DE2713458A1 - Verfahren zur herstellung von stickstoffhaltigen polysacchariden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von stickstoffhaltigen polysacchariden

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DE2713458A1 DE19772713458 DE2713458A DE2713458A1 DE 2713458 A1 DE2713458 A1 DE 2713458A1 DE 19772713458 DE19772713458 DE 19772713458 DE 2713458 A DE2713458 A DE 2713458A DE 2713458 A1 DE2713458 A1 DE 2713458A1
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Description

Verfahren zur Herstellung von stickstoffhaltigen
Polysacchariden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stick stoffhaltigen Polysacchariden mit Antitumoraktivität und anderen ausgezeichneten pharmakodynamischen Eigenschaften aus einem Pilz der Gattung Coriolus der Klasse der Basidiomyceten.
Es ist bekannt, daß ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung hergestellt werden kann durch Raffinieren des mit einem wässrigen Lösungsmittel erhaltenen Extrakts von Basidiomyceten. Dieses be kannte Verfahren hat jedoch einen schwerwiegenden Nachteil, da die Extraktionseffektivität bezüglich der aktiven Komponenten gering ist und deshalb die praktische Anwendbarkeit dieses Verfahrens zur industriellen Produktion von Antitumorsubstanzen ebenfalls gering ist. Das Raffinieren des Extraktes erfolgt durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Ausfällung mit
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einem organischen Lösungsmittel oder Gelfiltration, aber diese Raffinierungsmittel sind hinsichtlich ihrer Handhabbarkeit ziemlich ungeeignet und deshalb ist ein solches Verfahren zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt nicht geeignet. Die niedermolekularen Substanzen besitzen fast keine Hemmwirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung, schmecken bitter und haben einen unangenehmen Geruch, so daß das Vorhandensein solcher Substanzen bei Verwendung von Polysacchariden als Medikamente unerwünscht ist.
Es wurde nun gefunden, daß ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antitumorwirkung und verschiedenen anderen pharmakodynamischen Wirkungen in hoher Ausbeute erhalten werden kann, wenn ein zur Gattung Coriolus Polyporaceae der Klasse Basidiomycetes gehörender Pilz mit einer wässrigen alkalischen Lösung, die eine bestimmte Basizität aufweist, extrahiert wird und der erhaltene Extrakt mittels Ultrafiltration und/oder Hyperfiltration raffiniert wird.
Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharide mit einer ausgezeichneten Antitumoraktivität und verschiedenen anderen pharmakodynamischen Wirkungen aus einem
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zur Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilz herzustellen.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Herstellung von stickstoffhaltigen Polysacchariden mit Antitumoraktivität durch Extraktion eines zur Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilzes mit einem wässrigen Lösungsmittel vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Pilz der Gattung Coriolus Polyporaceae mit einer wässrigen, 0,01 η bis 2 η alkalischen Lösung extrahiert und dann den erhaltenen Extrakt zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 mittels Ultrafiltration und/oder Hyperfiltration raffiniert.
Der als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete zur Gattung Coriolus gehörende Pilz ist eine bekannte Pilzspezies und gehört zu den Polyporaceae der Klasse der Basidiomycetes. Zu diesen Spezien gehören beispielsweise Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. und Coriolus biformis (Klotz.) Pat. (siehe "Coloured Illustrations of Fungi of Japan" von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band I, 1974, und Band II, 1975). Die Pilze Coriolus versicolor (Fr.)
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Quel. (FERM-P Nr. 2414), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (FERM-P Nr. 988), Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2711) und Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P Nr. 2712) sind im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Chiba-shi, Japan) hinterlegt. Der Ausdruck "zur Gattung Coriolus gehörender Pilz" bezieht sich auf den Fruchtkörper und/oder das Mycel des Pilzes. Besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Verwendung ist das Mycel, das von einer künstlichen Kultur des Coriolus versicolor (Fr.) Quel. erhalten wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der oben genannte Pilz mit einer wässrigen, 0,01 bis 2 η alkalischen Lösung in der ersten Verfahrensstufe extrahiert und dann wird in der zweiten Verfahrensstufe der erhaltene Extrakt der Ultrafiltration und/oder Hyperfiltration unterworfen, um die niedermolekularen Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt zu entfernen.
