtigt, wobei die Reste R*, R⁵, R⁶ und R⁷ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten.
Als Aminoschutzgruppen, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ in der Formel (III) kommen beispielsweise Acylreste, wie Formyl-,

Benzoyl-, Phthalyl-, Trifluoracetyl- und Tosylreste; Alkylreste, wie Trityl und Benzyl; Alkylidenreste und ure-

thanartige Reste, wie Benzyloxycarbonyl-, p-Brom-, p-Chlor- und p-Methoxybenzyloxycarbonyl-,

Tolyloxycyclohexyloxy- und t-Butoxycarbonylreste in Frage. Als Schutzgruppen für R³ in Formel (III) können

erwähnt werden: niederes Alkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl; Benzyl, p-Brom-, p-Chlor- und p-Methoxybenzyl.

Die Abspaltung der Schutzgruppe oder Schutzgruppen von dem Ociapeptid der Formel (III) kann mit Hilfe

üblicher Methoden, wie der Behandlung mit Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoffsäure, sowie durch katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium-auf-Kohle erfolgen.

In einer Ausführungsform können z. B. Benzyloxycarbonyl- und Nitrogruppen durch katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium-auf-Kohie als Katalysator in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dioxan, Dimethylformamid oder dgl.; oder mittels der Fluorwasserstoffmethode (vgl. Bulletin of the Japanese Chemical

Society, 40, 2164 (1967)) abgespalten werden. Die t-Butoxycarbonylgruppe als Schutzgruppe kann durch Be- i|

handlung mit Trifluoressigsäure abgespalten werden. Die Verbindung der Formel (I) kann gewünschtenfalls in ||

deren pharmakologisch akzeptierbares Säureadditionssalz gemäß üblichen Salzbildungsmethoden überführt werden. Als pharmakologisch annehmbare anorganische Säuren können Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwas- ;_v!

serstoffsäure und Salpetersäure erwähnt werden. Als pharmakologisch annehmbare organische Säuren können Ameisensäure, Oxalsäure, Essigsäure, Citronensäure, Weinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Methansulfonsäure erwähnt werden.

Das geschützte Octapeptid der Formel (III), das als Ausgangsmaterial zur Durchführung des erfindungsgemä-Sen Verfahrens dient, ist eine neue Verbindung. Es können verschiedene Verfahren zur Synthese des Peptids der 5 Formel (III) verwendet werden. Beispielsweise kann man die beiden folgenden Fragmente kondensieren:

PIu-(N^ - R^LyS-GIy-(N" - R⁶)Arg-Pro-OH (Fragment C) und H-Trp-Ile-Leu-OR⁷ (Fragment D)

worin R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

Die Kondensation der Fragmente C und D unter Bildung der Verbindung der Formel (III) kann nach bekannten Arbeitsmethoden durchgeführt werden. 15

Die Fragmente C und D sind neue Verbindungen und könne;: durch aufeinanderfolgende Bindung der Aminosäureeinheiten gebildet werden. Beispielsweise kann ein Fragment A nachstehender Formel

Z-pyrGIu-(N'-Z)Lys-Gly-(N<*-NO₂)Arg-Pro-OH gemäß der in F ig. 1 gezeigten Arbeitsweise hergestellt werden. Fig. 1 __

pyrGlu Lys GIy

Arg

Pro

Z —

BOC

ONP H

(3)

BOC

OH

Z HOBT (2)

BOC

-OH H
(D

NO₂

OH

NO₂ (1)

NO₂

NO,

NO₂

NO₂

NO₂

(C)

OBZL

OBZL 35

OBZL

OH

Ferner kann ein Fragment D, geschütztes Tripeptid der nachstehenden Formel

K—Trp—Ile—Leu—OBZL
beispielsweise gemäß der in F i g. 2 angegebenen Arbeitsweise hergestellt werden.

