DE69600512T2

DE69600512T2 - Stabilisierte Troponin-Zubereitung für Immunoassays und Verfahren zur deren Herstellung

Info

Publication number: DE69600512T2
Application number: DE69600512T
Authority: DE
Inventors: Robert Marie 92270 Bois Colombes Riochet Denis
Original assignee: Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-13
Publication date: 1999-04-15
Anticipated expiration: 2016-05-14
Also published as: US20010006683A1; FR2734267B1; EP0743522B1; JP3672672B2; US20040033529A1; JPH0921804A; DE69600512D1; ATE169740T1; DK0743522T3; FR2734267A1; CA2176655A1; EP0743522A1; ES2122768T3; CA2176655C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte Troponin-Zubereitung, die als Eichlösung und/oder Kontrolle bei Immunoassays verwendet werden kann, die dazu dienen, Herz- und/oder Skelett-Troponine im Serum oder Plasma des Blutes von Menschen oder Tieren zu bestimmen, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zubereitung.
Es ist bekannt, daß Troponin ein Proteinkomplex der Myofibrillen ist, der aus drei Proteinen besteht, den Troponinen I, T und C. Dieser Proteinkomplex ermöglicht einen Beitrag zur Regulierung der Muskelkontraktion durch Ca²&spplus;-Ionen, indem er mit Myosin und Actin in Wechselwirkung tritt. Genauer ist bekannt, daß, wenn ein Nervenimpuls den Bereich der motorischen Endplatte eines Muskels erreicht, ein Aktionspotential erzeugt wird, welches auf das Sarkoplasmaretikulum übertragen wird. Dieses Ca²&spplus; wird dann in das Cytosol freigesetzt und bindet sich an Troponin C, welches zu einer Verstärkung der Wechselwirkung zwischen Troponin I und Troponin C führt und als Folge davon zu einer Veränderung der Konformation des Troponinkomplexes I, T, C. Es ergibt sich dann eine Freilegung der Actin- Myosin-Wechselwirkungsstellen, was die Kontraktionsbewegung des Muskels ermöglicht.
Wenn der Muskel beschädigt ist, sei es der Herzmuskle im Rahmen eines Myokardinfarkts oder der Skelettmuskel bei längeren physischen Anstrengungen, erscheinen die in dieser Weise freigesetzten Kontraktionsproteine mehr oder weniger schnell in der Blutzirkulation.
So wurde in jüngster Zeit die Bestimmung von Troponin bei der vorbeugenden Diagnose von Myokardinfarkten angestrebt, entweder die von Troponin T in: Circulation, 83 (1991), 902-912 oder die von Troponin I in: Am. Heart J. 110 (1987), 1333- 1344 und Molecular Immunology 29(2), (1992), 271-278. In gleicher Weise wurde die Bestimmung des Herz-Troponins T vorgeschlagen zur Messung des Erfolgs einer thrombolytischen Therapie als Folge eines Myokardinfarkts (Br. Heart J. 71 (1994), 242-248), sowie die Bestimmung des Skelett-Troponins I zur Bestimmung eines Muskelschadens (Abstrakt Nr. 35 der American Association for Clinical Chemistry, 46th National Meeting, New Orleans, 17.-21. Juli 1994). Es ist festzuhalten, daß die Bestimmung der verschiedenen Herz- und Skelett-Troponine heutzutage ein sehr nützliches Mittel ist für die Diagnose von menschlichen und tierischen pathologischen Zuständen.
Es ist gut bekannt, daß die in biologischen Analyselaboratorien durchgeführten Immunoassays es notwendig machen, daß der Lieferant neben den für die Bestimmung erforderlichen Reagenzien (d. h. die gegebenenfalls markierten Antikörper, die Entwicklungsmittel und die Verdünnungslösungen), einen Eichstandard der zu bestimmenden Verbindung, der bei Bedingungen eingesetzt wird, die analog jenen sind, denen die zu untersuchende Probe unterworfen wird, und als Eichstandard zur Berechnung der Ergebnisse und/oder als positive Kontrolle dient, liefert.
Zur Erzeugung eines Eichstandards oder einer Eichlösung und/oder einer Kontrolle der zu untersuchenden Verbindung kann man die genannte Verbindung in gereinigter Form in Form eines gefriergetrockneten Materials (welches von einem Lösungsmittel begleitet wird, in dem die Verbindung vor der Anwendung durch den Benutzer aufgelöst wird) oder in einer anwendungsfertigen Form verwenden.
Da die biologischen Reagenzien instabil sind, werden die Eichlösungen oder Kontrollösungen, die ausgehend von dem gefriergetrockneten Material hergestellt worden sind, in Einheitsdosierungen eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Es hat sich weiterhin gezeigt, daß diese Lösungen bei +4ºC nicht mehr als einige Stunden stabil sind, selbst wenn Protease-Inhibitoren oder antibakterielle Mittel zugesetzt worden sind. Dies macht es notwendig, daß die Benutzer bei der Anwendung ihre Eichlösungen herstellen.
