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Peptidkomplexe aus desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen
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mit jeweils spezifischen Antigendeterminanten für den Organismus,
aus dem sie gewonnen werden, zur diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen
Anwendung In einer noch unveröffentlichten Anmeldung (1) ist beschrieben, daß ein
Oligopeptidkomplex, der aus Mycobacterium tuberculosis isoliert wird, ein potentes,
für Mycobacterium tuberculosis spezifisches Vollantigen darstellt. Der Oligopeptidkomplex
ist zu diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen Anwendungen geeignet.
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In einer weiteren, noch unveröffentlichten Anmeldung (2) ist beschrieben,
daß ein Oligopeptidkomplex, der aus Bordetella pertussis Bakterien isoliert wird,
ein potentes, für Bordetella pertussis Bakterien spezifisches Antigen darstellt.
Auch dieser Oligopeptidkomplex ist zu diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen
Zwecken geeignet.
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Es wurde nun gefunden, daß gemäß der in diesen beiden Anmeldungen
geschilderten Art Peptidkomplexe aus allen desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen
gewonnen werden können. Die Peptidkomplexe sind Vollantigene, die eine hohe immunologische
Spezifität für die Organismen, aus denen sie gewonnen werden, besitzen.
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Die in den beiden noch unveröffentlichten Anmeldungen beschriebene
Anwendung für diagnostische, therapeutische und prophylaktische Zwecke ist jeweils
spezifisch der gesamten Gruppe dieser Peptidkomplexe zu eigen.
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Unter Peptidkomplexen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die
ein Molekulargewicht von Unter 5000 besitzen.
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Die Peptidkomplexe sind bei neutralen pH-Werten stabil gegen Erhitzen
auf
1000 C in wdßligen Loselgell. Sie sind auch relativ stabil gegen Erhitzen auf 1000
C in 0,1 normaler Essigsäure. Bei der Phenolextraktion nach Westphal (3) geht der
Peptidkomplex in die Phenolphase über. Die Peptidkomplexe werden aus wässrigen Lösungen
durch Zugabe von Terbium III Chlorid bis zu hohen VerdUnnungen gefällt. Die Peptidkomplexe
enthalten Kalzium in relativ fest gebundener Form. Die Peptidkomplexe sind leicht
löslich in Wasser, schwer löslich in Alkohol, Äther und Chloroform.
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Die Isolierung der Peptidkomplexe kann zum Beispiel derart vorgenommen
werden, daß aus den verschiedenen desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen nach
dem von Wilhelm (4) entwickelten Verfahren Ribonucleoproteine dargestellt werden
und diese Ribonucleoproteine einer Hochspannungselektrophorese (z.B. 50 V/ cm) bei
pH 5,7 in 0,1 molarem Eisessig-Pyridin-Puffer untertitft.Der Peptidkomplex kann
nach Elution zum Beispiel mit destilliertem Wasser oder 0,1 molarer Essigsäure von
begleitenden Aminosäuren durch Sephadexfiltration gereinigt werden. Die Herstellung
der erfindungsgemäß zu verwendenden Peptidkomplexe ist jedoch nicht auf bestimmte
Verfahren beschränkt. So kann man Peptidkomplexe zum Beispiel auch erhalten, wenn
man sie aus den spezifischen Ribonucleoproteinen durch Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel oder an anderen Absorbentien trennt. Es ist auch möglich, die spezifischen
Ribonucleoproteine mit Phenol nach Westphal und Mitarbeitern zu extrahieren und
die Peptidkomplexe aus der Phenolphase zu gewinnen. Die aus der Phenolphase gewonnenen
Peptidkomplexe können weiter zum Beispiel durch Filtration über Sephadex gereinigt
werden. Die Peptidkomplexe können nach den bekannten Verfahren der Eiweißchemie
auch synthetisch gewonnen werden. Die Herstellungsverfahren sind selbst nicht Gegenstand
der Erfindung.
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Es war nicht vorauszusehen, daß alle desoxyribonucleinsäurehaltigen
Organismen derart erfindungsgemäße Peptidkomplexe mit spezifischen Antigendeterminanten
für den Organismus, aus dem sie jeweils isoliert werden, enthalten. Mit diesen Peptidkomplexen
kann überraschend sehr gut die verzögerte und humorale Immunitätslage sowohl in
vivo als auch in vitro gemessen werden.
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Es war ebenfalls nicht vorauszusehen, daß die Bestimmung der Immunitätslage
bei Patienten über die verschiedensten bakteriellen
Infektionserreger
hinatssgeht und ztm Beispiel auch Pilzinfektionen umfaßt.
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Es war weiterhin nicht vorauszusehen, daß die Bestimmung der -Immunitätslage
bei Patienten über Infektionserreger hinausgeht und zum Beispiel bei Isolierung
eines Peptidkomplexes aus Synoviamaterial eines an rheumatoider Arthritis erkrankten
Patienten die Erkennung der Immunitätslage bei an rheumatoider Arthritis erkrankten
Patienten ermöglicht.