Die Konzentration der alkalischen Lösung bei der erfindungsgemäßen Extraktion der Basidiomycetes liegt im Bereich von 0,01 bis 2 n, weil bei einer geringeren Konzentration als 0,01 η das Ergebnis kaum anders ist als bei einer Extraktion mit Wasser, während bei Konzentrationen von über 2 η eine Zersetzung eintreten könnte. Die Extraktion der Basidiomycetes kann zufriedenstellend
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durchgeführt werden, indem man 20 bis 600 Minuten lang bei einer Temperatur von 50 bis 1OO°C und vorzugsweise 80 bis 98°C mit einer alkalischen Lösung der obigen Konzentration extrahiert Es sei darauf hingewiesen, daß bei Extraktionstemperaturen von weniger als 50°C die Extraktion der aktiven Komponente unzureichend ist, während Extraktionen bei über 1000C zu einer Verringerung der Aktivität der erhaltenen aktiven Komponente aufgrund der Wärmeeinwirkung führen können. Die bevorzugte Extraktionszeit hängt jeweils von der Konzentration und der Temperatur der verwendeten alkalischen Lösung ab. Gewöhnlich wird es jedoch bevorzugt, bei einer im oben angegebenen Bereich liegenden Temperatur zu arbeiten und dementsprechend 20 bis 600 Minuten lang zu extrahieren. Es ist möglich, ein befriedi gendes Ergebnis durch eine einzige Extraktion zu erzielen, aber falls gewünscht kann die Extraktion auch mehrere Male wiederholt werden.
Für die alkalische Lösung können verschiedene alkalische Materi alien wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammonium- oder Calciumhydroxid usw. verwendet werden. Vorzugsweise werden Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid eingesetzt.
Der auf die oben beschriebene Weise erhaltene flüssige Extrakt wird in gewöhnlicher Weise mit einer Mineralsäure wie verdünnter Salzsäure neutralisiert und dann zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als
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5000 einer Ultrafiltration oder Hyperfiltration unterworfen. Die bisherige Praxis war, den Extrakt durch Aussalzen mit Ammoniuinsulfat, Dialyse, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel oder Gelfiltration zu raffinieren, aber diese Raffinierungsmethoden sind äußerst schlecht durchführbar und so war das Raffinierungsproblem bisher nicht zufriedenstellend gelöst. Die Wirkung aller genannten Raffinierungsmethoden wurde hinsichtlich der pharmakodynamischen Wirkung des raffinierten Produkts untersucht und es wurde gefunden, daß die Lösung des Raffinierungsproblems darauf hinausläuft, daß die niedermolekularen Substanzen aus dem Extrakt zu entfernen sind. Die Erreichung dieses Zieles sowie die Verwendung eines besser durchführbaren Verfahrens gelang, indem ein sehr wirksames Verfahren zum Entfernen niedermolekularer Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 entwickelt wurde, bei dem die Ultrafiltrations- und/oder Hyperfiltrationstechnik angewendet wird.
Das hervorstechende Merkmal der erfindungsgemäßen Raffinierungsmittel ist, daß die Substanzen nach ihrem Molekulargewicht fraktioniert werden, indem eine Membran, die als eine Art Molekularsieb bezeichnet werden kann, unter Druck verwendet wird. Beim Fraktionieren mittels einer solchen Membran bestimmen sich die Molekulargewichte gewöhnlich nach der Art der verwendeten Membran, da aber die Fraktionierwirkung hauptsächlich vom
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Molekulargewicht und der Konfiguration der Moleküle in der Lösung abhängt, sind die in den Katalogen kommerzieller Membranhersteller angegebenen Molekulargewichtsfraktionen und die üblicherweise verwendbaren Arbeitsbedingungen nicht immer für das erfindungsgemäße Raffinieren des erfindungsgemäß erhaltenen Extraktes anwendbar. So wurde festgestellt, daß eine Membran für den Molekulargewichtfraktionsbereich von 5000 bis 15000 und mit einer 98 bis 100 %igen Undurchlässigkeit für Cytochrome C (Molekulargewicht 13.000) als Standardmaterial zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren empfehlenswert ist. Die Arbeitsbedingungen bei Verwendung der oben genannten Membran hängen zu einem gewissen Ausmaß von der Größe und Form der verwendeten Vorrichtung, dem Extraktdurchsatz und anderen Faktoren ab, aber im Fall der Ultrafiltration wird gewöhnlich unter einem
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Druck von 0,5 bis 5 kg/cm , vorzugsweise 1 bis 4 kg/cm und
einer Temperatur von gewöhnlich 5 bis 70°C gearbeitet, wenngleich die Temperatur je nach verwendeter Membran schwanken kann. Im Falle der Hyperfiltration wird gewöhnlich bei einem
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Druck von 20 bis 35 kg/cm , vorzugsweise 20 bis 25 kg/cm und
einer Temperatur von 5 bis 200C gearbeitet.
Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß die Ultrafiltration geeignet ist zum Fraktionieren von Material mit einem Molekulargewicht von über 10.000, während die Hyperfiltration zum Fraktionieren von Material mit einem Molekulargewicht von weniger
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als 1000 geeignet ist. Ein Fraktionierwert von 500O, der beim erfindungsgemäßen Verfahren angestrebt wird, liegt zwischen den für die oben genannten Verfahren empfohlenen Bereichen, aber es konnte gezeigt werden, daß beide Verfahren durch geeignete Wahl der Membran zur Abtrennung von Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 geeignet sind. So können zum Raffinieren des beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Extrakts die Ultrafiltration und die Hyperfiltration entweder allein oder in Kombination verwendet werden, wobei die jeweilige Auswahl unter Berücksichtigung der Durchführbarkeit und der Effektivität erfolgt. Die aus dem flüssigen Extrakt entfernten Fraktionen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 haben fast keine Hemmwirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung, schmecken bitter und riechen unangenehm, so daß das Vorhandensein solcher niedermolekularer Substanzen nicht im geringsten von Vorteil sondern eher schädlich hinsichtlich des pharmakodynamischen Effekts des erfindungsgemäßen Endproduktes, einem stickstoffhaltigen PoIysaccharid, ist.
Der Extrakt, aus dem die niedermolekularen Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 nach den obigen Raffinationsverfahren entfernt worden sind, wird sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet und dann zu kommerziellen Produkten verarbeitet.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz ist leberbraun und hat einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8 % und in vielen Fällen von 3 bis 6 %. Die Substanz zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt , wird allmählich schwarz und zer setzt sich bei einer Temperatur von mehr als etwa 120°C. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz ist löslich in Wasser aber nahezu unlöslich in Alkohol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan. Sie ist ferner geschmack- und geruchlos.
Die Ergebnisse verschiedener mit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Substanz durchgeführter Farbreaktionen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1 (Farbreaktionentests)
Farbe
purpur
braun
Ergebnisse
Qd-Naphthol-Schwefelsäurereaktion (Molish-Reaktion)
Indol-Schwefelsäurereaktion (Disch-Reaktion)
Anthron-Schwefelsäurereaktion
Phenol-Schwefelsäurereaktion
Tryptophan-Schwefelsäurereaktion
Lowry-Folin-Verfahren
Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure
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Saccharide nachgewiesen
Saccharide
grünlich
blau 		Saccharide
braun Saccharide
purpur-
braun 		Saccharide
blau Peptid-
bindungen
grünlich
blau 		Od-Amino
säuren
-α
Die Ergebnisse der obigen Tabelle zeigen, daß die erfindungsgemäß erhaltene Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharid ist. Das Molekulargewicht dieser Substanz gemessen durch Ultrazentrifugation liegt bei 5000 bis 3OO.OOO und das mittlere Molekulargewicht zwischen 10.000 und 1OO.OOO. Auch nach anderen Meßverfahren wie durch Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran ergaben sich Werte von 10.000 bis 100.000. Deshalb kann mit großer Zuverlässigkeit angenommen werden, daß das mittlere Molekulargewicht der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz im Bereich von 10.0OO bis 100.0OO liegt.
