NL9400092A

NL9400092A - Enzymatische koppeling van L-fenylalaninemethylester en N-benzyloxycarbonyl-asparaginezuur.

Info

Publication number: NL9400092A
Application number: NL9400092A
Authority: NL
Inventors: Shigeaki Irino; Shin-Ichiro Nakamura; Kiyotaka Oyama; Peter Jan Leonard M Quaedflieg; Theodorus Johannes Godf Dooren
Original assignee: Holland Sweetener Co
Priority date: 1994-01-20
Filing date: 1994-01-20
Publication date: 1995-09-01
Also published as: RU95100762A; TW425428B; US5527689A; DE69515709T2; ATE191009T1; EP0664338B1; CN1066773C; KR950032628A; EP0664338A1; KR100350011B1; DE69515709D1; CN1113266A

Description

ENZYMATISCHE KOPPELING VAN L-FENYLALANINEMETHYLESTER EN N-BENZYLOXYCARBONYL-ASPARAGINEZUUR

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van N-benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester door enzymatische koppeling van N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalanine-methylester met hoge conversie in waterig milieu onder de vorming van een precipitaat.

N-beschermd-a-L-aspartyl-L-fenylalaninemethyl-ester, zoals in het bijzonder N-benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester, is een belangrijke precursor van de "intense sweetener" aspartaam, een produkt met een zoetkracht van circa 200x die van sucrose en met een uitstekend smaakprofiel zonder bij voorbeeld de bittere nasmaak van andere intense sweeteners zoals bij voorbeeld saccharine en cyclamaat. De zoetstof aspartaam wordt o.a. toegepast in een breed scala van produkten, zoals frisdranken, zoetwaren, table-top zoetjes, farmaceutica, et cetera.

Voor de bereiding van aspartaam zijn diverse methodes bekend. Naast chemische bereidingswijzen bestaan er ook enzymatische bereidingswijzen, die hun belang vooral ontlenen aan het feit dat de enzymatische koppeling op stereo- en regioselectieve wijze plaats vindt. Enzymatische L,L-koppeling van N-beschermd asparaginezuur, in het bijzonder van N-benzyloxycarbonyl-asparaginezuur (hierna ook wel aangeduid met Z-Asp), en L- (of DL-) fenylalaninemethylester, respectievelijk daarvan afgeleide zure zouten zoals bijvoorbeeld het hydrochloridezout (verder ook wel aangeduid met PM) onder vorming van een N-beschermde aspartaamprecursor is tot nu toe uitvoerig bestudeerd en beschreven. Een overzicht van bereidings- wijzen voor aspartaam is gegeven door K. Oyama in hoofdstuk 11 (pag. 237-247) van Chirality in Industry,

John Wiley & Sons Ltd., 1992.

De betreffende enzymatische koppelingsreaktie, die in de regel bij een pH van 6 tot 7,5 wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een neutraal protease, in het bijzonder van een metallo-protease zoals bijvoorbeeld thermolysine, is een evenwichts-gecontroleerde reaktie.

Voor het bereiken van hoge conversies bij dergelijke enzymatische koppelingsreakties zijn volgens de bekende stand van de techniek specifieke maatregelen nodig. Zo wordt er bijvoorbeeld in US-A-4165311 gebruik gemaakt van het feit dat het evenwicht in de koppelingsreaktie naar rechts kan worden verschoven door de vorming van een precipiterende additieverbinding van N-beschermd aspartaam, in het bijzonder van N-benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester (hierna ook wel aangeduid met Z-APM), met in het reaktiemengsel aanwezig D- of L-fenylalaninemethylester. Dergelijke additie-verbindingen van de aspartaamprecursor worden ook wel aangeduid als Z-APM.D-PM resp. Z-APM.L-PM. Voor de vorming van zulke additieprodukten is het volgens de tot nu toe bekende leer gewenst dat de koppelingsreaktie van Z-Asp en L-PM wordt uitgevoerd met een ten minste dubbele molaire hoeveelheid L-PM ten opzichte van Z-Asp, of in aanwezigheid van een ten minste equivalente hoeveelheid D-PM teneinde hoge conversies, d.w.z. £ 60%, bij voorkeur £ 80% op Z-Asp, te bereiken. In de praktijk worden deze enzymatische koppelingsreakties dan ook meestal beschreven in verhoudingen van PM t.o.v. Z-Asp van bijvoorbeeld 2,0 tot 2,5:1 of hoger. Hoewel bij dergelijke uitvoeringsvormen inderdaad hoge conversies tot gewenst produkt worden bereikt, hebben deze methodes een aantal nadelen, te weten: (a) handling en verdere opwerking van het neerslag ter verkrijging van het uiteindelijk gewenste aspartaam (hierna: APM) is moeizaam, mede omdat het additieprodukt relatief slecht filtreerbaar is en goed moet worden uitgewassen om APM te verkrijgen dat slechts weinig verontreinigingen bevat; (b) terugwinning en/of recirculatie is nodig van de in overmaat aanwezige component(en) en van de uit het neergeslagen additieprodukt van het koppelingsprodukt vrij te maken niet-APM component; als de koppelingsreaktie wordt uitgevoerd met DL-PM dient het overblijvende D-PM in de regel bij opwerking ook nog, in de regel via DL-fenylalanine, geracemiseerd te worden. Zodoende zijn deze methodes minder geschikt voor toepassing op commerciële schaal.

Opgemerkt zij dat in WO-92/02617 (aanvraagnummer PCT/US91/05415) een enzymatische koppelingsreaktie van nagenoeg gelijke hoeveelheden Z-Asp en L-PM.HCl (in een molverhouding van circa 1,2:1) is beschreven in waterig milieu en in aanwezigheid van azijnzuur bij een pH = 7. Daarbij wordt gebruik gemaakt van door cross-linking geïmmobiliseerde enzymkristallen van protease, doch de daarbij bereikte omzettingsgraad bedraagt maar ongeveer 20%. In EP-A-0149594 wordt de toepassing van formyl-Asp (F-Asp) beschreven voor een enzymatische koppelingsreaktie in waterig milieu in een 1:1 verhouding van F-Asp t.o.v. L-PM. De conversie van F-Asp blijft vanwege de vorming van het F-APM.L-PM additieprodukt evenwel duidelijk onder de 50% en het daarbij bereikte rendement blijkt zeer laag te zijn (circa 12% na opwerking tot F-APM).

Overigens zij ook nog opgemerkt dat de in het koppelings-reaktiesysteem aanwezige esters relatief gevoelig zijn voor chemische hydrolyse. Zo wordt PM gehydrolyseerd onder vorming van fenylalanine (hierna ook aangeduid als Phe); Z-APM wordt gehydrolyseerd onder vorming van Z-beschermd aspartylfenylalanine (ook wel aangeduid als Z-AP). Deze ongewenste nevenreaktie treedt vooral op bij een pH ;> 6, of £ 4, en is sterker naarmate de pH meer van de genoemde waarden afwijkt en de verblijftijd onder reaktiecondities langer is.