Die dem Stand der Technik angehörende, unter der Nummer FR-A-2 701 954 veröffentlichte Patentanmeldung beschreibt eine stabilisierte Troponin I- oder Troponin T-Zubereitung für Immunoassays, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einer wäßrigen Lösung gebildet ist, die Troponin I oder Troponin T in Mischung mit Troponin C, insbesondere in den Verhältnissen von 1 bis 10 Mol-Äquivalenten Troponin C pro Äquivalent Troponin I oder T, und CaCl&sub2; enthält. Diese Methode ermöglicht die Aufbewahrung von mehr oder weniger verdünnten Eichlösungen von Troponin I oder T während mehrerer Tage bei +4ºC.
Die gemäß Artikel 54(3) EPÜ genannte Patentanmeldung WO 96/33415 beschreibt (auf den Seiten 45 und 46) eine Troponin-Zubereitung, die durch eine gepufferte Lösung des ternären Komplexes von Troponin I, T und C gebildet ist, welche Calcium- und Magnesiumsalze enthalten und einen pH-Wert von 6 bis 9 aufweisen kann.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht einerseits die Herstellung von Eichlösungen oder Kontrolllösungen, die während mehrerer Tage bei +4ºC stabil sind, und andererseits erhebliche Vorteile im Hinblick auf die Kosten ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Sie ermöglicht in der Tat eine einfache und praktische Anwendung der Lösung zur Bestimmung eines oder gegebenenfalls gleichzeitig mehrerer Parameter. Die Anmelderin hat in überraschender Weise gefunden, daß der durch das Vermischen von Troponin I, Troponin T und Troponin C erhaltene ternäre Komplex in Lösung stabil ist und daß die in dieser Weise erhaltenen stabilisierten Troponinlösungen, deren Spezifität und Empfindlichkeit im Vergleich zu Lösungen der gereinigten Bestandteile unverändert sind, zur Eichung und/oder Kontrolle bei diagnostischen in vitro-Tests zur Bestimmung eines oder mehrerer Troponine, erforderlichenfalls gleichzeitig verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft daher eine stabilisierte Troponin-Zubereitung, welche in wäßriger Lösung Troponin I, Troponin T und Troponin C und positive zweiwertige Ionen enthält, wobei die Troponine 1. T und C in Form des ternären Komplexes I-T-C vorliegen und der pH-Wert der Lösung zwischen 5,5 und 6 liegt, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist.
Die Troponine I, T und C können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein und können insbesondere vom Herzen und/oder den Muskeln stammen.
Man erhält die Troponine I, T und C entweder ausgehend von einem Extrakt des Homogenisats vom Herzen oder vom Muskel oder ausgehend von einer Mischung der zuvor gereinigten drei Troponine I, T und C.
Es ist aus Gründen der Herstellungskosten deutlich bevorzugt, die erfindungsgemäßen stabilisierten Zubereitungen von Troponin I, T und C ausgehend von einem rohen Herz- oder Muskelextrakt herzustellen.
Man kann in Abhängigkeit von der Herkunft der Mischung der drei Troponine mehr oder weniger unterschiedliche Mengen der genannten Troponine in der Zubereitung erhalten. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Lösungen eine äquimolare Menge von Troponin I, Troponin T und Troponin C, um eine maximale Menge der gebildeten ternären I-T-C-Komplexe zu erhalten.
Der ternäre I-T-C-Komplex ist die Grundlage der Stabilität der erfindungsgemäßen Troponin-Zubereitung. In Abhängigkeit von dem Verfahren zur Herstellung der Troponine kann man darüber hinaus positive zweiwertige Ionen, insbesondere von Calcium oder Magnesium, welche in Form von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zugeführt werden können, zugeben, um die Proteine noch weiter gegeneinander zu stabilisieren.