Das erfindungsgemäß erhaltene stickstoffhaltige Polysaccharid zeigte nicht nur eine hohe Antitumoraktivität mit hoher Hemmwirkung gegen festen Sarcoma-180-Krebs in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung sondern erwies sich auch bei oraler Verabreichung als wirksam. Dies zeigt die gute Eignung des erfindungsgemäß erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharids als orales Antitumormittel an und in der Tat bestätigte sich die genannte Wirkung in einer Vielzahl von Experimenten. Die Nützlichkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz beschränkt sich nicht nur auf die Eignung als orales Antitumormittel sondern zeigt auch eine hohe Immunität-Rekonvaleszenz-Aktivität beim Patienten. Das heißt, sie ist nicht nur wirksam zur Verhinderung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie von Krebs oder einer Steigerung der Empfindlichkeit bei der Radiotherapie
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sondern auch zur Verhinderung der Verringerung der Immunität und der physischen Stärke des Patienten nach einer Operation oder einer Bluttransfusion und zur Vorsorge oder zum Schutz gegen Infektionskrankheiten durch Viren oder Bakterien aufgrund der Abnahme der Immunität oder der physischen Stärke. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz ergab außerdem eine ausgezeichnete Wirkung hinsichtlich der Verbesserung der Leberfunktion, der Zunahme des Appetits, der Beseitigung von Darmstörungen und der Förderung der Harnabgabe- Ferner ist die erfindungsgemäß erhaltene Substanz auch wirksam bei der Behandlung von Lepra.
Wie oben beschrieben, ist es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, ein stickstoffhaltiges Polysaccharid zu erhalten, das nicht nur bei intraperitonealer Verabreichung sondern auch bei oraler Verabreichung sowohl eine ausgezeichnete Antitumoraktivität als auch andere pharmakodynamisehe Wirkungen wie die oben genannten zeigt, wobei eine verhältnismäßig einfache Arbeitsweise angewendet wird und, wie die folgenden Beispiele zeigen, hohe Ausbeuten erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist also geeignet zur industriellen Herstellung eines Antitumormittels aus Basidiomycetes.
Beispiel 1
2OO g trockene Mycelen von Coriolus versicolor (Fr). Quel.
(FERM-P Nr. 2414) (Feuchtigkeitsgehalt: 8,8 %; Bruttostickstoff-
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-u-
gehalt: 2,5 %) wurden zu 4 Litern 0,1 η NaOH-Lösung gegeben und unter Durchmischen in einem siedenden Wasserbad bei einer Innentemperatur von 90 bis 95 C eine Stunde lang extrahiert. Dann wurde die Mischung auf unter 50 C abgekühlt und schrittweise mit 1 η HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 versetzt. Die Feststoffe wurden abgenutscht und mit 500 ecm Wasser gewaschen. Insgesamt wurden 4,2 Liter flüssiger Extrakt erhalten. Dieser flüssige Extrakt wurde dann der Ultrafiltration unterworfen, wobei ein "desk-top ultrafilter" der Amicon Inc. (Ultrafiltrationsmembran: PM-5) verwendet wurde. Unter Durchmischen und Kühlen und bei einem Druck von 1,5 kg/cm sowie einer Temperatur von 10°C wurden die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 abgetrennt. Anschließend wurde die Lösung konzentriert, so daß 300 ecm verarbeitete Lösung erhalten wurden. Diese Lösung wurde gefriergetrocknet und es wurden etwa 26,6 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 13,5 %) erhalten. Dieses Pulver hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5 % und die Elementaranalyse ergab folgende Zusammensetzung: C : 40,5 %; H : 6,2 %; N : 5,8 %; 0 : 47,5 %. (Der Prozentsatz für Sauerstoff wurde erhalten durch Abziehen der Summe der Prozentsätze der anderen Elemente von 1OO.) Die erhaltene Substanz war leicht löslich in Wasser. Sie zeigte ein Inhibitionsverhältnis von 90 % gegen festen Sarcoma-180-Tumor in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung und 65 % bei oraler Verabreichung.