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Es war ebenfalls nicht vorauszusehen, daß ein spezifischer aus Blasten
einer akuten lymphatischen Leukämie gewonnener Peptidkomplex bei Kontaktpersonen
von an akuter lymphatischer Leukämie erkrankten Kindern verzögerte Immunreaktionen
auslöst.
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Die in den Beispielen angegebenen Teile sind, falls sie nicht ausdrücklich
als Volumenanteile angegeben sind, Gewichtsteile.
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Beispiel 1 Die in den Beispielen zwei bis zehn eingesetzten Peptidkomplexe
können nach folgendem Verfahren gewonnen werden: hitzedenaturierte Bakterien, Pilze,
Pflanzen, menschliches und tierisches Gewebe werden im Ultra-Turrax und Potterhomogenisator
in 0,2 molarem Phosphatpuffer pH 7,2 homogenisiert. Das Homogenisat wird bei 10
000 Umdrehungen fünfzehn Minuten zentrifugiert und der Uberstand dreißig Minuten
mit Phosphatpuffer beladener DEAE-Zellulose gerührt.
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Die DEAE-Zellulose wird drei bis fünf mal mit 0,2 molarem Phosphatpuffer
gewaschen und die Waschlösung jeweils verworfen. Sodann wird die beladene DEAE-Zellulose
in eine Säule gefüllt und mit Phosphatpuffer gewaschen, bis die Extinktion unter
0,1 abgesunken ist. Danach wird mit 0,1 molarer Essigsäure pH 3,2 weiter gewaschen,
bis die Extinktion unter 0,1 abgesunken ist. Danach wird der Essigsäurelösung 3%
NaCl zugefügt und die mit der NaCl-Front ins Eluat erscheinende Ribonucleoproteinfraktion
gesammelt. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser wird die Ribonucleoproteinfraktion
eingeengt und lyophilisiert. Die Ausbeute ist unterschiedlich, sie beträgt für dreißig
Gramm Bakterien und Pilze ungefahr dreißig Milligramm, bei pflanzlichen. tierischen
und menschlichen Geweben ist sie vom Zellgehalt abhängig. Das Ribonucleoprotein
wird dann einer Phenolextraktion
nach Westphal und ítaroeixern
unterzogen. Der Peptidkomplex wird sodann aus der Phenolphase gewonnen. Falls gewünscht,
kann der Peptidkomplex durch eine Hochspannungselektrophorese weiter gereinigt werden.
Der Peptidkomplex wird hierzu auf Whatman Nr.1-Elektrophoresepapier aufgetragen.
Die Elektrophorese erfolgt in 0,1 molarem Eisessig-Pyridin-Puffer pH 5,7 mit 50
V / cm 30 Minuten. Nach Anfärbung von Randstreifen wird die mit Amidoschwarz und
Ninhydrin färbbare Bande ausgeschnitten und mit destilliertem Wasser eluiert.
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Die so eluierten Peptidkomplexe sind in destilliertem Wasser und physiologischen
Salzlösungen sehr gut löslich. Die Peptidkomplexe können über Sephadex und bakteriendichte
Filter ohne Wirkungsveriust filtriert werden.
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Beispiel 2 Die aus den verschiedenen Organismen auf dem im Beispiel
1 beschriebenen Weg isolierten Peptidkomplexe werden zur Erzeugung von spezifischen
Antikörpern an Kaninchen verabreicht. Hierbei werden 10 bis 100 /ug Peptidkomplex
in 0,9 %-iger NaCl gelöst und 1:1 mit Freund'schem Adjuvans emulgiert. Die Dosis
wird zu vier gleichen Teilen in die Pfoten der Tiere injiziert. Nach vierzehn Tagen
werden 10 /ug Peptidkomplex intravenös zur Boosterung verabreicht.
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Das Serum der Tiere wird auf Antikörperbildung im Ouchterlonytest
überprüft. Die Boosterung wird in achttägigen Abständen wiederholt, bis gut sichtbare
Ouchterlonyreaktionen zu beobachten sind. Hierzu genügen meist ein bis drei Boosterinjektionen.
Im Ouchterlonytest wei den die gebildeten Antikörper auf Spezifität überprüft. Die
Uberprufung ergibt, daß die aus verschiedenen Organismen isolierten Peptidkomplexe
spezifische Antikörper hervorrufen. Auffällig ist zum Beispiel bei Peptidkomplexen
aus Bakterien, daß keine Typ-oder Gruppenspezifität besteht.
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Beispiel 3 -Der spezifische aus Streptokokken isolierte Peptidkomplex
wird in 0,9 -iger NaCl gelöst. Bei intracutaner Injektion von 10 bis 100 ng Peptidkomplex
treten bevorzugt bei Patienten mit rheumatischem Fieber und einer akuten, diffusen
Glomerulonephritis verzögerte Hautreaktionen
auf, die sich Im Auftreten
und in ihrer Stärke von Reaktionen gesunder Kontrollpersonen unterscheiden.
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Beispiel 4 Mit dem spezifischen aus Streptokokken isolierten Peptidkomplex
treten im Ouchterlonytest positive Reaktionen mit dem Serum von Patienten mit einem
rheumatischen Fieber und einer akuten diffusen Glomerulonephritis auf. Quantitativ
kann der Antikörperspiee' zum Beispiel mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behring
bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 1ul Serum unterschiedliche Mengen Peptid (zum
Beispiel 10 ng, 100 ng, 1 /ug) gegeben.
