DE2647189C2

DE2647189C2 - Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden

Info

Publication number: DE2647189C2
Application number: DE2647189A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Isowa; Hideaki Ichikawa Tetsuya Kurita; Kaoru Mori; Muneki Tokyo Ohmori; Kiyotaka Sagamihara Kanagawa Oyama; Masanari Sato
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1975-04-29
Filing date: 1976-10-19
Publication date: 1983-02-03
Also published as: NL7611569A; DE2647189A1; US3972773A; CA1059051A; FR2328695A1; CH623807A5; NL172462B; FR2328695B1; GB1523546A; NL172462C

Description

X-A-OH

oder eines Salzes derselben mit einer Aminosäure oder einem Peptid der allgemeinen Formel

H-B-Y

oder einem Salz derselben in einer wäßrigen Lösung in Gegenwart einer Proteinase, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart

von aus Streptomyces caespitosus gewonnener neutraler Proteinase,

von aus Bacillus subtilis gewonnenem Prolisin
oder von Thermolysin (EC 3.4.24.4)
bei pH 6 bis 8 und bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 8O⁰C durchführt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Mol der Verbindung H-B-Y 0,8 bis 2 Mol der Verbindung X-A-OH einsetzt

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Millimol der Verbindung H-B-Y 10 bis 500 mg der Metalloproteinase einsetzt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel H-B-Y einsetzt, in der Y Aminocarbonyl, Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl, 2,4-DimethoxybenzyIaminocarbonyl oder Benzhydrylaminocarbonyl ist

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Inhibitor für alkalische Proteinase, welcher in an sich bekannter Weise aus Kartoffeln gewonnen wurde, zusetzt, falls man die Umsetzung mit einem nicht gereinigten Enzym durchführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden unter Verwendung eines der in Anspruch 1 genannten Enzyme als Katalysator.

Herkömmlicherweise wurden Peptide nach der Azidmethode hergestellt oder nach der Methode der gemischten Säureanhydride, der Carbodiimidmethode oder der Methode der aktiven Ester oder nach der .Säurechloridmethode. Die herkömmlichen Verfahren sind jedoch mit verschiedensten industriellen Problemen verbunden. So tritt z, B. eine Razemisiefung der Carböxylkomponente des C-terminalen Aminosäurerests ein. Andere Probleme betreffen Nebenreaktionen, die Temperaturregelung, die Auswahl des Lösungsmil· tels, die Eigenschaften der Aminoschutzgruppen und der Carboxylschutzgruppen und die Effekte von funk* lionellen Gruppen in den Seilenketten def Amino

säuren.

Man kann ferner Peptide nach der Fragmentkondensationsmethode herstellen, die erhebliche industrielle Vorteile hat Die Fragmentkondensationsmethode kann vorteilhafterweise bei Verbindungen angewandt werden, welche an der C-terminalen Gruppe Glycin aufweisen. Allerdings kann auch bei diesem Verfahren eine Razemisiening nicht verhindert werden, wenn die C-terminale Gruppe von einer anderen Aminosäure gebildet wird. Tatsächlich ist bei jeder Peptidsynthese das Razemisierungsproblem gravierend. Wenn eine Racemisierung eintritt, so sinkt die Reinheit des Produkts, und es ist erforderlich, das verunreinigende Isomere vom angestrebten Produkt abzutrennen. Dies ist bei jeder industriellen Durchführung eines Verfahrens äußerst nachteilig.

Unter den herkömmlichen Verfahren zur Ausbildung von Peptidbindungen ist lediglich die Azidmethode weitgehend frei von Razemisiening. Aus diesem Grund war die Azidmethode bisher bevorzugt Da jedoch die Azidmethode komplizierte Reaktionsschritte umfaßt, und da im Wege einer Nebenreaktion ein Harnstoffderivat gebildet wird (was zu einer Senkung der Ausbeute führt), ist auch die Azidmethode unbefriedigend.

Zusätzlich zu den verschiedenen organisch-chemischen Verfahren zur Peptidherstellung wurde eine spezielle Peptidsynthese bekannt, welche von dem Enzym Papain oder dem Enzym Chymotrypsin Gebrauch macht (z. B. J. S. Fruton »Advances in Protein Chemistry«, 5, Academic Press Inc., New York, 1949). Wegen Schwierigkeiten bei der Abspaltung der für diese Synthesen verwendeten Schutzgruppen und wegen Transamidierungsreaktionen und Transpeptisierungsreaktionen als Nebenreaktionen sind diese Reaktionen in der Praxis zur Peptidsynthese nicht einsetzbar (vgl. R. B. Johnson et al, J. Biol. Chem., 185,629 [1950] und J. S. Fruton et al, J. Biol. Chem. 204, 891 [1953]).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese der gewünschten Oligopeptide zu schaffen, welches bei einfacher Verfahrensführung zu hohen Ausbeuten führt

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines Oligopeptids der allgemeinen Formel gelöst

X-A-B-Y,

in der A und B gleich o^er verschieden sind und einen Aminosäure-Rest oder einen Pep^d-Rest, X eine geschützte Aminogruppe und Y eine geschützte Carb-οχ/lgruppe bedeuten, durch Umsetzung einer Aminosäure oder ein<.ä Peptids der allgemeinen Formel

X-A-OH

H-B-Y

oder einem Salz derselben in einer wäßrigen Lösung in Gegenwart einer Proteinase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Umsetzung in Gegenwart von aus Streptomyces caespitosus gewonnener neutraler Pröteinase, von aus Bacillus subtilis gewonnenem Prolisin öder von Thermolysin (E. C. 3.4.24.4) bei pH 6 bis 8 und bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 8O⁰C durch' führt.

Die eingesetzten Enzyme sind Metalloproteinase-Enzyme, die aus den Mikroorganismen Slreptofnyces caespitosus, Bacillus subtilis lind Bacillus thermopro-

IO

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teolyticus gewonnen werden. Es wurde bereits b-.richtet, daß bestimmte Metalloproteinase-Enzyme Peptidbindungen zu hydrolysieren vermögen, die Aminogruppen von hydrophoben Aminosäureresten wie Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Valin umfassen (für Thermolysin: H. Matsubara e» al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 242 [1965]).

Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel

X-A-OH

wobei X eine Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe bedeutet und wobei A einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeutet, wird im folgenden als Säurekomponente bezeichnet Die Gruppe A bedeutet einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, in dem Aminosäuren aliphatische Aminosäuren sind, wie Monoaminomonocarbonsäuren, z. B. Glycin (G'y), Alanin (Ala), Win (VaI), Norvalin (nor-Val), Leucin (Leu), Isoleucin (Iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); oder Hydroxysäuren, wie Serin (Ser), Threonin (Thr), Homo-serin (homo-Ser); schwefelhaltige Aminos?»- ren, wie Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH); oder Aminodicarbonsäuren, z. B. Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (GIu), Asparagin (Asn) und Glutamin (Gin); Diaminomonocarbonsäuren, z. B. Ornithin (Orn), Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, wie Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), und heterocyclische Aminosäuren, wie Histidin (His), Tryptophan (Trp). Diese Aminosäuren werden durch Symbole bezeichnet, welche allgemein üblich sind. Die Peptide weiden durch Kombinationen dieser Symbole bezeichnet

Im folgenden seien einige geeignL.e Schutzgruppen für die freie terminale Aminogruppe der Säurekomponente genannt (N-terminale Schutzgruppe): tertiäre Alkoxycarbonylgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc); Benzyloxycarbonylgruppen, welche mit einem inerten Substituenten substituiert sein können, wie Benzyloxycarbonyl (Z-), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ-), 3,5-Dimethoxybenz.yloxycarbonyl (Z(OMe)₂-), 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-Phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-); p-Toluolsulfonyl (tos-); o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-) od. dgl.

Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel

H-B-Y

30

35

40

50

55

werden im folgenden als Aminkomponente bezeichnet. In der Formel bedeutet B einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, welcher in gleicher Weise definiert wie der Rest A. Die SchuUgruppen für die Carboxylgruppe (C-terminale Schutzgruppen) der Aminkomponente umfassen Alkoxygruppen wie Methoxy (-OMe), Äthoxy (-OEt); tertiäre Alkoxygruppen wie t-Butoxy (-O-t-Bu); Benzyloxygruppen, welche substituiert sein können, wie Benzyloxy (-OBzI), p-Nitrobenzyloxy (-OBzI(P-NO₂)). Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzI), 2,4-Dimethoxybenzylamino (-NHDMB), Benzhydrylamino (-NHBzh) oder die un^ substituierte Arnmögfuppe (-NH₂) od, dgl,

Die Säurekomponente und die Aminkomponente, Welche als Reaktanten des erfindungsgemäßen Verfah* rens eingesetzt werden, umfassen Aminosäurereste und Peptfdreste_r welche funktioneile Gruppen in den Seitenketten aufweisen. In den meisten Fällen ist es bevorzugt, die funkfionellen Gruppen mit einer Schutzgruppe zu schützen. Geeignete Schutzgruppen für ^-Aminogruppen (N") umfassen N"-Benzyloxycarbonyl (N"-Z), t-Butoxycarbonyl (N"-B0C) und Toxyl (N"-Tos). Geeignete Schutzgruppen fürN-Guanidinogruppen (N^G) von Arg umfassen Nitrc (N^G-N0₂), N^G-Benzyloxycarbonyl (N^G-Z) und N^G ■ N^G-Dibenzyloxycarbonyl (N^G-Z-Z). Geeignete Schutzgruppe für den Imizadolring (N'^ra) umfassen N'^m-Benzyl (N^-BzI) und Tosyl (N^im-tos). Geeignete Schutzgruppen für ^-Carboxylgruppen umfassen ω-Benzyloxy (-OBzI). Als geeignete Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen von aliphatischen oder aromatischen Oxyaminosäuren kommen Aralkylgruppen in Frage, wie Benzyl (BzI). A¹S geeignete Schutzgruppen für die Mercaptogruppe von CysH kommen Benzyigruppen (BzI) in Frage. Die verwendeten Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der Hauptreaktion stabil sein und leicht vom Produkt ablösbar sein, ohne dabei zu Nebenreaktionen zu führen. Die als Ausgangsmaterial eingesetzte Säurekomponente und Aminkomponente können Schutzgruppen aufweisen, und die N°-Aminogruppe der Aminkomponente kann frei sein oder in Form eines anorganischen oder organischen Salzes vorliegen, z. B. eines Hydrochlorids, eines Hydrobromids, eines Oxalats, eines p-Toluolsulfonats oder eines Acetats. Bei dem erfindungsgemäCin Verfahren wird die Kondensationsreaktion, bei der die Peptidbindung ausgebildet wird, in einer wäßrigen Lösung durchgeführt, welche einen pH-Wert aufweist, bei dem die Enzymaktivität aufrechterhalten bleibt. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert etwa 6 bis 8.

Man kann zwei Methoden anwenden, um den richtigen pH-Wert für die Erhaltung der Enzymaktivität einzustellen. Eine Methode besteht darin, die Kondensationsreaktion in einer Pufferlösung durchzuführen, z. B. in einer Zitronensäure-Pufferlösung, einer Mcllvaine-Pufferlösung, einer Kolthoff-Pufferlösung, einer Michaelis-Pufferlösung, einer ^ris-Pufferlösung oder einer Clark-Lub-Pufferlösung. In dieser Pufferlösung wird die Säurekomponente und die Aminokomponente aufgelöst, und dann wird das Enzym hinzugefügt Das andere Verfahren während der Kondensationsreaktion den pH-Wert der Reaktionsmischung innerhalb des für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität geeigneten Bereichs zu halten, besteht in der Zugabe der Säure oder der Base zum Reaktionsgemisch in einer Menge, welche von dem gemessenen pH-Wert abhängt.

Die Ausgangsmaterialien werden gewöhnlich in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen und vorzugsweise 1 b's 1,5 Molen der Säurekomponente pro Mol der Aminkomponente eingesetzt. Wenn die Ausgangsmaterialien indem wäßrigen Medium nicht allzu löslich sind, so kann man die Löslichkeit der Reaktanten durch Zusatz eines Lösungsmittels, wie z. B. eines Alkohols, z. B. Methanol oder Äthanol, Dimethylformamid, Dioxan. Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid od. dgl., zu der wäßrigen Lösung verbessern. Die Menge des zugesetzten Lösungsmittels sollte beschränkt sein, so daß die Aktivität des Enzyms für die erfindungsgemäße Reaktion nicht inhibiert wird. Wenn man ein Lösungsmittel anwendet, so wird dieses gewöhnlich in einer Menge von wsniger als 1 GewXTeilchen und vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Gew.-Teilen pro 1 Gew.-Teil Wasser eingesetzt Die erfindungsgemäße Reaktion wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, und es isterfor* derlich, die relative Löslichkeit des Reaktionsproduktes zu senken, vorzugsweise so weit, daß das Reaktions-

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produkt in dem System nur schwach löslich oder unlöslich ist

