DE2710264A1

DE2710264A1 - Verfahren zur bewertung eines immunkomplexes und analyse seiner bestandteile

Info

Publication number: DE2710264A1
Application number: DE19772710264
Authority: DE
Inventors: Roland Jacob Levinsky; John Farrar Soothill
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1976-11-24
Filing date: 1977-03-09
Publication date: 1978-06-01
Also published as: ZA771399B; US4141965A; DE2710264B2; JPS5369824A; DE2710264C3; AU2310977A; GB1590524A

Description

KRAUS & WEISERT 271026

ΓΑΤΕ NTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DtPLOMCHEM KER · DR-ING. AN N EKÄTE WEISERT DIPL-INS. FACHRICHTUNG CHEK IR MGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON Ο8Θ/797Ο77-79 7O 78 · TELEX Ο5-212156 kpal

TELEGRAMM KRAUSPATENT

-s-

1480 AYi/rm

NATIONAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION, London,

England

Verfahren zur Bewertung eines Inmunkomplexes und Analyse

seiner Bestandteile

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewertung von Immunkomplexen und die Analyse ihrer Bestandteile.

In den vergangenen Jahren hat man immune Antigen-Antikörper-Komplexe in Verbindung mit der Pathogenese vieler menschlicher Krankheiten, wie beispielsweise systemischer Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis, bestimmter Formen von Glomerulonephritis und chronischen inflammatorischen Darm- bzw. Eingeweidekrankheiten, gebracht. Die

809822/0505

Bestimmung und Bev/ertung von Immunkomplexen und ihren Bestandteilen ist für die Behandlung dieser Krankheiten von großer Bedeutung. Keine der zur Zeit verfügbaren Nachweis- und Bewertungsverfahren sind jedoch zufriedenstellend. Den physikalisch-chemischen Verfahren fehlt im allgemeinen die erforderliche Empfindlichkeit, wohingegen biologische Verfahren, obgleich sie empfindlicher sind, oft sehr komplex sind oder nur begrenzt verwendbar sind und oft die Verwendung lebender Zellen oder menschlicher Reagentien erfordern. Dies bewirkt, daß diese Verfahren für eine breite Anwendung in Krankenhauslaboratorien ungeeignet sind. Beispielsweise wurde kürzlich die Bestimmung von IgG-Komplexen durch Inhibierung der Agglutination von IgG-beschichteten Latexteilchen durch den rheumatoidisehen Faktor oder C1q, der die Komplexe verursacht, vorgeschlagen (Lurhuma et al (1976) "Clin. Exp. Immunol.", 25, 212). Dieses letztere Verfahren ist ungeeignet, da menschliche Reagentien, C1q und rheumatische Paktoren verwendet werden müssen, von denen die rheumatischen Faktoren nur von kranken Patienten erhalten v/erden können. Es ist weiterhin auf den Nachweis der IgG-Komponente von IgG-Komplexen beschränkt.

Es wurde jetzt ein einfaches und wirksames Verfahren für den Nachweis und die Bewertung von Immunkomplexen entwikkelt, bei dem charakterisierte nicht-menschliche Reagentien verwendet werden und das zusätzlich die Analyse der Bestandteile der Komplexe ermöglicht.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bewertung bzw. Bestimmung eines Immunkomplexes und die Analyse seine Bestandteile, das einen Latexteilchen-Agglutinationstest

809822/0 50 5

umfaßt. Bei dem Verfahren wird eine Probe, die einen Immunkomplex enthält, mit beschichteten bzw. überzogenen Latexteilchen und IgM-Antikörpern inkubiert. Die Latexteilchen sind mit dem Komplexbestandteil beschichtet und die IgM-Antikörper sind nicht-menschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität gegenüber dem Komplexbestandteil.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man irgendeinen Bestandteil des Immunkomplexes analysieren, vorausgesetzt, daß der Bestandteil zur Bildung nicht-menschlicher IgM-Antikörper verwendet werden kann, und vorausgesetzt, daß der Bestandteil fähig ist, an Latexteilchen zu haften bzw. mit den Latexteilchen eine Bindung einzugehen. So kann der Antikörperbestandteil, beispielsweise IgM, IgG oder IgA oder komplementäre Komponenten, beispielsweise C-,_f eines Komplexes nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden. Das Verfahren kann ebenfalls zur Analyse von Antigenbestandteilen eines Komplexes verwendet werden, beispielsweise zur Analyse viraler, bakterieller oder anderer antigener Materialien, die eine Komplexbildung ergeben.

