DK158005B - Fremgangsmaade til fremstilling af poroese celluloseperler og anvendelse af disse - Google Patents

Description

DK 158005B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af porøse celluloseperler, der er egnede til brug som bærere af enzymer og andre biologiske midler, og anvendelse af de ved fremgangsmåden fremstillede porøse celluloseperler.

5

Porøse celluloseperler udgør et forholdsvis billigt stabilt materiale, der har alsidige kemiske egenskaber, således at de kan være nyttige som bærere til immobi1iserede enzymer og andre aktive biologiske stoffer.

10 Sædvanlige cellulosepartikler og regenererede cellulosepulve-re tilfredsstiller de fleste af de ønskede krav til gode bære-rere, hvortil enzymer kan immobi1 i seres, men de lider af formulemper, der bevirker, at søjlereaktorer bliver tæt pakkede, 15 hvilket resulterer i strømningsreduktion og somme tider kanaldannelse og derfor utilstrækkelig berøring mellem de immobili-serede enzym og reaktionsvæsken eller luftarten. Immobilisering af enzymer på en uopløselig bærer er en meget anvendt teknik til en praktisk anvendelse af enzymer, som undgår nød-20 vendigheden af at anvende friske enzymer til hver ønsket brug. Gennem immobilisering af enzymet opnås stabilisering, som giver effektiv enzymbrug og muliggør konstruktion og drift af enzymreaktorer på kontinuerlig måde.

25 Et vellykket resultat af et immobi 1 iseret enzym til brug ved praktisk anvendelse afhænger i vidt omfang af egenskaberne af de bærere, der anvendes til immobiliseringen. En god bærer skal derfor tilfredsstille de krav at være billig og skal have en sådan fysisk form, at den er let at anvende i reaktorer. I 30 denne henseende er formen af en kugleformet perle særlig ønskelig, fordi den er nyttig i et pakket leje, et fluidiseret leje, et ekspanderet leje, en omrørt tank eller andre almindelige typer kemiske reaktorer. En sådan bærer skal også have den nødvendige fysiske og mekaniske styrke, således at den ik-35 ke knuses eller deformeres, når den pakkes i en høj søjle. Knusning og deformering resulterer i, at søjlen bliver tæt pakket, hvorved strømmen af flydende reagenser gennem søjlen blokeres, og effektiviteten af den kemiske reaktor derfor ned- 2

DK 158005 B

sættes. Egnede bærere skal også have alsidige kemiske egenskaber, således at immobiliseringen af enzymerne og de andre biologiske midler på bæreren gennem ionisk eller kemisk kovalent binding samt overfladeadsorption let kan opnås. I denne hen-5 seende skal bæreren have en høj kapacitet til at danne et stort antal bindinger, således at hver enhed af bæreren kan immobilisere store mængder af de ønskede enzym. En bærer, der har en høj grad af porøsitet og ensartet fordelte indre hulrum, er derfor særlig ønskelig. En sådan porøsitet giver god 10 diffusion af kemiske reagenser og reaktionsprodukter ind i og ud af de indre hulrum i celluloseperlerne. Bærere skal være kemisk stabile, fysisk stærke og fremstillet af indifferent materiale, som modstår mikrobiologisk angreb, der forårsager ødelæggelse af bæreren, for at der kan fås et immobi 1 iseret 15 enzymsystem med lang aktiv levetid.

For tiden anvendes porøse glaspartikler og porøse keramiske partikler almindeligvis til immobilisering af enzymer, og disse pørtikler tilfredsstiller ganske vist de fleste af de oven-20 nævnte krav til en acceptabel partikel, men de er forholdsvis dyre. Antallet af kemiske reaktioner, der kan anvendes til immobilisering af enzymerne til glas og keramiske bærere, er endvidere begrænset.

25 I de amerikanske patenter nr. 3.947.325, 3.905.954, 3.573.277, 3.505.299, 3.501.419, 3.397.198, 3.296.000, 3.251.824, 3.236.

669, 2.843.583, 2.773.027, 2.543.928 og 2.465.343 er beskre vet fremstillingen af forskellige cellulosematerialer i forskellige former, hvoraf nogle er beskrevet som egnede til brug 30 ved fiksering af biologisk aktive materialer, såsom enzymer eller ionbyttende grupper dertil. Disse fremgangsmåder synes imidlertid også at lide af den ulempe at være kostbare, og de fremkomne produkter har i almindelighed en uønsket fysisk form til brug i sådanne kemiske reaktorer som pakkede lejer og flu-35 idiserede lejer. Specielt kan den kendte teknik ikke give et middel til fremstilling af‘kugleformede cel!uloseperler, der har en ensartet fordeling af porer gennem overfladen og et stort ensartet porøst indre hulrum. Cel!ulosepartiklerne og 3

DK 158005 B

pulverne ifølge den kendte teknik er endvidere i almindelighed af så lille partikelstørrelse, at de ikke er egnede til brug i kemiske reaktorer. Desuden har cellulosepulverne og partiklerne ifølge den kendte teknik ofte en hård overfladehud, som 5 forårsager alvorlig diffusionshindring og ineffektiv brug i kemiske reaktorer.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe billige, højporøse, stabile partikler med alsidige kemiske 10 egenskaber, der gør dem egnede som bærere af immobi1iserede enzymer og andre biologisk aktive materialer, og at tilvejebringe porøse cel 1uloseperler med forbedret fysisk og mekanisk stabilitet og tilstrækkelig stor overflade til en høj immobiliseringskapacitet for enzymer.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) opløser et hydrolyserbart cellulosederivat i et indifferent organisk, med vand blandbart opløsningsmiddel i et forhold fra 20 1:20 til 1:3 vægt/rumfang til dannelse af en opløsning, der har en vægtfylde større end vægtfylden af den under b) anvendte udfældningsopløsning, b) fordeler denne opløsning i form af små dråber i en udfæld-25 ningsopløsning, der er blandbar med det under a) anvendte opløsningsmiddel, og som består af vand, en vandig opløsning af ikke-ioniske eller ioniske tensider, en blanding af vand og ethanol eller methanol eller en hydrocarbon eller hydrocarbon-blanding, hvorved cel!ulosederivatet udfældes i form af ens- 30 artet porøse perler, c) adskiller de udfældede perler fra opløsningen, d) vasker de adskilte porøse perler med vand, 35 e) hydrolyserer de vaskede perler for at omdanne perlerne til cellulose og for at forøge de aktive steder for binding af enzymer og andre biologiske midler, 4

DK 158005 B

f) vasker de hydrolyserede perler for at få porøse celluloseperler, der har et ensartet fordelt hulrum større end 50 rumfangsprocent, og 5 h) eventuelt tværbinder de porøse celluloseperler med mindst ét tværbindingsmiddel til fremstilling af tværbundne porøse celluloseperler før eller efter hydrolysen.

Opfindelsen angår ligeledes anvendelse af de ved fremgangsmå-10 den ifølge opfindelsen fremstillede porøse celluloseperler, eventuelt efter en forbehandling, til immobilisering af enzymer og andre biologisk aktive midler og til adskillelse og rensning af enzymer, proteiner og nukleinsyrer.