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Beispiel 5 Der spezifische aus Escherichia coli isolierte Peptidkomplex
wird in 0,9%-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im
Serum von Patienten, die an einer Colitis ulcerosa erkrankt sind, beobachtet. Bei
gesunden Personen (zum Beispiel Blutspenderseren) werden nur vereinzelt schwache
Reaktionen beobachtet.
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Quantitativ kann der Antikörperspiegel zum Beispiel mit dem Laser-Nephelometer
der Firma Behring bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 /ul Serum unterschiedliche
Mengen Peptid (zum Beispiel 10 ng, 100 ng, 1 /ug) gegeben.
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Beispiel 6 Der spezifische aus Salmonella typhi Bakterien isolierte
Peptidkomplex wird in 0,90/0-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive
Reaktionen im Serum von Patienten beobachtet, die an Typhus erkrankt waren oder
bereits zwei bis drei Wochen an Typhus erkrankt sind.Quantitativ kann der Antikörperspiegel
zum Beispiel mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behang bestimmt werden. Hierzu
werden zu 200 /ul Serum unterschiedliche Mengen Peptid (zum Beispiel 10 ng, 100
ng, 1 /ug) gegeben.
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Beispiel 7 Der spezifische aus Candida albicans Pilzen isolierte
Peptidkomplex wird in 0,996-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive
Reaktionen
im Serum von Patienten beobachtet, die an einer Candida albicans-Infektion erkrankt
sind oder waren. Quantitativ kann der Antikörperspiegel zum Beispiel mit dem Laser-Nephelometer
der Firma Behring bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 lul Serum unterschiedliche
Mengen Peptid (zum Beispiel 10 ng, 100 ng, 1 1ug) gegeben.
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Beispiel 8 Aus Synovia, die durch Operation aus dem entzündeten Gelenk
von Patienten, die an einer rheumatoiden Arthritis erkrankt sina, gewonnen wird,
wird ein Peptidkomplex auf dem im Beispiel 1 genannten Weg gewonnen. Der Peptidkomplex
wird in 0,996-iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden im Serum von an rheumatoider
Arthritis erkrankten Personen positive Reaktionen beobachtet. Quantitativ kann der
Antikörperspiegel zum Beispiel mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behring bestimmt
werden. Hierzu werden zu 200 /ul Serum unterschiedliche Mengen Peptid (zum Beispiel
10 ng, 100 ng, 1 /ug) gegeben.
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Beispiel 9 Aus Blastenzellen von Patienten, die an einer akuten lymphatischen
Leukämie erkrankt sind, wird ein Peptidkomplex auf dem im Beispiel 1 genannten Weg
gewonnen. Zur Kontrolle wird aus normalen Lymphocyten ebenfalls ein Peptidkomplex
gewonnen. Die beiden Peptidkomplexe werden in 0,996-iger NaCl gelöst. 10 ng bis
1 /ug der beiden Peptidkomplexe werden in 0,1 ml Lösung streng intracutan injiziert.
Die Verabreichung erfolgt an der Innenseite der Vorderarme, wobei der Peptidkomplex
aus Blastenzellen Jeweils auf den rechten Arm und der Peptidkomplex aus normalen
Lymphocyten jeweils auf den linken Arm appliziert wird. Als positive Reaktion wird
das Auftreten einer typischen verzögerten Reaktion bezeichnet. Während mit dem aus
normalen Lymphocyten gewonnenen Peptidkomplex keine positiven Reaktionen beobachtet
werden können, verursacht der aus Blasten isolierte Komplex bei einem Teil der Probanden
verzögerte Reaktionen. Die verzögerten Reaktionen lassen eine charakteristische
Verteilung erkennen.
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Sie treten in großer Häufigkeit bei Personen auf, die in Kontakt zu
= akuter lymphatischer Leukämie erkrankten Patienten stehen.
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Beispiel 10 Die spezifischen Peptidkomplexe werden nach der Methode
von Hunter (5) mit 125J gekoppelt. Mit den radioaktiv markierten Peptidkomplexen
werden jeweils für den eingesetzten Peptidkomplex spezifische Radioimmunoassays
durchgeführt.
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Literatur 1. Wilhelm, G.: P 27 17 476.1 2. Wilhelm, G.: P 27 17 475.0
3. Westphal,D., Luderitz,O., Bister, F.: Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol
/ Wasser. Z.Naturforschung 7b (1952), 148 - 155 4. Wilhelm, G.: Über ein aus menschlichen
und tierischen Geweben isoliertes Nucleoprotein mit kollagenfällenden Eigenschaften.
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I. Abtrennung und Charakterisierung des Nucleoproteins.
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Z.Naturforschung 21b (1966) 797-798 5. Hunter, W.M.:Radioimmunoassay
in: Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, Chapter 17. Sec.Edition.
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Blackwell Scientific Publications, Oxford-London-Edinbourgh-Melbourne,
1973