Het is tot nu toe algemeen aangenomen, dat bij de enzymatische koppeling van Z-Asp en L-PM, uitgaande van equivalente of nagenoeg equivalente hoeveelheden van Z-Asp en L-PM zonder aanwezigheid van een overeenkomstige hoeveelheid D-PM, of zonder het treffen van andere maatregelen om het koppelingsevenwicht te verschuiven, geen conversies hoger dan 50% berekend op Z-Asp konden worden bereikt. Wat betreft de enzymatische koppeling in waterig milieu is door Zhou en Huang (Indian J. Chem., 32B, pagina 35-39, 1993) recent nog aangegeven dat de optimum condities voor de reaktie, met toepassing van geïmmobiliseerd protease bij een verhouding Z-Asp t.o.v.

PM van 1:4 liggen. Daarbij zij opgemerkt, dat bij toepassing van een geïmmobiliseerd protease (zie bijvoorbeeld Biotechnology, 3., pagina 459-464, 1985; Nakanishi et al.) veel van het gevormde produkt in de voor de immobilisatie gebruikte hars wordt opgenomen en daaruit via een aparte extractiestap moet worden verwijderd. De door Nakanishi et al. met een l:l-verhouding Z-Asp t.o.v. L-PM bereikte resultaten in waterig milieu van maximaal ca 58% opbrengst bij relatief lage concentraties (80 mM) zijn voor de industriële praktijk dan ook zonder betekenis.

Alternatieve manieren om het koppelingsevenwicht te verschuiven zijn beschreven in o.a. (i) J. Org. Chem.

46., p.5241 (1981) door toepassing van een geïmmobiliseerd protease en niet-water-mengbaar organisch oplosmiddel; zo ook JP-B-8533840 waarin opbrengsten met 1:1 mol-verhou-dingen worden getoond van slechts ca 20-30%; (ii) GB-A-2250023 door toepassing van geïmmobiliseerd protease en water-mengbaar organisch oplosmiddel; zo ook EP-A-0272564 in acetonitril, waarbij weliswaar gesuggereerd wordt dat de verhouding N-beschermd Asp t.o.v. L-PM kan liggen tussen 10:1 en 1:10, doch uit de voorbeelden blijkt dat slechts ruime overmaat L-PM wordt overwogen en dat bij stoechiometrische of nagenoeg stoechiometrische verhoudingen slechte conversies en rendementen worden behaald. Stoechiometrische verhoudingen worden ook wel equimolaire verhoudingen genoemd, üit de in GB-A-2250023 beschreven voorbeelden blijkt overigens eveneens dat hogere opbrengsten worden bereikt naarmate de verhouding L-PM tot N-beschermd Asp hoger is (bij 2:1 is de opbrengst circa 85%, bij 1:1 slechts circa 50%). In dergelijke alternatieve uitvoeringsvormen wordt verschuiving van het evenwicht niet bereikt door vorming van een neerslag, doch veeleer door transport van het gevormde koppelingsprodukt naar de organische fase. Afgezien van kostenverhogende aspecten als gevolg van veelal niet te vermijden oplosmid-delverliezen bij het gebruik van organische oplosmiddelen, is ook een nadeel van dergelijke alternatieve uitvoeringsvormen, dat bij de opwerking tot aspartaam bijzondere maatregelen moeten worden getroffen ter verwijdering van de in de koppelingsreaktie gebruikte organische oplosmiddelen. Bij toevoeging van (of uitvoering van de reaktie in c.g. in aanwezigheid van) een organisch oplosmiddel zoals bij voorbeeld acetonitril of dimethylformamide, of stoffen als di- en triglym (zie EP-A-0278190), worden in de regel slechts lage opbrengsten aan Z-APM e.d. bereikt, tenzij de reaktie wordt uitgevoerd bij een hoge molverhouding van L-PM(.HCl) t.o.v. Z-Asp.

Opgemerkt zij verder nog dat het bij chemische koppelingsreakties (uitgaande van N-beschermd asparagine-zuuranhydride, bij voorbeeld het N-formylderivaat, en L-Phe of L-PM) niet ongebruikelijk is dat de reaktie bij stoechiometrische of nagenoeg stoechiometrische verhoudingen der reaktanten plaats vindt, doch zulks leert niets over de uitvoering van enzymatische koppelingsreakties met Z-Asp als uitgangsstof in water.

Wel zij hier nog gewezen op DE-A-3517361 waarin voor een enzymatische koppelingsreaktie is beschreven dat de reaktanten Z-Asp en L-PM weliswaar in nagenoeg stoechiometrische verhoudingen aanwezig kunnen zijn, doch waarbij -ter vorming van een addukt- (en in plaats van de in de hierboven aangehaalde stand der techniek minimaal equivalent benodigde overmaat L-PM of D-PM) een ten minste equivalente hoeveelheid van een organische amineverbinding wordt toegepast, waarin ten minste één C6-koolwaterstof-rest aanwezig is. Een dergelijke methode is praktisch voor APM-bereiding van weinig betekenis, omdat enerzijds het gevormde additieprodukt door aanzuren moet worden gesplitst onder vrijmaking van het amine, en anderzijds een verdere "procesvreemde11 organische component wordt geïntroduceerd welke, in recirculatie- en filtraatstromen van het proces, moeilijk van de voor de APM-synthese benutte uitgangsprodukten is te scheiden.

Er bestond derhalve behoefte aan een eenvoudige en efficiënte, bij voorkeur stoechiometrische, enzymatische koppeling van Z-Asp en L-PM, die zowel een hoge conversie als een laag verbruik aan grondstoffen en beperking van recyclestromen oplevert, en goed filtreer-baar produkt oplevert zonder de noodzaak van aanwezigheid van ten minste equivalente hoeveelheden D-PM (of een additioneel equivalent L-PM) of dergelijke, en zonder dat er bij de koppelingsreaktie organische solvents of amines moeten worden toegevoegd.

Doel van de uitvinding is nu een eenvoudige werkwijze met hoge conversie te verschaffen voor de enzymatische koppeling van Z-Asp en L-PM, waarbij de hierboven genoemde nadelen worden vermeden, stoechiometrische of nagenoeg stoechiometrische hoeveelheden reaktanten kunnen worden ingezet, en goed filtreerbaar produkt wordt verkregen. Dit doel wordt volgens de uitvinding verrassenderwijze bereikt doordat men de koppelingsreaktie uitvoert met behulp van equimolaire of nagenoeg equimolaire hoeveelheden Z-Asp en L-PM onder invloed van een neutraal protease als enzym bij een initiële pH van 4,5 tot 6,0 en in aanwezigheid van 3 tot 25%, berekend als gewichtspercentage t.o.v. het totale reaktiemengsel, van een alkalimetaal-, aardalkalimetaal-, of een ammoniumzout, In verband met reaktiesnelheid en beperking van ongewenste hydrolyse wordt de koppelings-koppelingsreaktie bij voorkeur uitgevoerd bij een initiële pH van 4,7 tot 5,5.

