DE2702108C2 - Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs.

Serotonin, welches auch als 5-Hydroxy-tryptamin oder 5-Hydroxy-3-(2-aminoäthyl)-indol bezeichnet werden kann, ist ein Indolalkaloide welches eine wichtige Rolle hinsichtlich des Cerebralmetabolismus spielt, d. h. also, daß es als Medikament bzw. als Wirkstoff eines Medikaments verwendet werden kann, welches vasoconstrictive, antipyretische, antiallergische, antipsychotische, Antimigräne- und Antitabak-Eigenschaften aufweist.

Gegenstand des Hauptpatents ist ein Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung von Kaffeewachs in einem Alkohol mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen unter einer inerten Atmosphäre einer alkalischen Hydrolyse unterwirft, wobei eine wäßrige Lösung einer starken Base verwendet wird, und daß man das Reaktionsmedium, welches das Serotonin enthält, abtrennt.

Die Erfindung betrifft eine Weiterbildung des Verfahrens des Hauptpatents, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß als Alkohol Benzylalkohol verwendet wird.

Die Verwendung von Benzylalkohol ist insofern von Vorteil, als die zu verwendenden Alkoholmengen wesentlich geringer sind. Bereits 1 Gewichtsteil Alkohol reicht aus, um 10 Gewichtsteile Kaffeewachs aufzulösen. Wegen des verhältnismäßig hohen Siedepunkts von Benzylalkohol ergibt sich der weitere Vorteil, daß man die Reaktion ohne Anwendung von Druck bei höherer Temperatur durchführen kann, woraus sich kürzere Reaktionszeiten ergeben.

Wie es in der Beschreibung des Hauptpatents angegeben ist, befindet sich das Serotonin im Kaffeewachs amidartig an Fettsäuren gebunden. Die alkalische Hydrolyse hat die Wirkung, daß die Amidbindung aufgebrochen wird und das Serotonin wie auch die entsprechenden Fettsäuren in Freiheit gesetzt werden. Diese Hydrolyse, welche mit Hilfe einer wäßrigen Lösung einer starken Base erfolgt, läuft in einem heterogenen System ab, das aus Wasser und dem mit Wasser nicht mischbaren Benzylalkohol besteht, wobei die Anwesenheit dieses Alkohols ein wichtiger Faktor ist. In Abwesenheit dieses Alkohols verwandelt sich das Reaktionsmedium rasch in ein mehr oder weniger festes und mehr oder weniger definiertes Produkt Der Alkohol spielt deshalb die Rolle eines Verdünnungsmittels für Kaffeewachs und ermöglicht es, daß die Hydrolysereaktion gut abläuft. Die verwendete Mindestmenge an Benzylalkohol liegt in der Größenordnung von 1 Gew.-Teil Alkohol auf 10 Gew.-Teile Wachs. Vorzugsweise werden etwa 1,5 Teile Alkohl auf 10 Teile Wachs verwendet.

Die starke Base kann irgendeine starke Base sein, wie z. B. Natrium, Kalium- oder Calciumhydroxyd. Kaliumhydroxyd ist das vorteilhafteste Reagens, da es mit den in Freiheit gesetzten Fettsäuren keine festen Seifen bildet. Natrium- und Calciumhydroxyd bilden feste Seifen, welche die Ausbeute der Hydrolysereaktion senken und die Gewinnung des Serotonins verkomplizieren.

Die verschiedenen Parameter, welche die alkalische Hydrolyse bzw. Verseifung bestimmen, sind die üblichen Parameter einer klassischen Verseifung. Der pH-Wert sollte sehr basisch sein und in der Größenordnung von 12 bis 14 liegen. Es ist deshalb zweckmäßig, ausreichend konzentrierte Lösung der starken Base zu verwenden, wie z. B. 1 :1-Lösungen. Da die alkalische Hydrolyse in der Kälte sehr langsam verläuft, wird es üblicherweise bevorzugt, die Reaktion bei Temperaturen in der Größenordnung von 140 bis 150°C, welche durch den Benzylalkohol ermöglicht werden, während Zeiten auszuführen, die vorzugsweise zwischen 3 und 6 Stunden liegen. Man kann aber auch die Reaktion bei Temperaturen in der Größenordnung von 160 bis 180° C während 1 bis 2 Stunden ausführen.

