CH650519A5 - Auf das zentrale nervensystem wirkende tripeptide und verfahren zur herstellung derselben. - Google Patents

Description

650 519

PATENTANSPRÜCHE

1. Peptide der allgemeinen Formel I

X-Y-W-NH2

worin

X eine L-Pyroglutamyl-, D-Pyroglutamyl-, L -2- Ketoimi-dazolidin -4- carbonyl-, L -6- Ketopipecolyl-, L-Thiazolidin-4- carbonyl-, L-Prolyl- oder Orotylgruppe,

Y eine L-Leucyl-, L-Norvalyl- oder L-Histidylgruppe,

W eine L-Prolyl-, D-Prolyl-, L-Thiazolidin -4- carbonyl-, L-Homoprolyl-, L-Leucyl-, L-Isoleucyl-, L-Methionyl-, L-Pi-pecolyl- oder D-Pipecolylgruppe oder -W-NH2 zusammen eine Pyrrolidyl- oder Piperidylgruppe bedeuten, wenn aber X L-Pyroglutamylgruppe und Y L-Histidylgruppe bedeuten, dann hat W eine von L-Prolylgruppe verschiedene Bedeutung, sowie therapeutisch anwendbare Komplexe dieser Verbindungen.

2. L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- pipecolinsäureamid als Verbindung nach Anspruch 1.

3. L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- thiazolidin -4- carbon-säureamid als Verbindung nach Anspruch 1.

4. L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- thiazolidin -4- carbon-säureamid als Verbindung nach Anspruch 1.

5. L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonyl -L- leucyl -L- pro-linamid als Verbindung nach Anspruch 1.

6. L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- leucyl -L- prolin-amid als Verbindung nach Anspruch 1.

7. L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- pro-linamid als Verbindung nach Anspruch 1.

8. D-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- prolinamid als Verbindung nach Anspruch 1.

9. L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid als Verbindung nach Anspruch 1.

10. L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- ho-moprolinamid als Verbindung nach Anspruch 1.

11. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I

Anwendung von aktiven Estern, gemischten Anhydriden oder Cyclohexyl-carbodiimid, aufbaut, oder b) die Verbindungen der allgemeinen Formel II

5 W-NH2

worin W die oben angegebene Bedeutung hat, mit Säureazi-den der allgemeinen Formel III

10

z-x-y-n3

(III)

worin Z die Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet, X und Y die im Anspruch 11 angegebenen Bedeutungen haben, acyliert, und dann aus den erhaltenen gegebenenfalls geschützten Verls bindungen der allgemeinen Formel IV

Z-X-Y-W-NH2

(IV)

worin Z, X, Y und W die oben angegebenen Bedeutungen ha-2o ben, die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet und das erhaltene Produkt der allgemeinen Formel I aus dem Reaktionsgemisch isoliert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der geschützten Verbindung der allgemei-

25 nen Formel IV die Schutzgruppe Z durch katalytische Hydrierung abspaltet.

14. Verfahren zur Herstellung von an der Stelle von X eine Pyroglutamylgruppe enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I, nach Anspruch 1 worin Y und W die im

3o Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, dadurch gekennzeichnet, dass man aus den Y und W entsprechenden Aminosäuren oder Aminosäurederivaten und einem Glut-aminrest als N-terminale Aminosäure ein Tripeptid der allgemeinen Formel Gln-Y-W-NH2 aufbaut und letzteres durch 35 Wärmebehandlung in Essigsäure in die entsprechende, an der Stelle von X eine Pyroglutamylgruppe enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I überführt.

40

X-Y-W-NH2

(I) Die Erfindung betrifft auf das zentrale Nervensystem wirkenden Tripeptidamide der allgemeinen Formel I

worin

X eine L-Pyroglutamyl-, D-Pyroglutamyl-, L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonyl-, L -6- Ketopipecolyl-, L-Thiazolidin -4- carbonyl-, L-Prolyl- oder Orotylgruppe,

Y eine L-Leucyl-, L-Norvalyl- oder L-Histidylgruppe, W eine L-Prolyl-, D-Prolyl-, L-Thiazolidin -4- carbonyl-, L-Homoprolyl-, L-Leucyl-, L-Isoleucyl-, L-Methionyl-, L-Pi-pecolyl- oder D-Pipecolylgruppe, oder -W-NH2 zusammen eine Pyrrolidyl- oder Piperidylgruppe bedeuten, wenn aber X L-Pyroglutaminyl- und Y L-Histidylgruppe bedeuten, dann hat W eine von L-Prolylgruppe verschiedene Bedeutung, sowie von therapeutisch anwendbaren Komplexen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man Tripeptidderi-vate der allgemeinen Formel I, worin X, Y und W die oben angegebenen Bedeutungen haben, aus den entsprechenden Aminosäuren oder Aminosäurederivaten aufbaut.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus Verbindungen der allgemeinen Formel II,

X-Y-W-NH2

(I)

45

worin

,W-NH2

(II)

worin W die im Anspruch 11 angegebene Bedeutung hat, ausgehend das Molekül der allgemeinen Formel I schrittweise, aus gegebenenfalls geschützten Aminosäuren oder Aminosäurederivaten durch Koppelungsmethoden, vorteilhaft unter

X eine L-Pyroglutamyl-, D-Pyroglutamyl-, L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonyl-, L -6- Keto-pipecolyl-, L-Thiazolidin-4- carbonyl-, L-Prolyl- oder Orotylgruppe,

so Y eine L-Leucyl-, L-Norvalyl- oder L-Histidylgruppe,

W eine L-Prolyl-, D-Prolyl-, L-Thiazolidin -4- carbonyl-, L-Homoprolyl-, L-Leucyl-, L-Isoleucyl-, L-Methionyl-, L-Pi-pecolyl- oder D-Pipecolylgruppe, ferner -W-NH2 zusammen auch eine Pyrrolidyl- oder Piperidylgruppe bedeuten, wenn 55 aber X L-Pyroglutaminyl- und Y L-Histidylgruppe bedeuten, dann W eine von L-Prolylgruppe verschiedene Bedeutung hat, sowie von therapeutisch anwendbaren Komplexen dieser Verbindungen.

Die neuen, der oben definierten allgemeinen Formel I ent-60 sprechenden Tripeptidderivate sind Analoga des auch als «thyrotropin-releasing hormone» (TRH) bekannten L-Pyroglutamyl -L- histidyl -L- prolinamids (Glp-His-Pro-NH2), in welchen aber einige Aminosäuregruppen gegen gewisse andere, in der obigen Definition der allgemeinen Formel I ange-65 gebene Aminosäuregruppen, bzw. -W-NH2 gegebenenfalls gegen eine Pyrrolidyl- oder Piperidylgruppe ausgetauscht sind.

Das Existieren von TRH war schon in den 60-er Jahren

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bekannt, seine Struktur wurde aber erst in den Jahren 1969 bzw. 1970 von den Forschergruppen von R. Guillemin bzw. A. Schally fast gleichzeitig, aber von einander unabhängig aufgeklärt, vgl. Bowers, C. Y., etc., Endocrinology 86,1143 (1970); R. Burgus etc., C. R. Acad. Sei. (Paris) 269,1870 (1969).

Das Tripeptid TRH wurde ursprünglich als ein die Freisetzung von TSH (thyreotropes Hormon) in der Hypophyse von Säugetieren regulierender Faktor beschrieben; die sich mit diesem Hormon befassende Forschung wurde aber in eine neue Richtung gelenkt, als erkannt wurde, dass die biologische Funktion dieses Tripeptids nicht auf die Regulierung der Freisetzung des thyreotropen Hormons beschränkt ist, sondern auch eine Wirkung auf das zentrale Nervensystem besteht [vgl.: N.P. Plotnikoff und Mitarb., Science 178,417 (1972); A.J. Prange und Mitarb., Lancet 2,999 (1972)]. Es wurde dann festgestellt, dass das TRH neben der erwähnten Hormonfunktion auch die Zeitdauer des durch Barbiturate oder Alkohol verursachten Schlafens erheblich herabsetzt, ferner auch die durch verschiedene Arzneimittel verursachte Hypothermie reduziert und die lokomotorische Aktivität steigert. Ein weiterer wichtiger Faktor der auf das zentrale Nervensystem ausgeübten Wirkung von TRH ist die Hemmung der durch Haloperidol verursachten Katalepsie. Es schien also als erwünscht, für die therapeutische Praxis solche TRH-Analoge herzustellen, welche auf die Hypophyse nur schwach wirken, dagegen aber die Wirkungvon TRH erreichende oder sogar übertreffende Wirkungen auf das zentrale Nervensystem zeigen. Zu diesem Zweck wurden die in den DE-OS 2 343 035,2 343 037,2 449 167,2 514 381,2 609 154 und 2 639 393 sowie in der BE-PS 819 198 beschriebenen derartigen Verbindungen hergestellt. Die bisherige diesbezügliche Forschung, deren Ergebnissen und Erfahrungen von A.J. Prange und Mitarb. [«The Rôle of Hormones in Depression», Life Sciences 20,1305 (1977)] und A.V. Schally und Mitarb. [«Hypothalamic Regulatory Hormones», Ann. Rev. Bio-chem. 47,89 (1978)] zusammengefasst wurden, konnte aber nicht zu die Bedürfnisse der therapeutischen Praxis in jeder Hinsicht befriedigenden Ergebnissen führen.