Es wird angenommen, daß Immunkomplexe KrankheitsSymptome, insbesondere Gewebeschäden, verursachen und somit kann das Verfahren entweder als solches oder zusammen mit anderen klinischen Testverfahren für die Diagnose und den Nachweis von Krankheiten verwendet werden, die mit Immunkomplexen assoziiert sind. Beispielsweise kann das Verfahren zur Verfolgung der Behandlungswirkung, beispielsweise der Chemotherapie oder Plasmapherese, auf die Gehalte an vorhandenem Immunkomplex, beispielsweise in dem Blutstrom eines Patienten, verwendet werden.

809822/0505

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beschichteten Latexteilchen werden hergestellt, indem man den Komplexbestandteil, der analysiert werden soll, an Latexteilchen bindet^ und charakteristischerweise liegen sie in einer für Latexteilchen-Agglutinationstests geeigneten Form vor. Einige Komplexbestandteile, bemerkenswerterweise IgG, können eine spontane Bindung bei dem Kontakt mit Latexteilchen eingehen und in einigen Fällen können beschichtete Latexteilchen aus solchen Bestandteilen durch direkte Zwischenwirkungen des Bestandteils und der Latexteilchen hergestellt werden. Andere Bestandteile jedoch, einschließlich andere Immunoglobulinklassen, wie IgM und IgA, widerstehen einer spontanen Bindung bzw. Haftung und es kann somit wünschenswert sein, ein Kupplungsreagens zum Verbinden einiger Komplexbestandteile an die Latexteilchen zu verwenden. Man kann irgendein geeignetes Kupplungsreagens oder eine geeignete Aktivierungsbehandlung verwenden.

Es wurde gefunden, daß bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform Dlnitrophenol (DNP) ein besonders geeignetes Kupplungsreagens zum Beschichten der Latexteilchen mit Komplexbestandteilen ist. Im allgemeinen ermöglicht die Vorbehandlung des Komplexbestandteils mit DNP eine Beschichtung der Latexteilchen mit dein Komplexbestandteil, der sonst einer Bindung widersteht. Normalerweise wird 2,4-Dinitrophenol verwendet, obgleich andere Dinitrophenole ebenfalls verwendet werden können. DNP kann als Kupplungsreagens für die Bindung bzw. Haftung anderer biologisch aktiver Materialien an Latexteilchen außer den Komplexbestandteilen, beispielsweise Antikörper, antigene Bestandteile und Komplementbestandteile verwendet werden.

809822/0505

Es können auch Latexteilchen, die durch DNP-Bindung bzw. DNP-Verkniipfung entweder mit Komplexbestandteilen oder mit einem anderen biologisch aktiven Material beschichtet sind, außer der Immunkomplexanalyse bei anderen Anwendungen verwendet werden. Beispielsweise ergeben Latexteilchen, die nach dem DNP-Verfahren mit einem Antigen, das für einen besonderen Antikörper spezifisch ist, beispielsweise einem viralen Antigen beschichtet sind, ein Produkt, das in Anwesenheit des Antikörpers für das Antigen agglutiniert und das als billiger und einfacher diagnostischer Test für den Antikörper verwendet werden kann.

Die Erfindung betrifft somit außerdem die Verwendung von DNP zum Beschichten bzw. Überziehen von Latexteilchen mit biologisch aktiven Materialien allgemein, Latexprodukte, die nach dem DNP-Verfahren beschichtet bzw. überzogen sind, und die breite Verwendung bzw. Anwendung dieser Produkte. Ohne daran gebunden zu sein, wird angenommen, daß die DNP-Bindung über Tyrosingruppen, die in dem biologischen Material vorhanden sind, erfolgt und das DNP-Verfahren kann spezifischer zum Binden biologisch aktiver Materialien, die Tyrosingruppen enthalten, an Latexteilchen verwendet werden.