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Die Antitumorwirkung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes wurde nach einer herkömmlichen Methode bestimmt, die im folgenden kurz beschrieben wird.
Sarcoma-180-Tumorzellen wurden in die Bauchhöhlen von Mäusen transplantiert. Nachdem die Zellen sieben Tage lang ausreichend gewachsen waren, wurden 10 dieser Zellen weiter unter die Haut der Achselhöhle anderer Mäuse zur Bildung fester Tumore transplantiert. Die Verabreichung des zu testenden Produkts begann 24 Stunden nach der Transplantation. Bei intraperitonealer Verabreichung wurden 20 Tage lang jeden zweiten Tag 10 mg/kg entsprechend einer Gesamtdosis von 0,2 ml je 20 g Körpergewicht der Maus verabreicht. Bei oraler Verabreichung wurde das erhaltene Produkt in Dosen von 1000 mg/kg je Verabreichung 20 Tage lang täglich verabreicht, was einer Gesamtdosis von O,2 ml je 20 g Körpergewicht der Maus entsprach. Am 25. Tag nach erfolgter Transplantation wurden die Tumore herausgenommen und das Inhibitionsverhältnis bezüglich des Tumorwachstums wurde aus dem mittleren Tumorgewicht bei den behandelten Mäusen und dem mittleren Tumorgewicht bei nicht behandelten Kontrollmäusen berechnet.
Für Vergleichszwecke wurde die Extraktion und die Raffinationsbehandlung unter den gleichen Bedingungen wie beim erfindungsgemäßen Verfahren aber unter Verwendung von Wasser anstelle von 4 Litern 0,1 η NaOH-Lösung durchgeführt. Die Produktausbeute
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betrug 7,8 % oder etwa 60 % der Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren.
Beispiel 2
500 g lebende Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414) (Feuchtigkeitsgehalt: 70,8 %; Bruttostickstoffgehalt: 2,6 % berechnet auf Trockenbasis) wurden zu 2 Litern Wasser gegeben und 10 bis 20 Minuten lang mit einem Saftmischer gemahlen. Dann wurde die Mischung allmählich mit 500 ecm 1 η NaOH-Lösung versetzt und in einem heißen Wasserbad zwei Stunden bei 90 bis 95°C extrahiert. Anschließend wurde mit HCl neutralisiert und dann gewaschen. Die Abtrennung der Zellen erfolgte gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1. Der erhaltene Extrakt wurde der Ultrafiltration unterworfen, wobei ein "desk-top ultrafilter" (Ultrafiltrationsmembran: G-05T-Membran der Bio-Engineering Co.) verwendet wurde. Nach Abtrennung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 wurde die Lösung konzentriert und gefriergetrocknet. Es wurden 24,2 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 15,1 %) erhalten. Dieses Pulver besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,6 % und einen Bruttostickstoffgehalt von 6 % sowie einen unlöslichen Teil von etwa 20 %, wenn es in Wasser gelöst wurde. Der restliche Teil war in Wasser gut löslich. (Elementaranalyse: C : 41,2 %; H : 6,1 %; N : 6,0 %; 0 : 46,7 %; Sauerstoffgehalt durch Ergänzung auf 100) Dieses Pulver wurde aufgelöst und nach Entfernen des Unlöslichen mittels eines
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Filterpapiers (Nr. 5c) wurde die Hemmwirkung gegenüber festem Sarcoma-180-Tumor in Mäusen geprüft. Das Produkt zeigte ein Inhibitionsverhältnis von 93 % bei intraperitonealer Verabreichung und 70 % bei oraler Verabreichung.
