DE2647189A1 - Verfahren zur herstellung eines peptids - Google Patents
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Description
wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest
oder einen Peptidrest bedeuten und wobei X eine Aminoschutzgruppe und Y eine Carboxylschutzgruppe bedeutet,
wird hergestellt durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptide mit einer N-ständigen Schutzgruppe oder ein Salz
derselben der Formel
X-A-OH
mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit O-ständiger Schutzgruppe
oder einem Salz derselben der Formel
H-B-Y
in Gegenwart von Metalloproteinase in einer wässrigen Lösung mit einem die Enzymaktivität der Metalloproteinase aufrechterhaltenden
pH-Wert.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptide. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung eines Peptide unter Einsatz eines spezifischen Enzyms als Katalysator.
Herkömmlicherweise wurden Peptide nach der Azidmethode hergestellt
oder nach der Methode der gemiechten Säureanhydride,
der Carbodiimidmethode oder der Methode der aktiven Eeter
oder nach der Säurechloridmethode oder dgl. Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch mit verschiedeneten industriellen
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Problemen verbunden. So tritt z. B. eine Razemisierung der Garboxylkomponente des C-terminalen Aminosäurerests ein.
Andere Probleme betreffen Nebenreaktionen, die Temperaturregelung, die Auswahl des Lösungsmittels, die Eigenschaften
der Aminoschutzgruppen und der Carboxylschutzgruppen und die Effekte von funktioneilen Gruppen in den Seitenketten
der Aminosäuren.
Man kann ferner Peptide nach der Fragmentkondensationsmethode
herstellen. Ein Peptid kann nämlich jeweils in Fragmente zerteilt werden. Dabei ist der Schaden, welcher durch einen
zufälligen Fehler hervorgerufen wird, minimal. Dieses Verfahren hat daher erhebliche industrielle Vorteile. Die Fragmentkondensationsmethode
kann vorteilhafterweise bei Verbindungen angewandt werden, welche an der C-terminalen Gruppe
Glycin aufweisen (die einzige Aminosäure, welche nicht razemisiert werden kann). Allerdings kann auch bei diesem
Verfahren eine Razemisierung nicht verhindert werden, wenn die C-terminale Gruppe von einer anderen Aminosäure gebildet
wird. Tatsächlich ist bei jeder Peptidsynthese das Razemisierungsproblem
gravierend. Wenn eine Razemisierung eintritt, so sinkt die Reinheit des Produkts und es ist erforderlich,
das verunreinigende Isomere vom angestrebten Produkt abzutrennen. Dies ist bei jeder industriellen Durchführung eines
Verfahrens äußerst nachteilig.
Unter den herkömmlichen Verfahren zur Ausbildung von Peptidbindungen
ist lediglich die Azidmetliode weitgehend frei vom Problem der Razemisierung. Aus diesem Grund war die
Azidmethode bisher bevorzugt. Da jedoch die Azidmethode komplizierte Reaktionsschritte umfaßt, und da im Wege einer
Nebenreaktion ein Harnstoffderivat gebildet wird, (was zu
einer Senkung der Ausbeute führt), ist auch die Azidmethode
unbefriedigend.
Zusätzlich zu den verschiedenen organisch-chemischen Verfahren zur Peptidherstellung wurde eine spezielle Peptidsynthese
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bekannt, welche von dem Enzym Papain oder dem Enzym Chymotrypsin Gebrauch macht (z. B. J. S. Fruton "Advances
in Protein Chemistry", 5, Academic Press Inc., New York, N.Y. 1949). Die mit diesem Verfahren durchführbaren Reaktionen
sind im folgenden zusammengestellt:
(1) BZ-Leu-OH + H-Leu-NH 0
(D (-II)
} Bz-Leu-Leu-NH 0
(III)
(2) Bz-Leu-OH + H-GIy-NH 0
(D (H)
> Bz-Leu-Gly-NH 0
(III)
(3) Bz-Tyr-OH + H-GIy-NH 0
(D (II)
Bz^yT_Qly_m 0
(III)
(4) Z-Phe-Gly-OH + H-Tyr-NH2
(D (II)
— > Z-Phe-Gly-Tyr-NH2
(III)
Bei den Reaktionen (1) bis (3) jedoch ist es erforderlich, Phenylaminogruppen vom gebildeten Peptid (III) unter drastischen
Bedingungen zu entfernen, da die an die C-terminale Gruppe der Aminkomponente (II) gebundene Phenylaminogruppe
nicht leicht vom Peptid abgetrennt werden kann. Es tritt daher nachteiligerweise leicht eine Spaltung der Peptidkette
ein. Wegen dieser Schwierigkeiten kann dieses Verfahren der Peptidsynthese praktisch nicht angewendet werden.
Andererseits wird die Reaktion (4) von einer Transamidierung und einer Transpeptisierung begleitet, so daß auch diese
Reaktion praktisch nicht verwendbar ist (R.B. Johnston et al, J. Biol. Chem., 185, 629 (1950) und J. S. Pruton et al;
J. Biol. Chem., 204, 891 (1953)). In Reaktion (4) fördert
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die primäre Aminogruppe des Säureamids, welche an die
terminale Gruppe der Aminkomponente gebunden ist, die papainkatalysierte
Amidasereaktion. Daher haben diese bekannten Verfahren nur theoretisches Interesse zur Demonstration
der Tatsache, daß Papain und Chymotrypson als Katalysatoren zur Synthese von Peptidbindungen geeignet sind, wenn die
terminale Carboxylgruppe der Aminkomponente mit einer Phenylaminogruppe
oder einer primären Aminogruppe geschlitzt ist. Möglichkeiten zur praktischen Synthese gewünschter Oligopeptide
oder Polypeptide werden durch diese bekannten Verfahren nicht eröffnet.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese der gewünschten Oligopeptide oder Polypeptide
zu schaffen, welches bei einfacher Verfahrensfiihrung zu hohen Ausbeuten führt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der folgenden allgemeinen Formel
gelöst
X-A-B-Y
wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest
oder einen Peptidrest bedeuten, wobei X eine Aminoschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine Carboxylschutzgruppe
bedeutet, bei dem eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben
der Formel
X-A-OH
mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit C-terminaler
Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formel
H-B-Y
in Gegenwart von Metalioproteinase umgesetzt wird, und zwar in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert bei dem die
enzymatische Aktivität der Metalioproteinase erhalten bleibt.
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Die erfindxingsgemäß eingesetzten Metalloproteinase-Enzyme
umfassen Enzyme, welche von Mikroorganismen gebildet werden, wie Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteoliticus, Streptomyees
caespitosus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, Stuptomyces
fradiae, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus oryzae, Chlostridium histolyticum, Proteus aeruginosa usw.