Es wurde nun gefunden, dass man durch den systematischen Austausch von einigen Aminosäuren des aus drei Aminosäuren aufgebauten TRH-Moleküls erreichen kann, dass die Hormonwirkung des Tripeptids ganz aufgehoben oder mindestens erheblich reduziert, die auf das zentrale Nervensystem ausgeübte Wirkung aber beibehalten oder sogar bedeutend erhöht wird. Als besonders vorteilhaft haben sich diejenigen Derivate erwiesen, in welchen an der Stelle der Histidin-gruppe in der 2-Stellung eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette enthaltende aliphatische Aminosäuregruppe steht. Im Interesse einer noch selektiveren biologischen Wirkung zeigte sich ebenfalls als vorteilhaft eine 6-Ketopipecolinsäu-regruppe anstatt des Pyroglutamyl-Ringsystems in das Molekül einzubauen.

Die der oben definierten allgemeinen Formel I entsprechenden Tripeptidderivate werden erfindungsgemäss aus den entsprechenden Aminosäuren bzw. Aminosäurederivaten nach an sich bekannten peptidchemischen Methoden vorzugsweise derart hergestellt, dass man a) aus Verbindungen der allgemeinen Formel II,

b) die Verbindungen der allgemeinen Formel II,

W-NH2

(II)

5 worin W die oben angegebene Bedeutung hat, mit Säureazi-den der allgemeinen Formel III,

Z-X-Y-Nj

(III)

W-NH2

(II)

worin W die oben angegebene Bedeutung hat, ausgehend das Molekül der allgemeinen Formel I schrittweise, durch Anwendung der in der Peptidchemie üblichen Koppelungsmethoden, vorteilhaft unter Anwendung von aktiven Estern, gemischten Anhydriden oder Dicyclohexyl-carbodiimid aufbaut, oder io worin Z Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet und X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben aeyliert, und dann aus den nach einer der obigen Methoden erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel IV,

i5z-x-y-w-nh2

(iv)

worin Z, X, Y und W die oben angegebenen Bedeutungen haben, die Schutzgruppe Z vorzugsweise durch katalytische Hydrierung abspaltet und das erhaltene Produkt der allge-20 meinen Formel I aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Die erhaltene Verbindung der Formel I kann gegebenenfalls in einen therapeutisch anwendbaren Komplex übergeführt werden.

Bei der Anwendung der Methode des schrittweisen Mole-2s kül-Aufbaus wird die zweckmässig in Überschuss eingesetzte Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel W-NH2 mit einem aktivierten Derivat, besonders mit dem Pentafluorphen-ylester einer geschützten Aminosäure der allgemeinen Formel BOC-Y-OH, worin BOC die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutz-30 gruppe bedeutet, umgesetzt, wobei die entsprechenden Dipep-tidderivate BOC-Y-W-NH2 in äusserst kurzer Reaktionszeit (in einigen Minuten), in leicht aufarbeitbarer und weitere Reinigung meistens nicht beanspruchender Form erhalten werden. Dieselben Dipeptidderivate der allgemeinen Formel 35 BOC-Y-W-NH2 können aber auch unter Anwendung von anderen Koppelungsmethoden, z.B. mit gemischten Anhydriden oder mit freien Säuren in Gegenwart von Dicyclohexyl-carbodiimid aufgebaut werden.

Die aus dem erhaltenen geschützten Dipeptidderivat 40 BOC-Y-W-NH2 durch Acidolyse freigesetzten Dipeptide der allgemeinen Formel H-Y-W-NH2 werden dann vorteilhaft wieder mit dem Pentafluorphenylester einer geschützten Aminosäure der allgemeinen Formel Z-X-OH umgesetzt, wobei dann auf die oben beschriebene vorteilhafte Weise die « entsprechenden geschützten Tripeptidderivate der allgemeinen Formel Z-X-Y-W-NH2 erhalten werden.

Die Acylierung der Ausgangs verbindung W-NH2 mit einem Azid der Formel Z-X-Y-n3, das aus einem Hydraziden der allgemeinen Formel Z-X-Y-NH-NH2 herstellbar ist, hat 50 den Vorteil, dass die erwähnten Hydrazide sehr gut kristallisierbare und dementsprechend in sehr reiner Form isolierbare Zwischenprodukte sind.

Die an der Stelle von X eine Pyroglutamylgruppe enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I können auch 55 derart aufgebaut werden, dass man den Pyroglutamylring nur im letzten Schritt der Synthese aus einer Glutamingruppe bildet, und zwar so, dass man Glutamin als dritte Aminosäure in das Molekül einführt und das auf diese Weise erhaltene Tripeptid der allgemeinen Formel Gln-Y-W-NH2 in Essigsäure so einige Minuten erwärmt.

Aus den nach einer der oben beschriebenen Methoden hergestellten geschützten Tripeptidderivaten der allgemeinen Formel Z-X-Y-W-NH2 können die gewünschten Endprodukte der allgemeinen Formel I vorteilhaft durch katalytische 65 Hydrierung freigesetzt werden. Die Reinigung der erhaltenen Endprodukte kann durch einfaches Kristallisieren oder Umfallen, nötigenfalls aber auch durch Säulenchromatographie erfolgen. Gegebenenfalls kann das Endprodukt nach dem

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4

Entfernen der Nebenprodukte auch durch einfache Lyophili-sierung auspräpariert werden.

Die erfindungsgemäss hergestellten Tripeptidderivate der allgemeinen Formel I wurden nach den nachstehend beschriebenen biologischen Methoden-auf ihre pharmakologischen Wirkungen geprüft.

1. Hemmung der Haloperidol-Katalepsie an Ratten (vgl.: J. Delay undP. Deniker: Compt. Rend. Cong. Med. Aleni-stes Neurologistes, 19,497, Luxemburg 1952)

40 mg/kg Haloperidol, d.h. 4- (p-Chlorphenyl) -1- [3- (p-fluorbenzoyl) -propyl] -piperidin -4- ol wurden den Tieren s.c. verabreicht und nach 120 Minuten wurde das Eintreten der Katalepsie kontrolliert; anschliessend wurden die Ratten in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilt und mit intravenös verabreichten Dosen von TRH bzw. von den neuen TRH-analogen Tripeptiden behandelt. Die Tiere der Kontrollgruppen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt. 15,30,90 und 120 Minuten nach der Behandlung wurde die katalepsieaufhebende Wirkung der einzelnen Verbindungen geprüft. Diejenigen Tiere wurden als kataleptisch betrachtet, welche, wenn sie mit ihren vorderen Füssen auf eine 7 cm hohe Säule gestellt wurden, ihre Position innerhalb von 30 Sekunden nicht korrigiert haben.

Aus der Zahl der keine Katalepsie zeigenden Tiere wurden durch Probit-Analyse die entsprechenden ED50-Werte für die einzelnen Wirkstoffe ermittelt.

Diese Versuche wurden mit männlichen Wistar Ratten mit 160 bis 180 g Einzelgewicht durchgeführt.

2. Potenzierung der durch L-Dopa verursachten lokomo-torischen Aktivität an Mäusen

(Vgl.: The Thyroid Axis, Drugs and Behavior, S. 116, A. 3. Präge 3r., Raven Press, New York, 1974)

Den Tieren wurden zuerst je 40 mg/kg N-Methyl- N-propargyl-benzylamin (Pargyline), dann 20 mg/kg TRH, bzw. die gleichen Dosen der zu untersuchenden neuen Tripep-tide und schliesslich 100 mg/kg L-Dopa, jeweils intraperitoneal verabreicht. Nach 30,60 und 90 Minuten nach der obigen Behandlung wurde die lokomotorische Aktivität der Tiere gemessen; die ermittelten Werte wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die mit TRH behandelten Tieren erhaltenen Werte bezogenen Prozenten angegeben. Zu diesen Versuchen wurden je 15 männliche Mäuse mit 18 bis 22 g Einzelgewicht eingesetzt.

3. Reserpin-Hypothermie-umkehrende Wirkung an Mäusen

Vgl.: B.M. Askew: Life Sei. 2,725-730 (1963).

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilten männlichen Mäusen mit 18 bis 22 g Einzelgewicht wurden 5 mg/kg Reser-

Tabelle pin i.p. verabreicht; nach 16 Stunden wurden die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. des zu untersuchenden Tripeptids behandelt.

Die rektale Temperatur der Tiere wurde vor der Behand-5 lung mit Reserpin (in der nachstehenden Tabelle: «norm.»), nach 16 Stunden nach der Behandlung mit Reserpin (in der Tabelle: «res.») und nach einer bzw. zwei Stunden nach der Verabreichung der zu untersuchenden Tripeptide (in der Tabelle: «nach Behandl.») gemessen. In der Tabelle sind die io Durchschnittswerte der bei je 10 Mäusen gemessenen rektalen Temperaturen angegeben.

4. Beeinflussung der Dauer des durch Hexobarbital verursachten Schlafes

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilten männlichen 15 Mäusen wurden je 60 mg/kg Hexobarbital-Na (EvipanR Bayer) intravenös verabreicht, nach 10 Minuten wurden dann die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den 20 Tieren der Kontrollgruppe gemessenen Werte bezogenen Prozenten (Durchschnittswerte von je 10 Tieren) angegeben.

5. Äthanol-Narkose

Vgl.: J.M. Cott et al.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 196,594 (1976).