Fig. 2

Trp

De

Leu

BOC

OH H

OH

(2) HOST, DCC

OBZL

In den vorerwähnten Formeln (C) und (D') und den F i g. 1 und 2 haben die Abkürzungen folgende Bedeutung:

(1) Gemischte Säureanhydridmethode

(2) Methode nach W. König und R. Geiger

(3) Aktivierte Estermethode

(4) Carbodiimidmethode Z Benzyloxycarbonyl ONP p-Nitrophenylester BOZ t-Butoxycarbonyl OBZL Benzylester

TFA Trifluoressigsäure

HOBT N-Hydroxybenzotriazol

DCO Dicyclohexylcarbodiimid

Das Octapeptid der Formel (I) zeigt im Tierversuch folgende pharmakologische Wirkung:

1. Versuch bezüglich der Kontraktion des Muskels des Magenfundus von Ratten (Magnus-Methode):
Schwellendosis: 0,1 ng/ml
Dosisantwort: beobachtet

2. Versuch bei Ratten bezüglich der Blutdruckdepression: 50 Schwellendosis (intravenöse Injektion): 1,2 g/ml

Beispiel pyrGlu-Lys-GIy-Arg-Pro-Trp-Me-Leu-OF

140 mg A—pyrGlu—(N«—Z)Lys—Gly-(N<"—NO₂)-Arg-Pro-Trp—I.'e-Leu—OBZL wurden in 25 ml Methanol gelöst, das 0,05 ml Essigsäure enthielt Die Lösung wurde in Gegenwart von 10% Palladium-auf-Kohle kontinuierlich 9 Tage katalytisch reduziert Nach der Behandlung wurde de- verbrauchte Katalysator abfiltriert Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert Der erhaltene Rückstand wurde mittels einer mit SP-Sephadex^e gefüllten Säule gereinigt, wobei eine Ammoniumformiatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 als Eluiermittel verwendet wurde. Die gesammelte Hauptfraktion wuide gefriergetrocknet, um das beabsichtigte Produkt als weißes Pulver zu erhalten.

[λ]™ —41,7° (c = 0,43 in einer Mischung aus Methanol und Dimethylformamid in einem Verhältnis von 1 :0,1).

Elementaranalyse nuf C47H73N13O10: ber.:(%) C 53,43 H 6,06 N 15,58 gef.:(%) C 53,57 H 5,90 N 15,40

Dünnschiclitkieseigelchromatographie: R/ = 0,47 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1 :5) und Rr = 0,76 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30 : 20 : 6 : 24). Das bei diesem Versuch verwendete Ausgangsmaterial ■>

Z-pyrGlu-(N'-Z)Lys-Gly-(N'"- NO₂)- Arg- Pro-Trp-Ile-Leu-OBZL wurde auf folgende Weise erhalten:

690 mg H—Trp—lie—Leu—OBZL · HCI wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung wurden 0,168 mITriäthylamin und anschließend

1,0g Z-pyrGlu-(N'-Z)Lys-GIy-(N«'-NO2)Arg-Pro-OH

zugegeben. Das Ganze wurde unter Kühlen auf 10⁰C gerührt. Zur Lösung wurden 200 mg Hydroxybenzotriazol und 258 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, und die Reaktion 5 Stunden bei einer Temperatur von 10⁰C durchgeführt. Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Tsg bei Raumtemperatur «eher, gelassen. Der auskristaüisierte Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert. Zum Konzentrat wurden 80 ml Äthyläther zugegeben und eine ölige Substanz durch Dekantieren erhalten. Diese wurde anschließend in 3 ml Tetrahydrofuran gelöst 100 ml Äthylacetat wurden zur Lösung zugegeben und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt. Auf diese Weise wurden 1,1 g des rohen Produkts erhalten. Das rohe Produkt wurde 2mal aus einer Mischung von Dimethylformamid/Äthylacetat umkristallisiert, um das beabsichtigte Produkt in reiner Form mit den folgenden Eigenschaften zu erhalten:

[λ] J?-37° (c - 1 in Methanol).

Elementaranalyse auf C32H I₉N₉Ou: ber.:(%) C 52,22 H 6,73 N 17,13 gef.:(%) C 52,11 H 6,86 N 1625

Dünnschichtkieselgelchromatographie: R/ = 0,64 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1:5) R/ - 0,76 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30 :20 :6 :24). Die Fragmente

Z-pyrGlu-(N'-Z)Lys-Gly-(N<»-N0₂)Arg-Pro-OHund H-Trp-Ile-Leu-OBZL

können auf folgende Weise synthetisiert werden:

Z-pyrG!u-(N'-Z)Lys-Gly-(N*'-NO₂)Arg-Pro-OH

(a) BOC-(N"-NO₂)Arg-Pro-OBZL

4,7 g ΒΟΟ-(Ν<"-Ν0₂)Α^— Pro—OH wurden in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Zur erhaltenen Lösung wurden unter Kühlen auf —5° bis 0⁰C tropfenweise unter Rühren 1,65 ml N-Methylmorpholin und 2,1 g Isobutylchlorformiat zugegeben. Die Lösung wurde weitere 10 min gerührt und 435 g H—Pro—OBZL · HCl und 138 ml N-Methylmorphoiin, jeweils in 20 ml Dichlormethan gelöst, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach weiterem 1 V;stündigem Rühren bei —5 bis 0⁰C wurde die Reaktionsmischung 12 Stunden bei Raumterr. peratur stehen gelassen und unter verringertem Druck konzentriert Der erhaltene Rückstand wurde in 150 ml Äthylacetat gelöst Die Lösung wurde nacheinander mit Wasser, 'Amolarer Citronensäure in Wasser, Wasser, einer wäBrigen normalen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck konzentriert Der Rückstand wurde durch eine mit Wako-GeP-C-lOO, ein Produkt der Wako Pure Chemical Company, beschickten Kolonne unter Verwendung von Äthylacetat als Eluiermittel Chromatographien. Die gesammelten Eluate wurden einer Dünnschichtkieselgelchroiriatographie mit Äthylacetat als Fließmittel unterworfen.

Teile eines Einzelflecks bei R/ = 0,41 wurden gesammelt und das beabsichtigte Produkt aus Tetrahydrofuran/ Äthyläther gewonnen. Die Ausbeute des Produkts betrug 5,0 g. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 50° C unter Zersetzung und Schäumen.

[χ] » -6Γ (c = 1 in Methanol). Elementaranalyse des Produkts auf C₂SH₃₄N₆O₇ · V₂C₄H₈O:

ber.:(%) C 5532 H 7,09 N 15,49 f(%) C 55,55 H 7,08 N 15,60

Dünnschichtkieselgelchrcrnatographie: ι

Rr = 0,41 (Äthylacetat als Fließmittel). ι j

(b) BOC-GIy-(N'"- NO₂)Arg-Pro-OBZL tj

3,2 g BOC-(Ν^ω— NO₂)Arg— Pro—OBZL wurden in einer 5O^u/oigen Trifluoressigsäure/Dichlormethanlösung rj

+ elöst. Es wurde 40 min bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter verringertem Druck auf etwa j

5 ml konzentriert, -u

k/um Konzentrat wurden 50 ml Äthyläther zugegeben und der Niederschlag durch Filtration abgetrennt und i

ίο mit Äthyläther gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurden 3,2 g der trockenen Substanz erhalten. *Ί

Ferner wurden 1,08 g BOC-GIy-OH in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zur erhaltenen Lösung wurden unter L

Kühlen 0,68 ml N-Methylmorpholin und 0,84 g Isobutylchlorformiat bei —5 bis 0⁰C zugegeben. Nach 15 min wurde tropfenweise eine Lösung zugegeben, die durch Lösung der trockenen Substanz, die gemäß dem vorstehenden Absatz erhalten wurde, in einer Mischung aus 0,68 ml N-Methylmorpholin und 15 ml Dichlormethan erhalten wurde. Das Ganze wurde 2 Stunden bei der vorerwähnten Temperatur gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Konzentrieren unter verringertem Druck wurde das Reaktionsprodukt in 200 ml Äthylacetat gelöst, nacheinander mit '/«molarer Citronensäure, Wasser, normaler wäßriger Natriumbibarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Glaubersalz getrocknet und unter verringertem Druck konzentriert. Es wurde eine ölige Substanz erhalten. Die Substanz wurde einer Säulenchromatographie durch einen

Wafco Gei^s-C-10Ö-Trager unterworfen, wobei Äthyiacetat ais Eiuiermitiei verwendet wurde. Anschiießerid wurde sie einer Dünnschichtkieselgelchromatographie mit Äthylacetat als Fließmittel unterworfen. 3,0 g des Einzelflecks bei Rf = 0,14 wurden gesammelt und davon die beabsichtigte Substanz als öliges Produkt erhalten.

(c) BOC-(W-Z)LyS-GIy-(N-"- NO₂)Arg-Pro-OBZL

3 g BOC-Gly—(N"-NO₂)Arg—Pro—OBZL wurden in einer Mischung aus 20 ml 50%igerTrifluoressigsäure/Dichlormethan und 1 ml Anisol gelöst, 40 min bei Raumtemperatur gerührt und die erhaltene Lösung unter verringertem Druck konzentriert. Zu dem so erhaltenen Rückstand wurden 100 ml Äthyläther mit einem Gehalt von 3 ml 10% Chlorwasserstoff/lsopropyläther zugegeben. Der ausfallende Niederschlag wurde durch Filtrie-