(Prolisin, Thennolysin, Collagenase, Thermoase, Tacynase N, Pronase). Es wurde bereits berichtet, daß diese Enzyme Peptidbindungen
zu hydrolysieren vermögen, welche Aminogruppen von hydrophoben Aminosäureresten wie Leucin, Isoleucin,
Phenylalanin und Valin umfassen (H. Matsubara et al,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 242 (1965)).
Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel
X-A-OH
wobei X eine Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe bedeutet und wobei A einen Aminosäurerrest oder einen Peptidrest bedeutet,
wird im folgenden als Säurekomponente bezeichnet. Die Gruppe A bedeutet einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest
in dem geeignete Aminosäuren aliphatische Aminosäuren sind, wie Monoaminomonocarbonsäuren, z. B. Glycin (GIy),
Alanin (AIa), Valin (Val), Norvalin (nor-Val), Leucin (Leu),
Isoleucin (Iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); oder Oxyaminosäuren,
wie Serin (Ser), Threonin (Thr), Homo-serin (homo-Ser); schwefelhaltige Aminosäuren, wie Methionin (Met) oder Cystin
(CysS) und Cystein (CysH); oder Aminodicarbonsäuren, z. B. Asparaginsäure(Asp), Glutaminsäure (GIu), Asparagin (Asn)
und Glutamin (GIn); Diaminomonocarbonsäuren, z. B. Ornithin
(Orn), Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, wie Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr) und heterocyclische
Aminosäuren, wie Histidin (His), Tryptophan (Trp). Diese Aminosäuren werden durch Symbole bezeichnet, welche allgemein
üblich sind. Die Peptide werden durch Kombinationen dieser Symbole bezeichnet.
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Im folgenden seien einige geeignete Schutzgruppen für die
freie terminale Aminogruppe der Säurekomponente genannt (N-terminale Schutzgruppe): tertiäre Alkoxyearbonylgruppen,
wie t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc); Benzyloxycarbonylgruppen,
welche mit einem inerten Substituenten substituiert sein können, wLe Benzyloxycarbonyl (Z-),
p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ-)s 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl
(Z(OMe)2-), 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-),
p-Phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-); p-Toluolsulfonyl (tos-);
o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-) oder dgl.
Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel
H-B-Y
werden im folgenden als Aminkomponente bezeichnet. In der Formel bedeutet B einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest,
welcher in gleicher Weise definiert wie der Rest A. Die Schutzgruppen für die Carboxylgruppe (C-terminale
Schutζgruppen) der Aminkomponente umfassen Alkoxygruppen
wie Methoxy (-0Me), Athoxy (-OEt); tertiäre Alkoxygruppen wie t-Butoxy (-O-t-Bu); Benzyloxygruppen, welche substituiert
sein können, wie Benzyloxy (-OBzI), p-Nitrobenzyloxy
(-0Bzl(p-MO2)), Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzI),
2,4-Dimethoxybenzylamino (-NHDMB), Benzhydrylamino (-NHBzh)
oder die unsubstituierte Aminogruppe (-NH2) oder dgl.
Die Säurekomponente und die Aminkomponente, welche als Reaktanten des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden,
umfassen Aminosäurereste und Peptidreste, welche funktioneile Gruppen in den Seitenketten aufweisen. In den meisten Fällen
ist es bevorzugt, die funktioneilen Gruppen mit einer Schutzgruppe zu schützen. Geeignete Schutzgruppen für au -Aminogruppen
(N1^) umfassen Ήίυ -Benzyloxycarbonyl (N^-Z),
t-Butoxycarbonyl (N^-BOC) und Tosyl (N^-Tos). Geeignete
Schutzgruppen für N-Guanidinogruppen (N ) von Arg umfassen Nitro (NG-N0o), NG-Benzyloxycarbonyl (NG-Z) und NG.NG-Dibenzyloxycarbonyl
(N -Z-Z). Geeignete Schutzgruppen für den
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im) umfassen NimBenzyl (Nim
Imizadolring (Nim) umfassen Nim-Benzyl (Nim-Bzl) und
Tosyl (Nlm-tos). Geeignete Schutzgruppen für ui-Carboxylgruppen
umfassen uj-Benzyloxy (-OBzI). Als geeignete Schutzgruppen
flir die Hydroxylgruppen von aliphatischen oder aromatischen Oxyaminosäuren kommen Aralkylgruppen in Frage,
wie Benzyl (BzI). Als geeignete Schutzgruppen für die Mereaptogruppe
von CysH kommen Benzylgruppen (BzI) in Frage. Die verwendeten Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der
Hauptreaktion stabil sein und leicht vom Produkt ablösbar sein, ohne dabei zu Nebenreaktionen zu führen. Die als
Ausgangsmaterial eingesetzte Säurekomponente und Aminkomponente können Schutzgruppen aufweisen und die Ν** -Aminogruppe
der Aminkomponente kann frei sein oder in Form eines anorganischen oder organischen Salzes vorliegen, z. B. eines Hydrochloride,
eines Hydrobromids, eines Oxalate, eines p-Toluolsulfonats
oder eines Acetats. Bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren wird die Kondensationsreaktion bei der die Peptidbindung ausgebildet wird, in einer wässrigen Lösung durchgeführt,
welche einen pH-Wert aufweist, bei dem die Enzymaktivität aufrechterhalten bleibt. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert
etwa 6 bis 8.
Man kann zwei Methoden anwenden, um den richtigen pH-Wert für die Erhaltung der Enzymaktivität einzustellen. Eine
Methode besteht" darin, die Kondensationsreaktion in einer Pufferlösung durchzuführen, z. B. in einer Zitronensäure-Pufferlösung,
einer Mcllvaine-Pufferlösung, einer Kolthoff-Pufferlösung, einer Michaelis-Pufferlösung, einer Tris-Pufferlösung
oder einer Clark-Lub-Pufferlösung. In dieser Pufferlösung
wird die Säurekomponente und die Aminokomponente aufgelöst und dann wird das Enzym hinzugefügt. Das andere
Verfahren während der Kondensationsreaktion den pH-Wert der Reaktionsmischung innerhalb des für die Aufrechterhaltung
der Enzymaktivität geeigneten Bereichs zu halten, besteht in der Zugabe der Säure oder der Base zum Reaktionsgemisch
in einer Menge, welche von dem gemessenen pH-Wert abhängt.
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Ai
Die Ausgangsmaterialien werden gewöhnlich in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen und vorzugsweise 1 bis 1,5 Molen der
Säurekomponente pro Mol der Aminkomponente eingesetzt.