Die Konzentration der Troponine I, T und C in den erfindungsgemäßen Lösungen entspricht jener, die im allgemeinen bei den Immunoassays angewandt wird, d. h. sie kann zwischen 0,01 ng/ml und 1 ug/ml und vorzugsweise zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml liegen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße stabilisierte Zubereitung in bevorzugter Weise eine Konzentration an CaCl&sub2; oder MgCl&sub2;, welche der 10²- bis 5 · 10&sup6;-fachen Gewichtsmenge des I-T-C-Troponinkomplexes entspricht, und liegt zwischen 100 uM und 100 mM. Bevorzugt enthält die er findungsgemäße Zubereitung 2 mM CaCl&sub2;.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die bevorzugte, stabilisierte erfindungsgemäße Zubereitung einen Proteinzusatz von 0,2 bis 2%, vorzugsweise von 0,4 bis 2%. Dieser Proteinzusatz wird beispielsweise durch Rinderalbumin, Kalbsfötenserum oder normalem menschlichem Serum gebildet. Es ist weiterhin bevorzugt, normales menschliches Serum in einer Menge von 10% in der Zubereitung enthalten zu haben, was einem Proteinzusatz im Bereich von 0,8% entspricht.
Als Puffer kann man beispielsweise eine Imidazol-Pufferlösung, eine Kaliumphosphat-Pufferlösung oder eine Natriumsuccinat-Pufferlösung verwenden. Es ist bevorzugt, eine 0,1 M Natriumsuccinat-Pufferlösung einzusetzen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin eine pulverförmige stabilisierte Troponin- Zubereitung, vorzugsweise in gefriergetrockneter Form, wie sie in den Ansprüchen 8 und 9 definiert ist.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zur Eichung und/oder Kontrolle von Troponin I, Troponin T oder Troponin C oder zwei oder drei der Troponine I, T und C in in vitro-Diagnosetests verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Troponin-Zubereitung, welches darin besteht:
- entweder eine Extraktion von Troponin I, Troponin T und Troponin C ausgehend von zerkleinertem menschlichem oder tierischem Herzen oder Muskel durchzuführen, wobei die Extraktion in Gegenwart von Antiproteasen und positiven zweiwertigen Ionen, insbesondere von Calcium oder Magnesium erfolgt, welche in Form von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zugeführt werden können,
- gegebenenfalls den in der obigen Weise erhaltenen Extrakt gegen einen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 5,5 und 6, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist, und Antiproteasen und positive zweiwertige Ionen enthält, insbesondere jene von Calcium und Magnesium, welche in Form von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zugeführt werden können, zu dialysieren,
- die in der obigen Weise erhaltene Lösung der Troponine I, T und C in einem Puffer mit einem pH-Wert, der vorzugsweise zwischen 5,5 und 6 liegt, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist, und der Antiproteasen, einen Proteinzusatz und positive zweiwertige Ionen, insbesondere von Calcium und Magnesium enthält, welche in Form von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zugeführt werden können, zu verdünnen, um eine geeignete Konzentration an Troponin I, T und/oder C zu erhalten,
- oder die gereinigten Troponine I, T und C in äquimolaren Mengen in einem Puffer mit einem pH-Wert, der vorzugsweise zwischen 5,5 und 6 liegt, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist, und einen Proteinzusatz und positive zweiwertige Ionen enthält, insbesondere jene von Calcium und Magnesium, die in Form von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zugeführt worden sind, zu vermischen.
Die Extraktion ausgehend von einem Homogenisat oder verriebenem Material von Herzen oder von Muskeln nach dem erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren ermöglicht den Erhalt von stabilen Zubereitungen, welche dazu verwendet werden können, ein zu analysierendes Material, wie Herz-Troponin I oder Herz-Troponin T zu bestimmen oder dazu ausgehend von einer solchen Zubereitung zwei zu analysierende Materialien, beispielsweise die Herz-Troponine I und T zu bestimmen.
Im folgenden werden Beispiele zur Durchführung der Erfindung und die Ergebnisse von Vergleichsversuchen bezüglich der Stabilität erläutert.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen stabilisierten Troponin-Zubereitungen wird in den folgenden Beispielen erläutert. In diesen Beispielen sind die Konzentrationen in Abhängigkeit von der Endkonzentration der herzustellenden Lösung angegeben.
Vor der Durchführung der Methode zur Herstellung der stabilisierten Zubereitungen bereitet man die folgenden Puffer:

EXTRAKTIONSPUFFER:

- Harnstoff 9 M
- Tris HCl 75 mM, pH 8
- CaCl&sub2; 1 mM
- Mercaptoethanol 60 mM
- Antiproteasen

DIALYSE-PUFFER:

- Natriumsuccinat 0,1 M, pH 6
- CaCl&sub2; 2 mM
- Antiproteasen

VERDÜNNUNGSPUFFER:

- Natriumsuccinat 0,1 M, pH 6
- normales menschliches Serum (NMS) 10%
- CaCl&sub2; 2 mM
- Antiproteasen
Die in den drei obengenannten Puffern verwendeten Antiproteasen können beispielsweise solche sein, die aus SBTI (Sigma T9003), TLCK (Sigma T7254), Pepstatin A (Sigma P4265). PMSF und Anticathepsin ausgewählt sind.
Die Extraktionsmethode ausgehend von dem Herzen oder dem Muskel ist genauer in American Heart Journal, Clinical Investigations, Juni 1987, Band 113, Nr. 6, "Cardiac-specific Troponin I Radioimmunoassay in the Diagnosis of Acute Myo cardial Infarction", Seite 1334 beschrieben.

Beispiel 1: Herstellung einer menschlichen Herz-Troponin I-T-C-Zubereitung

Man extrahiert die Mischung der Troponine I, T und C ausgehend von einem Gramm des zerkleinerten menschlichen Herzens in 30 ml des oben beschriebenen Extraktionspuffers. Man rührt die Mischung während 15 Minuten mit Hilfe eines Magnetrührers, bevor man während 20 Minuten bei 10000 g (bei +10ºC) zentrifugiert. Man gewinnt die überstehende Flüssigkeit und dialysiert sie gegen den Dialysepuffer während zwei Stunden und dann über Nacht bei +4ºC unter Wechseln des Puffers. Man bewirkt dann eine Verdünnung auf das 1/50ste der erhaltenen Lösung mit Hilfe des Verdünnungspuffers.
Man erhält eine Zubereitung, welche 63 ng/ml Troponin I enthält.

Beispiel 2: Herstellung einer menschlichen Herz-Troponin I-T-C-Zubereiteung

Man wendet die in Beispiel 1 beschriebene Methode an, dialysiert jedoch die überstehende Flüssigkeit nach der Extraktion nicht.
Man erhält eine Zubereitung, die Troponin I in einer Konzentration von 82 ng/ ml enthält.

Beispiel 3: Herstellung einer menschlichen Herz-Troponin I-T-C-Zubereitung

Man wendet die in Beispiel 1 beschriebene Methode an, gibt jedoch zu dem Extraktionspuffer, dem Dialysepuffer und dem Verdünnungspuffer 4 mM MgCl&sub2; zu. Man erhält eine Zubereitung, welche Troponin I in einer Konzentration von 31 ng/ml enthält.

Beispiel 4: Herstellung einer menschlichen Herz-Troponin I-T-C-Zubereitung

Man wendet das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren an, gibt jedoch zusätzlich 4 mM MgCl&sub2; zu dem Extraktionspuffer und dem Verdünnungspuffer. Man erhält eine Zubereitung, die Troponin I in einer Konzentration von 46 ng/ml enthält.

