DE2008493B2

DE2008493B2 - Hämatologische Kontrollflüssigkeit

Info

Publication number: DE2008493B2
Application number: DE2008493A
Authority: DE
Inventors: Anthony Elmhurst N.Y. Decasperis (V.St.A.)
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1969-02-25
Filing date: 1970-02-24
Publication date: 1979-01-25
Also published as: ES376863A1; DE2008493C3; FR2035733A5; SE376485B; GB1215662A; US3574137A; DE2008493A1

Description

Die Erfindung betrifft eine hämatologische Kontrollflüssigkeit zur Verwendung bei hämatologischen Diagnosen, insbesondere als Bezugskontrollmittel für eine Reihe von hämatologischen Routinebestimmungen.

Bisher bestand in der Hämatologie ein Mangel an stabilen Kontrollmitteln für hämatologische Bestim- v-> mungen. Mit dem Aufkommen von automatisierten Vorrichtungen, die in der Lage sind, hämatologische Mehrfachbestimmungen durchzuführen, entwickelte sich ein Bedarf an Bezugsproben für manuelle und maschinelle Analysen. <>"

In der US-PS 34 06 121 wird eine stabile Suspension roter menschlicher Blutzellen zur Verwendung als Zählstandard beschrieben, worin ein Stabilisierungsmedium verwendet wird, das im wesentlichen aus einer Osmiumtetraxid enthaltenden Kochsalzlösung besteht. ■ Eine solche Flüssigkeit kann jedoch nicht als Bezugskontrolle zum Zählen von weißen menschlichen Blutzellen dienen.

In der US-PS 3412 037 wird ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Standards zur Kalibrierung einer Blutzählapparatur beschrieben, worin das Stabilisierungsmittelmedium eine Kochsalzlösung von Hefe ist Hefe ist jedoch ein blutfremdes Material, während man bestrebt ist, Bezugskontrollen zu verwenden, die möglichst der Zusammensetzung von normalem, menschlichem Blut entsprechen.

Aufgabe der Erfindung war es, eine stabilisierte hämatologische Kontrollflüssigkeit für Mehrfachanalysen zu schaffen, mit der auch weiße Blutzellen bestimmt werden können, die annährend der Zusammensetzung von normalem, menschlichem Blut entspricht und praktisch keine blutfremden Mittel enthält

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine hämatologische Kontrollflüssigkeit mit den Merkmalen gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1.

Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen hämatologischen Kontrollflüssigkeit sind in den Patentansprüchen 2-8 beschrieben.

Durch die Erfindung wird ein stabiles Kontrollmittel für Mehrfachanalysen geschaffen, das in einem einzigen Mittel Bezugskontrollen zum Zählen von roten und weißen Blutzellen, zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes und zur Hämatokritbestimmung vereinigt und das eine mathematische Berechnung des mittleren Volumens, der mittleren Hämoglobinkonzentration und des mittleren Hämoglobinwertes der Blutkörperchen ermöglicht

Die erfindungsgemäße hämatologische Kontrollflüssigkeit besteht in einer stabilen Zellsuspension, die annährend der Zusammensetzung von normalem, menschlichen Blut entspricht. Dagegen hat mit Oxal- oder Zitronensäure behandeltes menschliches Blut nur eine begrenzte Lagerstabilität Die roten Blutzellen hämolysieren allmählich und verändern sich in Größe und Gestalt. Desgleichen erfahren weiße Blutzellen degenerierende Veränderungen. Die weißen Blutzellen des Menschen sind für Kontrollzwecke nicht geeignet, besonders nicht in Gegenwart roter Blutzellen, da sie nicht beständig sind und ein Lysozym-Enzym ausscheiden, das die roten Blutzellen angreift Rote Blutzellen von Vögeln hingegen sind größer als die menschlichen roten Blutzellen und haben etwa die Form und Größe der menschlichen weißen Blutzellen. Es zeigte sich, daß rote Blutzellen von Geflügel wie Gänse, Hühner, Enten und vorzugsweise die roten Blutzellen des Truthahns in Form und Größe den menschlichen weißen Blutzellen am ähnlichsten sind und sich für das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung mit Tannin (tanning process) seht gut eignen. Diese stabilisierten »simulierten« weißen Blutzellen sind ein guter Ersatz für menschliche weiße Blutzellen in dem erfindungsgemäßen Kontrollprodukt.

Es wurde gefunden, daß frische, menschliche rote Blutzellen, die durch Suspension in menschlichem Plasma oder Serum mit einem Zusatz an metabolischem Konservierungsmittel stabilisiert sind, brauchbare rote Blutzellen als Bestandteil für das erfindungsgemäße Gemisch darstellen. Plasma oder Serum liefern einige Elektrolyte und Proteine, die für die metabolischfc Stabilität der roten Blutzellen erforderlich sind. Ausgewählte Purine oder Pyrimidine können als zusätzliches Konservierungsmittel zugesetzt werden. Die nicht mit Tannin stabilisierten roten Blutzellen können vor der Bestimmung der Zahl der weißen Blutzellen und zur anschließenden Hämoglobinbestimmung sehr leicht hämolysiert werden.