Beispiel 3
2 kg trockene Zellen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414) (Feuchtigkeitsgehalt: 8,0 %, Bruttostickstoffgehalt: 2,5 %) wurden zu 2O Litern 0,4 η NaOH-Lösung gegeben und in einem mit einem Heiz-/Kühl-Mantel und einem Rührer ausgestatteten Extraktionskessel unter Durchmischen einer zweistündigen Extraktion unterworfen, wobei die Temperatur des Heiz-/Kühl-Mantels so eingestellt wurde, daß die Innentemperatur 90 bis 95°C betrug. Die extrahierte Aufschlämmung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 durch portionsweise Zugabe von 2 η HCl unter Rühren wurden die festen Rückstände durch Zentrifugieren vom flüssigen Extrakt abgetrennt. Die festen Rückstände wurden mit 20 Litern 0,4 η NaOH-Lösung vermischt und zwei Stunden einer nochmaligen Extraktionsbehandlung bei 90 bis 95°C unterworfen. Anschließend wurde wiederum gekühlt, neutralisiert und die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, um einen flüssigen Extrakt und feste Rückstände zu erhalten. Die letzteren wurden wiederum eine Stunde lang einer Extraktionsbehandlung wie oben beschrieben mit 0,4 η NaOH-Lösung unterworfen, um einen Extrakt zu erhalten.
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Diese dreimal wiederholte Extraktion ergab insgesamt etwa 58 Liter flüssigen Extrakt. Dieser flüssige Extrakt wurde mittels eines Vakuumkonzentrators auf etwa 10 Liter konzentriert und dann der Ultrafiltration unterworfen (HFA-180-Membran der Abcor Inc.). Die Ultrafiltration erfolgte bei 10°C und unter
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einem Druck von 2,11 kg/cm , um die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 zu entfernen. Anschließend wurde nochmals konzentriert, so daß etwa 5 Liter verarbeitete Lösung erhalten wurden. Außerdem wurden etwa 70 Liter verarbeiteter Lösung, die die niedermolekularen Substanzen enthielten und bei der Ultrafiltration angefallen waren, einer Hyperfiltration (unter Verwendung einer AS-205-Membran der Abcor Inc.) unterworfen, um die niedermolekularen Substanzen zu entfernen. Dann wurde wiederum konzentriert, so daß etwa 5 Liter verarbeitete Lösung erhalten wurden. Die Arbeitsbedingungen bei dieser Behandlung waren wie folgt: mittlerer Druck: 25 bis 30 kg/cm ; Behandlungstemperatur: etwa 10 C. Dann wurden die bei der Ultrafiltration und der Hyperfiltration erhaltenen Lösungen vereinigt und 10 Liter der vereinigten Lösung wurden durch Sprühtrocknen pulverisiert, wobei etwa 3 95 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 19,9 %) erhalten wurden. Dieses Pulver besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 7 % und seine Elementaranalyse ergab folgende Ergebnisse: C : 40,8 %; H : 6,0 %; N : 4,0 %; 0 : 49,2 %. Das Inhibitionsverhältnis dieses Produktes gegenüber festem Sarcoma-180-Tumor in Mäusen
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betrug 92 % bei intraperitonealer Verabreichung und 70 % bei oraler Verabreichung. Es war gut löslich in Wasser.
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Claims (10)

  1. Patentansprüche
    / 1./ Verfahren zur Herstellung von stickstoffhaltigen Polysacchariden mit Antitumoraktivität durch Extraktion eines zur Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilzes mit einem wässrigen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pilz der Gattung Coriolus Polyporaceae mit einer wässrigen, 0,01 η bis 2 η alkalischen Lösung extrahiert und dann den erhaltenen Extrakt zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 mittels Ultrafiltration und/oder Hyperfiltration raffiniert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz einen künstlichen oder natürlichen Fruchtkörper und/oder ein Mycel verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz Coriolus versicolor (Fr.) Quel verwendet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bezogen auf das Gewicht des Pilzes einen 5- bis 200-fachen Überschuß an wässriger alkalischer Lösung verwendet.
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    ORIGINAL INSPECTED
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als wässrige alkalische Lösung eine Natriumhydroxidlösung verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einer Temperatur von 80 bis 98°C durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Entfernung der niedermolekularen Substanzen unter Druck durchführt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    die Ultrafiltration unter einem Druck von 0,5 bis 5 kg/cm durchführt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    die Hyperfiltration unter einem Druck von 25 bis 35 kg/cm durchführt.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polysaccharid mit einem Stickstoffgehalt von 2 bis 8 Gew.% herstellt.
    ka:kö
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DE2713458A 1976-07-07 1977-03-26 Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Polysacchariden Expired DE2713458C2 (de)

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