Beispiel 5: Herstellung einer Troponin I-T-C-Zubereitung, ausgehend von gereinigten Troponinen

Man gibt zu 960 ul eines Natriumsuccinat-Puffers (0,1 M, pH 6), der 10% normales menschliches Plasma und 222 ug CaCl&sub2;, 2H&sub2;O enthält, 10 ul einer Troponin I- Lösung mit einer Konzentration von 10 ug/ml, 10 ul einer Troponin C-Lösung mit einer Konzentration von 10 ug/ml und 20 ul einer Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 5 ug/ml. Es ist bevorzugt, diese Maßnahmen in einem sterilen Medium durchzuführen unter Verwendung sterilisierter Lösungen von Troponin I, Troponin T und Troponin C, beispielsweise indem man sie durch ein Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 um führt.
Die erhaltene Lösung mit einer Konzentration an Troponin I von etwa 100 ng/ ml, an Troponin T von 100 ng/ml und an Troponin C von 100 ng/ml wird anschließend zur Herstellung einer Verdünnungsreihe von 0,1 bis 50 ng/ml Troponin I in ei nem Aufbewahrungspuffer (Verdünnungspuffer, der mit antibakteriellen Mitteln bis zu einer Endkonzentration von 1% versetzt worden ist) verwendet. Man kann entsprechende Verdünnungsreihen mit den Troponinen T und C herstellen.
Zur Durchführung von Stabilitäts-Vergleichstests mit den gereinigten Troponin-Zubereitungen verteilt man die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Zubereitungen wie folgt:
- Steril in sterilen Nalgene®-Fläschchen für die Eichlösungen, die in Form von Lösungen verwendet werden,
- steril in sterilen Glasfläschchen für die Präparate, die gefriergetrocknet werden.
Die erfindungsgemäßen stabilisierten Troponin-Zubereitungen können auch ausgehend von Muskeln menschlichen Ursprungs oder Herzen oder Muskeln tierischen Ursprungs hergestellt werden unter Verwendung der in der obigen Literaturstelle beschriebenen Methode (American Heart Journal, Clinical Investigations, Juni 1987, Band 113, Nr. 6, "Cardiac-specific Troponin-I Radioimmunoassay in the Diagnosis of Acute Myocardial infarction", Seite 1334).

Durchführung der Stabilitäts-Vergleichstests

Ausgehend von den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen konzentrierten Lösungen bereitet man Troponin-Lösungen, welche eine Konzentration an Troponin I im Bereich von 1 ng/ml enthalten. Hierzu verdünnt man die Lösungen in geeigneter Weise in einem Aufbewahrungspuffer (Verdünnungspuffer unter Zusatz von Kathon® bis zu einer Endkonzentration von 1%). Das von der Firma Haas vertriebene antibakterielle Mittel Kathon® umfaßt 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on (1,5%).
Für jedes Beispiel verfügt man über Fläschchen mit flüssigem und mit gefriergetrocknetem Material.
- Die das gefriergetrocknete Material enthaltenden Fläschchen werden rehydratisiert, um dann ihre Stabilität nach der Wiederherstellung zu überprüfen. Der Tag 0 (T0) entspricht dem Rehydratationstag. In der Tabelle I sind die Fläschchen als Fl. Lyoph. bezeichnet.
- Die flüssige Proben enthaltenden Fläschchen werden bei 4ºC aufbewahrt und bezüglich ihrer Stabilität überprüft. Der Tag 0 (T0) entspricht dem Herstellungstag. In der Tabelle II sind diese Fläschchen als Fl. bezeichnet.
Man bewirkt eine Qualitätskontrolle mit einem gefriergetrockneten Referenzprodukt, welches gereinigtes Troponin I in normalem menschlichem Serum enthält (bezeichnet als "Kontrolle" in der Tabelle I). Diese Kontrolle wird getrennt hergestellt und verwendet.
Bei jedem Test werden die Punkte der hergestellten Verdünnung an einer Eichlösung von gefriergetrocknetem Troponin I geprüft, welche nach der in der französischen Patentanmeldung FR-A-2 701 954 beschriebenen Methode hergestellt worden ist (5 Moläquivalente Troponin C pro Äquivalent des Troponins I und CaCl&sub2;). Zu Vergleichszwecken überprüft man die Stabilität einer flüssigen Lösung von Troponin I, die nach der in der französischen Patentanmeldung FR-A-2 701 954 beschriebenen Methode hergestellt worden ist, bei 4ºC. Diese Vergleichslösung ist in den Tabellen I und II als "FR-A-2 701 954" bezeichnet.
Die Tabellen I und II verdeutlichen die Ergebnisse der Stabilität der erfindungsgemäßen Zubereitungen in gefriergetrockneter und in flüssiger Form im Vergleich zu den oben beschriebenen Vergleichszubereitungen (wobei die Bestimmung der Konzentration in ng/ml angegeben ist).
Die Bestimmung der Troponine erfolgt nach der in der französischen Patentanmeldung FR-A-2 701 954 beschriebenen Methode.
Es ist festzuhalten, daß die Anfangskonzentrationen der gemessenen Lösungen nicht identisch sind. Aufgrund dieser Tatsache wurden bei der Bewertung der Stabilität die im Verlaufe der Zeit beobachteten Schwankungen der Konzentration ein und derselben Lösung berücksichtigt. TABELLE I TABELLE II
Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß die erfindungsgemäßen Zubereitungen der Beispiele 1 bis 4 eine Stabilität besitzen, die um einen Monat größer ist (T+30) als die des Kontrollmaterials der FR-A-2 701 954. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sind weiterhin im Vergleich zu den Kontrollzubereitungen auf der Grundlage von gereinigtem Troponin I deutlich stabiler, welche nur eine Stabilität von einigen Stunden bei 4ºC aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen in deutlicher Weise, daß die erfindungsgemäßen Troponin I-T-C-Zubereitungen eine erhöhte Stabilität besitzen und sowohl als Eichmaterialien und/oder zur Kontrolle bei Immunoassays eingesetzt werden können, die darauf abzielen, eines oder mehrere Troponine vom Herzen und/oder vom Skelett im Serum oder dem Plasma des Blutes von Menschen oder Tieren zu bestimmen.