Die bei dem Immunkomplexprüf- bzw. -analyseverfahren verwendeten, nicht-menschlichen IgM-Antikörper mit niedriger Affinität werden in Tieren gezüchtet, die für den Komplexbestandteil, der analysiert werden soll, geeignet sind. Für die Herstellung dieser Antikörper reichen für Laborzwecke kleine Tiere, wie Kaninchen und Meerschweinchen, aus. Für eine Produktion in größerem Maßstab sind jedoch

809822/0505

größere Tiere, wie Schafe, Kühe oder Pferde, geeigneter. Im allgemeinen wird der Immunkomplexbestandteil, bevorzugt in gereinigter Form, in das Tier injiziert. Das Tier wird anschließend ausgeblutet bzw. dem Tier wird Blut entnommen und aus dem Antiserum wird der IgM-Bestandteil mit niedriger Affinität abgetrennt. Bevorzugt wird die Ausbeute an IgM mit niedriger Affinität im Hinblick auf verschiedene Faktoren optimiert, was dem Fachmann geläufig ist. Beispielsweise können den Tieren injizierte Konzentrationen an Immunkomplexbestandteil, die Verwendung von Adjuvantien und der Ort der Injektion Einfluß auf die anschließende Ausbeute an Antikörper besitzen. Insbesondere kann ebenfalls die Zeit, die man nach der Injektion und vor der Blutentnahme an den Tieren vergehen läßt, die verschiedenen in dem Antiserum vorhandenen Antikörperkomponenten beeinflussen. Es wurde gefunden, daß für eine zufriedenstellende Bildung an IgM mit niedriger Affinität eine Zeit von etwa 10 Tagen bei Kaninchen nach der Injektion mit gereinigtem Menschen-Immunoglobulin Klassen IgA und IgG in Freund's vollständigem Adjuvans geeignet ist. Im allgemeinen wird angenommen, daß ähnliche Zeiten geeignet sind, eine ausreichende IgM-Bildung mit niedriger Affinität bei anderen menschlichen Immunoglobulinen, beispielsweise IgM und IgE, zu erhalten.

Charakteristischerweise v/irken die nicht-menschlichen IgM-Antikörper mit niedriger Affinität spezifisch ein auf den Komplexbestandteil, gegenüber dem sie gezüchtet wurden, und diese Einwirkung bzw. Zwischenwirkung ist typischerweise leicht reversibel, sofern nicht der Bestandteil in einer aggregierten Form, beispielsweise als Komponente eines

809822/0505

27Ί026Α

Immunkomplexes oder als Überzug auf Latexteilchen, vorliegt. Bei der Inkubierung wirken die IgM-Antikörper stark ein sowohl auf die Latexteilchen, die mit dem entsprechenden Komplexbestandteil überzogen sind, und bewirken eine Latexteilchenagglutination, und ebenfalls auf irgendeinen Immunkomplex, enthaltend den besonderen Bestandteil, der in dem Inkubat vorhanden ist. Immunkomplexe können so bestimmt und ihre Bestandteile analysiert werden durch Inhibierung der Agglutination, die sie verursachen. Je größer die Konzentration an Immunkomplex ist, umso weniger an IgM ist für die Agglutination der Latexteilchen vorhanden. Beispielsweise kann eine Immunkomplex enthaltende Probe mit beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern vermischt werden, die bevorzugt in solchen Verhältnissen vorhanden sind, daß sie in Abwesenheit der Probe einen bekannten Agglutinationswert ergeben, und inkubiert werden. So kann anschließend die Inhibierung der Agglutination nach einem geeigneten Verfahren gemessen werden.

Im allgemeinen ist es wünschenswert, Immunkomplexe als Komponenten des Blutstroms eines Patienten zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls zur Bestimmung von Immunkomplexen in anderen Medien, beispielsweise anderer physiologischer fluider Materialien, wie Urin, verwendet werden. Die Proben stammen so im allgemeinen aus Serum oder anderen physiologischen fluiden Materialien und werden, bevor sie bei dem Immunkomplextest eingesetzt werden, auf geeignete Welse vorbehandelt. Beispielsweise wird Serum vorteilhafterweise vor dem Test entkomplementiert (d.h. das Komplement wird entfernt), da freie C₁-Komplementkomponenten, die in dem Serum vorhanden sein können, bei dem

809822/0505

Versuch stören können und falsche Ergebnisse verursachen können. Die Sera können durch Wärmebehandlung entkomplementiert werden. Dies ist im allgemeinen jedoch nicht zufriedenstellend, da die Wärmebehandlung üblicherweise eine unerwünschte Aggregation von Protein ergibt, was falsche positive Ergebnisse bei dem Versuch bewirken kann. Ein bevorzugtes Entkomplementierungsverfahren für Sera besteht in der Behandlung mit EDTA zur Freisetzung von C1 , das dann durch ein Immunoabsorbens, beispielsweise Sigma-Zell IgQ entfernt wird. Diese bevorzugte Entkomplementierungsbehandlung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung und ist für die Entkomplementierungen von fluiden Materialien, die biologisches Material enthalten, allgemein vielfach anwendbar.