25 Den in Gruppen von je 20 Tieren eingeteilten CFLP (LATI) Mäusen gemischten Geschlechts mit 18 bis 22 g Einzelgewicht wurden je 4,5 g Äthanol i.p. verabreicht; nach 10 Minuten wurden dann die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. 3o Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den Tieren der Kontrollgruppe gemessenen Werte bezogenen Prozenten (Durchschnittswerte von je 20 Tieren) angegeben.

6. Hormon-Aktivität (TSH-Wirkung) an Ratten

35 Männliche Wistar-Ratten mit etwa 200 g Einzelgewicht wurden in Gruppen von je 7 bis 8 Tieren eingeteilt und mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intravenös behandelt. Die TSH-Reaktion der Tiere wurde 15 Minuten nach der Behandlung mit TRH bzw. mit 40 den TRH-analogen Verbindungen aus dem Plasma der Tiere durch radioimmune Untersuchung ermittelt. Die relativen Wirkungshöhen wurden nach der Vierpunktmethode, mit Hilfe eines TPA 101 Computers berechnet, wobei die Wirkungshöhe von TRH als 100 betrachtet wurde.

45 Die nach den oben geschilderten pharmakologischen Methoden ermittelten Daten der biologischen Wirkungen der wichtigeren Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

X-Y-W-NH2

Hemmung von

Haloperidol-Katalepsie

Potenzierung von

L-Dopa lokomo-tor. Aktivität, %

Umkehrung von Reserpin-Hypothermie rektale Temperatur, °C

Hexobarbital-Schlafzeit % der

Äthanol- TSH-Schlafzeit Wirkung % der

X

Y

W

ED 5o

Zeit

nach

norm. res.

nach Behandl.

Kontroll-

Kontroll-

mg/kg

Min.

30'

60'

90'

lh

2h

Tiere

Tiere

Kpc

Leu

Pro

23,5

60

319

80

127

36,3

24,5

32,0

33,9

37

79

2,7

Kpc

Nva

Pro

10,6

30

36

45

65

36,3

23,9

33,1

32,5

51

46

0

Gip

Leu

Tea

31,4

120

171

142

52

36,2

24,9

33,1

32,2

39

58

0

Gip

Leu

Pip

38,5

120

201

89

112

36,4

24,6

30,7

31,0

38

60

7,2

Gip

Nva

Tea

56

30

195

147

79

36,5

32,8

31,4

30,7

69

51

0

Kpc

Nva

Tea

60,3

30

103

38

70

36,4

23,6

30,4

29,0

61

48

-

Kpc

Nva

HPro

35,3

15

63

30

108

36,3

20,7

26,5

32,2

76

35

-

D-Glp

Leu

Pro

70

15

54

58

115

36,5

27,4

25,8

25,6

97

54

0

Kic

Leu

Pro

80

30

118

70

98

35,5

24,1

27,7

28,8

59

69

0

TRH

80

15

100

100

100

36,2

25,9

35,5

30,2

56

35

100

Hexobarbital-Schlafzeit: (X± SE) 38,4 ± 1,36 Min., Äthanol-Schlafzeit: (X± SE) 46,9 ±2,17 Min.

Aus den Daten der obigen Tabelle ist es ersichtlich, dass die neuen TRH-Analoga, bei denen zwei oder drei Aminosäuren des THR-Moleküls durch andere Aminosäuren ersetzt sind, erhebliche Wirkungen auf das zentrale Nervensystem zeigen. Aus diesem Gesichtspunkt sind besonders diejenigen Derivate vorteilhaft, in welchen an der Stelle der His Gruppe in der 2-Stellung des TRH-Moleküls eine aliphatische Aminosäure mit gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette steht. Ebenfalls vorteilhaft sind aus dem Gesichtspunkt dieser Wirkung diejenigen TRH-Analoga, in welchen die Gip Gruppe durch 6-Keto-pipecolinsäure ersetzt ist. Bei diesen Derivaten ist die Hormonwirkung von TRH entweder völlig aufgehoben oder auf ein Minimum reduziert, wobei gleichzeitig die auf das zentrale Nervensystem ausgeübte Wirkung sehr bedeutsam, in einigen Fällen sogar auf das Achtfache gesteigert ist.

Die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Tripeptide sowie ihre pharmazeutisch anwendbaren Salze bzw. Komplexe können in der Form von üblichen Arzneimittelpräparaten in der Therapie angewendet werden. Diese Arzneimittelpräparate enthalten die erfindungsgemässen Wirkstoffe in Begleitung von zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können z.B. in der Form von Tabletten, Dragéen, Injektionspräparaten, Lyophilisaten usw. hergestellt werden. Die Herstellung dieser Arzneimittelformen kann nach den üblichen pharmazeutischen Methoden erfolgen.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens, bzw. die chemische Herstellung der erfindungsgemässen neuen TRH-Analoga wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht. Die in diesen Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Peptidchemie üblichen konventionellen Abkürzungen, vgl.: J. Biol. Chem. 247,977 (1972). Es werden ferner die folgenden weiteren Abkürzungen in den nachstehenden Beispielen verwendet:

HPro L-Homoprolin

Kic L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonsäure

Kpc L -6- Ketopipecolinsäure

Oro Orotsäure

Pip L-Pipecolinsäure

Tea L-Thiazolidin -4- carbonsäure

DCC Dicyclohexyl-carbodiimid

DCU Dicyclohexyl-harnstoff

PFPOH Pentafluorphenol

DMFA Dimethylformamid

Die in den Beispielen angegebenen Schmelzpunkte der Verbindungen wurden mittels eines Schmelzpunkt-Messapparats nach Dr. Tottoli (Büchi) ermittelt. Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines Polarimeters vom Typ Per-kin-Elmer 141 gemessen. In den dünnschichtchromatographi-schen Untersuchungen bzw. Trennungen wurden «Kieselgel G nach Stahl» (E. Merck, Darmstadt) Silicagelplatten verwendet. Zur Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelgemische eingesetzt:

(1) Chloroform-Methanol 9:1

(2) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure-Wasser 20:6:11) 95:5

(3) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) 9:1

(4) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) 8:2

(5) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) 3:2

(6) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) 2:3

Zur Entwicklung der Flecke wurde Ninhydrinlösung verwendet; nach der Besprühung wurden die Platten etwa 5 Minuten lang bei 105 °C getrocknet. Dann wurden die Chroma-

5 650 519

togramme in Chlorgas gelegt und nach der Belüftung mit o-Tolidin-Kaliumjodidlösung entwickelt.

Zu der säulenchromatographischen Reinigung der Produkte wurde «Kieselgel G» (E. Merck) Silicagel mit 0,062 bis 5 0,2 mm Teilchengrösse verwendet.

Zum Eindampfen der Lösungen im Vakuum wurde ein «Rotavapor R» (Büchi) Vakuum-Eindampfer verwendet; das Eindampfen wurde bei 50 °C nicht überschreitenden Temperaturen durchgeführt.

10 Die Pentafluorphenylester der BOC-geschützten Aminosäuren wurden nach der Methode von L. Kisfaludy und Mitarb., Ann. 1973,1421, hergestellt.

Beispiel 1

i5 L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- pipecolinsäureamid Schritt 1:

L-Leucyl -L- pipecolinsäureamid-hydrochlorid

1,54 g (12 mMol) H-Pip-NH2 werden in 20 ml DMFA suspendiert und die Suspension mit 5,16 g (13 mMol) BOC-20Leu-OPFP und 1,68 ml (12 mMol) Triäthylamin unter Rühren versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden weiter gerührt, dann wird die erhaltene Lösung im Vakuum eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl in 60 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 0,2 ml 2- (Dimethylamino) -äthylamin 25 versetzt, 5 Minuten stehen gelassen und dann mit je 20 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 20 ml N Natriumhydrogen-carbonatlösung dreimal und mit 20 ml Wasser einmal, in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rück-3o stand wird in 3 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 10 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Nach einer Stunde Stehen wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es 35 werden auf diese Weise 3,12 g H-Leu-Pip-NH2.HC1 (94% der auf H-Pip-NH2 berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; R^? = 0,46.

40

. Schritt 2:

Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- leucyl -L- pipecolinsäureamid

3,13 g (11,2 mMol) H-Leu-Pip-NH2.HC1 und 4,94 g (11,5 mMol) Z-Glp-OPFP werden in 35 ml DMFA gelöst und die Lösung mit 1,57 ml (11,2 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 1,57 ml (11,2 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 90 ml Chloroform ge-so löst und die Lösung mit je 30 ml N Salzsäurelösung zweimal, mit je 30 ml N Natriumhydroxydlösung dreimal und mit 30 ml Wasser einmal, in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt. Die organische Phase wird dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der amorphe s5 Rückstand wird mit kaltem Äther verrührt, der Äther dekantiert und das zurückgebliebene Öl unter n-Hexan zum Erstarren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene amorphe rohe Produkt (4,7 g) wird aus Äthylacetat/Äther kristallisiert. Es werden 3,32 g Z-Glp-Leu-Pip-NH2 (61% d.Th.) erhalten; F.

60143-144 °C;R^ = 0,51; [a]^ = -97,2° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C25H3406N4 (Mol.Gew.: 486,57):

berechnet: C 61,71%, H 7,04%, N 11,51%;

gefunden: C 61,67%, H 7,05%, NI 1,40%.