Die alkalische Hydrolyse sollte unter einer interten Atmosphäre ausgeführt werden, beispielsweise unter einer Stickstoffatmosphäre, da das Serotonin in alkalischem Medium gegenüber Sauerstoff sehr empfindlich ist. Vorzugsweise wird das Reakuonsmedium heftig gerührt, um die alkoholische und wäßrige Phase innig miteinander zu dispergieren.

Das Kaffeewachs, welches im allgemeinen zur Verfügung steht, ist ein Nebenprodukt der Entkoffeinisierung von grünem Kaffee und aus diesem Grund sehr reich an Coffein. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren mit gewöhnlichem Kaffeewachs ausgeführt werden kann, wird es normalerweise bevorzugt, entcoffeinisiertes Kaffeewachs zu verwenden. Coffein neigt dazu, während der alkalischen Hydrolysereaktion zu reagieren und sich in Kaffeeidin zu verwandeln, wodurch die Ausbeute an Serotonin gesenkt wird. Entcoffeinisiertes Kaffeewachs kann nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Entcoffeinisierung mit angesäuertem Wasser.

Man kann das Serotonin vom Reaktionsmedium aus dem Gemisch mit Fettsäuren, Lipoiden und ggf. Resten von nicht-hydrolysiertem Wachs dadurch abtrennen, daß man sich die Tatsache zunutze macht, daß Serotonin

wie eine Aminosäure einen sauren und basischen Doppelcharakter aufweist und in Wasser mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 seine geringste Löslichkeit besitzt. Es kann deshalb durch eine Flüssig/Flüssig-Extraktion abgetrennt werden, beispielsweise wie folgt:

— Ansäuern des Reaktionsmediums (pH unterhalb 4);

— nach Dekantierung, Trennung der beiden Phasen des angesäuerten Reaktionsmediums und Gewinnung der wäßrigen Phase, welche Serotonin und Salze enthält, wobei die Hauptmasse der Fettsäuren, der Lipoide und des nichthydrolysierten Wachses in der Alkoholphase verbleibt oder in die Alkoholphase geht;

— Einstellung des pH der wäßrigen Phase auf 6 ± 1 und Emulgierung dieser wäßrigen Phase mit einem mit Wasser nicht-mischbaren Alkohol, wie z. B. mit einem C₄- (7:2-Alkohol;

— nach Dekantierung, Trennung der beiden Phasen und Gewinnung der alkoholischen Phase, welche die Hauptmasse des Seroionins enthält, wobei die Salze im wäßrigen Medium bleiben.

Die letzteren beiden Operationen werden wiederholt, bis das wäßrige Medium an Serotonin erschöpft ist. Es ist auch möglich, sie kontinuierlich in einem geeigneten Extraktor durchzuführen. Dabei wird eine alkoholische Serotoninlösung erhalten.

Das Serotonin kann durch Abtreiben des Alkohols isoliert werden. Serotonin ist nicht sehr stabil, weshalb es bevorzugt wird, das Serotonin als Salz oder Komplex zu isolieren, wie dies weiter unten beschrieben ist. Es ist auch möglich, das Serotonin direkt in Derivate zu überführen, wie z. B. in Melatonin oder N-Acetyl-5-methoxy-tryptamin.

Um das Serotonin in wäßrigem Medium zu erhalten, kann man die vorher erhaltene alkoholische Phase mit einer wäßrigen Lösung einer starken Säure, wie z. B. mit einer verdünnten Schwefelsäure oder mit Salzsäure, emulgieren. Das Serotonin geht dibei ins wäßrige Medium, wo es in Form eines Salzes kristallisiert werden kann, beispielsweise in Form des Chlorhydrats. Es ist jedoch auch möglich, das Serotonin in Form des Dreifachsalzes Serotonin-Creatinin-Sulfat zu isolieren, wie es in der Hauptanmeldung beschrieben ist.