Nach der Entkomplementierung und/oder anderer erforderlicher Vorbehandlungen werden die Proben, beispielsweise die Serumproben, mit beschichteten Latexteilchen und nichtmenschlichen IgM-Antikörpern niedriger Affinität vermischt. Das Inkubat ist im allgemeinen wäßrig und die Inkubation wird vorzugsweise unter Rühren bzw. Bewegen während einer Zeit durchgeführt, die ausreicht, die Umsetzung zu beenden.

Anschließend nach der Inkubation kann die Inhibierung der Agglutination der Latexteilchen auf irgendeine geeignete Weise gemessen bzw. Überwacht werden. Beispielsweise kann ein einfacher Objektträger-Asglutlnationstest verwendet werden, d.h. man verläßt sich direkt auf einen visuellen Vergleich. Bevorzugt wird jedoch eine elektronische Teilchenzählvorrichtung, wie ein Coulter-Zähler (Coulter

809822/0505

27Ί026Α

Electronics Ltd.), verwendet. Beispielsweise kann diese Vorrichtung bevorzugt so programmiert sein, daß sie nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt.

Bei dieser letzteren Art kann die Wahl der Latexteilchengröße wichtig sein. Beispielsweise wurde in der Praxis gefunden, daß Latexteilchen mit einer Größe entsprechend einem Durchmesser von etwa 1,15 um bevorzugt sind, wenn ein Coulter-Zähler verwendet wird, der so programmiert ist, daß er nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt. Kleinere Teilchen, beispielsweise mit einem Durchmesser unter 0,8 um, oder größere Teilchen, beispielsweise mit einem Durchmesser über 1,5 Jim, können durch andere Teilchen, beispielsweise Plättchen oder Aggregate, die in den Proben vorhanden sind, beeinflußt werden bzw. Interferenzerscheinungen können auftreten.

Die Reagentien, die bei der erfindungsgemäßen Immunkomplexanalyse bzw. dem erfindungsgemäßen Immunkomplexassay verwendet werden, können dem Verbraucher in Form von Kits bzw. Bestecken geliefert werden. Die Kits bzw. Bestecke bzw. Reagenssätze (diese Ausdrücke werden in der vorliegenden Anmeldung synonym verwendet) sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise umfaßt ein Besteck für die Bestimmung eines Immunkomplexes und die Analyse der Bestandteile des Komplexes typischerweise nicht-menschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität für den Bestandteil des Komplexes, Latexteilchen, die mit dem Bestandteil beschichtet sind, und zweckdienlicherweise ebenfalls ein Immunoabsorbens (Immunoabsorptionsmittel), beispielsweise Sigma-Zell-IgG, und EDTA für die Dekomplementierung bzw. Entkomplementierung (d.h. Entfernung des Komplements) der

809822/0505

Probe. Man kann weiterhin Kits herstellen bzw. liefern für die Bestimmung eines Bereichs unterschiedlicher Arten von Immunkomplexen und die Analyse für einen Bereich von Komplexbestandteilen. Ein solches Kit kann so den entsprechenden Bereich nicht-menschlicher IgM-Antikörper mit niedriger Affinität und beschichteter Latexteilchen enthalten. Normalerweise werden diese Kits zusammen mit Anleitungen bzw. Gebrauchsanweisungen oder anderen Angaben geliefert, so daß der Verbraucher den erfindungsgemäßen Immunkomplexversuch durchführen kann, der vorzugsweise nur geringe Laborkenntnisse erfordert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Zeichnungen näher erläutert.

Figur 1 ist eine Standardkurve für die Inhibierung von Latexteilchenagglutination gegenüber der IgG-Konzentration;

Figur 2 ist eine graphische Darstellung in Punktform und stellt die Inhibierung der Latexteilchenagglutination dar, die durch Sera von Patienten verursacht wird, die an systemischer Lupus erythematosus (SLE) leiden;

Figur 3 ist eine Reihe von graphischen Darstellungen, die die klinische Geschichte von Patienten darstellen, die an Lupus nephritis leiden, und

Figur 4 ist die graphische Darstellung der IgA- und IgG-Komplexaktivitäten abgetrennter Fraktionen aus

809822/0505

Serum von einem Patienten, der an Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet.