Claims

1. Stabilisierte Troponin-Zubereitung für Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß sie in wäßriger Lösung Troponin I, Troponin T und Troponin C und positive zweiwertige Ionen enthält, wobei die Troponine I, T und C in Form des ternären Komplexes I-T-C vorliegen und der pH-Wert der Lösung zwischen 5, 5 und 6 liegt, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des ternären Komplexes I-T-C zwischen 0,01 ng/ml und 1 ug/ml liegt und sie CaCl&sub2; in einer Konzentration zwischen 100 um und 100 mM enthält.

3. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Proteinzusatz von 0,2 bis 2 Gew.-% aufweist.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteinzusatz in Form von normalem menschlichem Serum mit einer Konzentration von 10 Vol.-% vorliegt.

5. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Troponin I, Troponin T und Troponin C durch Extraktion von zerkleinerten menschlichen oder tierischen Herzen erhalten worden sind.

6. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Troponin I, Troponin T und Troponin C durch Extraktion von zerkleinerten menschlichen oder tierischen Muskeln erhalten worden sind.

7. Zubereitung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Gegenwart von β-Mercaptoethanol durchgeführt worden ist.

8. Pulverförmige Zubereitung erhalten durch Trocknen einer wäßrigen Zubereitung nach einem der vorhergenden Ansprüche, enthaltend Troponin I, Troponin T, Troponin C, einen Proteinzusatz von 0,2 bis 2% und positive zweiwertige Ionen, wobei die pulverförmige Zubereitung, wenn sie erneut in Lösung gebracht worden ist, die Stabilität der wäßrigen Zubereitung nach einem der vorhergenden Ansprüche aufweist.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie in gefrierge trockneter Form vorliegt.

10. Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Erzeugung von Eichkurven und/oder zur Überprüfung von in-vitro-Diagnosetests für Troponin I, Troponin T oder Troponin C oder zwei oder drei der Troponine I, T und C, wobei die Troponine vom Herz oder dem Skelett her stammen.

11. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man:

- eine Extraktion von Troponin 1. Troponin T und Troponin C ausgehend von zerkleinertem menschlichem oder tierischem Herzen oder Muskel durchführt, wobei die Extraktion in Gegenwart von Antiproteasen und positiven zweiwertigen Ionen erfolgt:

- gegebenenfalls den in der obigen Weise erhaltenen Extrakt gegen einen positive zweiwertige Ionen enthaltenden Puffer dialysiert: und

- die in der obigen Weise erhaltene Lösung der Troponine I, T und C in einem Puffer verdünnt, welcher Antiproteasen, einen Proteinzusatz und positive zweiwertige Ionen enthält, um eine geeignete Konzentration an Troponin I, T und/oder C und einen pH-Wert zwischen 5,5 und 6, wobei der Wert von 6 ausgeschlossen ist, zu erhalten.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in Gegenwart von β-Mercaptoethanol bewirkt.