65

Schritt 3:

L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- pipecolinsäureamid 2,1 g (4,32 mMol) Z-Glp-Leu-Pip-NH2 werden in 40 ml

650 519

Methanol gelöst, 0,2 g 10%iger Palladium/Aktivkohle-Katalysator werden zugegeben und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang in das Gemisch geleitet. Dann wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (1,48 g) wird in 20 ml Wasser gelöst, mit Aktivkohle geklärt und abfiltriert. Im klaren Filtrat werden 4 g Natriumchlorid gelöst und die Lösung mit je 10 ml Chloroform dreimal ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der amorphe Rückstand mit einem Gemisch von Äthylacetat und Äther verrieben. Es werden auf diese Weise 1,33 g Glp-Leu-Pip-NH2

(87,5% d.Th.) erhalten; R^ = 0,60; [a]^ = -86,4°(c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 2

L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- thiazolidin -4- carbonsäu-reamid Schritt 1:

L-Leucyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid-hydro-chlorid

1,81 g(11 mMol) H-Tca-NH2.HC1 [vgl. S. Ratner und H.T. Clarke, J. Am. Chem. Soc. 59,200 (1937)] werden in 30 ml DMFA aufgeschlämmt und mit 3,97 g (10 mMol) BOC-Leu-OPFP, 1,49 g (11 mMol) 1-Hydroxy-benztriazol und 1,22 ml (11 mMol) N-Methyl-morpholin versetzt. Die erhaltene Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 80 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit je 20 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 20 ml N Natriumhydrogen-carbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der aufschäumende, amorphe Rückstand wird in 5 ml Äthylacetat gelöst, mit 10 ml 7 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt und eine Stunde stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 1,84 g H-Leu-Tca-NH2.HC1 (65% der auf BOC-Leu-OPFP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; R(^ = 0,25; F. 170-174 °C (Zers.).

Schritt 2:

Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- leucyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid

1,69 g (6 mMol) H-Leu-Tca-NH2.HC1 werden in 20 ml DMFA aufgeschlämmt und mit 2,7 g (6,3 mMol) Z-Glp-OPFP und 0,84 ml (6 mMol) Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit je 10 ml N Salzsäurelösung zweimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogen-carbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt. Die organische Phase wird dann eingedampft, der Rückstand mit Äther verrieben und das erhaltene rohe Produkt durch mehrmaliges Umfallen aus Äthylacetat/Äther gereinigt. Es werden 1,64 g Z-Glp-Leu-Tca-NH2 (56% d.Th.)

erhalten; F. 108-110 °C; R(JP = 0,46; a]^5 = -130,30° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 3:

L-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid

1,62 g (3,3 mMol) Z-Glp-Leu-Tca-NH2 werden in 6 ml eiskalter 3,5 N Bromwasserstofflösung in Eisessig gelöst und die Lösung anderthalb Stunden bei 0° bis 5 °C stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt,

die obere Phase dekantiert und das zurückgebliebene Öl in 20 ml Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit je 10 ml Äther dreimal ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird im Va-5 kuum eingedampft, der Rückstand in 20 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der amorphe Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Das erhaltene rohe Produkt (1,13 g) wird im Laufmittelgemisch (4) gelöst und auf eine io 20 g Silicagel enthaltende Säule gebracht. Die Säule wird mit dem selben Lösungsmittelgemisch eluiert. Aus den reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden 0,78 g amorphes Produkt isoliert. Dieses Produkt wird in 20 ml Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die erhaltene wasserklare 15 Lösung lyophilisiert. Es werden auf diese Weise 0,62 g Glp-

Leu-Tca-NH2 (53% d.Th) erhalten; = 0,53; [a] ^ =

-145,0° (c = 1, in Essigsäure).

2o Beispiel 3

L-Pyroglutamyl -L- leucyl -D- prolinamid Schritt 1:

Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- leucyl -D- prolinamid

25 1.54 g (5,8 mMol) H-Leu-D-Pro-NH2.HCl werden in 20 ml DMFA gelöst und die Lösung mit 0,81 ml (5,8 mMol) Triäthylamin und 2,58 g (6 mMol) Z-Glp-OPFP versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt, dann werden weitere 0,81 ml (5,8 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 10 Mi-30 nuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 60 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 15 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 15 ml N Natriumhydroxydlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 15 ml Wasser einmal gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der amorphe Rückstand wird mit Äther verrieben. Das erhaltene rohe Produkt (2,1 g) wird aus 5 ml Äthylacetat umkristallisiert; es werden auf diese Weise 1,8 g Z-Glp-Leu-

4o D-Pro-NH2 (66% d.Th.) erhalten; F. 153-157 °C, R(^ =

0,38; [a]^ = — 24,5° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 2:

L-Pyroglutamyl -L- leucyl -D- prolinamid 1,5 g (3,25 mMol) Z-Glp-Leu-D-Pro-NH2 werden in 70 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,3 g 10%igem Palladium-Aktivkohle Katalysator versetzt und Wasserstoff wird eine Stunde lang durch die Lösung geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft und der amorphe Rückstand mit Äther verrieben. Das erhaltene rohe Produkt (0,94 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und abfiltriert. Das wasserklare Filtrat wird lyophilisiert; es werden 0,87 g Glp-Leu-D-Pro-NH2 (79%

55 d.Th.) erhalten; R® =0,47;[a]^ = +8,4°(c= 1, in Essigsäure).

Beispiel 4

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- thiazolidin -4- carbon-6o säureamid Schritt 1:

L-Norvalyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid-hydro-chlorid

8,0 g (20 mMol) BOC-Nva-OH.DCHA werden in 60 ml 65 Äther aufgeschlämmt, mit 20 ml 2 N Schwefelsäurelösung versetzt und bis zur Auflösung des Feststoffes geschüttelt. Die Phasen werden getrennt, die Ätherphase mit 20 ml 2 N Schwefelsäurelösung und mit 20 ml Wasser je einmal ausge35

45

50

7

650 519

schüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 40 ml DMFA gelöst, die Lösung mit 2,8 ml (20 mMol) Triäthylamin versetzt, auf — 15 °C abgekühlt und unter Rühren mit 2,5 ml (20 mMol) Pivaloylchlorid tropfenweise, in solchem Tempo versetzt, dass dabei die Temperatur des Reaktionsgemisches unter - 5 °C bleibt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird bei der selben Temperatur noch 10 Minuten gerührt.

Während dieser Zeit werden 3,72 g (22 mMol) H-Tca-NH2.HC1 in 30 ml DMFA aufgeschlämmt, mit 3,1 ml (22 mMol) Triäthylamin versetzt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und das Filtrat der auf obige Weise zubereiteten Lösung des gemischten Anhydrids bei - 5 °C tropfenweise zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch 30 Minuten bei —10 °C gerührt,

dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen und am nächsten Tag im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 20 ml N Salzsäurelösung dreimal, anschliessend mit je 20 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 20 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 20 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung bis unter 5 °C abgekühlt und mit 20 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde in einem Eisbad gehalten, dann mit Äther verdünnt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 3,77 gH-Nva-Tca-NH2.HCl (70% der auf BOC-Nva-OH.DCHA berechneten theoretischen

Ausbeute) erhalten; R^P = 0,20.

Schritt 2:

Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- norvalyl -L-thiazolidin -4- carbonsäureamid

2,8 g (10,5 mMol) H-Nva-Tca-NH2.HC1 werden in 50 ml DMFA aufgeschlämmt und es werden unter Rühren 1,47 ml (10,5 mMol) Triäthylamin und 5,15 g(12mMol)Z-Glp-OPFP zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird nach 5 Minuten mit weiterem 1,47 ml (10,5 riiMol) Triäthylamin versetzt, 10 Minuten weiter gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 20 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 20 ml Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 20 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der amorphe Rückstand wird mit Äther verrieben und das erhaltene rohe Produkt (4,6 g) aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 3,2 g Z-Glp-Nva-

Tca-NHZ (64% d.Th.) erhalten; F. 116-118 °C; R^ = 0,45;

[a]

D

-129,0° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 3:

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid

4,76 g (10 mMol) Z-Glp-Nva-Tca-NH2 werden in 20 ml eiskalter 3,5 N Bromwasserstoff-Eisessiglösung gelöst und die Lösung anderthalb Stunden bei 0° bis 5 °C stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt und das ausgeschiedene Öl durch Dekantieren von dem Lösungsmittel getrennt. Das erhaltene Öl wird in 50 ml Wasser gelöst, die Lösung durch die Zugabe von festem Natriumhydrogen-carbonat neutralisiert und mit je 20 ml Äther dreimal ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird eingedampft, der Rückstand in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das erhaltene rohe Produkt (3 g) wird auf eine aus 80 g Silicagel hergestellte Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (4) eluiert. Aus den reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden 2,18 g amorphes 5 Produkt isoliert, dieses wird in 40 ml Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lio-ph.ilisiert. Es werden auf diese Weise 1,84 g Glp-Nva-

Tca-NH2 (54% d.Th.) erhalten; R^ = 0,50; [a]^ =

io -145,6° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 5

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- leucinamid Schritt 1:

15 tert.-Butyloxycarbonyl -L- norvalyl -L- leucin-methyl-ester

Das aus 8,0 g (20 mMol) DCHA-Salz auf die im Beispiel 4, Schritt 1 beschriebene Weise freigesetzte BOC-Nva-OH und 3,82 g (21 mMol) H-Leu-OMe.HCl werden in 60 ml 20 Chloroform gelöst und die Lösung zuerst mit 2,94 ml (21 mMol) Triäthylamin, dann unter Eiskühlung und Rühren mit der Lösung von 4,33 g (21 mMol) DCC in 40 ml Chloroform versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 5 °C stehen gelassen, dann wird der ausgeschiedene DCU ab-25 filtriert, das Filtrat mit je 30 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 30 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 30 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit n-Hexan verrieben, abfiltriert 3o und das erhaltene rohe Produkt (6,65 g) aus dem Gemisch von 5 ml Äthylacetat und 20 ml Petrolether umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 5,20 g BOC-Nva-Leu-OMe (75%

d.Th.) erhalten; F. 100-101 °C; R(j? = 0,84; [a]^ = -47,5° 35 (c = 1, in Methanol).