15 De ifølge opfindelsen fremstillede højporøse celluloseperler med ensartet porøsitet egner sig især til immobilisering af enzymer. Derudover er de også egnede til rensning og adskillelse af enzymer, proteiner, nukleinsyre og lignende forbindelser og til adskillelse af metalioner fra fortyndede opløs-20 ninger. På grund af deres porøsitet og deres gode mekaniske stabilitet giver de ifølge opfindelsen fremstillede celluloseperler ved anvendelse i reaktorer med fast leje en fremragende væskepassage og undergår ingen dekomponer ings- og deformer i ngsfænomener.

25

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver porøse celluloseperler, der egner sig som bærere for enzymer og andre biologiske midler. Endvidere muliggør fremgangsmåden ifølge opfindelsen ændring af de kemiske og fysiske egenskaber af porøse perler 30 fremstillet af cellulosederivater. Sædvanlig mikrokrystal1insk cellulose og andre partikler fremstillet af cellulose tilfredsstiller mange af de almindelige krav til en egnet bærer for enzymer, men sådanne partikler lider af en tendens til at pakke tæt sammen under tryk og kan heller ikke frembyde ti 1 -35 strækkelig porøsitet til at fastgøre en tilstrækkelig stor mængde enzymer dertil. Cellulosederivater er i almindelighed billige, og når de behandles ifølge den foreliggende opfindelse, giver det et meget alsidigt materiale for kemiske reaktio- 5

DK 158005 B

ner, der i almindelighed er biologisk indifferente. Cellulo-seperlerne fremstillet ifølge opfindelsen har således mange ønskelige egenskaber til brug som bærere af immobi1iserede enzymer .

5

Ved ifølge opfindelsen at opløse et cellulosederivat i et udvalgt opløsningsmiddel og fordele dette i en udva1gt udfældningsopløsning er det muligt at fremstille celluloseperler med høj ensartet porøsitet og forbedrede kemiske og fysiske egen-10 skaber. Perlerne fremstillet ifølge opfindelsen er højporøse. Porerne er i almindelighed ensartet fordelt over overfladen og gennem det indre af perlen. Ved passende valg af opløsningsmidler og udfældningsopløsninger kan perlernes porestørrelse reguleres. Det er særligt fordelagtigt, at de i overensstem-15 melse med fremgangsmåden er muligt at regulere både porestørrelsen og porefordelingen. Idet der henvises til tegningens fig. 2, 4· (A) og (B), vil det ses, at poreåbningerne er ensartet fordelt over perlens overflade og blev bedømt til at være ca. I'IO-? m,hvilket er en passende størrelse for bevægel-20 se af enzym og reagensmolekyler i porerne.

Det indifferente organiske, med vand blandbare opløsningsmiddel kan være en enkelt væske eller en kombination af væsker.

Det er vigtigt, at man anvender en korrekt kombination af in-25 different organisk opløsningsmiddel og udfældningsopløsning for at få porøse cel!uloseperler af ønsket form og porøsitet.

Det indifferente organiske, med vand blandbare opløsningsmiddel kan være en kombination af væsker, som sammen med cellulo-sederivatet giver en opløsning, som, når den blandes med ud-30 fældningsopløsningen, resulterer i en faseomvending, hvorved cellulosederivatet koaguleres i form af en porøs perle. Det indifferente organiske opløsningsmiddel indeholder således en komponent (a), der er karakteriseret som en væske, der er i stand til at opløse cellulosederivatet, såsom celluloseacetat 35 og er opløselig i udfældningsopløsningen.

En anden komponent (b) af opløsningsmiddelsystemet er en væske, som er opløselig i komponent (a) og også i udfældnings- 6

DK 158005 B

opløsningen, og som findes i opløsningsmidlet i en tilstrækkelig mængde til, at vægtfylden af den endelige opløsningsmiddelopløsning (sammen med cellulosederivatet) er tilstrækkelig meget højere end vægtfylden af udfældningsopløsningen, således 5 at ved fordeling af opløsningsmiddelopløsningen i form af små dråber i udfældningsopløsningen vil cellulosen koagulere og fælde ud som en porøs perle med ønsket størrelse og porøsitet. Komponenten (b) i opløsningsmidlet anvendes til at regulere overfladeaktiviteten af opløsningsmiddelopløsningen, således 10 at de små dråber af opløsningsmiddelopløsningen vil bevare deres form ved berøring med udfældningsopløsningen. Komponenten (b) tjener også til at regulere porestørrelsen og porøsiteten af de udfældede perler. I nogle tilfælde kan komponenten (a) og komponenten (b) være den samme. I andre tilfælde kan det 15 være hensigtsmæssigt at anvende en eller flere væsker til fremstilling af komponent (a) og/eller komponent (b).

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse defineres udtrykket "udfældningsopløsning" som en væskeopløsning, der ikke er et 20 opløsningsmiddel for cel!ulosederivatet og er blandbart med det ovennævnte indifferente organiske, med vand blandbare opløsningsmiddel. Som illustration kan udfældningsopløsningen være vand eller en vandig opløsning. Udfældningsopløsningen er således blandbar med både opløsningskomponenten (a) og (b).

25 Det vil således forstås, at når man opløser cellulosederivatet i det organisek opløsningsmiddel og derefter tilsætter en dråbe af den fremkomne opløsningsmiddelopløsning til udfældningsopløsningen, vil cellulosederivatet koagulere og fælde ud på grund af faseomvendingen, som cellulosederivatet undergår, 30 og derved danne den ønskede porøse celluloseperle.

Som det vil fremgå af beskrivelsen, er forskellige variationer mulige i den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af de ønskede porøse celluloseperler. Foruden cel!uloseacetat 35 kan andre cellulosederivater anvendes som udgangsmateriale til fremstilling af de porøse perler, f.eks. cellulosenitrat og methylcellulose. Udtrykkene cellulosederivat og hydrolyserbart cel!ulosederivat skal i den foreliggende beskrivelse forstås 7

DK 158005 B

som indbefattende materialer, hvoraf cellulose kan regenereres, f.eks. ved hjælp af hydrolyse eller hydrogenering.

De organiske opløsningsmiddelkomponenter (a) og (b) til cellu-5 1 osederivatet kan variere, men skal være kemisk indifferente over for cellulosederivatet og helt eller i det væsentlige blandbare med udfældningsopløsningen. Det er af betydning, at vægtfylden af opløsningsmiddelopløsningen dannet ved at sætte cellulosederivatet til det indifferente opløsningsmiddel er 10 v større end vægtfylden af udfældningsopløsningen, hvori den fordeles, således at når små dråber af opløsningsmiddelopløsningen fordeles i udfældningsopløsningen, vil dråberne synke, når den vandige opløsning ikke omrøres. Egnede enkelte opløsningsmidler, når der anvendes en vandig udfældningsopløsning, 15 indbefatter bl.a. f.eks. dimethylsulfoxid og methyl acetat. Det skal forstås, at industrielt tilgængelige materialer kan anvendes som opløsningsmiddelkomponenterne (a) og/eller (b), og at disse materialer kan indeholde fugtighed, hvilket i nogle tilfælde har vist sig at være fordelagtigt.