Suspensionen von menschlichen roten Blutzellen und »simulierten« weißen Blutzellen werden in einem solchen Verhältnis gemischt, daß die endgültige Zahl der roten und weißen Blutzellen, der Hämoglobingehalt und das Ergebnis der Hämatokritbestimmung in den für menschliches Blut als normal angesehenen Bereich fallen. _t

Im menschlichen Blut liegt die Zahl der roten Blutzellen normalerweise im Bereich von

4 000 000-5 000 000 Zellen/mm³ und die Zahl der weißen Blutzellen zwischen 5000 und 10 000 Zellen/ mm³. Der Hämoglobingehalt beträgt normalerweise 12-16 g/100 ml. Der Begriff »Hämatokrit« bedeutet das Verhältnis des Volumens der verdichteten (packed) roten Blutzellen zum Volumen des gesamten Blutes. Das normale Verhältnis ist beim Menschen etwa 45%. Das mittlere Volumen der Blutkörperchen ist das Verhältnis des Voäiimens der verdichteten roten Blutzellen in ml/1 Blut zu der Zahl der roten Blutzellen in Million pro m³. Die mittlere Hämoglobinkonzentration der Blutkörperchen ist ein Index für das mittlere oder durchschnittliche Gewicht des Hämoglobins pro 100 ml der verdichteten roten Blutzellen in Prozenten. Der mittlere Hämoglobinwert ist das Verhältnis des Hämoglobingehalts in g/l zu der Anzahl der roten Blutzellen in Million pro mm³.

Es ist offensichtlich, daß ein Kontrollprodukt auf Vergleichsbasis genau das anzeigen muß, woraus eine Versuchsblutprobe in bezug auf die vorstehen 1 beschriebenen Bestimmungen besteht. Es ist weiterhin offensichtlich, wie wichtig es ist, daß das Kontrollprodukt eine Nachbildung unbehandelter Zellen ist. Wenn ein Kontrollprodukt beispielsweise Zellen von wesentlich verschiedener Größe enthält, sind die Versuchsergebnisse ungenau, wenn nicht vollkommen bedeutungslos. Die nach dem hier beschriebenen Verfahren behandelten Zellen liefern ein ausgezeichnetes Kontroll- und Ausgleichsystem, das bei hämatologischen Bestimmungen unbedingt erforderlich ist.

Im folgenden wird zur Erläuterung der Erfindung ein Beispiel für die Herstellung ei.ier hämaiologischen Kontrollflüssigkeit beschrieben.

Der nachstehend verwendete Begriff »Salzlösung« kann eine der folgenden drei Lösungen bedeuten: eine 0,9 gew.-°/oige wäßrige Natriumchloridlösung, die als »Lösung A« bezeichnet wird; eine 0,45%ige wäßrige Natriumchloridlösung, genannt »Lösung B« oder eine gepufferte Salzlösung (Lösung C). Bei der Herstellung der »simulierten« weißen Blutzellen als Kontrollsubstanz ist es wichtig, daß die 0,45%ige Lösung (Lösung B) verwendet wird, weil bei dieser Konzentration die gewöhnlich ovale Form der roten Blutzellen von Geflügel in vorteilhafter Weise in eine mehr runde Form, wie sie die menschlichen weißen Blutzellen aufweisen, umgewandelt wird.

Die erste Stufe des Verfahrens zur Stabilisierung der roten Blutzellen von Geflügel besteht darin, daß die roten Blutzellen in der Salzlösung zu einer Suspension mit einer Konzentration bis zu 50 Vol.-% suspendiert werden Obwohl eine Konzentration von 50% brauchbar ist, wird vorzugsweise eine Konzentration von etwa

5 bis 10 Vol.-%, insbesondere von 8%, verwendet. Diese Suspension wird mit einem gleichen Volumen einer 1-bis 3 gew.-%igen Lösung von QuecksilberfllJ-chlorid in Salzlösung gemischt.

Die zweite Stufe besteht aus einem mindestens 12stündigem, vorzugsweise etwa 19- bis 20stündigen Erhitzen des entstandenen Gemisches bei 37⁰C. Die festen Stoffe werden durch Zentrifugieren und Abtrennen gewonnen und anschließend erneut in Salzlösung zu einer 2- bis 6%igen und vorzugsweise 4%igen Suspension suspendiert.