Schritt 2:

tert.-Butyloxycarbonyl -L- norvalyl -L- leucinamid 5,0 g (14,5 mMol) BOC-Nva-Leu-OMe werden in 50 ml 40 Methanol gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und Ammoniakgas wird eine halbe Stunde lang in die gekühlte Lösung geleitet. Die Lösung wird dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wieder abgekühlt, wieder mit Ammoniakgas gesättigt, 4 Stunden stehen gelassen und dann einge-45 dampft. Der kristalline Rückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 4,37 g BOC-Nva-Leu-NH2 (91% d.Th.) erhalten;

F. 158-159 °C;R^ = 0,60; [a]^ = -48,7° (c = l,in Methanol).

50

Schritt 3:

L-Norvalyl -L- leucinamid-hydrochlorid 4,12 g (12,5 mMol) BOC-Nva-Leu-NH2 werden in 15 ml Äthylacetat aufgeschlämmt und mit 20 ml 6 N Salzsäurelö-55 sung in Äthylacetat versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt; der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das rohe Produkt (3,64 g) aus 25 ml Methanol umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 2,75 g H-Nva-Leu-NH2.HC1 (83% d.Th.) erhalten; F.

60 215-216°C; R® = 0,45; [a]^ = -3,47° (c = l,in

Methanol).

Schritt 4:

65 Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- norvalyl -L- leucinamid

2,67 g (10 mMol) H-Nva-Leu-NH2.HC1 werden in 30 ml DMFA gelöst. Zu der Lösung werden zuerst 1,4 ml

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(10 mMol) Triäthylamin, dann nach dem Abfiltrieren des entstandenen Niederschlags 4,72 g (11 mMol) Z-Glp-OPFP zugesetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin zugegeben, und nach weiteren 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (5,5 g) aus Äthanol umkristallisiert. Es werden 3,84 g Z-Glp-Nva-Leu-NH2 (81% d.Th.) erhalten; F.

241-242 °C; R^ = 0,55; [a]^

säure).

-62,6° (c = 1, in Essig-

Schritt 5:

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- leucinamid

3,8 g (8 mMol) Z-Glp-Nva-Leu-NH2 werden in 200 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,8 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Dann wird der Katalysator abfiltriert und der gelartige Rückstand mit Äther verrieben. Es werden auf diese Weise 2,7 g Glp-Nva-Leu-NH2

(99% d.Th.) erhalten; F. 240 °C (Zers.); R(^ = 0,57; [a]^ =

— 55,8° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 6

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- isoleucinamid Schritt 1:

tert.-Butyloxycarbonyl -L- norvalyl -L- isoleucinamid

3,7 g (19 mMol) H-Ile-NH2.HC1 werden in 30 ml DMFA gelöst, die Lösung unter Rühren mit 2,7 ml (19 mMol) Triäthylamin und 6,63 g (17,3 mMol) BOC-Nva-OPFP versetzt und nach 5 Minuten werden weitere 2,4 ml (17,3 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung zweimal mit je 20 ml N Salzsäurelösung, dass dreimal mit ie 20 ml N Natrium-hydrogencarbonatlösung und zuletzt tinmal mit 20 ml Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Es werden auf diese Weise 4,7 g BOC-Nva-Ile-NH2 (83% d.Th.) erhalten; F.

192-194 °C; R^ = 0,60; [a]^ = -43,7° (c = 1, in

Methanol).

Schritt 2:

L-Norvalyl -L- isoleucinamid-hydrochlorid

4,5 g (13,7 mMol) BOC-Nva-Ile-NH2 werden in 20 ml Äthylacetat aufgeschlämmt und mit 12 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt. Der entstandene Niederschlag wird durch filtrieren abgetrennt und das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,6 g) aus einem Gemisch von Methanol und Äther umkristallisiert. Es werden 3,5 g H-Nva-Ile-NH2.HC1 (96% d.Th.) erhalten; F. 254-255

°C; R® = 0,45; [a]^ = + 3,8° (c = 1, in Methanol).

Schritt 3:

Benzyloxycarbonyl-L- pyroglutamyl -L- norvalyl -L- isoleucinamid

3,3 g (12,4 mMol) H-Nva-Ile-NH2.HC1 werden in 40 ml DMFA gelöst und die Lösung unter Rühren mit 1,74 ml (12,4 mMol) Triäthylamin und 5,85 g (13,6 mMol) Z-Glp-OPFP versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 1,74 ml (12,4 mMol) Triäthylamin zugegeben. Das nach einigen Sekunden gelartig erstarrende Reaktionsgemisch wird mit Äther verdünnt und verrührt, 2 Stunden im Kühlschrank ste-

,25

hen gelassen und dann abfiltriert. Es werden auf diese Weise 5,1 g Z-Glp-Nva-Ile-NH2 (86% d.Th.) erhalten; F.

252-253 °C; R^ = 0,60; [a]^5 = -57,5° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 4:

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- isoleucylamid 4,75 g (10 mMol) Z-Glp-Nva-Ue-NH2 werden in 200 ml 10 Essigsäure gelöst und nach der Zugabe von 1 g 10%igem Pal-ladium-Aktivkohle Katalysator wird eine Stunde lang Wasserstoffgas durch die Lösung geleitet. Nach der Beendigung der Hydrierung wird der Katalysator durch Fütrieren abgetrennt, das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand mit i5 Äther verrieben. Es werden 3,34 g Glp-Nva-Ile-NH2 (98%

d.Th.) erhalten; F. 267-270 (Zers.); R^?= 0,61; [a]^ =

- 50,2° (c = 1, in Essigsäure).

20 Beispiel 7

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- methioninamid Schritt 1:

tert.-Butyloxycarbonyl -L- norvalyl -L- methioninmethyl-ester

25 Aus 4,78 g (12 mMol) DCHA-Salz wird das BOC-Nva-OH auf die im Beispiel 4, Schritt 1 beschriebene Weise freigesetzt und mit 2,6 g (13 mMol) H-Met-OMe.HCl in 40 ml Chloroform gelöst. Zu der Lösung werden zuerst 1,82 ml (13 mMol) Triäthylamin, dann unter Eiskühlung und 30 Rühren die Lösung von 2,58 g (12,5 mMol) DCC in 20 ml Chloroform zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 5 °C stehen gelassen, dann wird der ausgeschiedene DCU abfiltriert, das Filtrat mit je 20 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 20 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung 35 dreimal und zuletzt mit 20 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der öüge Rückstand wird durch die Zugabe von Petroläther zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,42 g) wird aus einem Gemisch von Äthylace-40 tat und Petroläther umkristallisiert. Es werden 3,08 g BOC-

Nva-Met-OMe (71 % d.Th.) erhalten; F. 69-70 °C; R^=

0,81; [a]p = -42,7° (c = 1, in Methanol).

45 Schritt 2:

tert.-ButyloxycarbonyI -L- norvalyl -L- methioninamid 1,81 g (5 mMol) BOC-Nva-Met-OMe werden in 20 ml Methanol gelöst und Ammoniakgas wird unter Kühlung eine halbe Stunde lang in die Lösung geleitet. Das Reaktionsge-5omisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann einige Stunden im Kühlschrank gehalten. Das ausgeschiedene kristalline Produkt wird abfiltriert (1,27 g); das Filtrat wird eingedampft, der Rückstand aus 5 ml Äthanol umkristallisiert und mit der auf obige Weise erhaltenen Haupt-55 menge des Produkts vereinigt. Es werden so insgesamt 1,62 g BOC-Nva-Met-NH2 (93% d.Th.) erhalten; F. 166-167 °C;

R®= 0,57; [aj^ = -40,9° (c = 1, in Methanol).

60

.Schritt 3:

L-Norvalyl -L- methioninamid-hydrochlorid 4,5 g (13 mMol) BOC-Nva-Met-NH2 werden in 20 ml Äthylacetat aufgeschlämmt und mit 20 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine 65 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt; der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (4 g) wird aus einem Gemisch von Methanol und Äther umkristallisiert. Es

9

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werden 3,28 g H-Nva-Met-NH2.HC1 (89% d.Th.) erhalten; F. 198-200 °C; R^= 0,40; [a]^ = +10,2° (c = 1, in Methanol).