ren abgetrennt, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei 2,4 g einer trockenen Substanz, die aus H—Gly—(N¹"-NO₂)Arg— Pro—OBZL bestand, in Form eines Hydrochlorid-Additionssalzes erhalten wurden. 435 g dieses Additionssalzes und 2,7 g BOC-(N^f—Z)Lys—OH · Dicyclohexylaminsalz wurden in 50 ml Tetrahydrofuran suspendiert und gut geschüttelt. Unter Kühlen wurden 0,94 g N-Hydroxybenzotriazol und 1,67 g Dicyclohexylharnstoff zugegeben. Das Ganze wurde bei dieser Temperatur 3 Stunden gerührt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in 150 ml Äthyiacetat gelöst und die Lösung nacheinander mit Wasser, wäßriger normaler Natriurnbicarborsstiösur.g, Wasser, '/«molarer Citronensäure, Wasser, wäßriger normaler Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Glaubersalz getrocknet und unter verringertem Druck

konzentriert. Der Rückstand wurde aus einer Mischung aus Äthylacetat und Äthyläther ausgefällt 2,7 g des Niederschlags wurden gesammelt, und aus einer Äthyläther/Petroläther-Mischung umkristallisiert Schmelzpunkt der Kristalle 57 bis 63° C unter Zersetzung und Schäumen.

[λ] ³ _d°-50° (c = 0,62 in Methanol).

Elementaranalyse des Produkts auf C39H55N9O11:
ber.:(%) C 56,70 H 6,72 N 15,26
gef.:(%) C 56,64 H 6,82 N 14,89

Dünnschichtkieselgelchromatographie:

Rr = 039 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1:5)
R/ = 031 (Äthylacetat: Äthanol = 9 :1 als Fließmittel).

(d)BOC-(N*-Z)Lys-Gly-(N<»-N0₂)Arg-Pro-0H

2£ g BOC-(N'-Z)-Lys—Gly—(N-"-NO₂)Arg— Pro—OBZL wurden in einer Mischung aus 9 ml Methanol und 3 ml wäßriger normaler Natriumhydroxydlösung gelöst und die Lösung 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Zur Reaktionsmischung wurden 2,5 ml normaler Salzsäure zugegeben und die Lösung unter verringertem Druck konzentriert Der Rückstand wurde mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt nach Waschen mit

Wasser über Glaubersalz getrocknet und unter verringertem Druck konzentriert Zum Rückstand wurde Äthyläther zugegeben und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt Dieser wurde dann in 15 ml normaler wäßriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, mit Äthyiacetat gewaschen, mit 'Amolarer Citronensäure angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Glaubersalz getrocknet und unter verringertem Druck konzentriert Zum Rückstand wurde Äthyläther zugegeben und das gewünschte

Produkt daraus in fester Form gewonnen. Ausbeute: 1,2 g, Schmelzpunkt 92° C bis 95° C (unter Zerseteen und Schäumen).

Mi⁰ —³⁷° (c= \ in Methanol).

Elementaranalyse auf C32H49N9O11:
ber.:(%) C 52,22 H 6,73 N 17,13
gef.:(%) C 52,11 H 6,86 N 16,25

Dünnschichtkieselgelchromatographie:

R/ = 0.64 (n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4 :1 :5 als Fließmitte!) R, = 0,76 (n-Butanol : Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30 : 20 : 6 : 24 als Fließmittel).

(e)Z-pyrGlu-(N'-Z)Lys-Gly-(N«'-NO₂)Arg-Pro-OH

1 g BOC-(N^f—Z)Lys—Gly—(N'"-NO₂)Arg—Pro —OH wurde in einer Mischung aus 0,2 ml Anisol und 15 ml 50% Trifluoressigsäure/Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde nach 1 stündigem Rühren bei Raumtemperatur unter verringertem Druck konzentriert. Zum Konzentrat wurden 45 ml Äthyläther zugegeben und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt. Anschließend wurde mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei 1 g an trockener Substanz, d. h.demTrifluoracetat von

H-(N'-Z)Lys-Gly-(N"-NO₂)Arg-Pro-OH

erhalten wurde.

Die trockene Substanz wurde in 9 m! Dimethylformamid gelöst und zur Lösung wurden 0.92 ml N-Methyl- ?n morpholin und 0,58 g Z—pyrGlu—ONP zugegeben. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt Der Niederschlag wurde wiederum aus einer Mischung aus Äthanol und Äthylacetat ausgefällt und anschließend 2mal aus einer Mischung aus Äthanol und Wasser. Auf diese Weise wurden 0,9 g einer pulverförmigen Substanz erhalten. Schmelzpunkt des Produktes 130 bis 150° C unter Zersetzung.