Bei der erfindungsgemäßen Reaktion wird eine katalytische Menge des Enzyms eingesetzt, und zwar vorzugsweise 10 bis etwa 500 mg des Enzyms pro 1 mmol 5 der Aminkomponente. Wenn ein gereinigtes Enzym verwendet wird, so kann die Enzymmenge 5 bis 30 mg betragen. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 80°C und vorzugsweise im Bereich von 20 bis 50⁰C, da in diesem Temperaturbereich die Enzymaktivität erhalten bleibt Unter diesen Bedingungen schreitet die Reaktion glatt vonstatten, und zwar während 1 bis 24 h. Das Reaktionsprodukt fallt aus dem Reaktionssystem aus und kann daher le'cht isoliert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem als Enzymicatalysatoren die in Anspruch 1 angegebenen Metallproteinasen eingesetzt werden, kann durch folgende Reaktionen exemplifiziert werden:

Wenn ein Dipeptid erzeugt wird, so folgt das Verfahren der folgenden Reaktion:

BOC-Tyr(Bzl) —OH + H — Val —NHDMB
> BOC-Tyr(Bzl) — Bai — NHDMB

BOC-HiS(BzI)-OH + H —Leu—NHDMB
> BOC-His(Bzl) —Leu — NHDMB

Dabei wurde das Amidderivat von VaI und Leu als Aminkomponente eingesetzt und das BOC-Derivat /on Tyr und His mit geschlitzter Seitenkette als Säurekomponente. Die Kondensationsprodukte werden in Ausbeuten von etwa 60% erhalten. Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren und Aminosäureamiden 3s sind in Tabelle 1 zusammengestellt Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren mit Dipeptidamiden sind in Tabelle 2 angegeben. Beispiele der Kondensation on Acyldipeptiden und Aminosäureamiden sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Beispiele der Kondensation von Acyldipeptiden und Dipeptidamiden finden sich in der Tabelle 4 und Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren und Dipeptidestern finden sich in Tabelle 5

Durch die Verwendung der t.findungsgemäß einzusetzenden Metalloproteinasen werden Aminosäuren mit spezieller. Eigenschaften äußerst reaktiv als Aminkomponente, und verschiedene Aminosäuren können in Form einer AcyUminosäure oder eines Acylpeptids als Säurekomponente eingesetzt werden, wie die Tabellen ze.gen. Man erkennt, daß die Metalloproteinase bei dei Synthese von Peptiden unter Verwendung von hydrophoben Aminosäuren, wie Leu, iso-Leu, VaI, Phe u. dgl. als N-terminale Aminosäure der Aminkomponente eingesetzt werden kann.

Bei einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein Protein-Proteinase-Inhibitor, z. B. aus Kartoffeln, eingesetzt werden. Handelsübliche rohe Metalloproteinasen enthalten gewöhnlich alkalische Proteinasen, deren optimaler pH-Wert auf -"der alkalischen Seite liegt und welche nicht-substituierte Amide Und Aminosäuren oder Peptidester aus tinem primären Alkohol hydrolysieren. Zum Beispiel umfaßt Prolisin eine Metalloproteinase ohne Esteraseoder Amidaseaktivität und eine alkalische Proteinase im Verhältnis 7:3. Weiterhin umfaßt das Prolisin als weitere Komponenten eine geringe Menge Amyläse, Protein und etwa 65% Stärke. Wenn nun ProÜsin als Katalysator zur Bildung von Peptidbindungen verwendet wird, so sind die Ester, welche bei der Reaktion einer Carboxylgruppe und eines primären Alkohols gebildet werden, z. B. der Methylester oder der Äthylester, als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe nicht geeignet, noch ist ein unsubstituiertes Amid geeignet. Es sind daher kompliziertere Schutzgruppen erforderlich sowie komplizierte Verfahrensstufen und teure Reagenzien (Alkohole und Amine). Die Entfernung der alkalischen Proteinase aus Prolisin erfordert ebenfalls komplizierte Verfahrensschritte. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die Ausbeute an den angestrebten Produkten wesentlich verbessert werden kann, wenn man einen Inhibitor für das proteolytische Enzym (Proteinase) bei der Synthese der Peptide unter Verwendung einer rohen Metalloproteinase einsetzt.

Somit besteht eine wichtige Ausfuhrungsform der Erfindung darin, daß man bei der Durchführung der Umsetzung mit einem nicht gc.einigten Enzym der wäßrigen Lösung einen Inhibitor zagibt Mit diesem Inhibitor wird die Aktivität der alkalischen Proteinase, welche im handelsüblichen Enzym, das als Hauptkomponente eine Metalloproteinase enthält, auftritt, herabsetzt während die Metalloproteinase bei der Kondensationsreaktion unter Bildung von Peptidbindungen ihre katalytische Wirkung entfaltet (vgl. C. A. 76, 2566g). Geeignete Inhibitoren für das proteolytische Enzym können aus Hafer, Fava, Bohnen und Kartoffeln extrahiert werden. Die Methode der Extraktion ist in Nippon Kagaku Kaishi, 31, S. 38 (1957) (vgl. C. A. 53, 22135 i) beschrieben. Auch der erfindungsgemäß eingesetzte Inhibitor muß nicht rein sein. Man kann einen Rohextrakt einsetzen. Bei Verwendung eines solchen Inhibitors kann man eine Aminkomponente mit einer primären Alkoxygruppe, z. B. einer Methoxygruppe (O-Me), einer Äthoxygruppe (-OEt) oder einerunsubstituierten Aminogruppe als Schutzgruppe der Carboxylgruppe einsetzen.

Bei einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung kann eine Säurekomponente (I) mit einer Aminkomponente (II) in einer der folgenden Kombinationen umgesetzt werden:

(a) In Kombination von L-I und L)L-II,

(b) Kombination von DL-I und L-II oder

(c) Kombination von DL-I und DL-II.