Beispiel 1 Antikörper-Herstellung:

IgM-Antikörper mit niedriger Affinität gegenüber menschlichen Immunoglobulinklassen IgA, IgM und IgG, die bei dem erfindungsgemäßen Immunkomplexversuch verwendet werden, werden getrennt folgendermaßen hergestellt. Hochreines IgA und hochreines IgM werden aus Myelom-Sera und IgG aus gesammeltem frisch gefrorenem Plasma durch DEAE-52-Ionenaustauschchromatographie gewonnen. 10 mg von federn der gereinigten Immunoglobuline in vollständigem Freund's Adjuvans werden dann subkutan an vier verschiedenen Stellen in Kaninchen injiziert, denen 10 Tage nach der ersten Injektion Blut entnommen wird.

Die erhaltenen Sera werden an einer Sephadex-G200-Säule getrennt und die IgM-Peaks werden gesammelt und auf das Ausgangsvolumen durch Ultrafiltration konzentriert. Eine in dem so gebildeten IgM-Antiserum vorhandene Leichtkettenepezifizität * wird durch Sepharose

(Fab )₂-Inimunoabsorbenssäulen herausabsorbiert, wobei man ein monospezifisches Antiserum erhält. Es wurde gefunden, daß eine Zeitdauer von 10 Tagen zwischen der Injektion und der Blutentnahme reproduzierbare Ausbeuten mit hohem Titer, aber IgM-Antikörper mit niedriger Affinität ergibt, die keine nennenswerten Ausfällungsantikörper oder Antikörper mit hoher Affinität enthalten.

609822/0506

Beispiel 2

Beschichten der Latexteilchen:
IgA:

10 mg gereinigtes menschliches IgA in 1 ml Salzpuffer werden 3 h bei 37°C gegenüber 10% w/v Natriumbicarbonat dialysiert. 3 JiI Dinitrophenol (DNP) werden zugegeben und die Reaktionsteilnehmer werden bei 37°C konstant vermischt, bis eine hellgelbe Farbe erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt wird die Umsetzung durch Zugabe eines gleichen Volumens Benzol, wodurch überschüssiges DNP extrahiert wird, beendet. Die entstehende DNP-IgA-Lösung wird dann durch Dialyse während 24 h gegenüber 1/4 konzentrierter O,27M-Glycinsalzlösung, pH 8,2, -gereinigt..

800 ul einer 10#igen w/v-Latexsuspension (durchschnittlicher Teilchendurchmesser 1,15 Mm), hergestellt von Coulter Electronics, werden zweimal in 1/4 konzentrierter 0,27M-Glycinsalzlösung, pH 8,2, gewaschen. Die Latexteilchen werden von der Waschflüssigkeit zwischen und nach dem Waschen durch Zentrifugieren bei 10000 Upm abgetrennt. Schließlich werden sie in 20 ml 1/5 konzentriertem Puffer resuspendiert. 40 iig der wie oben hergestellten DNP-IgA-Lösung werden dann pro mg Trockengewicht Latex zugegeben. Das gesamte Reaktionsgemisch wird 30 bis 60 min bei Zimmertemperatur vermischt. Das entstehende, mit IgA beschichtete Latexprodukt wird zweimal mit 1/5 konzentriertem Puffer gewaschen und in 20 ml konzentrierter O,27M-Glycinsalzlösung, enthaltend 0,196 Menschenserumalbumin (HSA), wodurch irgendwelche freien Stellen, die an den Latexteilchen verbleiben,

809822/0505

blockiert werden, wieder suspendiert. Die so erhaltene Suspension aus mit IgA beschichteten Latexteilchen ist für die Bestimmung von Immunkomplexen, die einen IgA-Bestandtell enthalten, geeignet.

Außer IgA können auch andere Materialien, die einer spontanen Bindung an Latexteilchen widerstehen, nach DNP-Verfahren im wesentlichen, wie oben ausgeführt, gebunden werden, wobei das besondere Material anstelle von IgA bei dem Reaktionsschema verwendet wird. Beispiele für Materialien, die nach DNP-Verfahren gebunden werden können, sind andere Immunoglobulinklassen, wie IgM oder IgE, oder andere Typen von Materialien, wie Ovalbumin, Rindermilchbestandteile oder lösliche virale oder bakterielle Antigene.