20 Når der anvendes en vandig udfældningsopløsning, kan man hensigtsmæssigt som opløsningsmiddelkompoent (a) anvende en repræsentant fra gruppen bestående af acetone, formamid, en blanding af acetone og methanol eller ethanol, methyl acetat, 25 en blanding af methylendichlorid og methanol, methyl ethyl keton og dimethylsulfoxid. Opløsningsmiddelkomponenten (b) kan således hensigtsmæssigt vælges blandt repræsentanter fra gruppen bestående af dimethylsulfoxid, formamid, methyl acetat, cyklo-hexanon, methylendichlorid, ethylendichlorid, en blanding af 30 methylendichlorid og methanol og en blanding af ethylendichlorid og methanol.

En foretrukken opløsningsmiddelkomponent (a) er acetone, men andre opløsningsmidler kan anvendes, og når der anvendes en 35 vandig udfældningsopløsning kan man vælge en komponent (a) blandt følgende materialer (blandingsforholdet, hvor der er tale om blandinger, er det minimalt ønskelige forhold på rumfangsbasis) : DK 158005 B_ 8 /

Komponent (a) Minimalt forhold (rumfang)

Acetone -----

Acetone + methanol 60;40 5 Acetone + ethanol 60:40

Methylacetat -----

Methylendichlorid + methanol 80:20

Dimethylsulfoxid -----

Methylethylketon ----- 10 Formamid -----

Som ovenfor nævnt er den primære funktion af komponent (a) at opløse cellulosederivatet. Tilsætningen af komponent (b) er 15 nødvendig for at skabe en opløsningsmiddelopløsning, der har den nødvendige vægtfylde, således at cel!ulosederivatet vil fælde ud i udfældningsopløsningen. Komponent (b) giver også regulering af porestørrelse og ensartet porøsitet af perlerne.

20 Opløsningsmiddelkomponenten (b) tilvejebringer derfor den ønskede vægtfylde af opløsningsmiddelopløsningen, og når der anvendes en vandig udfældningsopløsning foretrækkes det at anvende dimethylsul foxid som komponent (b). Det vil forstås, at i nogle tilfælde kan komponent '(a) og komponent (b) være den 25 samme, dsv. dimethylsulfoxid, formamid eller methylacetat, når de anvendes sammen med vandige udfældningsopløsninger. Forskellige materialer, der kan anvendes som komponent (b), når der anvendes en vandig udfældningsopløsning, er anført nedenfor : 30 35 9

DK 158005 B

(·*λ :4

Komponent (b) Minimalt forhold (rumfang)

Dimethylsulfoxid ____ 5 Ethylendichlorid + methanol 60:40

Methylendichlorid + methanol 60:40

Ethylendichlorid _____

Methylendichlorid _____

Formamid _____ 10 Cyklohexanon _____

Opløsningen af cellulosederivat og indifferent opløsningsmiddel skal have et reguleret forhold mellem cellulosederivat og opløsningsmiddel, fordi dette vil have en virkning på den en-15 delige porøsitet af de fremstillede perler. I almindelighed resulterer et lille forhold (større indhold af opløsningsmiddel) i perler, der har større porøsitet. Et forhold mellem cellulose og opløsningsmiddel (inklusive komponenterne (a) og (b)) fra 1:20 til 1:3 (vægt/rumfang) har vist sig egnet til 20 fremstilling af cellu1 oseper 1 er, der har forskellige specielle anvendelser. Fortrinsvis anvendes et forhold mellem cellu-losederivat og opløsningsmiddel på 1:10 til 1:6 (vægt/rumfang) til at give en let håndterbar opløsning, som resulterer i porøse celluloseperler med ønskede egenskaber, der har et hulrum 25 på mindst 50 rumfangsprocent, fortrinsvis 75 til 95% og mest hensigtsmæssigt ca. 75 til 80%. Perler, der har større porøsitet, vil i almindelighed have en større mængde ensartet fordelte indre hulrum, der giver mindre diffusionshindring, men vil være noget svagere med hensyn til fysisk styrke end perler 30 med lavere porøsitet.

Den foretrukne udfældningsopløsning, hvori opløsningen af cellulosederivat skal fordeles, består i almindelighed af vand, men kan være en vandig opløsning, som indeholder egnede mæng-35 der af ikke-ioniske eller ioniske overfladeaktive midler for at nedsætte overfladespændingen deraf og lette dannelsen af de porøse perler. Udfældningsopløsningen kan hensigtsmæssigt også indeholde en blanding af vand og methanol eller ethanol (rum- 10

DK 158005 B

fangsforhold 50:50). Udfældningsopløsningen kan være ikke-van-dig, når blot cellulosederivatet er uopløseligt deri, og det nødvendige vægtfyldekrav er tilfredsstillet. Kulbrinteopløsninger kan således anvendes, såsom cyklohexan, hexan, decan, 5 benzen, når blot de er i flydende form, har en vægtfylde mindre end vægtfylden af det indifferente organiske opløsningsmiddel og er blandbare dermed. Når cellulosederivatopløsnin-gen fordeles ved sprøjtning via et egnet organ, såsom en dyse, resulterer trykfaldet og blandbarheden af det indifferente op-10 løsningsmiddel i den vandige opløsning i en dispersion og til sidst i udfældning af porøse perler af cel!ulosederivatet.

Som det vil forstås af fagfolk, må der ved udfældning af celluloseperlerne være en tilstrækkelig mængde af opløsningsmid-15 delkomponent (b) til stede til, at opløsningen indeholdende cellulosederivatet har den nødvendige højere vægtfylde end vægtfylden af udfældningsopløsningen. Tabel 1 angiver nogle indifferente organiske opløsningsmidler til udfældning af et cellulosederivat i en vandig opløsning. De anførte mængdefor-20 hold er det minimum, som kræves til at give en opløsningsmiddelopløsning, der har større vægtfylde end vand. Jo større vægtfylden af komponent (b) er, des mindre af denne komponent kræves der for at opnå den minimale vægtfylde.

Tabel 1 25 -

Opløsningsmiddel Minimalt rumfangs-;

Komponent (a)_Komponent (b)·_forhold a:b_i

Acetone Dimethylsulfoxid 70:30

Acetone Ethylendichlorid 80:20

Acetone Methylendichlorid 80:20 30 Acetone Formamid 75:25

Acetone Cyklohexanon 45:55

Acetone Methylacetat 35:65 35

Efter udfældning af de porøse perler regenereres cellulose af derivatet ved hydrolyse for at skabe flere aktive steder til enzymbinding. Ved regenerering af cellulose af dets derivat 11

DK 158005 B

efter dannelse af perlerne kan man fjerne de substituerende grupper (såsom acetat fra celluloseacetat) for at regenerere alle hydroxylgrupperne, der normalt findes i cellulosemateri-alet. Jo højere regenereringsgrad, des mere stabilitet kan der 5 findes i de fremkomne perler. I nogle tilfælde, hvor enzymerne skal immobi1iseres på cel!uloseperlebærerne, er det ønskeligt at omdanne hydroxygrupperne eller substituerende grupper til funktionelle kemiske grupper, såsom aminogrupper, der letter enzymbinding.

10 På tegningen er fig. 1 en i 111ustrati on af part i kel størrelses-fordelingen i de porøse perler, fig. 2 er et skanderende elektromikrografi af en porøs cellu-15 loseperle, fig, 3 er en kurve over de porøse celluloseperlers trykfaldsegenskaber, 20 fig. 4 (A) er et skanderende elektronmikrografi af overfladen af en porøs celluloseperle (20.000 x), fig. 4 (B) er et skanderende elektronmikrografi af det indre af en porøse celluloseperle (20.000 x).