Dabei erhält man in allen Fällen L.L-Acyldipeptid. Als Säurekomponente (I) kann man z. B. eine Verbindung der folgenden Formel

R^!
R'NH — CHCOOH

einsetzen, wobei R' eine Acylgruppe bedeutet und wobei R² eine Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure bedeutet. Die \minkomponente (II) kann eine Verbindung d^r folgenden Formel sein

R³
H₂N-CH-COR⁴

wobei R³ eine Seitenkettengruppe einer a-Aminösäure bedeutet und wobei R⁴ eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeutet Bei dieser Ausführungsform kann die Säurekomponente (I) und/oder die Aminkompö-

nente (II) als razemische Komponente eingesetzt werden und dennoch erhält man das L,L-Acyldipeptid bei Verwendung der Metalloproteinase selektiv. Vorzugsweise wird auch dabei ein Inhibitor für das proteolytische Enzym zugesetzt. Diese Reaktion kann folgendermaßen dargestellt werden

R² R³

R'NHCHCOOH + H₂N-CHCOR⁴
ω (Π)

R³ R⁴

R'NHCHCONHCHCOR⁴

(ffl)

Dabei bedeutet R' eine Acylgruppe. R² eine Seiten-

K?i

eine

⁴ eine Schutz-

keuengruppe einer a-Aminosäure,
tengruppe einer α-Aminosäure und R'
gruppe für die Carboxylgruppe. Somit fuhren drei verschiedene Kombinationen der Säurekomponente (I) und der Aminkomponente (II) zum Erfolg:

(a) L-I+ DL-II

(b) DL-I+ L-II

(c) DL-I+ DL-II

LL-III

(Das Molverhältnis wird dabei auf der Grundlage der L-Komponenten festgelegt)

Man erhält als Produkt LL-III, da die Reaktion selektiv ist Verbindungen der Formeln I und II können leicht erhalten werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man Asparagyl-phenylalanin-methylester, welcher als Süßstoff bekannt ist, leicht herstellen, indem man den N-BenzyIoxycarbonyl-(/?-benzyl)-asparagyl-phenylalanin-methylester reduziert, welcher durch Reaktion der N-BenzyloxycarbonyI-(/J-benzyl)-asparaginsäure mit Phenylaianinmethylester erhalten wird. Katalytische Mengen des Enzyms sind ausreichend, und das Enzym kann wiederholt eingesetzt werden. Die Reaktion schreitet unter milden Reaktionsbedingungen in einer gepufferten Lösung oder in einer Lösung mit einem gewünschten pH-Wert glatt voran. Die Ausbeuten sind relativ hoch, und die Reinheit des Produktes ist außerordentlich groß. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur stufenweisen Verlängerung einer Peptidkette und auch für die Kondensation von Fragmenten. Solche Fragmentkondensationsreaktionen sind für industrielle Zwecke äußerst vorteilhaft Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren setzt keine Razemisierung ein. Diese Vorteile können mit den herkömmlichen Verfahren nicht erzielt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert

Die in den Beispielen eingesetzten Enzyme sind dort stets nur kurz mit den Bezeichnungen »neutrale Proteinase«, »Thermoase« oder »Thermolysin« sowie »Prolisin« bezeichnet

Die so bezeichneten Enzyme sind dabei wie folgt charakterisiert:

Neutrale Proteinase:

Eine aus Streptornyces casspitosus gewonnene Metalloproteinase (E.C.-Gruppe 3.4 - beschrieben in CA. 71 [1969], 77563J und 77564k) mit einem Titer von 100 Einheiten/mg.

Prolisin:

Eine aus Bacillus subtilis vaf. ärnyloliquefaciens gewonnene Metalloproteinase (vgl, L Fukumofö et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi 32,230 [1958]; CA. 52, 156Ui; Biochem. Bi'ophys. Res. Cömm. 15,367 [1964]) mit einem Titer von 1,9 X 10³ Einheiten/mg.

Thermoase:

Bezeichnung für ein Thermolysin (s. ü.) enthaltendes, aus Bacillus thermoproteolyticus gewonnenes rohes Enzym mil einem Titer von 4,Ox 10³ Einheiten/mg. Es kann auf folgende Weise gereinigt werden: Man löst rohe Thermoase in einer wäßrigen Lösung von 1/50 m Calciumacetat und trennt unlösliches Material mit einer Zentrifuge und durch Dialyse der überstehenden Flüssigkeit ab, und zwar zweimal mit einer wäßrigen Lösung von 1/100 m Calciumacetat. Sodann gibt man Aceton zu der dialysierten Lösung das 0,8fache an Aceton, worauf ein Niederschlag abfiltriert wird. Sodann gibt man Aceton zu dem Filtrat bis zu einer 2,5fachen Menge des Filtrats, worauf der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt und bei Normal temperatur unter vermindertem Druck getrocknet wird.

Thermoly,«i (E.C. 3.4.24.4):

Gereinigte Thermoase mit einem Titer von 1,8 x 10" Einheiten/mg.

Alle angegebenen Titer wurden bei einem pH von 7,2 unter Verwendung von Hammarsten Casein nach dem Verfahren von D. Tsuru et al., Agric. Biol. Chem., 30, 651 (1966), bestimmt.

Beispiel 1

ml einer Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden zu 817 mg (2,20 mmol) BOG-Tyr(Bzl)-

OH und 606 mg (2,00 mmol) H-VaI-NHDMB-HCl gegeben, und dann gibt man noch 2,0 ml 1 n-NaOH zu

der Lösung. Sodann wird die Mischung unter Rühren bei 38°C mit 200 mg neutraler Proteinase versetzt.

Die Reaktion wird während 24 h bei 38°C durchgeführt Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5 n-HCl, 7% Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen. Man erhält 1,08 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in ml heißem Äthanol aufgelöst, und die heiße Lösung wird während 30 min mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt, und der Rückstand wird mit Wasser versetzt Dabei erhält man das kristalline Produkt der Formel

BOC-Tyr(BzI)-VaI-NHDMB.

Ausbeute
Schmelzpunkt
M? -1,6°

700 mg (56%)
183 bis 185°C
(C = 1,0 Chloroform)

Elementar-Analyse:

berechnet (%)
gefunden (%)

C 67,83, H 7,32, N 6,78;
C 67,71, H 7,35, N 6,60.

Beispiel 2

ml Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden zu 760 mg (2,20 mmol) BOC-His(Bzl)-OH

Und 634 mg (2,00 mmol) H-Leu-NHDMB · HCl gegeben, und dann fügt man noch 1 n-NaOH zu der Lösung. Weiterhin gibt man zu der erhaltenen Mischung unter Rühren bei 38⁰C 200 mg neutrale Proteinäse versetzt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7% Ammoniakwasser und daiiD wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 1,01 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml heißem Äthanol aufgelöst, und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle während 30 min zur Entfernung des Proteins behandelt. Die Lösung wird eingeengt und darin mit Wasser versetzt. Man erhält ein kristallines Produkt der Formel

BOC-HiS(BzI)-LeU-NHDMB · H₂O.