Allgemein wird ein ähnliches Verfahren, wie oben beschrieben, zum Beschichten von Latexteilchen mit Materialien, wie IgG und HSA, die eine spontane Bindung eingehen, verwendet, ausgenommen, daß die DNP-Aktivierung weggelassen wird.

Beispiel 3
Immunkomplextest:

Seraproben aus Patienten werden zuerst folgendermaßen entkomplementiert: 50 ul aliquote Teile von Sera werden während 10 min bei Zimmertemperatur mit 50-u 1-Mengen von 0,2M-EDTA, pH 7,6, zur Freigabe von C1q inkubiert. Das C1q wird dann aus den Proben durch Zugabe geeigneter Mengen aus Sigma-Zell-IgG-Immunoabsorbens, suspendiert mit 5,5-Diäthylbarbitursäure gepufferter Salzlösung, pH 7,4, entfernt. An-

809822/0505

schließend werden die Proben während weiterer 20 min bei Zimmertemperatur inkubiert, und dann wird das Sigma-Zell-IgG durch Zentrifugieren entfernt. Andere Verfahren zur Entkomplementierung der Sera einschließlich der Verwendung ähnlicher Immunoabsorbentien können verwendet werden, obgleich normalerweise die Entkomplementierung durch Wärmebehandlung ungeeignet ist, da eine Aggregation von Proteinen auftritt, die falsche positive Ergebnisse bei dem Versuch ergeben kann.

Der nicht-menschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität (hergestellt wie im Beispiel 1) wird mit den entsprechenden beschichteten Latexteilchen (hergestellt wie im Beispiel 2), beispielsweise mit menschliche» IgA beschichteten Latexteilchen, titriert bzw. bestimmt und die Konzentration, die eine 7O#ige Agglutination des Latex ergibt, wird bestimmt. Eine 100-iil-Probe an entkomplementiertem Testserum, verdünnt auf 1 : 10, wird mit 100 iil Antikörper mit niedriger Affinität geeigneter Konzentration zusammen mit 100 iil beschichteten, beispielsweise mit IgA beschichteten, Latexteilchen vermischt. Das gesamte Reaktionsgemisch wird dann in einem Plastikrohr auf einer Rotationsmischvorrichtung 30 min bewegt. Danach werden die Latexteilchen 1 : 500 in Isoton (Coulter Electronics) verdünnt. Die Anzahl der nicht-agglutinierten Teilchen wird in einem Coulter-Zähler Modell B gezählt, der so programmiert ist, daß er nur die einzelnen Teilchen und keine Aggregate zählt.

Der Antikörper mit niedriger Affinität reagiert stark sowohl mit beschichteten Latexteilchen als auch dem Komplex und somit wird durch die Anwesenheit des Komplexes die Agglutination von Latexteilchen inhibiert.

809822/0505

Beispiel A

Herstellung einer Standardvergleichskurve:

Der oben beschriebene Immunkomplextest wird durchgeführt, indem man anstelle von Sera Testlösungen verwendet, die bekannte Konzentrationen zusammengeballtes IgG enthalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem beigefügten Diagramm von Figur 1 dargestellt. Figur 1 zeigt eine Standardkurve A der Prozent-Agglutination (vertikale log-Probit-Skala) gegenüber der Konzentration an zusammengeballtem IgG im Glycinsalzpuffer in mg/u1 (horizontale logarithmische Skala) und zeigt ebenfalls die Ergebnisse, die bei der Kurve B für monomeres IgG erhalten werden, die keine bemerkenswerte Inhibierung der Agglutination zeigt.

Die Standardkurve A kann als semi-quantitativer Vergleich verwendet werden, aus der die Immunkoaplexkonzentrationen von den Agglutinationsinhibierungsergebnissen extrapoliert werden können. Die log-Probit-Skala der vertikalen Achse der Figur 1 ist eine statistisch angeordnete Skala, die zuvor für die Darstellung von quantitativen Hämagglutinationsergebnissen verwendet wurde.