Gemäß einer Variante werden die beiden Phasen des Reaktionsmediums vor der Ansäuerung unter einer interten Atmosphäre getrennt, wobei das Serotonin mit den Fettsäuren in Form ihrer Salze in der wäßrigen alkalischen Phase bleibt, während die Lipide und ggf. das nicht-hydrolysierte Wachs im alkoholischen Medium bleiben. Das Serotonin und die Fettsäuren können dann in einer nachfolgenden Stufe getrennt werden, beispielsweise durch physikalische Trennung oder durch Flüssig/Flüssig-Extraktion mit angesäuertem Wasser und Alkohol, wodurch das Serotonin direkt in wäßrigem Medium erhalten wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung von entcoffeinisiertem Kaffeewachs (erhalten durch Behandlung von Wachs in geschmolzenem Zustand mit angesäuertem Wasser) in Benzylalkohol mit Hilfe einer wäßrigen Kaliumhydroxydlösung einer alkalischen Hydrolyse unterworfen, wobei vorteilhafterweise auch in Gegenwart eines Schutzmittels gearbeitet wird, wie z. B. eines Dithionits. Die Hydrolyse wird in der Gegend von 145°C während 4 st durchgeführt. Das Serotonin wird dann durch Flüssig/Flüssig-Extraktion mit Wasser und Isobutanol isoliert und dann als Serotonin-Creatinin-Sulfat oa.r als Serotonin-chlorhydrat kristallisiert. Das Isobutanol wird zurückgewonnen, gereinigt und wieder verwendet.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. In diesen Beispielen sind die Prozentangaben und Verhältnisse in Gewicht ausgedrückt.

Beispiel 1

1000 g Kaffeewachs mit einem Trockenfeststoffge-

i» halt von etwa 70% werden während 1 Stunde mit 4000 g Wasser bei 80°C behandelt, worauf die beiden Phasen dann getrennt werden. Die wäßrige Phase, welche das Coffein enthält, wird zur Seite gestellt, und die fette Phase, welche das entcoffeinisierte Kaffeewachs enthält, wird durch Abdestillation von restlichem Wasser bei 100° C auf 90% konzentriert. Das Ganze wird dann durch Zusatz von 150 g Benzylalkohol verdünnt, worauf 250 g Kaliumhydroxydplätzchen und 10 g Natriumdithionit (Na2S2O4) zugegeben werden.

-" Hierauf wird unter einer Stickstoffatmosphäre und unter heftigem Rühren 4 Stunden auf J45°C erhitzt

Das Reaktionsmedium wird dann auf 90°C abgekühlt, worauf 1400 g Wasser und ungefähr 470 g 32%ige HCI zugegeben werden. Dann werden die beiden Phasen

-^ getrennt. Die Alkoholphase, welche die Fettsäuren und die Lipoide enthält, wird erhitzt, um den Benzylalkohol durch Destillation zurückzugewinnen. Die saure wäßrige Phase wird mit lO'Vbiger Natriumhydroxydlösung bis zu einem pH von 5,5 leutralisiert, filtriert, konzentriert und ggf. nochmals filtriert und schließlich mit 2,5 g Na2S2C>4 versetzt und mit 800 g Isobutanol emulgiert. Nach Abdekantierung und Trennung dieser Phasen wird eine Isobutanolphase erhalten. Diese Flüssig/Flüssig-Extraktion wird bis zu lOmal wiederholt. Die wäßrige Phase, welche gefärbt ist und Salze enthält, wird verworfen.

Die Isobutanolphase, welche das Serotonin enthält, wird dann mit einer verdünnten Schwefelsäure emulgiert, und zwar im Verhältnis von 2,5 Mol H2SO4 auf 1 Mol Serotonin (ungefähr 100 ml in Lösung). Nach der Abdekantierung und Trennung der Phasen wird eine wäßrige Phase erhalten, die das Serotonin enthält. Die vom Serotonin befreite Isobutanolphase wird zurückgeführt. Die wäßrige Phase wird dann mit H2SO4 auf einen pH von 2,8 angesäuert, worauf Creatinin in fester Form in einem Verhältnis von 1,1 Mol Creatinin auf 1 Mol Serotonin zugegeben wird. Hierauf wird auf das halbe Volumen (ungefähr 50 ml) konzentriert, wobei sich eine Ausfällung von Serotonin-Cratinin-Sulfat bildet, welche durch Filtration abgetrennt und mit einer wäßrigen 60%igen Acetonlösung gewaschen wird. Zur Mutterflüssigkeit wird V2 Volumen Aceton zugegeben, wodurch die Bildung einer zweiten Serotonin-Creatinin-Sulfat-Ausfällung hervorgerufen wird, die wie vorher abgetrennt und gewaschen wird. Die Mutterflüssigkeiten werden durch Destillation vom Aceton befreit und zur Flüssig/Flüssig-Extraktion mit Isobutanol (Zugabe zur wäßrigen Phase mit pH 5,5) zurückgeführt.
Die beiden gewaschenen Ausfällungen von Seroto-