Ausbeute
Schmelzpunkt
UYi 0,69°

Elementararialyse:

berechnet (%)
gefunden (%)

800 mg (64%)
144 bis 146⁰C
(C = 1,0 Chloroform)

C 63,34,
C 63,37,

H 7,57,
H 7,45,

N 11,19;
N 11,17,

Beispiele 3 bis

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und die Aminkom- ;ponenten gemäß den Tabellen 1 bis 5 einsetzt. In Tabelle ί ist die Säure'körnpuneiKe eine N°-Acy!arr.iriC' säure Und die Aminkomponente ein Aminosäüreamid. In Tabelle 2 ist die Säurekomponente eine N°-Acyl-"aminosäure und die Aminkomponente ein Dipeptidamid. In Tabelle 3 ist die Säurekomponente ein N⁰-Acyldipeptid, und die Aminkomponente hat die Formel H-Leu-NHBzh. Gemäß Tabelle 4 sind die Säurekomponenten N°-Acyldipeptide, und die Aminkomponenten sind Dipeptidamide der Formel

Gemäß Tabelle 5 setzt man als Säurekömponente eine N"-Acylaminosäure ein und als Aminkomponente einen Dipeptidester

Tabelle 1

Beispiel Säurekomponente Nr,

Aminkomponente

Produkt

Aus- Schmelzpunkt

Elementar-Analyse
® berechnet (%)
® gefunden (%)

c: H.

3	Z-Leu-OH	2	H-Phe-NHBzh
4	Z-Phe-OH	H-Phe-NHBzh
5	Z-GIn-OH	H-Phe-NHBzh
6	Z-Arg(NO₂)-OH	H-Phe-NHBzh
7	Z-Trp-OH	H-Phe-NHBzh
8	Z-Pro-OH	H-Phe-NHBzh
9	Z-Phe-OH	H-Val-NHBzh
10	Z-Phe-OH	H-Leu-NHBzh
11	Z-Phe-OH	H-Ile-NHBzh
Tabelle

Z-Lcu-Phe-NHBzh Z-Phe-Phe-NHBzh Z-G'ln-Phe-^NHBzh · Vi H₂O Z-Arg(NO₂)-Phe-NHBzh Z-Trp-Phe-NHBzh ■ Vi H₂O Z-Pro-Phe-HNBzh Z-Phe-Val-NHBzh Z-Phe-Leü-NHBzh Z-Phe-LIe-NHBzh · H₂O

69
48
91
48
34
44
51
57
30

233-224
204-705
260-263
214-216
191-194
186-189
230-233
203-207
207-212

74.84
74.72

76.57
76.32

69.86
69.64

64.95
64.61

74.63
75.04

74.84
74.74
74.54
74.65
74.84
74.62

72.58
72.99

6l79

6.10
6.05

6.20
6.00

5.90
5.71

5.96
5.91

6.28
6.25

6.62
6.67
6.80

6:78

6.94
6.70

Bei- Säurekomponente Aminkomponente spiel

Produkt

Aus- Schmelzbeute punkt

Elementar-Analyse

® berechnet (%)
® gefunden (%)

C H

12 Z-Phe-OH

13 Z-Leu-OH

14 Z--Phe-OH

15 Z-Phe-OH

16 Z-Phe-OH

H-Phe-Arg(NO₂)-NHBzh

H-Ala-Phe-NHBzh

H-Phe-A!a-NHBzh

H-Leu-Gly-NHBzh

Z-Phe-Phe-Arg(NO₂)-NHBzh ■ H₂O Z-LeU-AIa-PHe-NHBZh · H₂O Z-Pfie-Ala-Phe-NHBzh · H₂O Z-T'he-Phe-Ala-NHBzh - Vi H₂O Z-Phe-Leu-GIy-NHBzh · Vi H₂O

172-176

162-165

173-175

205-209

207-208

65.04
65.03

70.05
70.21

71.98
71.65

72.91
72.89

70.89
70.84

6.07
5.82

6.95
6.80
6.33
6.38

6.26
6.18

6.73
6.60

7.27 7.30

6.87 6.93

9.31

9.14

14.73

14.78

8.49 8.59

7.43 7.55 7.46 7.49 7.27 7,27

7.05 7.17

13.49 13.55

8.40 8.23

8.00 7.82

8.10 8.18

8.70 8.82

Tabelle 3

Bei- Süurckomponemtc
spiel

Aminkomponente

Produkt

Aus-; Schmclzbeute punki

Elementar-Analyse ® berechnet (%)

©■

gefunden (%) C H

2-Trp-Gly-OH
PMZ-Ah- AIa-OH
Z-Leu-Ala-OH
Z-Pho-Ala-OH
Z-Ala-Lsu-OH
Z-AIa-Phe-OH

H-Leu-NHBzh H-Leu-NHBzh H-Leu-NHBzh H-Leu-NHBzh H-Leu-NHBzh H-Leu-NHBzh

Z-Trp-GIy-Leu-NHBzh PMZ-AIa-Ala-Leu-NHBzh 7.-1. cu- Ala-Lcu-NHIi/.h Z-Phe-Ala-Leu-NHBzh Z-AIa-Leu-Leu-NHBzh Z-Ala-Phe-Leu-NHBzh

183-13S
236-239.
22S-2-J2
240-241
225-226
202-205

©■·■
©

©■■
©

71.30 70.92

67.75 68.02

70.33 70.52

72.20 72.14 70.33 70.14

72.20 72.27

6.43 6.39

7.02 7.05

7.54 7.48

6.84 6.84

7.54 7.52 6.84 6.82

Tabelle· 4:

10.40 10.45

9.30 9.42

9.11 8.93

8.64 8.85

9.11 9.33

8.64 8.88

k)8i- ιιί" Nn	Miurekomponente	Aminkomponente	Produkt	V₂ H₂O	Aus beute (%)	Schmelz punkt (⁰C)I	Elementar-Analyse © berechnet (%) © gefunden (%)	C	H	N
			_;,,...,; _.:	'/2 H₂O				70.93 70 51	5.95 5 91	10.79 >- 10.75 *"
23	Z-TfF-GIy-OH	H-Phe-Ala-NHBzh '	"Z-Trp-Gly-Phe-Ala-NHBzh	'/2 H₂O	58	245-247	© ©	70.07 69.82	6.86 fr.78	9.73 9.73
24	Z-Leu-Ala-OH	H-Phe-Ala-NHBzh	Z-Leu-Ala-Phe-Ala-NHBzh		38	259-262	© ®	70.00 69.44	6.94 6.7^.	2.28 9.20
25	Z-Pro-Leu-OH	H-Phe-Ala-NHBzh	Z-Prö-Leu-Phe-Ala-NHBzh ·	39	210-213	© ©	70.84 70.65	6.34 6.19	9.18 9.14
26	Z-Ala-Phe-OH	H-Phe-Ala-NHBzh	Z^AIa-PhB-PhC-AIa-NHBZh ·	57	256-259	© ©.	68.59 68.17	6.27 6.00	8.89 9.11
27 ■WIM	Z-Ala-Tyr-OH	H-phe-Ala-NHBzh	Z-Ala-Tyr-Phe-Aia-NHBzh ·	34	252-253	© ©