Wenn die Ausgangsmaterialien in dem wässrigen Medium nicht allzu löslich sind, so kann man die löslichkeit der Reaktanten
durch Susatz eines Lösungsmittels, wie z. B. eines Alkohols, z. S. Methanol oder Äthanol, Dimethylformamid,
Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid oder dgl. zu der wässrigen Lösung verbessern. Die Menge des zugesetzten Lösungsmittels
sollte beschränkt sein, so daß die Aktivität des Enzyms für die erfindungsgemäße Reaktion nicht inhibiert
wird. Wenn man ein Lösungsmittel anwendet, so wird dieses gewöhnlich in einer Menge von weniger als 1 Gew.-Teilen und
vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Gew.-Teilen pro 1 Gew.-Teil Wasser eingesetzt. Die erfindungsgemäße Reaktion wird in einem
wässrigen Medium durchgeführt und es ist erforderlich, die relative Löslichkeit des Reaktionsprodukts zu senken, vorzugsweise
so weit, daß dae Reaktionsprodukt in dem System nur schwach löslich oder unlöslich ist.
Bei der erfindungsgemäßen Reaktion wird eine katalytische Menge des Enzyms eingesetzt, und zwar vorzugsweise 10 Ms
etwa 500 mg des Enzyms pro 1 mmol der Aminkomponente. Wenn ein gereinigtes Enzym verwendet wird, so kann die Enzymmenge
5 bis 30 mg betragen. Die Reaktionstemperatür liegt
gewöhnlich im Bereich von 20 bis 80 0C und vorzugsweise im
Bereich von 20 bis 50 0C, da in diesem Temperaturbereich
die Enzymaktivität erhalten bleibt. Unter diesen Bedingungen schreitet die Reaktion glatt vonstatten und zwar während
1 bis 24 h. Das Reaktionsprodukt fällt aus dem Reaktionssystem aus und kann daher leicht isoliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren bei dem als Enzymkatalysator Dirnetalloproteinase eingesetzt wird, kann durch folgende
Reaktionen exemplifiziert werden:
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Wenn ein Dipeptid erzeugt wird, so folgt das Verfahren der folgenden Reaktion:
BOC-Tyr(BzI)-OH + H-VaI-HHDMB
^ B0C-Tyr(BzI)-BaI-NHDMB
BOC-HiS(BzI)-OH + H-Leu-NHDMB
^ BOC-His(BzI)-Leu-NHDMB
Dabei wurde das Amidderivat von VaI und Leu als Aminkomponente
eingesetzt und das BOC-Derivat von Tyr und His mit geschlitzter Seitenkette als Säurekomponente. Die Kondensationsprodukte
werden in Ausbeuten von etwa 60 $> erhalten. Beispiele
der Kondensation von Acylaminosäuren und Aminosäureamiden
sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren mit Dipeptidamiden sind in Tabelle
angegeben. Beispiele der Kondensation von Acyldipeptiden und Aminosäureamiden sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Beispiele der Kondensation von Acyldipeptiden und Dipeptidamiden finden sich in der Tabelle 4 und Beispiele der Kondensation
von Acylaminosäuren und Dipeptidestern finden sich in Tabelle 5.
Wenn die Metalloproteinase als Enzymkatalysator verwendet wird, so sind die Aminosäuren mit speziellen Eigenschaften
äußerst reaktiv als Aminkomponente und verschiedene Aminosäuren können in Form einer Acylaminosäure oder eines Acylpeptids
als Säurekomponente eingesetzt werden, wie die Tabellen zeigen. Man erkennt, daß die Metalloproteinase
bei der Synthese von Peptiden unter Verwendung von hydrophoben Aminosäuren, wie Leu, iso-Leu, VaI, Phe und dgl. als N-terminale
Aminosäure der Aminkomponente eingesetzt werden kann.
Bei einer weiteren Ausfllhrungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens kann ein Protein-Proteinase-Inhibitor, z. B. aus Kartoffeln, eingesetzt werden. Handelsübliche rohe
Metalloproteinasen enthalten gewöhnlich alkalische Proteinasen, deren optimaler pH-Wert auf der alkalischen Seite liegt und
welche nicht-substituierte Amide und Aminosäuren oder Peptidester
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aus einem primären Alkohol hydrolysieren. Zum Beispiel umfaßt Prolisin eine Metalloproteinase ohne Esterase- oder Amidaseaktivität
und eine alkalische Proteinase im Verhältnis 7:3. Weiterhin umfaßt das Prolisin als weitere Komponenten eine
geringe Menge Amylase, Protein und etwa 65 ^ Stärke. Wenn nun Prolisin als Katalysator zur Bildung von Peptidbindungen
verwendet wird, so sind die Ester welche beider Reaktion
einer Carboxylgruppe und eines primären Alkohols gebildet werden, z. B. der Methylester oder der Äthylester als
Schutzgruppe für die Carboxylgruppe nicht geeignet, noch ist ein unsubstituiertes Amid geeignet. Es sind daher kompliziertere
Schutzgruppen erforderlich, sowie komplizierte Verfahrensstufen und teure Reagenzien (Alkohole und Amine). Die
Entfernung der alkalischen Proteinase aus Prolisin erfordert ebenfalls komplizierte Verfahrensschritte. Es wurde nun überraschenderweise
festgestellt, daß die Ausbeute an den angestrebten Produkten wesentlich verbessert werden kann, wenn
man einen Inhibitor für das proteolytische Enzym (Proteinase) bei der Synthese der Peptide unter Verwendung der Metalloproteinase,
und insbesondere einer rohen Metalloproteinase, einsetzt.
Somit besteht eine wichtige Ausführungsform der Erfindung darin, in Gegenwart eines Inhibitors für das proteolytische
Enzym zu arbeiten. Mit diesem Inhibitor wird die Aktivität der alkalischen Proteinase, welche in handelsüblichem
Enzym, das als Hauptkomponente Metalloproteinase enthält, auftritt, herabgesetzt, während die Metalloproteinase
bei der Kondensationsreaktion unter Bildung von Peptidbindungen seine katalytische Wirkung entfaltet. Geeignete
Inhibitoren für das proteolytische Enzym können aus Hafer, Pava, Bohnen und Kartoffeln extrahiert werden. Die Methode
der Extraktion ist in Nippon Kogei Kagaku Kaishi, 31, Seite 38 (1957) beschrieben. Der erfindungsgemäß eingesetzte
Inhibitor muß nicht rein sein. Man kann einen Rohextrakt einsetzen. Bei Verwendung eines solchen Inhibitors
kann man eine Aminkomponente mit einer primären Alkoxygruppe,
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is
ζ. B. einer Methoxygruppe (O-Me), einer Äthoxygruppe £OET)
oder einer unsubstituiarten Aminogruppe als Schutzgruppe
der Carboxylgruppe einsetzen.