Schritt 4:

tert.-Butyloxycarbonyl -L- glutaminyl -L- norvalyl -L-methioninamid

2,84 g (10 mMol) H-Nva-Met-NH2.HC1 werden in 40 ml DMFA aufgeschlämmt und es werden unter Rühren 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin und 4,53 g (11 mMol) BOC-Gln-OPFP zugesetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 1,4 ml (10 mMol) Triathylamin zugegben und nach weiteren 10 Minuten Rühren wird die erhaltene dicke Suspension im Vakuum eingedampft. Der feste Verdampfungsrückstand wird mit Äthanol verrieben und das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (4,82 g) wird mit 50 ml Äthanol aufgekocht. Nach dem Abkühlen wird die Suspension einige Stunden im Kühlschrank gehalten und dann abfiltriert. Es werden auf diese Weise 4,08 g BOC-Gln-Nva-Met-NH2 (86% d.Th.) erhalten;

F. 237-238 °C; R(^= 0,43; [a]^ = -37,1° (c = 1,inEssigsäure).

Schritt 5:

L-Pyroglutamyl -L- norvalyl -L- methionamid 3,8 g (8 mMol) BOC-Gln-Nva-Met-NH2 werden in 100 ml 98%iger Ameisensäure gelöst, die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 50 ml Essigsäure gelöst, die Lösung 2 Minuten gekocht und dann im Vakuum wieder eingedampft. Der gelartige Rückstand wird mit Äther verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 2,8 g Glp-Nva-Met-NH2 (98% d.Th.) erhalten; F.

249-25 °C(Zers.); R(^ = 0,58; [a]^ = -48,4° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 8

N-(L-Pyroglutamyl -L- leucyl) -pyrrolidin Schritt 1;

N(L-Leucyl) -pyrrolidin-hydrochlorid

3,46 g (15 mMol) BOC-Leu-OH werden in 50 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 2,1 ml (15 mMol) Triäthylamin versetzt und auf —15 °C abgekühlt. Dann werden unter Rühren, bei unter -10 °C 1,97 ml (16 mMol) Pivaloylchlorid tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene Suspension wird 10 Minuten weiter gerührt, dann werden bei der selben Temperatur 1,37 ml (16,5 mMol) Pyrrolidin tropfenweise zugegeben und das Gemisch noch eine halbe Stunde bei -10 °C gerührt und anschliessend 3 Stunden bei 5 °C stehen gelassen. Die erhaltene Lösung wird mit je 10 ml N Salzsäurelösung dreimal, anschliessend mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 5 ml Äthylacetat gelöst und mit 10 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird mit Äther gewaschen, mit Kaliumcarbonat alkalisch gemacht und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 10 ml Äther gelöst, der pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäurelösung in Äthylacetat auf 3 eingestellt und das ausgeschiedene kristalline Produkt abfiltriert. Es werden auf diese Weise 2,41 g H-Leu-pyrroli-

din.HCl (73% d.Th.) erhalten; F. 170-174 °C (Zers.); R^ = 0,37.

Schritt 2:

N- (Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- leucyl) -Pyrrolidin

1,7 g (7,7 mMol) H-Leu-pyrrolidin.HCl, 3,0 g (7 mMol) Z-Glp-OPFP und 1,08 ml (7,7 mMol) Triäthylamin werden 1Qin 20 ml Chloroform gelöst und nach 5 Minuten werden weitere 0,98 ml (7 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach weiteren 5 Minuten wird die Lösung mit 30 ml Chloroform verdünnt, mit je 10 ml N Salzsäurelösung zweimal, dann mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zu-15 letzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit n-Hexan zum Kristallisieren gebracht und das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (2,85 g) aus einem Gemisch von Äthanol und Äther umkristallisiert. Es 20 werden 2,14 g Z-Glp-Leu-pyrrolidin (71% d.Th.) erhalten; F

109-110 °C; R^ = 0,55; [a]^ = - 53,3° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C23H3105N3 (Mol. Gew. 429,52):

berechnet: C 64,32%, H 7,27%, N9,78%; 25 gefunden: C 64,31%, H 7,47%, N9,78%

Schritt 3: *

N-(L-Pyroglutamyl -L- leucyl) -pyrrolidin

2,0 g (4,66 mMol) Z-Glp-Leu-pyrrolidin werden in 40 ml 30 Methanol gelöst, zu der Lösung werden 0,4 g Palladium-Aktivkohle-Katalysator zugesetzt und Wasserstoffgas eine Stunde lang durch die Lösung geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft, das als Rückstand erhaltene Öl in Äther gelöst, die Lösung über Nacht im 35 Kühlschrank stehen gelassen, dann werden die ausgeschiedenen Kristalle durch Filtrieren abgetrennt. Es werden auf diese Weise 1,25 g Glp-Leu-pyrrolidin (91% d.Th.) erhalten;

F. 103-104 °QR^ = 0,65; [a]^ = -31,6° (c = l,inEs-

40 sigsäure).

Aminosäure-Analyse: Glu, 1,00 (1,0), Leu 1,00 (1,0).

Beispiel 9

N- (L-Pyroglutamyl -L- leucyl) -piperidin Schritt 1:

N- (L-Leucyl) -piperidin-hydrochlorid

3,46 g (15 mMol) BOC-Leuk-OH werden in 50 ml Äthyl-acetet gelöst, die Lösung mit 2,1 ml (15 mMol) Triäthylamin 50 versetzt und auf —15 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden unter Rühren zuerst 1,97 ml (16 mMol) Pivaloylchlorid, dann nach 10 Minuten 1,65 ml (16,5 mMol) Piperidin tropfenweise zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch eine halbe Stunde bei 55 -10 °C gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Der Niederschlag wird dann abfiltriert, das Filtrat mit je 10 ml N Salzsäurelösung dreimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Na-60 triumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 15 ml 4 N Salzsäurelösung in Äthylacetat gelöst, die Lösung eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt und über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das als Niederschlag erhaltene 65 Produkt durch Filtrieren abgetrennt. Es werden auf diese Weise 2,0 g H-Leu-piperidin.HCl (57% der auf BOC-Leu-OH berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; F. 123—

125 °C; R(p = 0,45.

650519

10

Schritt 2:

N-(Benzyloxycarbonyl -L- pyroglutamyl -L- leucyl) -piperidin

1,81 g (7,7 mMol) H-Leu-piperidin.HCl, 3,0 g (7 mMol) Z-Glp-OPFP und 1,08 ml (7,7 mMol) Triäthylamin werden in 20 ml Chloroform gelöst und nach 5 Minuten Stehen werden weitere 0,98 ml (7 mMol) Triäthylamin zugesetzt. Nach weiteren 5 Minuten wird die Lösung mit 30 ml Chloroform verdünnt, mit je 10 ml N Salzsäurelösung zweimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene kristalUsierende Öl wird mit einem Gemisch von Äther und n-Hexan verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (2,75 g) wird aus einem Gemisch von Äthanol und Äther umkristallisiert; es werden 2,21 g Z-Glp-

Leu-piperidin (71% d.Th.) erhalten; F. 113-115 °C; R^ =

0,69, [a]^ = — 42,5° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C24H33O5N3 (Mol. Gew. 443,55):

berechnet: C 64,99%, H 7,50%, N9,47%;

gefunden: C 64,90%, H 7,72%, N9,53%

Schritt 3:

N- (L-Pyroglutamyl -L- leucyl)-piperidin

2,0 g (4,51 mMol) Z-Glp-Leu-piperidin werden in 40 ml Methanol gelöst, mit 0,4 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang in die Lösung geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther zum Kristallisieren gebracht. Es werden auf diese Wei- ! se 1,12 g Glp-Leu-piperidin (81% d.Th.) erhalten; F. 99-

100 °C; R(^ = 0,71; [a]^ = + 30,4° (c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: Glu 0,95 (1,0), Leu 1,00 (1,0).

Beispiel 10

L-Thiazolidin -4- carbonyl -L- leucyl- L- prolinamid

5,13 g (22 mMol) BOC-Tca-OH und 4,05 g (22 mMol) PFPOH werden in 60 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 4,12 g (20 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 0° bis 5 °C gerührt, dann wird der DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 50 ml n-Hexan gelöst. Die Lösung wird mit je 25 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung fünfmal und anschliessend mit je 25 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Die auf diese Weise erhaltenen 7,32 g öliges BOC-Tca-OPFP werden in 20 ml DMFA gelöst und die Lösung wird zu der Suspension von 5,23 g (20 mMol) H-Leu-Pro-NH2.HC1 in 30 ml DMFA zugegeben, dann wird dieses Gemisch unter Eiskühlung und Rühren mit 2,8 ml (20 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 2,8 ml (20 mMol) Triäthylamin zugesetzt, das Gemisch 20 Minuten weiter gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 30 ml N Salzsäure dreimal, mit je 30 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 30 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Die als Rückstand erhaltenen 8,84 g öliges BOC-Tca-Leu-Pro-NH2 werden in 15 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 15 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äthylacetat verdünnt, der entstandene Niederschlag wird verrieben und abfiltriert und dann im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen 8,05 g

Tnpeptidamid-Hydrochlorid werden in 80 ml Wasser gelöst, die Lösung mit je 20 ml Äther dreimal ausgeschüttelt, dann wird der pH-Wert der wässrigen Lösung mit Natriumhydro-gencarbonat auf 8 eingestellt und die alkalisch gemachte Lö-5 sung mit je 20 ml Chloroform fünfmal extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Es werden auf diese Weise 5,20 g H-Tca-Leu-Pro-NH2 (76% d.Th.)

1C erhalten; F. 159-160 °C; R(^ = 0,63; [a]^ = -162,9° (c =

1, in Essigsäure).