25

Fig. 1 illustrerer størrelsesfordel i ngen af de endelige porøse perler fremstillet ved at fordele (f.eks. ved sprøj tn ing) en opløsning af cellulosederivat gennem en sprøjtedyse i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er beskrevet i enkelt-30 heder i det følgende. Perler, som enten er for store eller for små, afhængende af den tilsigtede endelige anvendelse, kan opsamles og genopløses i det ønskede opløsningsmiddel. Generelt foretrækkes perler med ensartet størrelse, hvis de anvendes i en kemisk reaktor af søjletypen. Den ønskede partikelstørrel-35 se kan variere med den tilsigtede brug af perlerne, f.eks. den type enzym, som skal immobi1iseres.

De porøse celluloseperler fremstillet ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde har i almindelighed meget høj porøsitet og en 12

DK 158005 B

reguleret porestørrelse, der ligger fra 0,05 til 30 micron.

Når der anvendes et forhold mellem cellulose og opløsningsmiddel på 1:10 (vægt/rumfang) til fremstilling af opløsningen af cellulose og opløsningsmiddel, kan de dannede færdige perler 5 have en høj porøsitet på ca. 90% hulrum. Et skanderende elek-tromikrografi af en porøs celluloseperle fremstillet ved fremgangsmåden er vist på fig. 2, 4 (A) og 4 (B). Af disse billeder kan man se flere vigtige ejendommeligheder ved de fremstillede perler. For det første vil de ses, at perlerne er 10 generelt kugleformede, og porøse åbninger er ensartet fordel over overfladen af perlerne. Til de fleste anvendelser er dette ønskeligt, fordi det kan give en immobi1iseret enzymkatalysator med ensartet aktivitet. Hulrumsfasen i ce11uloseperi erne er kontinuerlig. Dette er et ønskeligt træk, fordi diskon-15 tinuerlige adskilte bobler ville resultere i et nytteløst og ikke tilgængeligt dødt rum i et immobi1 i seret enzymsystem. For det tredje er der ingen hård hud på perleoverf 1 aden. En hård hud ville forårsage alvorlig diffusionshindring. Endelig er porestørrelserne helt ensartede. Som resultat heraf vil hele 20 det indre overfladeareal af de indre hulrum i perlerne være tilgængeligt for enzymimmobilisering og for enzymkatalyserede reaktioner. Både den høje porøsitet og de andre nævnte træk gør de porøse celluloseperler ifølge opfindelsen enestående egnede til brug ved immobilisering af enzymer og andre biolo-25 gisk aktive midler.

En vigtig egenskab ved en enzymbærer er trykfaldet, som den forårsager ved forskellige væskestrømningshastigheder gennem en enzymreaktor indeholdende bæreren. F.eks. anvendes DEAE-30 cellulose for tiden i· industrien som en enzymbærer til omdannelse af glukose til fruktose. For DEAE-cellulose er trykfaldet meget stort, og følgelig kan der kun anvendes lave lejer til at opnå en rimelig hastighed af væskestrømmen. Trykfaldsegenskaberne af de porøse celluloseperler ifølge den forelig-35 gende opfindelse ved drift i en pakket søjle er vist med kurven A på fig. 3. Den nominelle lineære strømningshastighed er beregnet ved at dividere den volumetriske strømningshastighed af væsken, som føres til søjlen, med søjlens tværsnitsareal.

13

DK 158005 B

Ved praktisk drift vil den nominelle lineære strømningshastighed i industrielle søj1ereaktorer være mindre end 0,5 cm/sek. Med en reaktorsøjle med en indre diameter på 60,96 cm er en lineær hastighed på 0,5 cm/sek. f.eks. ævkvivalent med 5 en volumetrisk strømningshastighed på 5254 liter/time. I en typisk industriel drift til fremstilling af fruktose af glukose er sukkerkoncentrationen i den tilførte væske ca. 0,59 kg/liter. Ovennævnte strømningshastighed vil give mere end 27.000.000 kg af produktet pr, 61 cm søjle pr. år. På grund af 10 den enzymatiske reaktions krav til opholdstid er den lineære strømn i ngshastighed i reglen mindre end 0,5 cm/sek. Det kan derfor ses, at de porøse cel 1uloseperler fremsti 11 et ifølge den foreliggende opfindelse ikke frembyder nogen alvorlige problemer med hensyn til trykfald, når de anvendes i kemiske 15 reaktorer af søjletypen som bærere, hvortil enzymer og andre biologisk aktive midler kan immobi1 i seres. Når de porøse celluloseperler efter passende derivatdannelse anvendes til andre formål (f.eks fjernelse af garvestof fra frugtsaft, vin eller øl og af metalioner fra fortyndede opløsninger), kan væske-20 strømningshastigheden gennem reaktorsøjlen være meget større end de her nævnte 0,5 cm/sek.

Strømningsegenskaberne og andre fysiske og mekaniske egenskaber af de porøse celluloseperler kan forbedres ved tværbinding 25 med bi- og/eller multifunktionel le forbindelser. Kurven B på fig. 3 viser trykfaldkravet til porøse celluloseperler efter behandling med tolylen-2,4-diisocyanat og enzymimmobilisering.

Over en nominel lineær hastighed på 2 cm/sek. bliver de ubehandlede celluloseperler (kurven A) sammentrykt og deformeret 30 betydligt, hvilket resulterer i en drastisk forøgelse af trykfaldet. Kurven B er kun svagt konkav, hvilket viser ingen eller ringe deformering af de behandlede perler.

Behandling af de porøse cel!uloseperler med et tværbi ndings-35 middel enten før eller efter hydrolyse af perlerne resulterer i en forøgelse af deres fysiske styrke. Binding af enzymer på perlerne vil også forøge deres fysiske styrke. Efter behandling med, f.eks. et diisocyanat (f.eks. tolylen-2,4-diisocya- 14

DK 158005 B

nat eller hexamethylendiisocyanat), bliver perlerne faktisk ret stive og stærke. Tværbinding med epichlorhydrin forbedrer også de fysiske egenskaber af de porøse celluloseperler. Kemien i tværbinding af polysaccharider, herunder cellulose og 5 stivelse, er en godt udviklet gren af fysikken. Andre egnede tværbindingsmidler indbefatter f.eks. formaldehyd i saltsyreopløsning eller giutaraldehyd. Mange andre kulhydrattværbindingsmidler er velkendte som f.eks. beskrevet i amerikansk patent nr. 3.905.954.

10

Generelt fremstilles de porøse perler ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved følgende trin: a) En hydrolyserbar form af cellulose opløses i et indifferent 15 organisk, med vand blandbart opløsningsmiddel i et reguleret forhold mellem cellulosederivat og opløsningsmiddel, som i almindelighed er i intervallet 1:20 til 1:3 (vægt:rumfang) til fremstilling af en opløsningsmiddelopløsning. Opløsningsmidlet skal være helt eller væsentligt blandbart med udfældningsop-20 løsningen, og vægtfylden af op løsnings-middel«©© løsn ingen skal være tilstrækkelig til, at opløsningsmidlet ved berøring med udfældningsopløsningen let bliver blandbart med udfældningsopløsningen, og cellulosederivatet udfælder deri.