Verrassenderwijze is tevens gevonden dat de koppelings-reaktie bij de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding ook zeer gunstig bij relatief hoge concentraties uitgangsstoffen kan worden uitgevoerd. Dergelijk hoge concentraties waren bij de werkwijzen van de stand der techniek ónmogelijk gebleken wegens te hoog oplopende viscositeit van het reaktiesysteem tijdens het verloop van de reaktie. Zonder zich vast te leggen op een of andere verklaring denkt aanvraagster dat de gunstige resultaten van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegeschreven aan verschillen in oplosbaarheid van Z-APM en van Z-APM.L-PM bij verschillende pH's en zoutconcen-traties.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt in waterig milieu, dat een hoeveelheid van een alkalimetaal-, aardalkalimetaal-, of ammoniumzout bevat van 3 tot 25%, berekend als gewichtspercentage t.o.v. het totale reaktiemengsel, bij een initiële pH van 4,5 tot 6,0 een enzymatische koppelingsreaktie met een neutraal protease uitgevoerd van Z-beschermd asparaginezuur en L-fenylala-ninemethylester in stoechiometrische of nagenoeg stoechiometrische verhoudingen onder de vorming van een precipitaat.

Onder waterig milieu wordt in het kader van de onderhavige aanvrage verstaan elk homogeen, polair, eventueel geringe hoeveelheden (tot ca 30%) organisch oplosmiddel zoals bijvoorbeeld methanol of acetonitril bevattend, waterig systeem.

Allerlei alkalimetaal-, aardalkalimetaal- of ammoniumzouten kunnen bij de werkwijze volgens de uitvinding worden toegepast. Geschikt zijn bijvoorbeeld halogenides of sulfaten van kalium, natrium, lithium, calcium, magnesium en ammonium, of mengsels daarvan. Onder ammonium wordt hier ook verstaan met een of meer alkylgroepen gesubstitueerd ammonium; voorbeelden van dergelijke gesubstitueerde ammoniumzouten zijn tri(m)ethylammoniumchloride, di(m)ethylammoniumchloride enz. De toepassingsmogelijkheden worden wat betreft de gewichtspercentagerange, die volgens de uitvinding in het gebied van 3 tot 25 gew.% ligt, voor een deel bepaald door de oplosbaarheid van de betreffende zouten. Alkalimetaal-en ammoniumzouten hebben i.h.a. de beste oplosbaarheid, en verdienen de voorkeur. Met grote voorkeur worden lithium-chloride, natriumchloride, kaliumchloride, natriumsulfaat, kaliumsulfaat, ammoniumchloride en/of ammoniumsulfaat toegepast.

Naarmate het zoutgehalte in het reaktiesysteem hoger is verloopt de omzetting sneller, zonder dat er sprake is van wezenlijke invloed op de rendementen. Wel zal er bij hogere gehaltes al gauw sprake zijn van sterk oplopende viscositeit van het systeem en/of overschrijding van de oplosbaarheidsgrens van een of meer der uitgangsstoffen en/of van het zout zelf, zodat het verkregen precipitaat onnodig verontreinigd wordt met dat zout, of zodat de reaktie met een lagere conversie verloopt. Boven de 25% blijkt uitvoering van de reaktie i.v.m. de viscositeit van het systeem nauwelijks meer realiseerbaar. Naarmate het zoutgehalte in het reaktiesysteem lager is zal de totaal benodigde reaktietijd langer zijn, hetgeen aanleiding geeft tot meer hydrolyse van vooral L-PM. Bij lagere gehaltes dan 3% wordt geen significant effect van de aanwezigheid van zout op de reaktie aanwezig geacht. Eveneens is er bij lagere zoutconcentraties een ongewenste invloed op de oplosbaarheid van het koppelingsprodukt. Eventueel voortijds neerslaand additieprodukt (Z-APM.L-PM) is in de reaktie volgens de uitvinding overigens niet storend, aangezien dit -als gevolg van verschuiving van evenwicht- gedurende het verloop van de omzetting onder de betreffende specifieke condities vanzelf, geheel of gedeeltelijk, overgaat in Z-APM-precipitaat. Bij voorkeur bedraagt het zoutgehalte 10 tot 18%, omdat in dat gebied de meest gunstige omstandigheden worden gevonden t.a.v. a) de viscositeit van het systeem? b) de oplosbaarheid van de uitgangsstoffen en precipitaatvorming van het eindprodukt; en c) de reaktietijd. E.e.a. wordt hierna nader verduidelijkt bij bespreking van de mechanische condities waaronder het systeem zich bevindt.

De enzymatische koppeling vindt in de regel plaats binnen een temperatuurgebied van 10 tot 60°C. Naarmate de temperatuur lager is verlopen zowel de koppelingsreaktie alsook de nevenreakties, zoals hydrolyse van L-PM en Z-APM trager. Naarmate de temperatuur hoger is zal desactivering van het enzym sneller optreden. Het is voor de vakman eenvoudig vast te stellen welke temperatuur bij het gebruikte enzym gekozen moet worden om optimale resultaten wat betreft conversie tot Z-APM en levensduur van het enzym te bereiken.

De enzymatische koppeling volgens de uitvinding wordt uitgevoerd met een neutraal protease. Onder neutraal protease wordt hier verstaan elk bekend neutraal proteolytisch enzym dat geschikt is in de synthese van Z-APM uit Z-Asp en L-PM, alsmede mutanten daarvan met vergelijkbare, of zelfs verhoogde, aktiviteit. Voorbeelden zijn metalloproteases zoals thermolysine, geproduceerd door Bacillus thermoproteolvticus, en andere proteases geproduceerd o.a. door verschillende Bacillus species, zoals Bacillus stearothermophilus, Bacillus amvlolicue-faciens. Bacillus cereus, collagenase enz. In het algemeen vertonen deze enzymen een optimum in protease-aktiviteit bij een pH van circa 6 tot 8, doch het is gebleken dat bij toepassing onder de condities volgens de onderhavige uitvinding ook bij de initiële pH van 4,5 tot 6,0, in het bijzonder van 4,7 tot 5,5, goede resultaten worden bereikt zonder dat excessief meer enzym dient te worden gebruikt. Opgemerkt zij, dat aanwezigheid van geringe hoeveelheden Ca2+-ionen in het algemeen een gunstige invloed heeft op de stabiliteit en de werking van het enzym.