[ac]i°—41,7° (c = 1 in Methanol: Dimethylformamid = 1 :0,l).

Elemientaranalyseauf C40H52N10O15 · H2O:
ber.:(%) C 53,43 H 6,06 N 15,58
ger.:(%) C 53,57 H 5,90 N 15,40

Dünnschichtkieselgelchromatographie:

R/ =■ 0,47 (n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1:5)

R/ = 0,76 (n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30 :20 :6 :24).

35 (a) BOC-Trp-lie-Leu-OBZL

3,9 g BOG—Heu—Leu—OBZL wurden in einer 50%igen Trifluoressigsäure/Dichlormethan-Lösung gelöst, und die erhaltene Lösung Wurde nach l'/jstündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in 200 ml Äthyläther eingebracht, der Chlorwasserstoff enthielt. Es fiel ein weißer Niederschlag aus, der durch Filtrieren gesammelt und getrocknet wurde. Der Niederschlag hatte einen Schmelzpunkt von 154 bis 155°C. 3,0 g wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und 0,88 ml N-Methylmorpholin zugegeben. Ζιτ Mischung wurden 2,4 g BOC-Trp—OH unter Kühlen auf 0°C und anschließend 13 g N-Hydroxybenzotriazol und 1,8 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wurde nach einstündigem Rühren bei dieser Temperatur weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend über Nacht stehen gelassen. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat nach Waschen mit Athylacetat unter verringertem Druck konzentriert Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, nacheinander mit Wasser, normaler wäßriger Natriumbicarbonatlösung;, Wasser, 'Amolarer Citronensäure in Wasser und Wasser gewaschen, und anschließend über Glaubersalz getrocknet Der durch Konzentrieren unter verringertem Druck erhaltene Niederschlag wurde aus einer Mischung aus Äthyläther und η-Hexan umkristallisiert Auf diese Weise wurde das beabsichtigte Produkt in Form eines weißen Pulvers erhalten.

Aasbeute: 4,5 g,

Schmelzpunkt: 154 bis 156"C₁

Γ>] »-4,2° (c = 1 in Methanol), -

Massenspektrum: m/e 620 (M⁺).

Elementaranalyse auf C₃SrIwN₄O₆:
ber.:(%) C 67,70 H 7,81° N 9,03
gef.:(%) C 67,73 H 8,06 N 934

Dünnschichtchromatographie:
Rr= 0,86 (Äthyläther).

(b)H-Trp-Ile-Leu-OBZL

2£ g BOC-Trp—lie—Leu—OBZL wurden in 20 ml 50%iger Trifluoressigsäure/Dichlonnethan-Lösung gelöst, die 0,4 ml Mercaptoäthanol und 0,5 ml Anisol enthielt Die Lösung wurde nach 30minütigem Rühren bei

Raumtemperatur unter verringertem Druck auf 5 ml konzentriert. Zum Konzentrat wurden zuerst 100 ml Äthyläther und anschließend 4 ml einer Athylacetatlösung mit 10% Salzsäure zugegeben. Der auf diese Weise ausfallende gelatineartige Niederschlag, der das Hydrochlorid des beabsichtigten Produkts ist, wurde durch Filtrieren gesammelt und aus einer Mischung aus Ä thanol/Isopropyläther umkristallisiert.

Ausbeute: 1,9 g.

Schmelzpunkt 219 bis 220⁰C.

[λ] ²J -2533° (c = 0,75 in 50% Äthanol).

ίο Elementaranalyse des Produkts Q0H40N4O4 · HCI · H₂O ber.:(%) C 62,63 H 7,55 N 9,74 gef.:(%) C 62,62 H 7,26 N 9,84

Dünnschichtkieselgelchromatographie: 15 R/ => 0,83 (n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1:5) Rr = 0,87 (Fließmittel n-Butanol: Essigsäure : Pyridin . Wasser = 30 :6 :20 :34).

Claims

Patentansprüche:

1. Octapeptid der Formel

pyrGlu—Lys—Gly—Arg—Pro—Trp—Ue-Leu—OH (I).

2. Verfahren zur Herstellung des Octapeptids gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schutzgruppen aus einem Octapeptid der allgemeinen Formel

R⁴-pyrGlu-(N* - RS)Lys-GIy-(N" - R⁶)Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OR⁷ (II)