25 b) Opløsningsmiddelopløsningen fordeles (f.eks. ved sprøjtning) i form af små dråber i en udfældningsopløsning. Ved berøring med udfældningsopløsningen, der kan indeholde et over-fadeaktivt middel, dispergeres opløsningsmidlet inde i opløsningsmediet, og porøse perler af cellulosematerialet dannes, 30 efterhånden som de koagulerer og udfælder til bunden af beholderen, der indeholder udfældningsopløsningen. Cellulosederi-vatopløsningen kan hensigtsmæssigt sprøjtes under tryk gennem en forstøvningsdyse ind i et bad af udfældningsopløsning. Hvis det ønskes, kan badet omrøres for at fremme dannelsen af per-35 lerne.

c) Efter at være vasket bliver de udfældede perler hydrolyseret for at regenerere cellulose og derved tilvejebringe en po- 15

DK 158005 B

røs celluloseperle, der har aktive steder til enzymbinding.

Hvis det ønskes for at forøge stabiliteten af de porse perler eller tilvejebringe egende reakt i onssteder, kan man kemisk modificere perlerne på forskellige måder. F.eks. kan perlerne 5 tværbindes for at tilvejebringe større stabilitet og forøget fysisk styrke. Man kan også kemisk substituere enten positivt ladede Iler negativt ladede grupper for at ændre overfladeabsorptionsegenskaberne af celluloseperlen. Cellulosen selv er generelt hydrofil, og ved at ændre dens reaktionssteder kan 10 man derfor ændre dens hydrofile egenskaber.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde, ved hvilken enzymer og andre biologisk aktive midler kan immobi1iseres ved binding på de porøse celluloseperler. F.eks. kan man omdanne 15 porøse celluloseperler, som ovenfor beskrevet, t-mnethylami-noethyIcel1u1 ose (DEAE) ved at bringe perlerne til at reagere med N,N-diethyl-2-chlorethylaminhydrochlorid på sædvanlig måde. Perler fremkommet på, denne måde indeholder DEAE-cellu-~-lese og; er med-godt resul tat anvendt"'·* i T-at bNtrdf-^jUjkoseiso-20 merase, udvundet af en streptomyces kultur. Der har også“\^f?^i^_^^ anvendt en fremgangsmåde, som indebærer cyanogenbromid til at ^ Mmmob'f 1 i sere g 1 ukoseisomerasen.

En anden fremgangsmåde til enzymimmobilisering på de porøse 25 celluloseperler indebærer anvendelse af tolylen-2,4-diisocya-nat. Diisocyanatet blev anvendt til at tværbinde cellulose for at forbedre den fysiske styrke af de porøse perler, det har imidlertid vist sig, at de porøse celluloseperler ifølge opfindelsen, når de er behandlet med diisocyanat, kan immobili-30 sere enzymer på overfladen deraf ved blot at blande de med diisocyanat behandlede perler sammen med en enzymopløsning. Når der f.eks. blev anvendt giukoamylase, bandt diisocyanatperlerne mere end 1000 internationale enheder af enzymet pr. g tørre perler. Opfindelsen er ikke begrænset til den følgende te-35 ori, men det ser ud til, at når tørre porøse celluloseperler er i tør acetone med to 1 y 1 en-2,4-di isocyanat i nærværelse af en katalysator (f.eks. triethylamin), sker der en betydelig grad af tværbinding mellem cellulosemolekyler, som vist ved 16

DK 158005 B

den forbedrede fysiske styrke af perlerne. Efter en tilstrækkelig lang reaktionstid blev perlerne vasket med tør acetone for at fjerne frie diisocyanatrester. Cel 1u1 oseper 1 erne synes at have et stort antal bundne isocyanatgrupper. Ved blanding 5 af de behandlede perler med en vandig enzymopløsning synes enzymmolekyler at blive kovalent bundet til celluloseperlerne gennem isocyanatgrupperne. Det har også vist sig, at vask af de behandlede perler med vand resulterer i omdannelse af isocyanatgrupper til aminogrupper. På denne måde er med godt 10 resultat immobi1iseret et enzym, glukoamylase til aminocellu-loseperlerne med glutaraldehyd, et middel, der er velkendt for dets evne til at reagere og tværbinde aminogrupper (på perlerne og enzymet).

15 De porøse^eTTXrl-©£^erJer fremstillet ifølge opfindelsen kan - også anvendes til adskiHelse og rein.s.ning af enzymer, protei ner, nukleinsyrer ©g lignende. De porøse cel 1 uloseperle.r .fremstillet ved fremOanosjnåden^ffølaae opfi-adejsen kan derivatise-res i-H^f’remstTlTTWg af DEAE-porøse cel 1 uTosepCT'Ter ,~"som Irar Z ?r~ ' udmærkede strømningsegenskaber og alligevel er effektiv i stand til at adskille enzymer, proteiner, nuklejjisyrej^jag lig-nende, ligeså effektivt som eksisterénde"~industriel le produkter i overensstemmelse med den teknik-, #e.r kaldes søj 1 ekr-oma-tografi.

25

Man kan også derivatisere de porøse celluloseperler ifølge opfindelsen (in situ) med andre grupper end DEAE. De porøse celluloseperler ifølge opfindelsen er således anvendelige til mange forskellige anvendelser. F.eks. kan man binde en speci-30 fik funktionel gruppe til de porøse cellu1 oseper 1 er, og de derefter derivatiserede perler kan anvendes f.eks. til fjernelse af garvestof fra frugtsaft ved at lede frugtsaften gennem et leje af de derivatiserede porøse celluloseperler med protei n.

På lignende måde kan man fjerne metalioner fra fortyndede opløsninger indeholdende disse. En sådan fremgangsmåde kunne muliggøre udvinding af værdifulde metalioner (dvs. kobberioner 35 17

DK 158005 B

og guldioner) af fortyndede opløsninger, der forekommer i minedriften, og kunne finde særlig anvendelighed til eksisterende mineteknik med opløsninger, hvorved metaller ekstraheres fra malme med sure opløsninger.

5

Opfindelsen anskueliggøres nærmere af de følgende eksempler, af hvilke eksempel I-V belyser fremstilling af porøse celluloseperler, eksempel VI-XII og XVIII-XXVII belyser anvendelsen af porøse celluloseperler, og eksempel XIII-XVIII belyser 10 tværbinding af porøse celluloseperler.

Eksempel I

50 g celluloseacetat (Vise 3 fra Eastman Kodak Chemicals) blev 15 opløst i 400 ml opløsningsmiddel A (sammensat af acetone og dimethylsulfoxid i et rumfangsforhold på 6-til-4) til dannelse af en 12,5% (vægt/rumfang) opløsning. Med e.n sprøjtepistol (malingssprøjte fra Sears Roebuck & Co.) t>!©v celluloseopløs-n i ngen s;å aprejjtet ved et lufttryk på U,,4 fcg/cai* som fine små 20 dråber ii/nd ii ©m 'vawdtan'k indeholdende 152 liter vand og 4 drå-—~b©r—af ét "ålmindeligt husholdsningsrensemiddel . Ved berøring med overfladen af vandet koagulerer celluloseacetatdråberne til porøse perler og synker til bunds. De porøse perler blev opsamlet og vasket. De vaskede perler blev så deacetyleret med 25 ca. en 0,15 N opløsning af natriumhydroxid natten over ved stuetemperatur. De deacetylerede perler blev så vasket og sugetørret og gav en porøs celluloseperle med et hulrum større rend 50 rumfangsprocent parat til brug ved enzymimmobilisering. Fig. 1 illustrerer størrelsesfordelingen af de frem-30 stillede porøse perler. Elektronmikrografier afslørede, at perlerne var generelt kugleformede, og det indre og overfladen deraf havde samme struktur. Porestørrelserne var helt ensartede, og porerne var fordelt ensartet gennem hele perlen som vist på fig. 2, 4 (A) og 4 (B). Perlernes porestørrelse blev 35 bestemt af skanderende elektronmikrografier. Den skanderende mikrografering kræver tørre prøver, og da tørring af perlerne i luft resulterer i en formindskelse af størrelsen, blev perlerne tørret ved den kritiske punktteknik med flydende kuldioxid. Porestørrelsen blev bestemt til at være ca. 1*10-^ m.