nin-Creatinin-Sulfat werden vereinigt und unter milden Bedingungen in einem Wirbelbett getrocknet. Auf diese Weise werden etwa 24 g dieses Produkts erhalten, dessen Reinheit zwischen 95 und 98% liegt. Gewünschtenfalls wird das Serotonin-Creatinin-Sulfat in Wasser oder in den Mutterflüssigkeiten einer vorhergehenden Umkristallisation umkristallisiert, wobei ein Produkt mit einer Reinheit von 99,5% erhalten wird.
Das erwähnte Produkt ist mit einer authentischen

Probe von Serotonin-Creatinin-Sulfat identisch.

Das oben beschriebene Verfahren ergibt eine Ausbeute, die im wesentlichen derjenigen des Verfahrens der Hauptanmeldung entspricht, wobei jedoch die Energiekosten beträchtlich verringert sind, da die Erhitzungsdauer (bei atmosphärLchem Druck) viel kurzer ist.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei von rohem nicht-entcoffeinisiertem Kaffewachs ausgegangen wird, d. h. also, daß die Stufe der Entcoffeinisierung durch Behandlung mit Wasser übersprungen wird und direkt 1000 g rohes Kaffeewachs in 200 g Benzylalkohol aufgelöst werden. Zur so erhaltenen Lösung werden 250 g Kaliumhydroxydplätzchen und 10 g Natriumdithionit (NaJS₂CM) zugegeben, worauf dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 fortgefahren wird.

Auf diese Weise werden ungefähr 10 g Serotonin-Creatinin-Sulfat mit einer Reinhe"'. von 85 bis 88% erhallen.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wild bis einschließlich der Emulgierung der auf pH 5,5 neutralisierten wäßrigen Phase in Isobutanol wiederholt, wobei diese Maßnahme lOmal wiederholt wird. Die einzelnen erhaltenen Isobutanolphasen werden dann vereinigt und dann auf Vio des Volumens konzentriert und schließlich mit 32%iger Salzsäure behandelt. Das saure

ίο Medium wird dann erneut auf Vio des Volumens konzentriert, worauf das Serotonin-chlorhydrat kristallisiert wird. Nach Filtration und Trocknen bei 80⁰C im Varkuum werden 25 g Serotonin-chlorhydral mii einer Reinheit von etwa 95% erhalten. Gewünschtenfalls kann dieses Produkt in der Mutterflüssigkeit einer vorhergehenden Umkristallisation umkristallisiert werden.

Das erhaltene Produkt entspricht gut einer Elementaranalyse und einem RMN-Spektrum vor Serotoninchlorhydrat.

Die Ausbeute an Serotonin liegt wesentlich über derjenigen von Beispiel 1.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs, bei welchem eine Lösung von Kaffeewachs mit einem Alkohol unter einer inerten Atmosphäre einer alkalischen Hydrolyse unterworfen wird, wobei eine wäßrige Lösung einer starken Base verwendet wird, und das Reaktionsmedium, welches das Serotonin enthält, abgetrennt wird, gemäß Patent 2532308, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkohol Benzylalkohol verwendet wird.

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kaffeewachs entkoffeinisiertes Kaffeewachs verwendet. '5

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kaffeewachslösung eine Lösung verwendet wird, die mindestens 1 Gew.-Teil Alkohol auf 10 Gew.-Teile Wachs enthält.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als starke Base Kaliumhydroxyd verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Hydrolyse unter einer inerten Atmosphäre 3 bis 6 Stunden bei 140 bis 15O⁰C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Serotonin aus dem Reaktionsmedium als Serotonin-Creatinin-Sulfat oder Serotoninchlorhydrat isoliert wird.