Beispiel 5

Der Immunkomplextest von Beispiel 3 für die Bestimmung der IgG-Komplexe wird an dem von Komplement befreiten Serum von 24 Patienten , die an systemischer Lupus erythematosus (SLE) leiden, angewendet, wobei IgM-Antimenschen-IgG-Antikörper mit niedriger Affinität von Kaninchen und

809822/0505

IgG-beschichtete Latexteilchen verwendet werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Spalte X1 von Figur 2 aufgeführt, wo der Prozentgehalt der Inhibierung der Agglutination für jeden Patienten dargestellt ist. In der Spalte X2 sind die entsprechenden Ergebnisse für 12 Kontrollsera dargestellt. Zum Vergleich werden die Sera von 21 der ursprünglichen Gruppe von SLE-Patienten ebenfalls nach dem C1q-Latexteilchen-Agglutinationstest, wie es von Lurhuma et al (Clin. Exp. Immunol., 25, 212 - 1976) beschrieben wird, getestet, der so angepaßt wird, daß mit einem Coulter-Zähler, wie bei dem Verfahren von Beispiel 3» durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse, die bei dem C1q-Test erhalten werden, sind in der Spalte Y1 von Figur 2 aufgeführt, zusammen mit den entsprechenden Vergleichsversuchen in der Spalte Y2. Man stellt eine gute Übereinstimmung zwischen dem erfindungsgemäßen Test und dem angepaßten Lurhuma-Test fest.

Beispiel 6

Der Immunkomplextest von Beispiel 3 für die Bestimmung von IgG-Komplexen wird zur Bestimmung des Verlaufes von Lupus nephritis bei einer 18 Jahre alten Frau verwendet, die diese Krankheit kurz nach der Geburt ihres ersten Kindes bekam. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Zeile 1 der Figur 3 (f) zusammen mit den in Zeile 2 erhaltenen Ergebnissen aufgeführt, wobei der modifizierte Lurhuma-Test wie in den vorherigen Beispielen verwendet wurde. Die Patientin zeigte zuerst Nierenversagen, Ausschlag, Fieber, Myocarditis und Krämpfe. Die DNA-Bindung war hoch, die Serum-C,, C^ und C1q-Gehalte wurden vermindert und die Nierenbiopsie zeigte starke diffuse proliferative Glomerulonephritis. Die Pa-

809822/0505

27Ί0264

tientin wurde mit Azathioprin, Prednisolon, Dipyridamol, Antikoagulationsmittel und Methylprednisolon-Pulstherapie (1 g/Tag i/v während 3 Tagen) behandelt. In der Figur 3 sind ebenfalls die Informationen bei der Hedikamentverabreichung (3a)» der Methylprednisolontherapie und gesonderten Nierenzeichen (3b), GFR und der klinischen Aktivität (3c), DNA-Bindung (3d) und Serum C1q und C,-Komplementgehalten (3e) während des Verlaufs der Krankheit aufgeführt.

Aus Figur 3 ist erkennbar, daß die Serumimmunkomplexgehalte anfangs sehr hoch sind und stark nach der Methylprednisolontherapie abfallen, was einer Verbesserung des Zustandes der Patientin entspricht. Die Serumkomplexgehalte steigen jedoch erneut und ergeben ein V/arnsignal für einen Rückfall der Patienten am folgenden Tag mit Myocarditis und Krämpfen. Die Patientin wird erneut mit der Methylprednisolontherapie behandelt, ihr Zustand verbessert sich und die Serumkomplexgehalte fallen erneut. Der vorübergehende Anstieg in den Gehalten der Immunkomplexe im Juni tritt zusammen mit einem kleinen Rückfall an Fieber und Ausschlag auf.

Aus diesem Beispiel geht eindeutig hervor, wie der erfindungsgemäße Test die Prüfung des Immunkomplexes, der mit der Krankheit assoziiert ist, erleichtert bzw. ermöglicht.

Beispiel 7

2 ml Serum von einem 11 Jahre alten Jungen, der an Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet, werden an einer kalibrierten Sepharose C.L.6B-Säule (90 χ 3,2 cm) getrennt.

809822/0505

Alle erhaltenen Fraktionen werden auf IgA- und IgG-Komplexe nach dem Immunkomplextest, wie er im wesentlichen im Beispiel 3 beschrieben wurde, geprüft. Die IgA-Komplexe werden durch die Inhibierung der Agglutination von IgA-Latex durch Kaninchen-IgM-Antimenschen-IgA bewertet, die sie verursachen, und IgG-Komplexe durch die Inhibierung der Agglutination von IgG-Latex durch Kaninchen-IgM-Antimenschen-IgG. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 4 aufgeführt, die in Form einer graphischen Darstellung Y des Elutionsmusters der Fraktionen in Fora der optischen Dichte bei 280 nm (links y-Achse o.d.) zusammen mit vertikalen Linien, die der Größe der Inhibierung entsprechen (rechts y-Achse % Inhibierung) dargestellt ist. Nur die Ergebnisse, die eine Inhibierung, die über 350 liegt, ergeben, sind graphisch dargestellt.