Eksempel II

DK 158005 B

ιβ

Ved anvendelse af en 10% (vægt/rumfang) cel!uloseacetatopløs-ning i opløsningsmiddel A ved fremgangsmåden i eksempel I blev 5 der også dannet porøse perler, som var egnede til brug ved en-zymimmobi1isering.

Eskempel III

10 En 10% (vægt/rumfang) celluloseacetatopløsning (Vise 3 fra Eastman Kodak Chemicals) blev fremstillet i opløsningsmiddel B (acetone og formamid i et rumfangsforhold 7-til3). Cellulose-acetatopløsningen blev så sprøjtet og hydrolyseret ved fremgangsmåden i eksempel I. Der fremkom stærkt porøse cellulose-15 perler med et hulrum større end 50 rumfangsprocent.

Eksempel IV

Fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel II, blev gentaget 20 ved anvendelse af en opløsning fremstillet med cel!uloseacetat af typen Vise 45 (fra Eastman Kodak Chemicals)-^ Der fremkom også porøse perler med udmærkede egenskaber til enzymimmobilisering.

25 Eksempel V

Fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel II, blev udført under anvendelse af en 10% vægt/rumfang opløsning af cellulo-setriaeetat (fra Eastman Kodak Chemicals) i opløsningsmiddel 30 a. De derved fremkomne perler udviste udmærket porøsitet til enzymimmobilisering. Cellulose kan anvendes som understøtningsmateriale til immobilisering af enzymer og andre biologisk aktive midler. Mange har valgt cellulose som understøtning, fordi cellulose er billig, kemisk stabil og er resistent 35 over for mikrobiologisk forurening. Cellulose har også tre hy-droxylgrupper på hver anhydro-glukoseenhed, hvilket giver stor alsidighed samt stor kapacitet til immobilisering af et ønsket stof.

19

DK 158005 B

Den største ulempe ved at anvende cellulose som understøtningsmateriale er, at cellulose har en fibrøs form og mangler den nødvendige mekaniske styrke. Reaktorer pakket med cellulose har dårlige strømningsegenskaber, udvikler et alvorligt 5 højt trykfald og somme tider kanaldannelse. For at overvinde disse problemer fremstilledes ifølge opfindelsen cellulose i perleform, som udviste bedre mekanisk styrke og gav forbedrede strømningsegenskaber sammenlignet med kendte materialer. Da strukturen af celluloseperlerne ifølge opfindelsen er forskel-10 lig fra strukturen af regulær cellulose, kan belastningen af enzymer og stabiliteten af de immobi1iserede enzymer dog være forskellig fra den, der fås med regulær cellulose. Kemien ved fremstillingen af immobi1iserede enzymer påvirker ikke blot belastningen og stabiliteten af enzymet på celluloseperlerne, 15 men påvirker også den mekaniske styrke af celluloseperlerne. Enhver mekanisk fremgangsmåde til immobilisering af enzymer, som forøger den mekaniske styrke af celluloseperler, ville forbedre strømningsegenskaberne i en reaktor, såedes som det vil fremgå af eksemplerne.

20

Eksempel VI

1 g porøse celluloseperler fremstillet ifølge eksempel I blev dispergeret i 15 ml vand, som blev indstillet til pH 11,5 med 25 natriumhydroxid og holdt ved konstant temperatur på 20°C. l g cyanogenbromid blev sat til denne dispersion. pH-værdien blev holdt på 11,5 med IN NaOH. Efter 15 minutter blev perlerne vasket med en phosphatstødpude (0,1 M) ved pH og 0eC. 15 ml glukoamylaseopløsning (30 mg/ml) blev så sat til perlerne.

30 Blandingen blev henstillet natten over. De således fremstillede perler indeholdet 1830 enheder enzymaktivitet pr. g tør vægt af celluloseperlen ved 60eC under anvendelse af 5% maltose som substrat. En enhed enzymaktivitet defineres som den, der frembringer et mikromol produkt pr. minut.

35 20

DK 158005 B

Eksempel VII

0,2 g porøse celluloseperler fremkommet som i eksempel I blev dispergeret i 5 ml acetone. 0,2 ml tri ethyl am in blev sat til 5 dispersionen, og det samme blev 0,2 ml tolylen-2,4-diisocya-nat. Efter 30 minutter blev perlerne vasket med acetone og derefter en acetatstødpude ved pH 4,75. 5 ml glukoamylaseop-løsning (25 mg/ml) blev tilsat. Enzymet blev derved immobili-seret på perlerne med en aktivitet af 2000 enheder pr. g cello 1 uloseperler.

Eksempel VIII

200 mg glukoseisomerase i en maleinsyrestødpudeopløsning blev 15 immobi1iseret på 2 g celluloseperler på samme måde, som beskrevet i eksempel 7. Cel!uloseperlerne indeholdt 90 enheder enzymaktivitet pr. g celluloseperler ved 60°C under anvendelse af 9% fruktose som substrat.

20 Eksempel IX

300 mg invertase i 5 ml acetatstødpude blev immobi 1 iseret på 0,5 g porøse celluloseperler ved anvendelse af fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel VII. Celluloseperlerne indeholdt 25 3000 enheder aktivitet pr. g cellulose.

Eksempel X

50 mg laktase i phosphatstødpude (pH 7,0) blev immobi1 i seret 30 på 0,5 g celluloseperler ved anvendelse af fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel VI. De fremkomne celluloseperler indeholdt ca. 80 enheder enzymaktivitet pr. g celluloseperler ved 3Q°C under anvendelse af 1¾ laktose som substrat.

35

Eksempel XI

21

DK 158005 B

500 mg giukkoseisomerase blev opløst i 150 ml maleinsyrestød-pude (0,0 M, pH = 5,5). Enzymopløsningen blev pumpet gennem 5 5 g porøse tværbundne celluloseperler fremstillet som beskrevet i eksempel XIV. DEAE-celluloseperlerne indeholdt således 100 enheder enzymaktivitet pr. g perler.

Eksempel XII

10 0,25 g porøse celluloseperler fremstillet som i eksempel I blev udblødt i 3% giutaraldehyd og 0,1 M MgCl2· Efter tørring under anvendelse af vakuumsugning på en Buchner tragt blev prøverne opvarmet til 80°C i 30 minutter. 5 ml glukoamylase 15 (25 mg/ml) blev sat til perlerne. Efter henstand natten over indeholdt de således fremstillede perler ca. 200 enheder enzymaktivitet pr. g tørre celluloseperler.