De waarden van het pH-gebied (aangeduid als initiële pH) waarbinnen de uitvinding met goed resultaat kan worden toegepast zijn in het kader van deze aanvrage op te vatten als de waarde van de pH in het waterige reaktiesysteem bij het begin van de enzymatische koppeling; gedurende de koppelingsreaktie volgens de uitvinding wordt in de regel eerst een geringe daling van de pH geconstateerd, waarna naarmate de reaktie vordert weer een stijging optreedt. Zowel bij die daling als bij die stijging kunnen de genoemde pH-grenzen, zonder nadelig effect op de resultaten, worden gepasseerd. Het verdient echter voorkeur, dat de pH tijdens de koppelingsreaktie, en in het bijzonder tijdens de latere fase daarvan, op een niveau lager dan 6,2, bij voorkeur lager dan 5,7, wordt gehouden.

Bij een lagere initiële pH dan 4,5 is sprake van dalende conversie en rendementen, veroorzaakt door lagere enzymaktiviteit. Bij hogere initiële pH dan 6,0 is eveneens sprake van daling van conversie en rendement, mede veroorzaakt door toename van ongewenste hydrolyse van de esters, alsmede door vorming van Z-APM.L-PM dat onder die condities niet meer overgaat in Z-APM. Overigens zij opgemerkt dat deze grenzen van de pH ook in geringe mate kunnen variëren naarmate het toegepaste enzym anders is.

Zo zal, indien gewerkt wordt met een mutant-enzym dat bij lagere pH aktief is, verdere verlaging van de ondergrens van het pH-gebied tot bijvoorbeeld 3,5 è 4 kunnen worden bereikt.

Aan het einde van de reaktiecyclus, d.w.z. bij het bereiken van de uiteindelijke conversie, is de aktiviteit van het enzym in de regel niet of nauwelijks veranderd, hetgeen hergebruik van het enzym mogelijk maakt. Het verdient -met name bij toepassing van opgeloste enzymen- dan ook aanbeveling het enzym na afscheiding van het verkregen precipitaat opnieuw voor de enzymatische koppelingsreaktie in te zetten. Eventueel dient daarbij de samenstelling van het waterige milieu enigszins te worden aangepast totdat opnieuw de juiste uitgangscondities bereikt zijn. De enzymatische koppelingsreaktie kan aldus enige malen worden herhaald met gebruikmaking van dezelfde hoeveelheid enzym; indien de initiële aktiviteit enigszins terugloopt wordt zo nodig vers enzym toegevoegd zodat de gewenste conversie binnen een daartoe aanvaardbare tijd wordt behaald.

Waar in deze aanvrage wordt gesproken van Z- is daaronder ook te verstaan elke qua apolair karakter met Z-verwante beschermgroep, zoals bijvoorbeeld in de benzylring met een of meer alkyl-, alkoxy-, acyl-, of halogeengroepen gesubstitueerde benzyloxycarbonyl-verbindingen. Waar in deze aanvrage wordt gesproken van L-fenylalanine-methylester (L-PM) dient daaronder ook te worden verstaan de daarvan afgeleide zure zouten, zoals bijvoorbeeld het hydrochloride (L-PM.HC1). Waar in deze aanvrage wordt gesproken van benzyloxycarbonylaspara-ginezuur (Z-Asp) dient daaronder ook te worden verstaan de daarvan afgeleide zouten daarvan, zoals bijvoorbeeld het dinatriumzout (Z-Asp.diNa). Uiteraard zal bij toepassing van een zuur zout i.p.v. L-PM en/of van een zout i.p.v. Z-Asp, in beperkte mate aanpassing van de te gebruiken hoeveelheden chemicaliën nodig zijn om de in te stellen pH te bereiken.

Onder stoechiometrische of nagenoeg stoechio-metrische verhoudingen wordt in deze aanvrage verstaan een molaire verhouding Z-Asp : L-PM in de range 1 : 0,7 tot 0,7 : 1. Bij voorkeur wordt een molaire verhouding van 1 : 0,8 tot 1 : 1 toegepast. Een geringe overmaat Z-Asp leidt tot de beste resultaten qua omzettingsgraad en rendement. In de 1 : 1 situatie zijn de eventueel benodigde recycles van een of beide der onomgezette uitgangsstoffen het geringst.

Het blijkt dat het precipitaat bij de werkwijze volgens de uitvinding zich -zowel qua chemische samenstelling als qua kristaleigenschappen en filtreerbaarheid-onderscheidt van het Z-APM.(D/L)-PM additieprodukt dat bij de werkwijze volgens de stand der techniek wordt verkregen. Met name zijn de verkregen kristallen groter en is derhalve ook de filtratiesnelheid groter, met als gevolg dat de zuivering van het produkt eenvoudiger is omdat minder verontreinigingen worden ingesloten danwel in aanhangend vocht achterblijven.

Het is aanvraagster gebleken dat er wat betreft de uitvoering van de reaktie vele vormen mogelijk zijn, zowel qua apparatuur als qua aard van de middelen die eventueel gebruikt worden om het systeem eventueel in beweging te brengen of te houden. De koppelingsreaktie kan worden uitgevoerd in allerlei vaten en kolommen, vervaardigd uit materialen zoals glas, roestvrij staal, enz. welke niet op nadelige wijze met de reaktie interfereren. Kolommen zijn met name geschikt bij toepassing van geïmmobiliseerd enzym, zoals enzym op drager. De afmetingen van de apparatuur kunnen binnen wijde grenzen variëren. De reaktie is dan ook uitvoerbaar op elke gewenste schaal, van reageerbuis of bekerglas tot bijvoorbeeld 10 m3 schaal.

Ook kan men ervoor kiezen de reaktie batch-gewijze, danwel gedeeltelijk continu uit te voeren. Bij (semi)-continue uitvoering zal men bij uitvoering van de werkwijze van de onderhavige uitvinding bij voorkeur pas met continue afscheiding van het precipitaat beginnen vanaf het moment dat ten minste ca 60% van de conversie van het uitgangsreaktiemengsel is bereikt, waarna verdere dosering van de grondstoffen in nagenoeg stoechiometrische verhouding kan geschieden in de mate waarin het precipitaat wordt afgescheiden.

De omzetting volgens de uitvinding verloopt uitstekend zonder dat er enige mechanische invloed op het reaktiesysteem wordt uitgeoefend; er is dan sprake van zogenaamd statische condities. In de gekozen reaktor hoeft dan geen roerder aanwezig te zijn of middelen die het reaktiemedium anderszins in beweging houden. Ook worden uitstekende resultaten bereikt indien het reaktiesysteem, continu of in intervallen, in meer of minder heftige beweging wordt gehouden, bijvoorbeeld door mechanisch roeren of door het ceaktievat door schudden in beweging te houden. Onder roeren en schudden worden hier alle voor de vakman in aanmerking komende uitvoeringsvormen begrepen.