Tabelle 5 Bei» Säurekomponente Aminkomponcnte

Produkt

28 Z-AIa-OH H-Phe-

25 Z-GIa-OH H-Phe·

30 Z-Thr-OH H-Phe·

31 Z-Met-OH H-Phe

32 Z-Cys(Bzl)-OH H-Phe 33i Z-Arg(NO₂)-OH H-Phe

34 Z-Lys(Z)-OH H-Phe·

35 Z-Arg(N0₂)-0H H-Leu

36 Z-Lys(Z)-OH H-Leu

37 Z-Lys(Tos)-OH H Leu

■ Phe-OBu¹ -Phe-OBu¹ -Phe-OBu' -Phe-OBu¹ -Phe-OBu' -VaI-OBu' -VaI-OBu' -Phe-OBu' -Phe-OBu¹ -Phe-OBu¹

Z-Ala-Phe-Phe-OBu¹

Z-Gln-Phe-Phe-OBu'

Z-Thr-Phe-Phe-OBu¹

Z-Met-Phe-Phe-OBu'

Z-Cys(Bzl)-Phe-Phe-OBu'

Z-Arg(NO₂)-Phe-VaI-OBu'

Z-Lys(Z)-Phe-Val-OBu'

Z-Arg(NO₂)-Leu-Phe-OBu'

Z-Lys(Z)-Leu-Phe-OBu'

Z-Lys(Tos)-Leu-Phe-OBu'

Aus beute	Schmelz punkt (⁰C)	Ilcmcntar-Analyse ii' berechnet ( © gefunden V	C	%) '/·)	N	LT,	KD cn
			69.09 69.05	II	7.32 7.36		ί,
71	160-163	© ©	66.65 66.51	6.85 6.87	8.88 8.74		OO
86	196-200	Φ	67.64 67.24	6.71 6.71	6.96 6.88
63	63- 68	©	66.32 66.30	6.85 6.70	6.C3 6.53
85	107-108	Φ	69.04 68.92 58.52 58.99	6.84 6.77	6.04 6.06 14.93 14.00
57 83	68- 80 oily	© © ©	66.97 66.93	6.52 6.48 7.06 7.09	7.71 7.80
100	112-115	©	57.63 57.50	7.31 7.30	14.26 13.99
57	88- 92	Φ ©	67.38 67.40	7.18 6.97	7.67 7.73
76	103-106	Φ	63.97 61.02	7.45 7.43	7.46 7.45
87	103-106	© ©	7.25 7.20

Beispiel 38

In einem Kolben gibt man 280,2 mg (1 mmol) Z-GIn-OH und 268,5 mg (1 mmol) H-Phe-Phe-OBu¹, und diese Stoffe werden in 10 ml Wasser suspendiert. Sodann fuhrt man in die Suspension eine Glaselektrode eines pH-Meßgerätes ein, worauf 1/10 n-NaOH in die Suspension eingetropft wird, um den pH auf 6,5 bis 7,0 einzustellen, während man unter Rühren die Suspension mit 100 mg Thermoase versetzt Dabei wird aer Feststoff aufgelöst. Die Reaktion wird unter Rühren bei 38^QC während 20 h fortgesetzt Während der Reaktion gibt man zu der Reaktionsmischung unter ständiger Messung des pH-Wertes des Reäktionsgemisches mit einem pH-Meter 1/10 n-NaOH, um den pH auf 6,5 bis 7,0 zu halten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser 1 n-HCl, Wasser, 7% Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet Das Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert Man erhält 330 mg_ (Ausbeute 52,3%) des angestrebten Produkts der hormel Z-Gln-Phe-Phe-O-Bu¹ mit einem Schmelzpunkt von 197 bis 200⁰C.

Beispiel 39

In einem Kolben suspendiert man in 10 ml Wasser 398,5 mg (lmmol) Z-Phe-Val-OH und 320,4 mg (1 mmol) H-Phe-Val-OBu¹. In die Suspension taucht man eine Glaselektrode eines pH-Meters, worauf eine 1/10 n-NaOH in die Suspension eingetropft wird, um den pH auf 6,5 bis 7,5 einzustellen. Sodann gibt man 100 mg Thermoase unter Rühren zu der Suspension, wobT die Feststoffkomponente aufgelöst wird. Die Reaktion wird unter Rühren bei 38⁰C während 20 h durchgeführt. Während der Reaktion gibt man 1/10 n-NaOH zu dem Reaktionsgemisch, während der pH des Reaktionsgemischs mit einem pH-Meter verfolgt wird. Auf diese Weise wird der pH-Wert auf 6,5 bis 7,5 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 1 n-HCl, Wasser, 7% Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 240 mg (Ausbeute 34,2%) des angestrebten Produkts der Formel

Z-Phe-Val-Phe-VaI-O-Bu¹
mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 145°C.
Bei spie! 40

0.1 gProlisin und 0,1 g eines Inhibitors für das proteolytische Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit 3 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5) versetzt, welche 2xl0^JM Calciumacetat enthält. Sodann wird die Stärke von der Mischung abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,33 g (1 mmol) Z-GIn-GIy-OH und 0,26 g (1 mmol) H-Leu-Val-

Tabelle 6

NH₂ · HCl gegeben. Sodann fügt man zu dem Gemisch 1 ml 1 n-NaOH hinzu, worauf die Mischung noch während 20 h bei 38 bis 40⁰C gerührt wird. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 7% Ammoniakwasser, 5% Zitronensäure und Wasser gewaschen. Man erhält 0,394 g rohe Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 237 bis 240⁰C [α]% = -22,0 (C= 0,5 AcOH). Das Produkt wird zu Methanol gegeben, und die Mischung wird zum Sieden gebracht, worauf

;" eine geringe Menge unlöslicher Verunreinigungen entfernt wird. Man erhält 0,38 g (70%) Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 244 bis 247°C und [atf = - 20,0 (C= 0,5 ArOH).