Eksempel XIII

20 1 g porøse celluloseperler blev cyanethy1eret med 10 ml acryl-nitril (C = CCsN) ved 50°C. De således behandlede celluloseperler blev derefter behandlet med hydroxylamin ved en pH-vær-di på 6,5-6,7 ved 50-100°C i 4 timer. De fremkomne modificere-25 NH2 de porøse perler indeholdt - C = Ν0Η grupper og er egnet til absorbering af tunge ioner, såsom ferri, ferro og kupri.

30 Eksempel XIV

En suspension af 2,5 g porøse celluloseperler blev behandlet med 2,5 ml hexamethy1 end iisocyanat og triethylamin, efterfulgt af hydrolyse i vand. Produktet blev så behandlet med 50 ml 0,5 35 M 0-methyl isourinstof ved pH 5. Det fremkomne produkt havde følgende funktionelle grupper: 22

DK 158005 B

porøse m © cellulose- ΪΗ2 perler---- - C - 5 der er nyttig som anionbytter.

Eksempel XV

10 5 g porøse celluloseper ler fremstillet ifølge eksempel I blev sat til 100 ml 36% formaldehyd og 200 ml 37% saltsyre. Efter henstand i 1¾ time ved stuetemperatur blev perlerne filtreret og derefter vasket med vand og 0,2% natriumcarbonatopløsning. Perlerne blev så tørret ved 75 til 80°C. De fremkomne, tvær-15 bundne celluloseperler udviste stor fysisk styrke.

Eksempel XVI

3 g porøse cel!uloseperler blev tværbundet med formaldehyd ved 20 fremgangsmåden i eksempel XV. Perlerne blev så behandlet med 3 g 2-chlortriethylamin. Efter opvarmning af blandingen i 35 minutter til en temperatur på 80 til 85eC blev perlerne vasket i rækkefølge med natriumchlorid, natriumhydroxid, saltsyre, vand og ethanol. De derved fremkomne tværbundne porøse DEAE-cellu-25 loseperler udviste udmærket porøsitet og havde et hulrum større end 50 rumfangsprocent.

Eksempel XVII

30 Der blev dannet en dispersion af 0,5 g porøse celluloseperler i 5 ml 0,2 N natriumhydroxid og 5 ml epichlorhydrin. Dispersionen blev så opvarmet i 5 minutter til en tempertur på 80°C. Derefter blev perlerne vasket, og de tværbundne porøse perler udviste større styrke end de porøse celluloseperler før tvær-35 bindingen. Våde celluloseperler fremkommet ved fremgangsmåden i eksempel I blev vasket i acetone.

De vaskede perler blev så suspenderet i tør acetone indeholdende 0,6 ml triethylamin for hver gram cellulose. Tolylen- 23

DK 158005 B

2,4-diisocyanat i en mængde 1,6 ml pr. g celluloseperler blev sat til suspensionen ved 0°C. Efter en periode på 30 minutter blev perlerne vasket med tør acetone og derpå filtreret., De fremkomne porøse celluloseperler indeholder reaktionsdygtige 5 isocyanatgrupper, som så kunne hydrolyseres til en aminogrup-pe ved tilsætning af vand.

Eksempel XVIII

10 0,2 g af celluloseperlerne fremstillet i eksempel I blev sus penderet i 10 ml destilleret vand, pH-værdien blev indstillet til 11,5 ved tilsætning af 1 N NaOH ved 20°C. 0,2 g CNBr blev sat til suspensionen af celluloseperler, lidt ad gangen og pH-værdien blev opretholdt ved hjælp af et autot itrameter med 1 H 15 NaOH. Efter 20 minutter blev perlerne vasket med iskoldt destilleret vand og en passende pufferopløsning. Enzymer opløst 1 en passende pufferopløsning blev sat til de vaskede celluloseperler. Cellulose (Solka floc) anvendt ved denne fremgangsmåde blev merceriseret med 18% (vægt/rumf ang) NaOH i fire 20 timer og blev derefter vasket med destilleret vand.

Eksempel XIX

2 g sugetørrede celluloseperler fra eksempel I blev vasket med 25 acetone for at fjerne fugtighed og blev suspenderet i 10 ml acetone. En tiendedel ml triethylamin eller dibutyltindiacetat blev tilsat som katalysator. En tiendedel ml tolylen-2,4-d i -isocyanat eller hexamethy1 end i isocyanat blev sat til cellulo-seperlesuspensionen. Efter 45 minutters reaktion ved omgivel-30 sernes temperatur blev celluloseperlerne vasket med acetone for at fjerne overskud af diisocyanat, og vand blev derefter anvendt til at vaske celluloseperlerne for at fjerne acetone. Enzymer opløst i en passende stødpudeopløsning blev sat til celluloseperlerne. Celluloseperlerne blev lagret ved 4eC nat-35 ten over.

Eksempel XX

24

DK 158005 B

Aryldiisocyanat blev bundet til celluloseperler som beskrevet 1 eksempel XIX, Før enzymopløsningen blev tilsat, blev cellu-5 loseperlerne suspenderet i destilleret vand. En tiendedel ml triethylamin blev tilsat for at katalysere reaktionen mellem isocyanat og vand til dannelse af arylamincelluloseperler. Arylaminderivatet blev så diazoteret med NaN02 i HC1. Enzymer suspenderet i en passende stødpudeopløsning blev så bundet til 10 cel!uloseperlerne.

Eksempel XXI

Diisocyanat bundet på cellulosen ved fremgangsmåden i eksempel 15 XIX reagerer med vand til dannelse af aminogrupper med eller uden en tertiær amin som katalysator. GIutaraldehyd anvendes til at koble enzymet på celluloseperlerne ved tværbinding af aminogrupper på enzymer og på celluloseperler.

20 Eksempel XXII

2 g sugetørrede perler fremstillet i eksempel I blev suspenderet i 10 ml 3% glutaraldehyd, som var 0,1 M i Mg Cl2· Suspensionen blev opvarmet til 100eC i 30 minutter. Celluloseperler- 25 ne blev så vasket med destilleret vand. Enzymer opløst i en passende stødpudeopløsning blev sat til celluloseperlerne. Reaktionen fik lov at fortsætte natten over ved 4@C.

Eksempel XXIII 30 1 g celluloseperler fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel I blev opvarmet under tilbagesvaling med 10 ml 10% 3-amino-propyl triethoxysi1 an i toluol i 4 timer. Cel!uloseprøverne blev så filtreret og vasket med acetone. 2,5% (vægt/rumfang) 35 glutaraldehydopløsning i 0,1 M phosphatstødpude (pH = 7,0) blev sat til cel!uloseperlerne ved omgivelsernes temperatur i en time under lejlighedsvis omrøring. Celluloseperlerne blev så vasket grundigt med vand og en passende stødpudeopløsning.

25

DK 158005 B

Enzymer opløst i en passende stødpudeopløsning blev sat til celluloseperlerne. Reaktionen fik lov at fortsætte natten over ved 4°C.

5 Eksempel XXIV

Porøse celluloseperler fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel I blev først tværbundet med 36% formaldehyd og 37% HC1 med rumfangsforhold på 5 til 1. De tværbundne celluloseperler (5 g 10 tør vægt) blev suspenderet i 50 ml kold 1,5 N NaOH opløsning.