Zo kan er wat betreft roeren in principe elk type roerder worden gebruikt; het biedt evenwel voordelen roerders met variabel toerental te benutten omdat de roersnelheid dan op een optimum kan worden ingesteld en zelfs eventueel kan worden aangepast aan veranderingen van viscositeit en dergelijke. Er is overigens slechts sprake van geringe effecten van roersnelheid. Het via een externe pomp circuleren van de inhoud van het reaktievat is te beschouwen als een variant van roeren. De pompsnelheid en de dimensies van het reaktievat bepalen daarbij de mate van menging in het systeem. Het zal duidelijk zijn dat varianten waarbij schudden wordt toegepast beter geschikt zijn bij uitvoering van de reaktie op relatief kleine schaal, tot ca 1000 1. Uit de door aanvraagster uitgevoerde experimenten is gebleken dat zeer hoge conversies worden bereikt bij toepassing van de "schudmethode". Ook blijkt een uitvoeringsvorm zeer geschikt te zijn waarbij het eerste deel van de omzetting onder statische condities wordt uitgevoerd, totdat ca. 20 tot 60%, bij voorkeur 30 è 50% van de conversie is bereikt, en de reaktie vervolgens onder geroerde condities wordt voortgezet tot het bereiken van de gewenste conversiegraad. Ook alle mogelijke combinaties van deze "mechanische" behandelingen kunnen in het kader van de uitvinding worden toegepast.

De hoeveelheid enzym die bij de koppelings-reaktie wordt gebruikt is niet kritisch, doch in de regel zal een zodanige hoeveelheid enzym worden gebruikt dat de reaktieduur tot het bereiken van een hoge conversie (£ 60, bij voorkeur £ 80%) niet meer dan 150 uur zal bedragen. In de regel zijn hoeveelheden enzym (waarmee hier wordt bedoeld het eiwit met de betreffende enzymaktiviteit, het zogenaamde aktief eiwit) van 0,08 tot 1,5%, bij voorkeur van 0,15 tot 0,75%, uitgedrukt in gewichtsprocenten ten opzichte van het totale reaktiemengsel, geschikt. De hier genoemde percentages komen in de regel overeen met ca 0,5 tot 10%, respectievelijk bij voorkeur 1 tot 5%, wanneer de hoeveelheid enzym wordt aangeduid als totale hoeveelheid ingezet (droog) enzympreparaat, d.w.z. aktief eiwit en overige proteïnen alsmede andere hulpstoffen zoals zouten. De enzymen zullen veelal worden ingezet als enzympreparaat, en zijn als zodanig ook commercieel verkrijgbaar. Heestal is de hoeveelheid aktief eiwit in zo'n preparaat ongeveer 15% van het gewicht van het preparaat.

Het enzym kan bij de werkwijze volgens de uitvinding in elke daartoe geschikte vorm worden gebruikt, d.w.z. zowel in opgeloste als in geïmmobiliseerde vorm.

Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van opgelost enzym (verkregen door oplossen van een enzympreparaat in het reaktiemedium), aangezien dit voordelen heeft bij de afscheiding van het verkregen precipitaat en de verdere opwerking daarvan, alsmede bij hergebruik van de biokatalysator zelf. Zoals reeds vermeld kunnen ook mutanten van de betreffende enzymen worden gebruikt. De hierboven aangegeven percentages voor de hoeveelheid enzym kunnen, naar gelang de aktiviteit van het in te zetten enzym, zeker bij gebruik van mutanten, variëren.

De concentratie van de uitgangsstoffen Z-Asp en L-PM kan eveneens binnen ruime grenzen variëren, en wordt mede bepaald door de oplosbaarheid van deze stoffen in het uitgangs-reaktiemengsel. Echter aanwezigheid van kleine hoeveelheden onopgeloste uitgangsmaterialen is niet storend op het verloop van de reaktie aangezien deze hoeveelheden tijdens de reaktie in oplossing zullen gaan. Bij werkwijzen volgens de stand der techniek is het, als gevolg van produktinhibitie en in verband met te hoog oplopende viscositeit gedurende de reaktie, onmogelijk de reaktie uit te voeren bij hogere molaire concentraties van de uitgangsstoffen dan ca. 200 tot 700 mM; de onderhavige uitvinding voorziet in de mogelijkheid ook goede omzettingen te bereiken bij hogere molaire concentraties van de uitgangsstoffen, en dus ook van het koppelings-produkt, en wel tot in de orde van ca 1200 mM.

Dit betekent een additioneel voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding, omdat hiermee een verbeterde output per reactorvolume kan worden bereikt.

De uitvinding zal nu verder worden toegelicht aan de hand van de navolgende voorbeelden en het vergelijkende voorbeeld, zonder echter daartoe beperkt te zijn. Vooraf zij hier opgemerkt, dat de in de voorbeelden genoemde samenstelling van het reaktiemengsel (molaire concentraties en gew.% in uitgangssituatie) berekend zijn op basis van de ingezette, nauwkeurig bepaalde hoeveelheden, en het gewicht en volume van het bereide reaktiemengsel. De conversies (en ook de resultaten wat betreft opgetreden L-PM-hydrolyse aan het einde van de reaktietijd) zijn bepaald door middel van zogenaamde "reversed-phase high performance liquid chromatography" (reversed-phase HPLC) met UV-spectrofotometrische detectie bij 257 nm, waarbij gebruik werd gemaakt van een met Nucleosil C18 gevulde kolom en een multigradiënt eluens-systeem (water / acetonitril / triethylammoniumfosfaat) bij pH 3,0. De uit het reaktiemengsel genomen monsters werden steeds onmiddellijk opgenomen in methanol om de enzymatische reaktie te stoppen, en bij lage temperatuur bewaard alvorens (via auto-injectie in de continue stroom van het eluens) te worden geanalyseerd. De in de navolgende voorbeelden aangegeven concentraties enzym en initiële enzymaktiviteiten zijn telkens berekend op basis van de ingezette hoeveelheid enzympreparaat. De aangegeven waarden voor L-PM hydrolyse zijn aan het einde van de reaktie bepaald en uitgedrukt als gemiddelde hydrolyse per uur in procenten ten opzichte van de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid L-PM.