Bei einer weiteren Aus führungs form der Erfindung kann eine Säurekomponente (I) mit einer Aminkomponente (II) in einer
der folgenden Kombinationen umgesetzt werden:
(a) In Kombination von L-I und DL-IIj
(b) Kombination von DL-I und L-II oder
(c) Kombination von DL-I und DL-II.
Dabei erhält man in allen Fällen L,L-Acyldipeptid. Als Säurekomponente (i) kann man z. B. eine Verbindung
der folgenden Formel 0
IT
I R'NH-CHCOOH
2 einsetzen, wobei R1 eine Acylgruppe bedeutet und wobei R
eine Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure bedeutet. Die Aminkomponente (II) kann eine Verbindung der folgenden
Formel sein ■*
H2N-CH-COR4
wobei R eine Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure bedeutet
und wobei R eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeutet. Bei dieser Ausführungsform kann die Säurekomponente (I)
und/oder die Aminkomponente (II) als razemische Komponente
eingesetzt werden und dennoch erhält man das L,L-Acyldipeptid bei Verwendung der Metalloproteinase selektiv. Vorzugsweise
wird auch dabei ein Inhibitor für das proteolytische Enzym zugesetzt. Diese Reaktion kann folgendermaßen dargestellt
werden S2 B5
R1NHCHCOOH + H0N-CHCOR4
(D 2 (II)
R2 R4
f f —^ R'NHCHCONHCHCOR4
CHCON
7 0 9 8 1 8 / Π 0 2
2 Dabei bedeutet R1 eine Acylgruppe, R eine Seitenkettengruppe
einer α-Aminosäure, R eine Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure und R4 eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe.
Somit führen drei verschiedene Kombinationen der Säurekomponente (I) und der Aminkomponente (II) zum
Erfolgt:
(a) L-I + DLII
(b) DL-I + L-II
LL-III
(c) DL-I + DL-II
(Das Molverhältnis wird dabei auf der Grundlage der L-Komponenten festgelegt.)
Man erhält als Produkt LL-III, da die Reaktion selektiv ist. Verbindungen der Formeln I und II können leicht erhalten
werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man Aspargylphenylalanin-methylester,
welcher als Süßstoff bekannt ist, leicht herstellen, indem man den N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-aspargyl-phenylalanin-methylester
reduziert, welcher durch Reaktion der N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-asparaginsäure
mit Phenylalaninmethylester erhalten wird. Katalytische
Mengen des Enzyms sind ausreichend und das Enzym kann wiederholt eingesetzt werden. Die Reaktion schreitet unter milden
Reaktionsbedingungen in einer gepufferten Lösung oder in einer Lösung mit einem gewünschten pH-Wert glatt voran.
Die Ausbeuten sind relativ hoch und die Reinheit des Produktes ist außerordentlich groß. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet
sich zur stufenweisen Verlängerung einer Peptidkette und auch für die Kondensation von Fragmenten. Solche Fragmentkondensationsreaktionen
sind für industrielle Zwecke äußerst vorteilhaft. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren setzt keine
Razemisierung ein. Diese Vorteile können mit den herkömmlichen Verfahren nicht erzielt werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
709818/1102
In den Beispielen wird gereinigte Thermoase hergestellt durch Auflösung roher Thermoase in einer wässrigen lösung von
1/50 M-CaIciumacetat und durch Trennung des unlöslichen
Materials mit der Zentrifuge und durch Dialyse der liberstehenden Flüssigkeit, und zwar zweimal mit einer wästjrigen Lösung
von 1/100 M-CaIeiumacetat. Sodann gibt man zu der dialysierten
Lösung des O,8-fache an Aceton, worauf der Niederschlag abfiltriert
wird. Sodann gibt man Aceton zu dem Pil trat bis zu der 2,5-fachen Menge des Filtrats, worauf der Niederschlag
durch Zentrifugentrennung abgetrennt und bei Normaltemperatür
unter vermindertem Druck getrocknet wird,
40 ml einer Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden
zu 817 mg (2,20 maol) BOC-Tyr(Bzl)-OH und 606 mg (2,00 mmol)
H-VaI-NHDMB.HCl gegeben und dann gibt man noch 2,0 ml 1n NaOH
zu der Lösung. Sodann wird die Mischung unter Rühren bei 38 0C mit 200 mg neutraler Proteinase versetzt (Streptomyces;
Titer: 100 Einheiten/mg; hergestellt durch Kyowa Hakko K.K.).
Die Reaktion wird während 24 h bei 38 0C durchgeführt. Der
erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5 η HCl, 7 % Ammoniakwasser und wiederum
Wasser gewaschen. Man erhält 1,08 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml heißem Äthanol aufgelöst und die heiße Lösung
wird während 30 min mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand
wird mit Wasser versetzt. Dabei erhält man das kristalline Produkt der Formel BOC-Tyr(BzI)-VaI-NHDMB.
Ausbeute 700 mg (56 %)
Schmelzpunkt 183 bis 185 0C
Schmelzpunkt 183 bis 185 0C
Elementar-Analyse: CHN
berechnet (£) 67,83 7,32 6,78
gefunden (£) 67,71 7,35 6,60
709818/1102
40 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden zu
760 mg (2,20 mmol) BOC-HiB(BzI)-OH und 634 mg (2,00 mmol)
H-Leu-NHDMB.HCl gegeben und dann fügt man noch. 1n NaOH zu
der Lösung. Weiterhin gibt man zu der erhaltenen Mischung unter Rühren bei 38 0C 200 mg neutrale Proteinase (Streptomyces)
und die Mischung wird während 24 h bei 38 0C umgesetzt.
Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 $>
Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 1,01 g rohe
Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml heißem Äthanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle während 30 min
zur Entfernung des Proteins behandelt. Die Lösung wird eingeengt und dann mit Wasser versetzt. Man erhält ein kristallines
Produkt der Formel BOC-His(Bzl)-Leu-NHDMB.H2O.
Ausbeute 800 mg (64 $)
Schmelzpunkt 144 bis 146 0C
Schmelzpunkt 144 bis 146 0C
[α] 2\ = 0,69 ° (C = 1,0 Chloroform)
Elementaranalyse: CHF berechnet ($) 63,34 7,57 11,19
gefunden (%) 63,37 7,45 11,17
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und die Aminkomponenten gemäß
den Tabellen 1 bis 5 einsetzt. In Tabelle 1 ist die Säurekomponente eine l^-Acylaminosäure und die Aminkomponente
ein Aminosäureamid. In Tabelle 2 ist die Säurekomponente eine N11-Acylamino säure und die Aminkomponente ein Dipeptidamid„
In Tabelle 3 ist die Säurekomponente ein K^-Acyldipeptid
und die Aminkomponente hat die Formel H-Leu-NHBzh. Gemäß Tabelle 4 sind die Säurekomponenten Ia-Acyldipeptide
und die Aminkomponenten sind. Dipeptidamide der Formel
H-Phe-Ala-NHBzh. Gemäß Tabelle 5 setzt man als Säurekomponente
eine ü^-Acylaminosäure ein und als Aminkomponente
einen Dipeptidester.