In der dritten Stufe wird die vorstehend beschriebene Suspension unter sorgfältigem Mischen mit einem gleichen Volumen einer 0,0025%igen (Gewicht/Volumen) Lösung von wäßrigem Tannin in Salzlösung vereinigt; anschließend wird das entstandene Gemisch inkubiert und das feste Gemisch durch Zentrifugieren ίο und Abtrennen gewonnen. Die Tannin enthaltende Salzlösung ist eine gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 und ist die vorstehend erwähnte »Lösung C«. Sie besteht aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengenverhältnissen (pro Liter):

0,9%ige Salzlösung 500 ml

0,15molare Dinatriumphosphatlösung 385 ml
0,15molare Kaliumphosphatlösung 115 ml

Die stabilisierten Zellen werden mehrmals mit Salzlösung gewaschen und anschließend in steriler Alsever-Lösung rekonstituiert.

Die Herstellung der Suspension der menschlichen roten Blutzellen wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt Rote Blutzellen von jeder Blutart können dafür verwendet werden. Jedoch wird vorzugsweise die Blutgruppe 0 verwendet, da sich für diese Gruppe leicht Spender finden lassen. Das in einer antikoagulierend wirkenden sauren Citrat-Dextroselösung gesammelte Blut der Gruppe 0 wird zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und beiseite gestellt, die Pufferschicht der weißen Blutzellen entfernt und verworfen. Die verdichteten roten Blutzellen werden mehrmals mit Alsever-Lösung gewaschen, in Alsever-Lösung rekonstituiert und bei 2 - 8° C gelagert.

Das für die endgültige Suspension der menschlichen roten Blutzellen verwendete resuspendierende Medium wird aus einem defibrinierten Plasma hergestellt, das mit den suspendierten menschlichen roten Blutzellen serologisch verträglich ist, d. h. Blutzellen der Gruppe A mit Plasma der Gruppe A, Blutzellen der Gruppe B mit Plasma der Gruppe B und Blutzellen der Gruppe 0 mit Plasma der Gruppe 0. Defibriniertes Plasma der Gruppe AB (fehlende Antikörper A und B) ist verträglich mit roten Blutzellen der Gruppe A, B und 0. Die

π überstehende Plasmaflüssigkeit wird durch Behandlung mit Rinderthrombin defibriniert und anschließend im Verhältnis 1 :3 mit Alsever-Lösung verdünnt.

Zur weiteren Stabilisierung des aus frischen Blutzellen bestehenden Bestandteils der endgültigen Zellsus-

)(i pension wird das suspendierende Medium mit einem Surin oder Pyrimidin als metabolischem Konservierungsmittel (metabolic preservative) in solcher Menge versetzt, daß eine Endkonzentration von etwa 34-35 mg pro ml der Zellsuspension erhalten wird. Ein

>■> besonders wirksames Konservierungsmittel ist Adenin (6-Aminopurin oder ein pharmazeutisch verträgliches Säure-Additionssalz, hergestellt von Mann Research Laboratories, Inc., New York, N. Y.).

Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren

> Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In einem wäßrigen sauren Citrat-Dextrose-Antikoagulant gesammeltes Blut der Gruppe 0 wurde unter sterilen Bedingungen mit 200 Upm 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde vorsichtig abgesaugt, wobei darauf geachtet wurde, daß in dem Grenzbereich zwischen den roten Zellen und der

überstehenden Flüssigkeit keine roten Zellen oder die weiße Pufferschicht in die überstehende Flüssigkeit abgezogen wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur nachstehend beschriebenen Verdünnung mit Alsever-Lösung und Verwendung als resuspendierendes Mittel aufbewahrt

Die Pufferschicht (weiße Blutzellen) wurde vorsichtig über den verdichteten roten Blutzellen entfei nt, wobei gegebenenfalls eine dünne Schicht der roten Zellen mit abgezogen wird. Die verdichteten roten Zellen wurden zweimal mit Alsever-Lösung gewaschen, zentrifugiert und bei 2—8° C bis zum Mischen mit stabilisierten »simulierten« weißen Blutzellen gelagert

Beispiel II _|5

Rote Blutzellen von Geflügel, vorzugsweise eines Truthahns, wurden viermal mit Salzlösung (Lösung A) gewaschen (wobei sie nach jedem Waschen 20 Minuten bei 3300 Upm zentrifugiert wurden; und nach dem letzten Waschen zu einer 8vol.%igen Suspension in Salzlösung (Lösung A) resuspendiert 100 ml dieser 8%igen Suspension wurden mit 100 ml einer 1 gew.%igen Lösung von Quecksilber(II)-chlorid in Salzlösung (Lösung A) versetzt; die erhaltene Suspension wurde sorgfältig gemischt Anschließend wurde sie 19 Stunden bei 37°C inkubiert, viermal mit destilliertem Wasser gewaschen (obei sie nach jedem Waschen 5 Minuten bei 1200 upm zentrifugiert wurde) und in Salzlösung (Lösung A) zu einer 4vol.°/oigen Suspension resuspendiert. Diese 4%ige Suspension wurde mit 3d einem gleichen Volumen einer 0,0025%igen (Gewicht pro Volumen) Lösung von Tannin in gepufferter Salzlösung (Lösung C) versetzt und das entstandene Gemisch wurde sorgfältig gemixt 30 Minuten bei 50° C inkubiert, zentrifugiert und dreimal mit destilliertem J5 Wasser gewaschen.