Voorbeeld 1

Aan een hoeveelheid L-PM.HC1 (4,01 gj 18,6 mmol) werd bij kamertemperatuur in een bekerglas van 100 ml onder roeren een oplossing van Z-Asp.diNa (7,28 g; 23,4 mmol) in water (20,57 g) toegevoegd. Achtereenvolgens werden, eveneens onder roeren, aan de verkregen oplossing toegevoegd 2,59 g NaCl, en 0,17 g CaCl2.2H20, waarna de pH door toevoegen van 3N HC1 werd ingesteld op 5,0. Aan de resterende heldere oplossing werd daarna 2,98 g thermolysine (poeder, van Daiwaj bevattende ca 15% thermolysine-eiwit en 70% NaCl) toegevoegd. Aldus werd een reaktiemengsel verkregen met de volgende samenstelling: Totaal gewicht : 39,7 g

Totaal volume : 33,1 ml [Z-AspJ0 : 707 mM (26% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]o : 562 mM

[NaCl] : 14,5 % [enzym] : 7,5 % (preparaat) pH : 5,0

Porties van telkens ca 2,0 ml van dit reaktiemengsel werden onmiddellijk overgebracht in 15 reageerbuizen, welke vervolgens tegelijkertijd in een waterbad van 40°C werden geplaatst, opgehangen in aan een schudmachine (Gyrotory Water Bath Shaker, Mode G76D van New Brunswick Scientific Co. Ine.) verbonden houders. De schudmachine werd ingesteld op een toerental van 200 toeren/minuut. Na zekere tijdsintervallen werd telkens één reageerbuis uit het waterbad genomen ter bepaling van de voortgang van de reaktie. Daartoe werd de buis, na toevoeging van ca 15 ml methanol zodat de reaktie werd gestopt, afgekoeld tot ca 5°C, waarna de samenstelling van de inhoud met behulp van reversed-phase HPLC werd geanalyseerd. Er werd een initiële enzymactiviteit van 32 nmol.min^mg-1 enzym-preparaat gevonden, Ook werd vastgesteld dat na ca. 30 minuten het eerste precipitaat aanwezig was, en dat een uiteindelijke conversie (berekend t.o.v. L-PM) werd bereikt van 87% na 2,5 uur reaktietijd. Bij verdere reaktieduur trad geen verhoging van de conversie meer op. Na 2,5 uur reaktietijd kon geen waarneembare vorming van L-Phe worden geconstateerd. Onder deze condities is zodoende geen sprake van hydrolyse van L-PM.

Voorbeeld 2

Aan een suspensie van L-PM.HC1 (3,34 g; 15,5 inmol) en Z-Asp (4.96 g; 18,6 inmol) in water (14,9 g) werd bij kamertemperatuur in een bekerglas onder roeren een hoeveelheid 22% NaOH (6,72 g; 37,0 mmol NaOH) toegevoegd zodat er een heldere oplossing ontstond met pH = 5,0. Achtereenvolgens werden eveneens onder roeren aan deze oplossing toegevoegd 3,26 g NaCl, 0,12 g CaCl2.2H20 en 1,40 g thermolysine (poeder, van Amano; bevattende ca 15% thermolysine-eiwit en 34% NaCl). Aldus werd een reaktiemengsel verkregen met de volgende samenstelling: Totaal gewicht : 34,7 g

Totaal volume : 29,3 ml [Z-Asp]0 : 634 mM (20% overmaat t.o.v. L-PM)

[L—PM]o : 529 mM

[NaCl] : 13,5 % [enzym] : 4,0 % pH : 5,0

Het reaktiemengsel werd onmiddellijk verdeeld over reageerbuizen, en verder behandeld zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymactiviteit van 27 nmol.min^mg-1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat na ca 120 minuten het eerste precipitaat waarneembaar was, en dat een uiteindelijke conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 80% na 9 uur reaktietijd.

Bij verdere reaktieduur trad geen verhoging van de conversie meer op. Na 9 uur reaktietijd was een geringe hoeveelheid L-Phe (0,21 mmol) ontstaan, hetgeen overeenkomt met een hydrolyse van L-PM van 0,16% per uur.

Voorbeeld 3

De procedure van voorbeeld 2 werd herhaald, met dien verstande dat nu de hierna tussen haakjes genoemde hoeveelheden uitgangsstoffen werden ingezet: L-PM.HC1 (4,70 g; 21,8 mmol); Z-Asp (5,28 g; 19,8 mmol); water (13,68 g); 22% NaOH (6,36 g; 35,0 mmol NaOH); NaCl (2,95 g); CaCl2.2H20 (0,13 g); thermolysine (poeder, van Amano, 1,50 g; als in voorbeeld 2).

Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van het uitgangsreaktiemengsel:

Totaal gewicht : 34,6 g

Totaal volume : 29,0 ml

[Z-Asp]0 : 683 mM

[L-PM]o : 752 mM (10% overmaat t.o.v. Z-Asp) [NaCl] : 13,7 % [enzym] : 4,3 % pH 5,0

Het reaktiemengsel werd onmiddellijk verdeeld over reageerbuizen, en verder behandeld zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymactiviteit van 32 nmol.min“1mg-1 enzympreparaat gevonden. Ook werd na ca 60 minuten de eerste precipitaatvorming vastgesteld. Na 13,5 uur reaktietijd was een conversie (t.o.v. L-PM) bereikt van 57%, en bij verdere reaktieduur trad nog enige verdere verhoging van de conversie op. Na 13,5 uur reaktietijd werd een geringe hoeveelheid L-Phe (0,32 mmol) waargenomen, hetgeen overeenkomt met een hydrolyse van L-PM van ca. 0,1% per uur.

Voorbeeld 4a

De procedure van voorbeeld 2 werd herhaald, met dien verstande dat nu de hierna tussen haakjes genoemde hoeveelheden uitgangsstoffen werden ingezet: L-PM.HC1 (4,31 g; 20,0 mmol); Z-Asp (5,87 g; 22,0 mmol); water (14,53 g); 22% NaOH (6,89 g; 37,9 mmol NaOH); NaCl (3,20 g); CaCl2.2H20 (0,12 g); thermolysine (Amano 1,42 g; als in voorbeeld 2). Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van het uitgangsreaktiemengsel: Totaal gewicht : 36,3 g

Totaal volume : 30,8 ml [Z-Asp]0 : 714 mM (10% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]o : 649 mM

[NaCl] : 13,4 % [enzym] : 3,9 % pH : 5,0

Het reaktiemengsel werd onmiddellijk verdeeld over reageerbuizen, en verder behandeld zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymactiviteit van 27,9 nmol.min^mg"1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat na 15 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 83% , en dat bij verdere reaktieduur geen verdere verhoging van de conversie meer optrad. Na 15 uur reaktietijd werd een slechts een zeer geringe hoeveelheid L-Phe waargenomen, overeenkomend met een hydrolyse van 0,2% per uur.

Voorbeeld 4b

De procedure van voorbeeld 4a werd herhaald, met dien verstande dat andere hoeveelheden water, 22% NaOH en NaCl werden ingezet, te weten: water (13,58 g); 22% NaOH (7,30 g; 40,1 mmol); NaCl (4,60 g). Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van het uitgangsreaktiemengsel:

Totaal gewicht : 37,2 g

Totaal volume : 31,2 ml [Z—Asp]0 : 706 mM (10% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]o : 641 mM

[NaCl] : 17,2 % [enzym] : 3,8 % pH : 5,0

Het reaktiemengsel werd onmiddellijk verdeeld over reageerbuizen, en verder behandeld zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymactiviteit van 42,0 nmol.min^mg"1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat na ca 4 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 77% , en dat bij verdere reaktieduur geen verdere verhoging van de conversie meer optrad. Na 4 uur reaktietijd werd een geringe hoeveelheid L-Phe (0,23 mmol) waargenomen, d.w.z. een hydrolyse van 0,16% per uur.