709318/1 102
OO
- 15 -
Bji$.' Acidkomponente i Aminkomponente Produkt
te
-S chmeljz
punkt
punkt
(0C)
E1ementar-Analys e
(1) "berechnet (%)
(2) gefunden
Z-Leu-OH
H-Phe-NHBzh Z-Leu-Phe-NHBzh
:69
233-224
(D 74. 84
(D 74,72
(D 74,72
6.80 6.79
7.27 7.30
Z-Phe-OH
' H-Phe-NHBzh Z-Phe-Phe-NHBzh
.204-205
φ 76.57
(D 76.32
(D 76.32
6.10 6.05
6.87 6.93
! Z-GIn-OH
H-Phe-NHBzh
Z-Gln-Phe-NHBzh-l/2H2O 91 i260-263
φ 69.86
(2) 69.64
(2) 69.64
6.20 6.00
9.31 9.14
Z-Arg(NO2)-OH H-Phe-NHBzh
Z-Arg(NO2)-Phe-NHBzh
214-216
Φ 64.95
(2) 64.61
(2) 64.61
5.90 5.71
14.73 14.78
oo —
— 8
Z-Trp-OH
H-Phe-NHBzh Z-Trp-Phe-NHBzh· 1/2H2O
34
191-194
Φ 74.63
(D 75.04
(D 75.04
5.96 5.91
8.49 8.59
Z-Pro-OH
H-Phe-NHBzh Z-Pro-Phe-HNBzh
44
186-189
φ 74.84
(D 74.74
(D 74.74
6.28 6.25
7.43 7.55
Z-Phe-OH
H-VaI-NHB zh Z-Phe-Val-NHBzh
51
230-233
φ 74. 54
(S) 74.65
(S) 74.65
6.62 6.67
7.46 7.49
10
Z-Phe-OH
H-Leu-NHBzh Z-Phe-Leu-NHBzh
57
203-207
74.84
74.62
74.62
6.80 6.78
7.27 +> 7.27 NT
11
Z-Phe-OH
H-Ile-NHBzh Z-Phe-1 le-NHBzh· H2O
30
207-212
φ 72.58
(D 72.99
(D 72.99
6.94 6.70
7.05 OD 7.17 «Ä
- 16 -
Bs- Nr |
). Acid- komponente |
Amin- komponente |
Produkt | ^UB- "beu- te (*) |
Schmelz punkt (0C) |
in in
CD CD |
E1ementar-Analys e (1) "berechnet (ft) (2) gefunden (96) |
H 6.07 5.82 |
N 13 13 |
.49 .55 |
i2 | Z-Phe-OH | H-Phe-Arg(NO2)- NHB zh |
Z-Phe-Phe-Arg(NO2)- NHBzh.H2O |
78 | 172-176 | D 70 3) 70 |
C .04 .03 |
6.95 6.80 |
8 8 |
.40 .23 |
13 | Z-Leu-OH | H-Ala-Phe-NHBzh | Z-Leu-Ala-Phe-NHBzh· H2O | 33 | 162-165 | φ 71 (D 71 |
.05 .21 |
6.33 6.38 |
8 7 |
.00 .82 |
1' | Z-Phe-OH | H-Ala-Phe-NHBzh | Z-Phe-Ala-Phe-NHBzh.H2O | 23 | 173-175 | (D 72 (D 72 |
.98 .65 |
6.26 6.18 |
8 8 |
.10 .18 |
15 | Z-Phe-OH | H-Phe-Ala-NHBzh | Z-Phe-Phe-Ala-NHBzh· 1/2H2O |
25 | 205-209 | φ 70 (D 70 |
.91 .89 |
6,73 6,60 |
8 8 |
.70 .82 |
16 | Z-Phe-OH | H-Leu-Gly-NHBzh | Z-Phe-Leu-Gly-NHBzh· 1/2H2O |
31 | 207-208 | .89 .84 |
||||
OO TO"
- 17 -
Bsp Nr.
. Acid-Komponente
Amin-Komponente
Produkt
Aus
beu
te
beu
te
Schmelzpunkt
(0C)
E1ementar-Analyβ e
(1) berechnet
(2) gefunden
17. Z-Trp-Gly-OH H-Leu-NHBzh Z-Trp-Gly-Leu-NHBzh
6.43 6.39
10.40 10.45
PMZ-Ala-Ala-OH
H-Leu-NHBzh PMZ-Ala-Ala-Leu-NHBzh
236-239 '(I) 67.75 7.02
! :(2) 68.02 7.05
9.30 9.42
Z-Leu-Ala-OH
H-Leu-NHBzh \ Z-Leu-Ala-Leu-NHBzh
,228-232 \φ 70.33 7.54
Z) 70.52 7.48
9.11 8.93
Z-Phe-Ala-OH
H-Leu-NHBzh ! Z-Phe-Ala-Leu-NHBzh !240-241
72.20
72.14
72.14
6.84 6.84
8.64 8.85
Z-AIa-Leu-OH
H-Leu-NHBzh Z-Ala-Leu-Leu-NHBzh
I225-226
70.33
70.14
70.14
7.54 7.52
9.33
Z-Ala-Phe-OH
H-Leu-NHBzh
Z-Ala-Phe-Leu-NHBzh !202-205
φ 72.20
(2) 72.27
(2) 72.27
6.84 6.82
8. 8.
- 18 -
. Acidkomponente
Aminkomponent e
Produkt Aus-Deu
te
te
Schmelzpunkt
(0C)
Elementar-Analyse
(1) "berechnet (96)
(2) gefunden (%)
Z-Trp-Gly-OH H-Phe-AIa-NHB zn
Z-Trp-Gly-Phe-Ala-NHBzh 58
1^.