Beispiel III

Das überstehende Plasma, das aus dem in einem wäßrigen sauren Citrat-Dextrose-Antikoagulant ge- ■«> sammelten Blut der Gruppe 0 erhalten wurde, wurde im Verhältnis 1:3 mit Alsever-Lösung verdünnt. Das verdünnte Plasma wurde unter Zusatz von Rinderthrombin (hergestellt von Parke-Davis % Co, Detroit, Michigan) in einer Konzentration von 1 Einheit/ml defibriniert und 1 Stunde bei 37° C inkubiert Das klumpige Material wurde heftig geschüttelt und die Klumpen aufzubrechen und durch ein Filter (Whatman Nr. 50), das sich auf einem Büchner-Trichter über einer Saugflasche befand, filtriert Adeninsulfat wurde in einer Konzentration von 70 mg/100 ml zugesetzt; zur Beschleunigung der Auflösung wurde das Gemisch auf 37°C erhitzt; anschließend wurde die Lösung nacheinander durch Filterkörper mit einer Porengröße von 0,45 und 0,22 Milliporen (0,45 und 0.22 Millipore filter pads) filtriert

Beispiel IV

Die Arbeitsweise von Beispiel III wurde wiederholt, wobei das Plasma der Gruppe 0 durch Plasma der Gruppe AB ersetzt wurde.

Beispiel V

Die nach Beispiel II hergestellten »simulierten« weißen Blutzellen wurden in steriler Alsever-Lösung bis zu einem Hämatikritwert von etwa 24% rekonstituiert. Diese I -ösung enthält etwa 750 000- 800 000 Zellen/mm³. Zwei ml dieser Suspension wurden unter Zusatz von 100 ml des nach Beispiel III oder IV hergestellten resuspendierenden Mittels weiter verdünnt.

Ein Volumen der nach Beispiel 1 hergestellten, verdichteten menschlichen Blutzellen der Gruppe 0 (etwa 90% Hämatokrit) wurde mit einem gleichen Volumen der verdünnten Suspension der »simulierten« weißen Blutzellen versetzt

Die als Endprodukt erhaltene Zellsuspension mit einem Gehalt von etwa 34 —35 mg Adenin pro 100 ml wies etwa 4 000 000-5 000 000 rote Blutzellen pro mm³, 5000-10 000 weiße Blutzellen pro mm³,12-16 g Hämaglobin pro 100 ml und 43-47% Hämatokrit auf.

Aliquote Teile (2,5 ml) der Endsuspension in Glasfläschchen verteilt hielten sich bei Lagerung bei 2-8° C etwa 4 Wochen.

Claims

Patentansprüche:

1. Hämatologische Kontrollflüssigkeit dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Suspension von frischen menschlichen roten Blutzellen und von mit Tannin stabilisierten roten Geflügelblutzellen in einem ein antikoagulierend wirkendes Mittel enthaltenden, serologisch verträglichen menschlichen Piasmedium besteht, wobei die Konzentration der Geflügelblutzellen etwa 5000 bis 10 000 Zellen pro mm³ und die Konzentration der menschlichen roten Blutzellen etwa 4 000 000 bis 5 000 000 Zellen pro mm³ beträgt.

2. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die frischen menschlichen roten Blutzellen rote Blutzellen der Gruppe 0 sind.

3. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Tannin stabilisierten roten Geflügelblutzellen rote Blutzellen eines Truthahns sind.

4. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das antikoagulierend wirkende Mittel in dem menschlichen Plasmamedium saure Citrat-Dextrose Lösung ist

5. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmamedium aus mit Alsever- Lösung in einem Volumenverhältnis von etwa 1 :3 verdünntem, defibrinierten menschlichen Plasma in einem aus wäßriger saurer Citrat-Dextrose-Lösung bestehenden antikoagulierend wirkenden Mittel besteht.

6. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das defibrinierte menschliche Plasma Plasma der Gruppe 0 ist.

7. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das defibrinierte menschliche Plasma Plasma der Gruppe AB ist

8. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie pro 100 ml etwa 34-35 mg 6-Aminopurin oder eines seiner pharmazeutisch verträglichen Säure-Additionssalze enthält. «