Beispiel 11

15 L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonyl -L- leucyl -L- prolinamid Schritt 1:

Benzyloxycarbonyl -L-2- ketoimidazolidin -4- carbonsäu-re-pentafiuorphenylester 20 10,56 g (40 mMol) Z-Kic-OH und 9,09 g (44 mMol) PFPOH werden in 100 ml 1:2 Gemisch von DMFA und Dioxan gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 9,06 g (44 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0° bis 5 °C anderthalb Stunden gerührt, dann wird der 25 DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl mit n-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (16,46 g)

wird aus 50 ml Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 12,75 gZ-Kic-OPFP (74% d.Th.) erhalten; F. 146-148 °C;

30 R^ = 0,53; [cc]p = -42,1° (c = 1, in Äthylacetat).

Analyse für C18H„05N2F5 (Mol. Gew. 430,29):

berechnet: C 50,25%, H 2,58%, N 6,51%, F 22,08%; gefunden: C 49,88%, H 2,35%, N 6,66%, F 21,81 %.

35

Schritt 2:

Benzyloxycarbonyl -L-2- ketoimidazolidin -4- carbonyl-L- leucyl-L- prolinamid

2,38 g (9 mMol) H-Leu-Pro-NH2.HCI werden in 30 ml io DMFA aufgeschlämmt und mit 3,87 g (9 mMol) Z-Kic-OPFP und 1,26 ml (9 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 1,26 ml (9 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Ver-45 dampfungsrückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml N Salzsäure zweimal, in je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene so Öl wird mit Äther zum Kristallisieren gebracht und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,31 g) wird mit 30 ml Äthylacetat aufgekocht; nach dem Abkühlen wird die Aufschlämmung einige Stunden im Kühlschrank stehen gelassen und dann abfiltriert. Es werden 3,0 g Z-Kic-Leu-

55 Pro-NH2 (70% d.Th.) erhalten; F. 172-174 °C; R^ = 0,18;

25

[a]p = — 102,6° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C23H3106N5 (Mol. Gew. 473,50):

so berechnet: C 58,34%, H 6,60%, N 14,79%;

gefunden: C 57,52%, H 6,62%, N 14,62%.

Schritt 3:

L -2- Ketoimidazolidin -4- carbonyl -L- leucyl -L- pro-65 linamid

1,2 g (2,54 mMol) Z-Kic-Leu-Pro-NH2 werden in 30 ml Wasser gelöst, die Lösung wird mit 0,25 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird

11

650 519

4 Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der amorphe Rückstand im Vakuum, über wasserfreiem Phosphor-pentoxyd getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (0,75 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lyophilisiert. Es werden 0,61 g Kic-Leu-Pro-NH2 (71 % d.Th.) erhalten; R^

= 0,35, [a]^ = -90,4° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 12

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L-leucyl -L- prolinamid Schritt 1:

L -6- Ketopipecolinsäure-pentafluorphenylester

4,3 g (30 mMol) L -6- Ketopipecolinsäure und 6,07 g (33 mMol) PFPOH werden in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 6,8 g (33 mMol) DCC versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde bei 0 °C gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der ausgeschiedene DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der kristalline Rückstand mit n-Hexan verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (9,87 g) wird in 20 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung eine Stunde im Kühlschrank stehen gelassen, dann mit Aktivkohle geklärt, abfiltriert und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird im Gemisch von 5 ml Äthylacetat und 20 ml n-Hexan gelöst, die Lösung über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen und am nächsten Tag werden die ausgeschiedenen Kristalle durch Filtrieren abgetrennt. Es werden

6,34 gKpc-OPFP (68,5% d.Th.) erhalten; F. 96-98 °C; [a]^

= +30,0°(c= 1, in Äthylacetat).

Analyse für Ci2H803NF5 (Mol. Gew. 309,20):

berechnet: C 46,62%, H 2,61 %, N 4,53%, F 30,72%; gefunden: C 46,37%, H 2,88%, N 4,26%, F 30,51 %.

Schritt 2:

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- leucyl -L- prolinamid

1,32 g (5 mMol) H-Leu-Pro-NH2.HCl werden in 20 ml DMFA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 1,61 g (5,2 mMol) Kpc-OPFP und 0,7 ml (5 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 0,7 ml (5 mMol) Triäthylamin zugesetzt und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Äther verrieben, die Kristalle werden abfiltriert, am Filter mit Äther und mit kaltem Chloroform gewaschen und getrocknet. Es werden auf diese Weise 1,27 g Kpc-Leu-Pro-NH2 (72%

d.Th.) erhalten; F. 214-216 °C, R^P = 0,41, [o]q = -83°

(c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: a-Amino-adipinsäure 0,99 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 0,98 (1,0).

Beispiel 13

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- prolinamid

2,38 g (9,5 mMol) H-Nva-Pro-NH2.HCl werden in 30 ml DMFA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 30,09 g (10 mMol) Kpc-OPFP und 1,33 ml (9,5 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 1,33 ml (9,5 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert, am Filter mit kaltem Äthanol gewaschen und getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,66 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt, die wasserklare Lösung eingedampft und der kristalline Rückstand mit 10 ml Äthanol verrieben. Das Gemisch wird im Kühlschrank stehen gelassen und dann abfiltriert. Es werden 2,10 g Kpc-Nva-Pro-NH2 (65% d.Th.) erhalten; F. 192-193 °C; = 0,31; [a]^ = -83,2° (c = 1, 5 in Essigsäure).

Beispiel 14

D-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- prolinamid Schritt 1:

10 Benzyloxycarbonyl -D- pyroglutaminsäure-pentafluor-phenylester

4,55 g (18 mMol) Z-I>Glp-OH und 3,68 g (20 mMol) PFPOH werden in 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 4,12 g (20 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei 0 °C gerührt, dann wird der DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der ölige Rückstand mit n-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (7,3 g) wird in 20 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung eine Stunde im Kühlschrank stehen gelassen, dann mit Aktivkohle geklärt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 5 ml Äthylacetat gelöst und durch Zugabe von 20 ml n-Hexan wird das Produkt gefällt. Es werden 6,60 g Z-D-Glp-

25 OPFP (85% d.Th.) erhalten; F. 81-82 °C; R^ = 0,84; [a]^

= +40,1° (c = 1, in Äthylacetat).

Analyse für C19Hi205NF5 (Mol. Gew. 429,30):

berechnet: C 53,16%, H 2,82%, N 3,26%, F 22,13%; „ gefunden: C 53,28%, H 3,04%, N 3,02%, F 21,86%. Schritt 2:

Benzyloxycarbonyl -D- pyroglutamyl -L- leucyl -L- prolinamid

3,24 g (12,3 mMol) H-Leu-Pro-NH2.HCl werden in 50 ml DMFA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 5,6 g (13 mMol) Z-D-Glp-OPFP und 1,72 ml (12,3 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 1,72 ml (12,3 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach weiterem 20 Minuten Rühren wird das Reaktions-40 gemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 120 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 30 ml N Salzsäure zweimal, mit je 30 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 30 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und ein-45 gedampft. Der ölige Verdampfungsrückstand wird mit Äther zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (5,31 g) wird mit 50 ml Äthylacetat aufgekocht, die erhaltene Suspension wird drei Stunden im Kühlschrank stehen gelassen und dann wird das als Niederschlag erhaltene Produkt durch Filtrieren abgetrennt. Es werden 4,61 g Z-D-Glp-Leu-Pro-NH2 (80% d.Th.) erhalten; F. 189-194 °C.;

R*y* = 0,44; [a]^ = — 31,2°(c= 1, in Essigsäure).

55 Schritt 3:

D-Pyroglutamyl -L- leucyl -L- prolinamid

4,48 g (9,5 mMol) Z-D-Glp-Leu-Pro-NH2 werden in 200 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 0,9 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoff-6o gas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Dann wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der amorphe Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,07 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die 65 wasserklare Lösung lyophilisiert. Es werden 2,90 g D-Glp-

Leu-Pro-NH2 (90,5% d.Th.) erhalten; R(jP = 0,40; [a]^ =

-23,6° (c = 1, in Essigsäure).

650 519

Beispiel 15 Orotyl -L- histidyl -L- pipecolinsäureamid Schritt 1:

Orotyl -L- histidin-methylester 24,2 g (100 mMol) H-His-OMe.2HCl werden in 120 ml 1:1 Gemisch von DMFA und Dioxan gelöst und die Lösung mit 17,41 g (100 mMol) Orotsäure-monohydrat versetzt. Die Lösung wird auf 0 °C abgekühlt und es werden bei dieser Temperatur 11,5 g (100 mMol) N-Hydroxy-sukcinimid, 11,1 ml (100 mMol) N-Methylmorpholin und zuletzt 20,6 g (100 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei 0 °C und anschliessend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch 2 Stunden im Kühlschrank gehalten, dann wird der DCU abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird durch Verreiben mit Wasser zum Kristallisieren gebracht, die Kristalle werden abfiltriert und am Filter mit 5%iger wässriger Citronensäurelösung und mit Wasser gewaschen. Es werden auf diese Weise 11,6g Oro-

His-OMe (38% d.Th.) erhalten; F. 258-262 °C; R^P = 0,40.

Analyse für Q2H13O5N5 (Mol. Gew. 307,27):

berechnet: N 22,79%;

gefunden: N 22,51 %.