Elementar-Analyse: C₂₆H₄₀N₆O₇
berechnet (%) C 56,92, H 7,34, N 15,32;

gefunden (%)

C 56,89, H 7,30, N 15,21
Beispiel 41

0,2 g Prolisin und 0,2 g eines Inhibitors für das proteoiytische Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5) vermischt, welche 2 x 10 M Calciumacetat enthält. Danach wird die Stärke von dem Gemisch abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,43g (lmmol) Z-Leu-Tyr-OH und 0,33 g (1 mmol) H-Leu-Val-OMe ■ HBr gegeben, und dann gibt man zu der Lösung 1 ml 1 η NaOH. Die Mischung wird bei 38 bis 40° C während 20 h gerührt. Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch unter Rühren mit Äthylacetat vermischt, worauf die wäßrige Phase abgetrennt wird, und die organische Phase wird der Reihe nach mit 7%igem Ammoniakwasser, In HCl und einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann mit Na₂SO₄ getrocknet. Die Mischung wird eingeengt, und man erhält 0,52 g (Ausbeute 78,8%) eines weißen schaumigen Pulvers. Das Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie aufgetrennt, wobei als Entwickler ein Gemisch aus sekundärem Butanol und 3%igem Ammoniakwasser (8 : 3) (Rf = 0,85) eingesetzt wird. Das Produkt wird aus Dioxan/ Wasser umkristallisiert. Man erhält Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 184 bis 190°C[ffß⁹ = -50,0(C= 1,0 Methanol). Das gleiche Produkt, hergestellt nach der DCCl-HOBt-Methode hat einen Schmelzpunkt von 176 bis 181° C und [a]$ = -48,6 (C = 1,0 Methanol)

Elementar-Analyse C₃₅H₁₀N₄O₁₁ '/2H₂O

berechnet (%)
gefunden (%)

C 63,33. H 7,74, N 8,44.
C 63,36. H 7,70, N 8,15.

Beispiele 42 bis 45

Das Verfahren des Beispiels 40 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und Aminkomponenten der Tabelle 6 einsetzt.

Bei- Säurekomponente

. spiel ii

Ammokomponente Ausbeute

Schmelzpunkt

(⁰C)

\it\D

42	ZLeüPheOH	HLeuLeuOMe	65	190-192	-57,2
					• (C = 0,5 MeOH)
43	pMZMeiGlyOH	KPheNHj	82	226-229

Fortsetzung

Beispiel
Nr.

Sfiurekumpunenie

Aminukumponente Ausbeute

Schmelzpunkt

(⁰C)

WlP

ZPheOH
ZMetOH

HIleuOMe 79 104-106

HLeuPheOBu · t 82 160-163

-10,0

(C = 0,5 EtOH,^x

-39,0

(C = 1 MeOH)

Beispiel 46

Eine Mischung von 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-03-benzyl)-D,L-asparaginsäure, 215 mg (1,00 mmol) L-PSenylanilinmethylesterhydrochlorid und 20 mg gereinigter Thermoase und 20 mg Inhibitor für das proteolytische Enzym, hergestellt aus Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) vermischt, welche 2,0 x 10"² M Calciumacetat enthält, und dann gibt man zu dem Gemisch In NaOH, um den pH auf 7,5 einzustellen. Die Reaktion wird unter Rühren während 17 h bei 39° C durchgeführt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 5%igem Ammoniakwasser, 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen und dann getrocknet. Min erhält 413 mg N-Benzyloxycarbonyl-GS-benzyl)-L-asparagyl-L_:phenylalanin-methylester. Das Produkt wird au* Äthy.acetat/Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute
Schmelzpunkt

[O]¹S- -12,2(C =
Elementar-Analyse:

Berechnet (%)
gefunden (%)

79,6%

116 bis 117⁰C

1,0 Dimethylformamid)

C-29H30N2O7

C 76,17, H 5,83, N 5,40,
C 67,35, H 5,81, N 5,28.

Beispiel 47

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 715 mg N-Benzyloxycarbonyl-^-benzyO-D.L-asparaginsäure und 431 mg D,L-PhenylalaninmethyI-esterhydrochlorid einsetzt sowie 20 mg Thermolysin, jedoch ohne Inhibitor. Man erhält 244 mg (Ausbeute 47,0%) des gleichen Produkts. '<■

Beispiel 48

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-C/J-benzyl)-L-asparaginsäure und 431mg (2,00 ml) D₁L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 426 mg (Ausbeute 82,1%) N-Benzyloxycarbonyl-(/?-benzyl)-l-asparagyl-L-phenylalaninmethylester mit [a]]} = -12,5 (C = 1,0 Dimethylformamid).

B e i s ρ i e 149

Das Verfahren des Beispiels I wird wiederholfj wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-BenzyloxycarbonyUC/?- benzyi)-D,L'asparaginsäüre und 413 mg (2,00 mfnol) DjL'Pnenylalaninmethylesterhydrochiqrid einsetzt, Mari erhalt 410 mg (Ausbeute 79,0%) N-Benzyloxycar^ bonyΓ-C/^benzyl)*L*asparagyl·L·phenylalanίnmetlιylester mit (ff]⁵,⁰ = =12,0 (C = 1,0 Dimethylformamid),

bf) B e i s ρ ί e 1 50

100 mg Thermoase und 100 mg eines Inhibitors für das proteolytische Enzym, hergestellt aus Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) mit 2,0 x 10'² M Calciumacetat vermischt Die Mischung wird während 10 min bei 30⁰C gerührt Das unlöslische Material wird durch Filtrieren der Lösung über ein Glasfilter (G-3) entfernt Das Filtrat wird mit 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-OS-benzyl)-D,L-asparaginsäure und 215 mg (1,00 mmol) L-Phenylalaninmethylester vermischt und dann giDt man In NaOH zu dem Filtrat, um den pH auf 7,5 einzustellen. Die Reaktion wird unter Rühren bei 39⁰C während 17 h durchgerührt Der erhaltene weiße Niederschlag wird nach dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt, wobei man 411 mg (Ausbeute 79,2%) N-Benzyloxycarbonyl-(jß-benzyl)-L-asparagyl-L-phenylalanin-methylester erhält mit [σ]!,³ = -12,5 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 51

Das Verfahren des Beispiels 50 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-Cfl-benzyl)-D,L-asparaginsäure und 2Hmg L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid einsetzt, sowie 200 mg Prolisin und 200 mg des Inhibitors. Man erhält 110 mg (Ausbeute 21,2%) N-BenzyloxycarbonyI-(j!-benzyl)-L-asparagyl-L-phenylalaninmethylester mit [a]" = -12,8 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 52

Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-0?-benzyl)-L-asparaginoäure und 431 mg (2,00 mmol) D.L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 238 mg (Ausbeute 45,8%) N-Benzyloxycarbonyl-CS-benzyl)-L-asparagyl-L-phenyla!aninmethylester mit [σ]² ₀° = -13,2 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 53

Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(jJ-benzyl)-D,L-asparaginsäure und 431 mg

(2,00 mmol) D.L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 121 mg (Ausbeute 23,3%) N-BenzyIoxycarbonyl-03-benzyl)-L-asparagyUL-phenyl·'
lalaninmethylester mit[a)o = ^12,4 (C = 0,5 Dimethylformamid),

Beispiele 54 bis 60

Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, Wobei man die Bedingungen gemäß Tabelle 7 wählt. Man erhält das Produkt gemäß Beispiel 46.