Voorbeeld 4c

De procedure van voorbeeld 4a werd nogmaals herhaald, met dien verstande dat opnieuw andere hoeveelheden water, 22% NaOH en NaCl werden ingezet, te weten: water (15,78 g); 22% NaOH (6,82 g; 37,5 mmol); NaCl (2,00 g). Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van het uitgangsreaktiemengsel:

Totaal gewicht : 36,3 g

Totaal volume : 30,8 ml [Z-Asp]0 : 714 mM (10% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]0 : 649 mM

[NaCl] : 10,0 % [enzym] : 3,9 % pH : 5,0

Het reaktiemengsel werd onmiddellijk verdeeld over reageerbuizen, en verder behandeld zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymactiviteit van 18,0 nmol .min^mg-1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat na ca 16 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 84% , en dat bij verdere reaktieduur geen verdere verhoging van de conversie optrad. Na 16 uur reaktietijd werd een hoeveelheid L-Phe (1,1 mmol) waargenomen, hetgeen neerkomt op een hydrolyse van 0,3% per uur.

Voorbeeld 5

De procedure van voorbeeld 2 werd herhaald, met dien verstande dat nu de hierna tussen haakjes genoemde hoeveelheden uitgangsstoffen werden ingezet, en dat ter bepaling van effecten van mate van beweging ook proeven werden uitgevoerd bij andere schudsnelheid en onder statische condities: L-PM.HC1 (12,93 g; 60,0 mmol); Z-Asp (18,33 g; 68,6 mmol); water (43,86 g); 22% NaOH (19,99 g; 109,9 mmol NaOH); NaCl (9,75 g); CaCl2.2H20 (0,42 g); thermolysine (poeder, van Amano; 4,26 g; als in voorbeeld 2). Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van het uitgangsreaktiemengsel:

Totaal gewicht : 109,5 g Totaal volume : 91,2 ml [Z-Asp]o : 752 mM (14% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]0 : 658 mM

[NaCl] : 13,4 % [enzym] : 3,9 % pH : 5,0

Van het verkregen reaktiemengsel werd onmiddellijk 15 ml overgebracht in een glazen reaktievaatje met een doorsnede van 3,3 cm, dat in een waterbad van 40°C werd geplaatst, opgehangen in een aan een schudmachine verbonden houder.

De schudmachine werd ingesteld op een toerental van 150 toeren/minuut.

Tegelijkertijd werd een tweede 15 ml portie van hetzelfde reaktiemengsel op soortgelijke wijze behandeld in een andere schudmachine, ingesteld op een toerental van 250 toeren/minuut. Ook werd een derde portie, 10 ml, onder statische condities bij 40°C weggezet.

Na zekere tijdsintervallen werden, ter bepaling van de voortgang van de reaktie, telkens monsters genomen uit de vaatjes (de eerste monsters -die nog geen of slechts weinig precipitaat bevatten- met behulp van een pipet? de latere monsters, bij toegenomen viscositeit van het reaktiemengsel als gevolg van precipitatie, met behulp van een spatel). De genomen monsters werden daartoe met ca 15 ml methanol verdund, afgekoeld tot ca 5°C en met behulp van reversed-phase HPLC op samenstelling geanalyseerd.

Er werden initiële enzymactiviteiten van respectievelijk 37,8, 30,0 en 21,0 nmol.min-1mg_1 enzympreparaat gevonden (bij resp. 150 rpm, 250 rpm, en statisch). Ook werd vastgesteld dat in de drie situaties al na 8 uur (bij 150 rpm), resp. na 12 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van ca. 89%, en dat bij verdere reaktieduur geen verdere verhoging van de conversie optrad. In deze drie situaties bedroeg de L-PM-hydrolyse ca. 0,2% per uur. Een hoeveelheid van het na 4 uur in de geschudde situatie aanwezige precipitaat werd bovendien geanalyseerd op chemische samenstelling, en bleek ten minste voor 98% uit Z-APM te bestaan.

Voorbeeld 6

Een verdere 50 ml portie van het uitgangs-reaktiemengsel zoals bereid in voorbeeld 5 werd overgebracht in een gethermostreerd glazen reaktievaatje met een doorsnede van ca 5 cm, dat op 40°C werd gehouden, en was voorzien van een regelbare roerder met vlak boven de bodem en vlak onder het vloeistofniveau geplaatste schoepen. Het toerental van de roerder werd ingesteld op 60 toeren/minuut. Na zekere tijdsintervallen werden, evenals in voorbeeld 5, telkens monsters genomen, met pipet resp. met spatel, en geanalyseerd. Er werd een initiële enzymactiviteit van 20,1 nmol.min-1mg_1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat na 25 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 67%, en dat de conversie bij verdere reaktieduur nog verder opliep. Na 25 uur reaktietijd werd een geringe hoeveelheid L-Phe (0,55 mmol) waargenomen, d.w.z. dat de hydrolyse 0,07% per uur bedroeg.

De samenstelling van het precipitaat, zoals verkregen na 4 resp. 20 uur, werd geanalyseerd, en bleek op beide tijdstippen te verschillen; na 4 uur was 98% aanwezig als Z-APM.L-PM en 2% als Z-APM, doch na 20 uur waren deze percentages veranderd in 67% en 33% respectievelijk.

Voorbeeld 7

Analoog aan de uitgangsoplossing van voorbeelden 5 en 6 werden ook uitgangsoplossingen bereid waarbij het zoutgehalte van 13,4% werd bereikt met -in hoofdzaak- KC1 danwel Na2S04, bij overigens gelijke samenstelling. In mengsel A was 12,1% KC1 en 1,3% NaCl aanwezig? in mengsel B 8,9% Na2S04 en 4,5% NaCl. Bij uitvoering van de koppelingsreaktie werden vergelijkbare resultaten gevonden met de resultaten van voorbeelden 5 en 6.

Voorbeeld 8

Op dezelfde wijze als in beschreven in voorbeeld 5 werd een nieuw reaktiemengsel bereid. Daarvan werd vervolgens onmiddellijk 50 ml overgebracht in het gethermostreerde glazen reaktievaatje van voorbeeld 8, dat op 40°C werd gehouden. De roerder werd nu evenwel pas gestart na 5 uur reaktie onder statische condities, en werd toen ingesteld op 60 toeren/minuut. Na zekere tijdsintervallen werden, evenals in voorbeeld 5, telkens monsters genomen en geanalyseerd. Er werd een initiële enzymactiviteit van 20,6 nmol.min-1mg-1 enzympreparaat gevonden. De conversie na 5 uur bedroeg 43%.

Ook werd vastgesteld dat na 20 uur reaktietijd een conversie (t.o.v. L-PM) was bereikt van 86% , en dat deze conversie bij verdere reaktieduur zelfs nog verder opliep. Na 25 uur reaktietijd werd een geringe hoeveelheid L-Phe (1,1 mmol) waargenomen, hetgeen een hydrolysegraad van ca. 0,17% per uur betekende.