Schritt 2:

Orotyl-histidin-hydrazid

9,21 g (30 mMol) Oro-His-OMe werden in 120 ml DMFA gelöst und die Lösung mit 7,35 ml (150 mMol) Hy-drazinhydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit 100 ml Äthylacetat verdünnt und über Nacht im Kühlschrank gehalten. Der abgeschiedene Niederschlag wird dann abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Es werden auf diese Weise 8,07 g

Oro-His-N2H3 (88% d.Th.) erhalten; F. 250-260 °C; R^ =

0,35.

Analyse für CnH1304N7 (Mol. Gew. 307,28):

berechnet: N 31,91 % ;

gefunden: N 30,75%.

Schritt 3:

Orotyl -L- histidyl -L- pipecolinsäureamid 5,0 g (16,28 mMol) Oro-His-N2H3 werden in 135 ml DMFA aufgeschlämmt und mit 5,99 ml (48,84 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf —15 °C abgekühlt und unter Rühren mit 2,13 ml (17,9 mMol) tert.-Butylnitrit tropfenweise versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann bei -10 °C 20 Minuten gerührt, anschliessend bei —10 °C mit 4,56 ml (32,56 mMol) Triäthylamin, darauffolgend mit der Lösung von 2,05 g (16,28 mMol) H-Pip-NH2 in 10 ml DMFA und zuletzt mit weiteren 2,28 ml (16,28 mMol) Triäthylamin tropfenweise versetzt. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch eine Stunde bei —10 °C gerührt, dann über Nacht bei 2 °C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äthylacetat verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (4,6 g, 74% d.Th.) wird abgetrennt und 1,3 g dieses Produkts werden auf eine, aus dem 1:1 Gemisch von Carboxymethylcellulose-23 und Carboxymethylcellulose-52 hergestellte Säule gebracht und mit 0,005-0,1 M Ammoniumacetatlösung (pH = 5) eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 820 mg amorphes Oro-His-

Pip-NH2 erhalten; R® =0,10; [a]^ = -19,0°

(c = 1, in Wasser).

12

Aminosäure-Analyse: His 1,00 (1,0), Pip 0,94 (1,0).

Beispiel 16 Orotyl -L- histidyl -D- pipecolinsäureamid 5 5,0 g (16,28 mMol) Oro-His-N2H3 werden in 135 ml DMFA aufgeschlämmt und mit 5,99 ml (48,84 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf —15 °C abgekühlt und unter Rühren, tropfenweise mit 2,13 ml (17,9 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Das Reak-xo tionsgemisch wird bei — 10 ° C 20 Minuten gerührt, dann bei der selben Temperatur tropfenweise mit 4,56 ml (32,56 mMol) Triäthylamin, anschliessend mit der Lösung von 2,05 g (16,28 mMol) H-D-Pip-NH2 und zuletzt mit weiteren 2,28 ml (16,28 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach der Been-15 digung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch eine Stunde bei —10 °C gerührt, dann über Nacht bei 2 °C im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der entstandene Niederschlag abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit Äthylacetat 20 verrieben. Es werden auf diese Weise 4,1 g rohes Produkt (66% d.Th.) erhalten; 1,3 g dieses Produkts werden auf eine aus dem 1:1 Gemisch von Carboxymethylcellulose-23 und Carboxymethylcellulose-52 hergestellte Säule gebracht und mit 0,005-0,1 molarer Ammoniumacetatlösung (pH = 5) 25 eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 795 mg amorphes Oro-

His-D-Pip-NH2 erhalten; R^ = 0,10; [a]?5 = +13,5°(c = 1, in Wasser).

30 Aminosäure-Analyse: His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0).

Beispiel 17 Orotyl -L- histidyl -L- homoprolinamid 5,0 g (16,28 mMol) Oro-His-N2H3 werden in 135 ml 35 DMFA aufgeschlämmt und mit 5,99 ml (48,84 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf —15 °C abgekühlt und unter Rühren tropfenweise mit 2,13 ml (17,9 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann 20 Minuten bei —10 °C gerührt, 40 dann werden bei —10 °C nach einander 4,56 ml (32,56 mMol) Triäthylamin, die Lösung von 2,05 g (16,28 mMol) H-HPro-NH2 in 10 ml DMFA und zuletzt noch 2,28 ml (16,28 mMol) Triäthylamin tropfenweise zugegeben. Nach der Beendigung der Zgabe wird das Reaktionsgemisch noch 45 eine Stunde bei -10 °C gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank, bei 2 °C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Äthylacetat verrieben. Von dem auf diese Weise erhaltenen rohen Produkt (4,2 g, 67% d.Th.) wer-50 den 1,3 g auf eine aus dem 1:1 Gemisch von Carboxymethylcellulose-23 und Carboxymethylcellulose-52 hergestellte Säule getragen und mit 0,005-0,1 molarer Ammoniumacetatlösung eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 802 mg amor-

55 phes Oro-His-HPro-NH2 erhalten; R^P = 0,10; [a]^ =

—12,8° (c = 1, in Wasser).

Aminosäure-Analyse: His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0).

60 Beispiel 18

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- thiazolidin -4- carbonsäureamid

2,55 g (9,5 mMol) H-Nva-Tca-NH2.HC1 werden in 30 ml DMFA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren 65 mit 3,09 g (10 mMol) Kpc-OPFP und 1,33 ml (9,5 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 1,33 ml (9,5 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im

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Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird über Nacht im Kühlschrank gehalten und dadurch zum Kristallisieren gebracht. Am nächsten Tag werden die Kristalle abfiltriert, mit Äther und mit kaltem Äthanol gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,25 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt, die wasserklare Lösung wird eingedampft, der kristalline Rückstand mit 20 ml Äthanol verrieben und über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das erhaltene Produkt abfiltriert und getrocknet. Es werden 2,0 g Kpc-Nva-

Tca-NH2 (59% d.Th.) erhalten; F. 183-185 °C; R(^ = 0,47;

Mq = -136,0° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 19

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- ho-moprolinamid Schritt 1:

tert.-Butyloxycarbonyl -L- homoprolinamid 2,29 g (10 mMol) BOC-HPro-OH werden im 30 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzt, dann wird das Gemisch auf —10 °C abgekühlt und 1,3 ml (10 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester werden tropfenweise zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren wird bei -10 °C Ammoniakgas eine halbe Stunde lang in das Reaktionsgemisch geleitet, dann wird das Gemisch 2 Stunden bei 0° bis 5 °C stehen gelassen. Der Niederschlag wird dann abfil-triertj das Filtrat eingedampft und das als Rückstand erhaltene Ol in 30 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 10 ml N Salzsäure zweimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls zweimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl mit n-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (1,95 g) wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther umkristallisiert; es werden 1,78 g BOC-HPro-NH2 (78% d.Th.) erhalten; F. 138-140 °C;

R^= 0,43, [a]^ = -24,85° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für CnH2o03N2 (Mol. Gew. 228,29):

berechnet: C 57,87%, H 8,83%, N 12,27%;

gefunden: C 57,60%, H 8,89%, N 12,11%.

Schritt 2:

L-Homoprolinamid-hydrochlorid 1,6 g (7 mMol) BOC-HPro-NH2 werden in 10 ml Äthylacetat warm gelöst, die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt, der Niederschlag wird mit Äther verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 1,05 g H-HPro-NH2.HCl (91 % d.Th.) erhalten; F. 178-180 °C; R(^ = 0,32, [a]^ = +26,2° (c = 1, in 5 Methanol).

Schritt 3:

L-Norvalyl -L- homoprolinamid-hydrochlorid 0,99 g (6 mMol) H-HPro-NH2.HCl werden in 20 ml 10 DMFA aufgeschlämmt und unter Rühren mit 0,84 ml (6 Mol Triäthylamin und 2,3 g (6 mMol) BOC-Nva-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten Stehen werden weitere 0,84 ml (6 mMol) Triäthylamin dem Reaktionsgemisch zugesetzt und nach einer Stunde Rühren wird das Gemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml N Salzsäure zweimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls zweimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 6 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 10 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Nach 1 Stunde Stehen wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der amorphe Niederschlag verrieben, abfiltriert und im Vakuum, über wasser-25 freiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese

Weise 1,22 g H-Nva-HPro-NH2.HCl (89,5% d.Th.) erhalten;

R^ = 0,12.

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Schritt 4:

L -6- Ketopiperidin -2- carbonyl -L- norvalyl -L- homoprolinamid

1,22 g (5,37 mMol) H-Nva-HPro-NH2.HCl werden in 35 20 ml DMFA gelöst und die Lösung mit 0,75 ml (5,37 mMol) Triäthylamin und 1,7 g (5,5 mMol) Kpc-OPFP versetzt.

Nach 5 Minuten Rühren werden weitere 0,75 ml (5,37 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach weiteren 20 Minuten Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. 40 Der Rückstand wird mit Äther verrieben und das auf diese Weise erhaltene amorphe rohe Produkt (1,8 g) wird auf eine aus 40 g Silicagel hergestellte Säule getragen und mit dem Lösungsmittelgemisch (4) eluiert. Die reines Produkt enthaltende Fraktionen des Eluats werden vereinigt und einge-45 dampft. Es werden 1,11g reines Produkt erhalten, dieses wird in Wasser gelöst, mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lyophilisiert. Es wird auf diese Weise 1,0 g Kpc-Nva-

HPro-NH2 (53% d.Th.) erhalten; R^ = 0,35; [a]^ =

so -44,6° (c = 1, in Essigsäure).

C