6 g 2-chlortriethylaminhydrochlorid blev sat til celluloseper-lerne. Blandingen blev så opvarmet til 80-85°C i 35 minutter. Blandingen blev afkølet i et isbad og filtreret. Celluloseper-lerne blev asket med 500 ml 2M NaCl og blev så vasket med 200 15 ml IN NaOH, og 200 ml IN NaOH skiftevis tre gange. Efter vask med yderligere 200 ml IN NaOH blev celluloseprerlerne vasket med destilleret vand, indtil pH-værdien af vaskevandet blev neutral. Reaktionen med 2-chlortriethylaminhydrochlorid blev gentaget igen for at få højere substitutionsgrad. Enzymer op-20 løst i en passende stødpude blev sat til celluloseperlerne natten over ved 4°C.

Eksempel XXV

25 Hexamethylendi isocyanat 'blev bundet til celluloseperler som beskrevet i eksempel 14, og derefter blev isocyanatgrupperne hydrolyseret til dannelse af aminogrupper som beskrevet i eksempel XX. 0-methy1 i sour i nstof blev sat til celluloseperlerne for at inkorporere guanidinofunktionen i de derivatiserende 30 perler.

Eksemplerne 18-23 beskriver immobilisering af enzymer med kovalent binding, hvorimod eksemplerne 24 og 25 beskriver ionisk adsorption. Glukoamylase, giukoseisomerase og invertase blev 35 fyldt på forskellige af perlerne fra eksempel XVIII til XXV, og omfanget af enzymbelastning blev målt.

Enzymerne immobi1 i seret ved kovalent binding blev vasket med 2M NaCl opløsning for at fjerne de absorberede enzymer. Nogle 26

DK 158005 B

egenskaber af de immobi1iserede enzymer er vist i tabel 2. Den viser, at samme kemi, som anvendes til cellulær cellulose, også kan anvendes til celluloseperler. Den omstændighed, at cel!uloseperlerne har højere kapacitet for belastning med 5 enzym end regulær cellulose, kan tyde på et større overfladeareal i de porøse celluloseperler.

Eksempel XXVI

10 Protein og enzymer kan adskilles og renses ved følgende fremgangsmåde. 2 g glykoseisomerase (Strep, albus fra Miles Laboratory) blev suspenderet i 20 ml 0,01M phosphatstødpude (pH = 7,0) og suspensionen blev centrifugeret. Den overliggende væske blev sat til en søjle af DEAE porøse celluloseperler frem-15 stillet ifølge eksempel XVI. Lejerumfanget var 30 ml og søjlediameteren 1,5 cm. Søjlen blev vasket med 0,01 M phosphatstødpude (pH = 7,0). Søjlen blev elueret med NaCl gradientopløsning i 0,01 M phosphatstødpude. 61ucoseisomerase begynder at elueres ud af søjlen i NaCl fraktionerne med koncentrationer, 20 der ligger fra 0,25 til 0,45 M.

25 30 35 27

DK 158005 B

Tabel 2._Enzymbelastning på porøse celluloseperler.

«r |SoLa:tnln8 på I

5 immobil!- IUX//g (be3fegnet

Enzymer sering reaktionsgrad)lge Prøvebetingelser

Eks. Regulær Porøse cellu- cellulose-lose perler

XVIII 820 1.800 10% maltose, 60°C

10 XIX 550 »

Glykoamylase XX 275 10% maltose, 40°C

(A. Oryzae) XXI 550 5% maltose, 60°C

XXII 80 190 10% maltose, 60°C

XXIII 200 " 15 Glykoamylase XXIV 3.000 9.000 ” (A. Niger) XXV 1.000 "

Glukose XIX 90 0,5M fruktose,60°C

Isomerase XXIV 300 " 20 (Strep. XXV 160 " albus)

Invertase XIX 1.140 0,125M sakkarose,45°C

(Candida XXIV 2.000 " utilis) XXV 1.840 " 25 * I-U - internationale enheder.

Eksempel XXVII

30 De porøse celluloseperler fra eksempel XIII sættes til en 0,05 M natriumacetatopløsning (pH = 5,2), som indeholder 1.600 dele kupri ion pr. million dele. Efter en time opsamlede cellulose-perlerne 6,3% kupriion beregnet på perlernes vægt.

35 De har også vist sig, at når de porøse celluloseperler ifølge opfindelsen tørres og/eller opvarmes f.eks. til 100°C før brugen, udviser de fremkomne perler en forøget fysisk styrke.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af porøse celluloseperler, 5 der er egnede til brug som bærere af enzymer og andre biologiske midler, kendetegnet ved, at man a) opløser et hydrolyserbart cellu1 osederivat i et indifferent organisk, med vand blandbart opløsningsmiddel i et forhold fra 10 1:20 til 1:3 vægt/rumfang til dannelse af en opløsning, der har en vægtfylde større end vægtfylden af den under b) anvendte udfældningsopløsning, b) fordeler denne opløsning i form af små dråber i en udfæld-15 ningsopløsning, der er blandbar med det under a) anvendte opløsningsmiddel, og som består af vand, en vandig opløsning af ikke-ioniske eller ioniske tensider, en blanding af vand og ethanol eller methanol eller en hydrocarbon eller hydrocarbon-blanding, hvorved cellulosederivatet udfældes i form af ens- 20 artet porøse perler, c) adskiller de udfældede perler fra opløsningen, d) vasker de adskilte porøse perler med vand, 25 e) hydrolyserer de vaskede perler for at omdanne perlerne til cellulose og for at forøge de aktive steder for binding af enzymer og andre biologiske midler, 30 f) vasker de hydrolyserede perler for at få porøse cellulose-perler, der har et ensartet fordelt hulrum større end 50 rumfangsprocent, og h) eventuelt tværbinder, enten før eller efter hydrolysen, de 35 porøse celluloseperler med mindst ét tværbindingsmiddel til fremstilling af tværbundne porøse celluloseperler.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man i trin (b) fordeler opløsningen ved sprøjtning. DK 158005 B

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man som cellulosederivat anvender celluloseacetat og udfører hydrolysen i en kaustisk opløsning.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at man som opløsningsmidlet anvender en blanding af (a) acetone, en blanding af acetone og methanol eller ethanol, methyl acetat, methylendichlorid og methanol, methylethylketon, 10 formamid og/eller dimethylsulfoxid, og (b) dimethylsulfoxid, formamid, methylacetat, cyklohexanon, methylendichlorid, ethylendichlorid, en blanding af methylen-dichlorid og methanol og/eller en blanding af ethylendichlo- 15 rid og methanol.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fremstiller perler med et porerumfang fra 75 til 95%.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man som tværbindingsmidlet anvender diisocyanat.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6* kendetegnet ved, at man som diisocyanat anvender tolylen-2,4-diisocyanat eller he- 2. xaimet'hylendi i socyanat.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man som tværbindingsmiddel anvender epichlorhydrin i en natri umhydroxidopløsni ng. 30

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man som tværbindingsmiddel anvender formaldehyd i saltsyreopløsning.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man som tværbindingsmiddel anvender glutaraldehyd.

11. Anvendelse af de ved fremgangsmåden ifølge krav 1-10 fremstillede porøse celluloseperler, eventuelt efter en forbehand- ling, til immobilisering af enzymer og andre biologisk aktive midler og til adskillelse og rensning af enzymer, proteiner og nukleinsyrer. DK 158005 B 5 10 15 20 25 35