21

Tabelle 7

Bei- N-Benzyloxycarbonylspiel O!!-benzyl)-asparagin-Nr. säure

(Menge mg)

Phenylalaninmethylesler

(Menge mg)

Proteinase

(Menge mg)

Inhibitor

(Menge mg)

Ausbeute

54	D,L-^T-'»irbindung(715)	L-Verbindung (215)	Thermolysm (20)	—	47,0
55	L-Verbindung (357)	D,L-Verbindung (413)	desgl.	-	86,1
56	L-Verbindung (357)	D,L-Verbindung (431)	Thermoase (100)	Kartoflel- inhibitor (100)	75,5
57	D,L-Verbindung (715)	D,L-Verbindung(431)	desgl.	desgl.	48,4
58	D,L-Verbindung (715)	L-Verbindung (215)	Thermolysin	-	63,6
59	L-Verbindung (357)	D,L-Verbindung(431)	desgl.	-	36,2
60	D,L-Verbindung (715)	D₁L-Verbindung (431)	desgl.	-	21,8

Beispiele 61 bis 74

Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man die Acylaminosäuren und die Aminosäurederiyate gemäß Tabelle 8 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt. Alle Produkte sind L,L-Produkte.

Tabelle 8

Bei	Acylamiiiosäure	Aminosäurederivat Produkt	•HCI	Z-L-Ala-L-PheOMe	Aus	Iah,
spiel		H-PheOR	R		beute
Nr.		Konfigu		desgl.	(%)
		ration	CH₃	desgl.
61	Z-L-AIaOH	D,L		Z-L-Trp-L-PheOMe	23,2	-14,5
			CH₃	desgl.		(C = 0,5, MeOH)
62	Z-D₁L-AIaOH	L	CH₃	desgl.	23,7	desgl.
63	Z-D,L-AlaOH	D₁L	CH₃	Boc- L-Leu-L-PheOMe	13,8	desgl.
64	PMZ-L-TrpOH	D₁L	CH₃		52,3	-37,0 (C = 1 DMF)
65	PMZ-D,L-TrpOH	L	CH₃	desgl.	67,4	desgl.
66	PN.Z-D,L-TrpOH	D₁L	CH₃	Z-L-Phe-L-PheOMe	39,7	desgl.
67	Boc-L-LeuOH	D₁L			19,6	-26,4
			CH₃	desgl.		(C = 0,5, MeOH)
68	Boc-D,L-LeuOH	L	CH₃	desgl.	19,9	desgi.
69	Z-L-PheOH	D₁L		5 Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt	71,2	-17,6
			CH₃			(C= 1,DMF)
70	Z-D,L-PheOH	L	CH₃	₅ Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt	47,8	desgl.
71	Z-D,L-PheOH	D₁L	C₂H	₅ Z-L-*.s?(BZL)-L-PheOEt	27,2	desgl.
72	Z-L-ASp(BZL )OH*1)	D₁L			84,0	-12,2
			C₂H	Beispiel 75		(C= 1,DMF)
73	Z-D,L-Asp(BZL)OH	L	C₂H	79,2	desgl.
74	Z-D₁L-ASp(BZL)OH	D₁L		70,3	desgl.
*1) BZL: jj-benzylester.

Eine Mischung von ZArg(NO₂) LeuOH (0,47 g; phorpentoxid bei vermindertem Druck getrocknet.

1 mmol), HLeuGlnölyOet ■■ HCl (0,38 g; 1 mmol), 60 Man erhält 0,58 g (73,5%) eines weißen Pulvers mit den 'Thermolysin (2 mg), 0,2M Tris-HCl-PüflerJösung folgenden Daten!

(pH 8; 10"⁴²M Calciumacetat; 2 ml), 1-Butanol (0,4 ml) ρ . 207-210 5°C

und eine 4M wäßrige Lösung von Natriumhydroxid Ul^· -24 2° (C = 0 5' DMF)
,(0,25 ml) wird bei 4O⁰C während 3 h in einem 25 ml J^D ' 0,79(S-EyOHi'3% Ammoniak = 8 : 3)

RundkolberigerulirL Das Produkt wird Über eine Glas- 65 _E|e_mentar-Analyse· C₃₅H₅₆N₁₀O,, · '/2H₂O

flache abgesaugt und der Reihe nach mit lM-Ammo-

niakwasser, lM'Salzsaure und Wasser gewaschen, Nach berechnet (%) C 52,42, H 7,16, N 17,47

dem Trocknen an der Luft wird das Produkt über Phos- gefunden (%) C 52,46, H 6,99, N 17,32.

0,33 g eines weißen Pulvers in einer Ausbeute Von 63%. Das Produkt hat die folgenden Kenndaten:

' * TLG'

Beispiel 76

ZLeuGlnArg(NO₂)LeuOH (10,35 g; 0,5 mmol), HLeuGlnGlyOEt · HCl (0,19 g; 0,5 mmol), Thermoly- Fp.: sin (5 mg), O,2M-Tris-HCI-Pufferlösung (pH 8; 10"²M 5 [σ]²,³: Calciumacetat; 3 ml), 1-Butanol (0,5 ml) und 4M wäß- R rige Natriumhydroxidlösung (0,125 ml) werden vermischt und bei 40⁰C während 4 h in einem 25 ml Rundkolben gerührt. Das Produkt wird über ein Glasfilter abgesaugt und der Reihe nach mit 1M-Ammoniakwas- io Elementar-Analyse: C₄₆H₇₅N₁₃Oi₄ ser, lM-Salzsäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen an Luft wird das Produkt unter vermindertem berechnet (%) Druck über Phosphorpentöxid getrocknet. Man erhält gefunden (%)

251-260°C

-ii,7^ö (C « 0,5; DMF)

0,49 (s-Butanol; 3% Ammdniakwasser; 8 : 3)

Und 0,47 (1-Butanol: Essigsäure ; Wasser;

4 : 1 : 5) ein Fleck.

G 53,42, H 7,31, N 17,61, C 53,29, Ή 7,27i N 17,45,

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden der allgemeinen Formel

X-A-B-Y,

in der A und B gleich oder vei schieden sind und einen Aminosäure-Rest oder einen Peptid-Rest, X eine geschützte Aminogruppe und Y eine geschützte Carboxylgruppe bedeuten, durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids der allgemeinen Formel