(2) 70.51
245-247 ;® 70.93 5.95
5.91
24 Z-Leu-Ala-OH
H-Phe-Ala-NHBzh
Z-Leu-Ala-Phe-Ala-NHBzh 38 !2 59-262 φ 70.07 6.86
j © 69.82 6.78
Z-Pro-Leu-OH
H-Phe-Ala-NHBzh \ Z-Pro-Leu-Phe-Ala-
i NHBzh-l/2H2O
210-213 'φ 70.00 6.94
!(2) 69.44 6.72
Z-Ala-Phe-OH
H-Phe-Ala-NHBzh j Z-Ala-Phe-phe-Ala
NHBzh-l/2H2O 1256-259 IQ) 70.84
1(2) 70. 65
1(2) 70. 65
6.34 6.19
Z-Ala-Tyr-OH
H-Phe-Ala-NHBzh
Z-Ala-Tyr-Phe-Ala-NHBZh-H2O
34
252-253
\φ 68.59
i(2) 68.17
i(2) 68.17
6.27 6.00
- 19 -
• co CM Bsp, Nr. |
35 | Acidkomponente | Aminkomponente | Produkt | Aus beute (%) |
Schmelz punkt (0C) |
- Elementar-Analyse (1) berechnet (%) (2) gefunden (#) |
28 | 36 | Z-AIa-OH | H-Phe-Phe-OBu1 | Z-Ala-Phe-Phe-OBu* | 71 | 160-163 | C H N φ 69.09 6.85 7.32 ® 69.05 6. 87 7.36 |
29 | 37 | Z-GIn-OH | H-Phe-Phe-OBu1 | Z-Gln-Phe-Phe-OBu* | 86 | 196-200 | φ 66.65 6.71 8.88 φ 66.51 6.71 8.74 |
30 | Z-Thr-OH | H-Phe-Phe-OBu* | Z-Thr-Phe-Phe-OBu1 | 63 | 63- 68 | Φ 67.64 6.85 6.96 φ 67.24 6.70 6.88 |
|
<τ 31 | Z-M et-OH | H-Phe-Phe-OBu* | . Z-Met-Phe-Phe-OBu1^ | 85 | 107-108 | φ 66.32 6.84 6.63 ® 66.30 6.77 6.53 |
|
32 | Z-Cys(Bzl)-OH | H-Phe-Phe-OBut | Z-CysiBz^-Phe-Phe-OBu1 | 57 | 68- 80 | φ 69.04 6. 52 6.04 (2) 68.92 6.48 6.06 |
|
Γ 33 | Z -A rg(NO2) -OH | H-Phe-Val-OBu* | Z-Arg(NO2)-Phe-Val-OBut | 83 | oily | φ 58.52 7.06 14.93 Φ 58.99 7.09 14.00 |
|
ο | Z-Lys(Z)-OH | H-Phe-Val-OBu* | Z-LyS(Z)-PhLe-VaI-OBu* | 100 | 112-115 | Φ 66.97 7.31 7.71 Φ 66.93 7.30 7.80 |
|
Z-Arg(NO2)-OH | H-Leu-Phe-OBu*- | Z-ArgCNO^-Leu-Plie-OBii1 | 57 | 88- 92 | Φ 57.63 7.18 14.26 (D 57.50 6.97 13.99 |
||
Z-Lys(Z)-OH | H-Leu-Phe-OBu1- | Z-LyS(Z)-LeU-PlIe-OB^ | 76 | 103-106 | φ 67.38 7.45 7.67 Φ 67.40 7.43 7.73 |
||
Z-Lys(Tos)-OH | H-Leu-Phe-OBu^ | z-Lys(Tos)-Leu-phe-OBut | 87 | 103-106 | φ 63.97 7.25 7.46( (D 61.02 7.20 7.45 |
In einen Kolben gibt man 280,2 mg (1 mmol) Z-GIn-OH und
268,5 mg (1 mmol) H-Phe-Phe-OBu1' und diese Stoffe werden
in 10 ml Wasser suspendiert. Sodann führt man in die Suspension eine Glaselektrode eines pH-Meßgerätes ein, worauf
1/1On NaOH in die Suspension eingetropft wird, um den pH auf 6,5 "bis 7,0 einzustellen, während man unter Rühren die
Suspension mit 100 mg Thermoase versetzt. Dabei wird der Feststoff aufgelöst. Die Reaktion wird unter Rühren bei 38 0C
während 20 h fortgesetzt. Während der Reaktion gibt man zu der Reaktionsmischung unter ständiger Messung des pH-Wertes
des Reaktionsgemisches mit einem pH-Meter 1/1On NaOH, um den pH auf 6,5 bis 7,0 zu halten. Der erhaltene Niederschlag
wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser 1n HCl, Wasser,
7 % Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen und
dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 330 mg (Ausbeute 52,3 %) des angestrebten
Produkts der Formel Z-Gln-Phe-Phe-O-Bu mit einem Schmelzpunkt
von 197 bis 200 0G.
In einem Kolben suspendiert man in 10 ml Wasser 398,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Val-OH und 320,4 mg (1 mmol) H-Phe-Val-OBu*.
In die Suspension taucht man eine Glaselektrode eines pH-Meters worauf eine 1/1On NaOH in die Suspension eingetropft wird,
um den pH auf 6,5 bis 7,5 einzustellen. Sodann gibt man 100 mg Thermoase unter Rühren zu der Suspension, wobei die
Feststoffkomponente aufgelöst wird. Die Reaktion wird unter
Rühren bei 38 0C während 20 h durchgeführt. Während der
Reaktion gibt man 1/1On NaOH zu dem Reaktionsgemisch, während der pH des Reaktionsgemische mit einem pH-Meter verfolgt
wird. Auf diese Weise wird der pH-Wert auf 6,5 bis 7,5 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe
nach mit Wasser, 1n HCl, Wasser, 7 # Ammoniakwasser und wiederum
mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird
709818/1102
aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 240 mg (Ausbeute 34,2 $>) des angestrebten Produkts der Formel
Z-Phe-Val-Phe-Val-O-Bu mit einem Schmelzpunkt von 130 bis
145 0C
0,1 g Prolisin und 0,1 g eines Inhibitors für das proteolytische Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit
3 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5) versetzt, welche
•x
2 χ 10 M Calciumacetat enthält. Sodann wird die Stärke von der Mischung abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,33 g
(1 mmol) Z-Gln-Gly-OH und 0,26 g (1 mmol) H-Leu-Val-NH2.HC1
gegeben. Sodann fügt man zu dem Gemisch 1 ml 1n NaOH hinzu, worauf die Mischung noch während 20 h bei 38 bis 40 0C gerührt
wird. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 7 % Ammoniakwasser, 5 # Zitronensäure und
Wasser gewaschen. Man erhält 0,394 g rohe Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 237 bis 240 0C Γα! jp = -22,0
(C = 0,5 AcOH). Das Produkt wird zu Methanol gegeben und die Mischung wird zum Sieden gebracht, worauf eine geringe
Menge unlöslicher Verunreinigungen entfernt wird. Man erhält 0,38 g (70 #) Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 244 bis
247 0C und [α] |5 =-20,0 (C = 0,5 AcOH).