Figur 4 zeigt, daß das Serum zwei Populationen an IgA enthaltenden Komplexen enthält, entsprecl'iend 2,5 bis 4 χ und 4 bis 8 χ 10 Molekulargewichtsbereichen, und ebenfalls eine geringe Menge an IgG enthaltenden Komplexen im Bereich von 3,5 bis 4 χ 10 m.w.

809822/0505

Leerseite

Claims

Patentansprüche

Iy Verfahren zur Bestimmung eines Immunkomplexes und Analyse seiner Bestandteile mit einem Latexteilchen-Agglutinationstest, bei dem die Immunkomplex enthaltende Probe mit beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern inkubiert wird, die Latexteilchen mit dem Komplexbestandteil beschichtet sind, dadurch gekennzeichnet , daß die IgM-Antikörper nicht-menschliche Antikörper niedriger Affinität gegenüber dem Komplexbestandteil sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein Antikörperbestandteil des Komplexes ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein antigener Bestandteil des Komplexes ist.
kx Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das Komplement aus der Probe vor der Inkubierung entfernt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe durch Behandlung mit EDTA zur Freigabe von C1q, das dann durch Kontakt mit einem Immunoabsorbens entfernt wird, entkomplementiert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß anschließend an die Inkubierung die Inhibierung der Agglutination durch ein ObJekt-Träger-Agglutinationsverfahren bestimmt wird.

809822/0505

ORIGINAL INSPECTED
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an die Inkubierung die Inhibierung der Agglutination mit einer elektronischen Teilchenzählvorrichtung bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung so programmiert ist, daß nur nicht-zusammengeballte Teilchen gezählt werden.
9. Latexteilchenprodukt, enthaltend mit einem Immunkomplexbestandteil beschichtete Latexbestandteile, dadurch gekennzeichnet , daß an die Latexteilchen ein mit DNP behandelter Bestandteil gebunden ist bzw. daran haftet.
10. Verfahren zum Beschichten von Latexteilchen mit Komplexbestandteilen, dadurch gekennzeichnet , daß der Bestandteil mit DNP vor dem Binden an die Latexteilchen behandelt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein Immunoglobulin der Klasse IgM oder IgA ist.
12. Kit bzw. Besteck für die Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es nicht-menschliche IgM-Antikörper niedriger Affinität gegenüber dem Bestandteil des Komplexes, der analysiert werden soll, und Latexteilchen, beschichtet mit dem Bestandteil, enthält.

8 0 9822/0505
13. Kit bzw. Besteck nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich EDTA und ein Immunoabsorbens für die Entfernung des Komplements der Probe enthält.
14. Kit bzw. Besteck nach einem der Ansprüche 12 oder

13, dadurch gekennzeichnet , daß es einen Bereich von nicht-menschlichen IgM-Antikörpern mit niedriger Affinität und beschichtete Latexteilchen für die Bestimmung eines Bereiches von Immunkomplexen und die Analyse eines Bereiches von Komplexbestandteilen enthält.
15. Kit bzw. Besteck nach einem der Ansprüche 12 bis

14, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Latexteilchenprodukt nach Anspruch 9 enthält.
16. Latexteilchenprodukt, enthaltend Latexteilchen, die mit einem biologisch aktiven Material beschichtet sind, dadurch gekennzeichnet , daß ein mit DNP behandeltes biologisch aktives Material an die Latexteilchen gebunden ist.
17. Verfahren zur Herstellung von Latexteilchen, die mit einem biologisch aktiven Material beschichtet sind, dadurch gekennzeichnet , daß das biologisch aktive Material mit DNP vor dem Binden an die Latexteilchen behandelt wurde.
18. Verfahren zur Entfernung des Komplements eines fluiden Materials, das biologisches Material enthält, dadurch

609822/0505

gekennzeichnet , daß das fluide Material mit EDTA zur Freigabe von C1q behandelt v/ird, das durch Behandlung mit einem Immunoabsorbens entfernt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekenn zeichnet, daß das fluide Material Serum oder
Plasma ist.

809822/0505