Voorbeeld 9

Een reaktiemengsel (totaal gewicht: 339,96 g; totaal volume: 275,6 ml) werd bereid met de volgende samenstelling: [Z-Asp]0 : 745 mM (14% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]o : 653 mM

[NaCl] : 13,0 % [enzym] : 3,8 % (preparaat; thermolysine Amano) pH : 5,3

Dit mengsel werd in drie porties (A, B, C) van 90 ml verdeeld, welke porties werden ingezet zoals beschreven in voorbeeld 6. De pH van portie A werd tijdens de koppelingsreaktie niet verder beïnvloed; de pH van portie B werd tijdens de koppelingsreaktie door het in druppels doseren van NaOH-oplossing (bij daling van de pH) en HC1-oplossing (bij stijging van de pH) op ongeveer 5,3 gehouden; bij portie C werd gezorgd dat de pH door het in druppels doseren van HCl-oplossing (bij stijging van de pH boven 5,3) op ongeveer 5,3 werd gehouden.

Zowel bij de koppelingsreaktie met portie A als bij die met portie B waren na 30 minuten reeds kristallen ontstaan, hetgeen bij portie C ongeveer 1 uur duurde. Bij portie A was (bij een initiële enzymaktiviteit van 33,0 nmol.min^mg'1 enzympreparaat) na 24 uur een conversie van ca 70% bereikt, die niet meer toenam bij verdere reaktieduur; de eind-pH bedroeg 6,16 en de PM-hydrolyse ca. 0,1% per uur. Bij porties B en C werd (bij eenzelfde initiële enzymaktiviteit) na 60, respectievelijk 45 uur, een conversie van 95 h 96% bereikt, en werd een PM-hydrolyse van ca 0,07% per uur geconstateerd.

Vergelijkend Voorbeeld A

De procedure van voorbeeld 2 werd herhaald, met dien verstande dat nu de hierna tussen haakjes genoemde hoeveelheden uitgangsstoffen werden ingezet, en een pH van 6,0 werd ingesteld: L-PM.HC1 (4,04 g? 18,8 mmol); Z-Asp (5,34 g; 20,0 mmol); water (44,35 g); 22% NaOH (7,56 g; 41,6 mmol NaOH); NaCl (8,08 g); CaCl2.2H20 (0,12 g); thermolysine (poeder, van Amano; 1,42 g; als in voorbeeld 2). Een en ander resulteerde in de volgende samenstelling van de heldere oplossing van het uitgangsreaktiemengsel:

Totaal gewicht : 70,1 g

Totaal volume : 61,7 ml [Z—Asp]0 : 324 mM (6% overmaat t.o.v. L-PM)

[L-PM]o : 305 mM

[NaCl] : 13,4 % [enzym] ; 1,0 % pH : 6,0

Dit reaktiemengsel werd verdeeld over reageerbuizen en verder behandeld zoals aangegeven in Voorbeeld 1. Er werd een initiële enzymaetiviteit van 61 nmol.min-1mg_1 enzympreparaat gevonden. Ook werd vastgesteld dat een uiteindelijke conversie (t.o.v. L-PM) werd bereikt van 46% na 3 uur reaktietijd, en dat bij verdere reaktieduur geen verhoging van de conversie optrad. Na 3 uur reaktietijd werd overigens ook gevonden dat 0,65 inmol L-Phe was gevormd, ontstaan door hydrolyse van L-PM (d.w.z. ca 1,15% per uur t.o.v. de oorspronkelijke 18 mmol).

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van N-benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester door enzymatische koppeling van N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester met hoge conversie in waterig milieu onder de vorming van een precipitaat, met het kenmerk dat men de koppelings-reaktie uitvoert met behulp van equimolaire of nagenoeg equimolaire hoeveelheden N-benzyloxy-carbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester onder invloed van een neutraal protease als enzym bij een initiële pH van 4,5 tot 6,0 en in aanwezigheid van 3 tot 25%, berekend als gewichts-percentage t.o.v. het totale reaktiemengsel, van een alkalimetaal-, aardalkalimetaal- of aramoniumzout.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de initiële pH in de range 4,7 tot 5,5 ligt.

3. Werkwijze volgens een der conclusies 1-2, met het kenmerk dat het alkalimetaal-, aardalkalimetaal- of ammoniumzout aanwezig is in een hoeveelheid van 10 tot 18%.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk dat als alkalimetaal- of ammoniumzout lithiumchloride, natriumchloride, kaliumchloride, natriumsulfaat, kaliumsulfaat, ammoniumchloride en/of ammoniumsulfaat wordt gebruikt.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk dat de koppeling wordt uitgevoerd in aanwezigheid van 0,08 tot 1,5, in het bijzonder van 0,15 tot 0,75, gewichtsprocenten enzym (aktief eiwit) ten opzichte van het totale reaktiemengsel.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk dat men gebruik maakt van een opgelost enzym.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, met het kenmerk dat hoeveelheden N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester worden toegepast in een onderlinge molaire verhouding in de range van 1 : 0,7 tot 0,7 : 1.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk dat de molaire verhouding van N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester gelegen is in de range van 1 : 0,8 tot 1:1.

9. Werkwijze volgens een der conclusies 1-8, met het kenmerk dat de pH van het waterige reaktiesysteem van de koppelingsreaktie op een niveau lager dan 6,2, bij voorkeur lager dan 5,7, wordt gehouden.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 1-9, met het kenmerk dat men de koppeling uitvoert onder zodanige condities dat het reaktiemengsel, althans ten minste gedurende gedeelten van het koppelingsproces, in beweging wordt gehouden.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 1-10, met het kenmerk dat men het reaktiemengsel, althans ten minste gedurende gedeelten van het koppelingsproces, in beweging houdt door schudden.

12. Werkwijze volgens een der conclusies 1-11, met het kenmerk dat de koppelingsreaktie semi-continu wordt uitgevoerd, waarbij continue afscheiding van het precipitaat plaats vindt vanaf het moment dat ten minste 60% conversie van het uitgangsreaktiemengsel is bereikt, alsmede vanaf datzelfde moment verdere dosering van de grondstoffen in nagenoeg stoechio-metrische verhouding.

13. Werkwijze volgens een der conclusies 1-12, met het kenmerk dat men het eerste deel van het koppelingsproces, totdat ca. 20-60 % van de conversie is bereikt, uitvoert onder statische condities, en daarna het reaktiemengsel, althans ten minste gedurende gedeelten van het verdere koppelingsproces, in beweging houdt.

14. Werkwijze voor de bereiding van N-benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester zoals in hoo£dzaak beschreven in de beschrijving en de voorbeelden.

15. N-benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester verkrijgbaar volgens de werkwijze van een der conclusies 1-14.