Elementar-Analyse: C26H40N607
C HN
berechnet (#) 56,92 7,34 15,32
gefunden (%) 56,89 7,30 15,26
0,2 g Prolisin und 0,2 g eines Inhibitors flir das proteolytische
Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit Tris-Salzsäure-Pufferlösung
(pH 7,5) vermischt, welche 2 χ 10 M Calciumacetat enthält. Danach wird die Stärke von dem Gemisch
abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,43 g (1 mmol)
709818/1102
Z-Leu-Tyr-OH und 0,33 g (1 mmol) H-Leu-VaI-OMe.HBr gegeben
un d dann gibt man zu der Lösung noch 1 ml 1n NaOH. Die Mischung wird bei 38 bis 40 0C während 20 h gerührt. Nach
der Reaktion wird das Reaktionsgemisch unter Rühren mit Äthylacetat vermischt, worauf die wässrige Phase abgetrennt wird
und die organische Phase wird der Reihe nach mit 7%-igem Ammoniakwasser, 1n HCl und einer gesättigten wässrigen Lösung
von Natriumchlorid gewaschen und dann mit Na3SO4 getrocknet.
Die Mischung wird eingeengt und man erhält 0,52 g (Ausbeute 78,8 #) eines weißen schaumigen Pulvers. Das Produkt wird
durch Dünnschichtchromatographie aufgetrennt, wobei als Entwickler ein Gemisch aus sekundärem Butanol und 3$£-igem Ammoniakwasser
(8:3) (Rf = 0,85) eingesetzt wird. Das Produkt wird aus Dioxan/Wasser umkristallisiert. Man erhält Kristalle mit
einem Schmelzpunkt von 184 bis 190 0C [a] ^9 = -50,0 (C =
1,0 Methanol). Das gleiche Produkt, hergestellt nach der DCCl-HOBt-Methode hat einem Schmelzpunkt von 176 bis 181 0C
und [cc] p9 = -48,6 (C = 1,0 Methanol).
Elementar-Analyse C3J1-H N. q
:*) | 45 | C | 33 | H | 74 | N | 44 | |
berechnet | 42 bis | 63, | 36 | 7, | 70 | 8, | 15 | |
gefunden ( | 63, | 7, | 8, | |||||
Beispiele | ||||||||
Das Verfahren des Beispiels 40 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und Aminkomponenten der Tabelle
einsetzt.
709818/1 102
Bsp. | Säurekomponente | Aminkomponente | Aus beu te (*) |
Schmelz punkt (0C) |
—57 2 (C=O,5 MeOH) |
42 | ZLeuPheOH | HLeuLeuOMe | 65 | 190-192 | -1,0 (C=O,25 DMP) |
43 | pMZMetaiyOH | HPheNH2 | 82 | 226-229 | -10,0 (C=O,5 EtOH) |
44 | ZPheOH | HIleuOMe | 79 | 104-106 | -39,0 (C=1 MeOH) |
45 | ZMetOH | HLeuPheOBu.t | 82 | 160-163 | |
Eine Mischung von 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ßbenzyl)-D,!-asparaginsäure,
215 mg (1,00-mmol) L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
und 20 mg gereinigter Thermoase und 20 mg Inhibitor für das proteolytische Enzym, hergestellt aus
Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung
(pH 8,0) vermischt, welche 2,0 χ 10 M Calciumacetat enthält und dann gibt man zu dem Gemisch 1n NaOH, um den pH auf 7,5
einzustellen. Die Reaktion wird unter Rühren während 17 h bei 39 0C durchgeführt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert
und der Reihe nach mit 5%-igem Ammoniakwasser, 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung und Waeser gewaschen und
dann getrocknet. Man erhält 413 mg N-Benzyloxycarbonyl-(ßbenzyl)-L-aspargyl-L-phenylalanin-methylester.
Das Produkt wird aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 79,6 ?έ
Schmelzpunkt 116 bis 117 0C
ro]^° = -12,2 (C = 1,0 Dimethylformamid)
Elementar-Analyse: CggH^NgO,,
C HN
berechnet (%) 67,17 5,83 5,40
gefunden (%) 67,35 5,81 5,28
709818/1 102
9?
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 715 mg N-Benzyioxyearbonyl-(ß-benzyl)-D,L-asparaginsäure
und 431 mg D.l-Phenylalaninmethylesterhydroehlorid einsetzt
sowie 20 mg Thermolysin, jedoch ohne Inhibitor. Man erhält 244 mg (Ausbeute 47,0 $>) des gleichen Produkts.
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-L-asparaginsäure
und 431 mg (2,00 ml) D.L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
einsetzt. Man erhält 426 mg (Ausbeute 82,1 io) F-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-l-aspargyl-L-phenylalaninmethylester
mit [V]1) = -12,5 (C = 1,0 Dimethylformamid)
.
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-D,L-asparaginsäure
und 413 mg (2,00 mmol) D,L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
einsetzt. Man erhält 410 mg (Ausbeute 79,0 %) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester
mit [Vj 2^ « -12,0 (C = 1,0 Dimethylformamid),
100 mg Thermoase und 100 mg eines Inhibitors fllr das proteolytische
Enzym, hergestellt aus Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) mit 2,0 χ 10 M Calciumacetat
vermischt. Die Mischung wird während 10 min bei 30 0C gerührt. Das unlösliche Material wird durch Filtrieren der
Lösung über ein Glasfilter (G-3) entfernt. Das Filtrat wird mit 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-D,L-
709818/1 102
asparaginsäure und 215 mg (1,00 mmol) L-Phenylalaninmethylester
vermischt und dann gibt man 1n NaOH zu dem Filtrat, um den pH auf 7,5 einzustellen. Die Reaktion wird unter
Rühren "bei 39 0C während 17 h durchgeführt. Der erhaltene
weiße Niederschlag wird nach dem Verfahren des Beispiels 1 "behandelt, wobei man 411 mg (Ausbeute 79,2 #) N-Benzyloxycarbonyl-(
ß-benzyl) -L-aspargyl-L-phenylalanin-methylester
erhält mit fa] 2^ » -12,5 (C « 1,0 Dimethylformamid).
Das Verfahren des Beispiels 50 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-D,!-aspara
ginsäure und 215 mg L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
einsetzt, sowie 200 mg Prolisin und 200 mg des Inhibitors. Man erhält 110 mg (Ausbeute 21,2 $>) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester
mit 2D * ~12»8 (° = 1»° Dimethylformamid).
Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-!-asparaginsäure
und 431 mg (2,00 mmol) DjL-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
einsetzt. Man erhält 238 mg (Ausbeute 45,8 $>) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester
mit [α] °> - -13,2 (C * 1,0 Dimethylformamid).
Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-D,L-asparaginsäure
und 431 mg (2,00 mmol) D.L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid
einsetzt. Man erhält 121 mg (Ausbeute 23,3$) N-Benzyloxycarbonyl-(ß-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester
mit W\ % = -12,4 (C = 0,5 Dimethylformamid).
709818/ 1 102
Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man die Bedingungen gemäß Tabelle 7 wählt. Man erhält das Produkt
gemäß Beispiel 46.
709818/1 102
- 27 -
Bsp. N-Benzyloxycarbonyl- Phenylalanin- Proteinase Inhibitor
(ß-benzyl)-asparagin-methylester säure (Menge mg) (Menge mg) (Menge mg) (Menge mg)
Ausbeute
54 D,L-Verbindung (715) L-Verbindung
(215) Thermolysin
(20)
47,0
55 | L-Verbindung | (357) | D,L-Verbin dung (413) |
η | - | 86,1 |
56 | L-Verbindung | (357) | D,L-Verbin dung (431) |
rohe Thermo ase (100) |
Kartoffel inhibitor (100) |
75,5 |
57 | D,L-Verbindung | (715) | D,L-Verbin dung (431) |
η | H | 48,4 |
58 | D,L-Verbindung | (715) | L-Verbindung (215) |
gereinigte Thermoase |
- | 63,6 |
59 | L-Verbindung | (357) | D,L-Verbin dung (431) |
Il | — | 36,2 |
60 | D,L-Verbindung | (715) | D,L-Verbin dung (431) |
W | — | 21,8 |
- ae>
Daß Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man
die Acylaminosäuren und die Aminosäurederivate gemäß
Tabelle 8 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt. Alle Produkte sind !,!-Produkte.
709818/1102
2GVM83
Q) H H Φ
ffi* | O | co | N | — | ι - | co | — | - | — | ffi | O | co | O | |
O | Il | rq | co | T-H | (M | T-H Ü |
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O | ||||||||||||||
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||||||||||||||
Z f | ||||||||||||||
948/4102
Fortsetzung Tabelle
8
V \ |
69 | Z-L-PheOH | D,L-H-PheOMe-HCl | Z-L-Phe-L-PheOMe | 71. | 2 | -17.6 (C = ], DMF) |
70 | Z-D,L-PheOH | L-H-PheOMe-HCl | Il | 47. | 8 | Il | |
71 | Z-D,L-PheOH | D, L-H-PheOMe- HCl | It | 27. | 2 | Il | |
O io β· |
72 | Z-L-ASp(B1Z1L)OH | D,L-H-PheOEt-HCl | Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt | 84. | O | -12.2 (C = I, DMF) |
ο» "ST |
73 | Z-D, L-Asp(BZL)OH | L-H-PheOEt-HCl | Z -L-Asp(BZL)-L-PheOEt | 79. | 2 | π |
Nt ' | 74 | Z-D,L-Asp(BZL)OH | D,L-H-PheOEt-HCl | Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt | 70. | 3 | Il |
: BZL : ^A-benzyl ester
:y£
Claims (13)
- PATENTANSPRÜCHEwobei A und B gleich oder verschieden sind und jeweils einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest "bedeuten und wobei X eine Aminosäureschutzgruppe und Y eine Carboxylschutzgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Säurekomponente einer Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben der FormelX-A-OHmit einer Aminkomponente einer Aminosäure oder eines Peptide mit einer C-terminalen Schutzgruppe oder einem Salz derselben der FormelH-B-Yin Gegenwart eines Metalloproteinaseenzyms in einer wässrigen Lösung mit einem die Aktivität des Metalloproteinaseenzyms aufrechterhaltenden pH-Wert umsetzt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Metalloproteinase einsetzt, welche aus einem der folgenden Mikroorganismen erhalten wurde: Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteoliticus, Streptomyces caespitosus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, Streptomyces fradiae, Pseudomonas aeruglnosa, Aspergillus oryzae, Clostridium histolyticum und Proteus aeruginosa.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Lösung durch Zusatz einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8 auf einem70 9 818/1102 original inspectedWert gehalten wird, bei dem die Enzymaktivität bei der Reaktion der Aminosäure- oder Peptid-Reaktanten erhalten bleibt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH durch Zugabe einer Säure oder einer Base zu der Reaktionslösung je nach Messung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf dem gewünschten Wert gehalten wird.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangsmaterialien in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen der Säurekomponente X-A-OH pro Mol der Aminkomponente H-B-Y einsetzt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion unter Zusatz von 10 bis 500 mg der Metalloproteinase pro mmol der Aminkomponente H-B-Y durchführt.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die M-terminale Schutzgruppe der Säurekomponente X-A-OH tert-Alkoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl oder o-Nitrosulfenyl ist und daß die C-terminale Schutzgruppe der Aminkomponente H-B-Y unsubstituiertes Amino, primäreB Alkoxy, tert-Alkoxy, Benzyloxy, p-Nitrobenzyloxy, Benzhydryloxy, Benzylamino, 2,4-Dimethoxybenzylamino oder Benzhydrylamino ist.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten, wobei die Aminosäure eine aliphatische Aminosäure, eine schwefelhaltige Aminosäure, eine Monoaminodicarbonsäure, eine Diaminomonocarbonsäure, eine aromatische Aminosäure oder eine heterocyclische Aminosäure ist.709818/1102
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man der wässrigen Lösung einen Inhibitor für das proteolytische Enzym zusetzt, welcher aus Hafer, Fava, Bohnen oder Kartoffeln extrahiert wurde.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kombination der Säurekomponente (I) und der Aminkomponente (II) eine der folgenden Kombinationen einsetzt: L-I + DL-II; DL-I + L-II; DL-I + DL-II.
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säurekomponente eine Acylaminosäure (I) und als Aminkomponente ein Aminosäurederivat (II) einsetzt und gemäß nachfolgendem Reaktionsschema umsetzt:2 3fi. 1\R'NHCHCOOH + HgN-CHCOR4(D (ID 2 3f f— R' nhchconhchcor4(iii)wobei R1 eine Acylgruppe bedeutet, wobei R eine Seiten-3 kettengruppe einer α-Aminosäure bedeutet, wobei R eine Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure bedeutet und wobeiR eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeutet.
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die tert-Alkoxycarbonylgruppe t-Butyloxycarbonyl oder t-Amyloxycarbonyl ist und daß die primäre Alkoxygruppe Methoxy oder Ä'thoxy ist und daß die tert-Alkoxygruppe t-Butoxy ist.
- 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatische Aminosäure Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin oder Norleucin einsetzt und als Oxyaminosäure Serin, Threonin oder Homoserin;709818/1102als schwefelhaltige Aminosäure Methionin, Cystin oder Cystein; als Monoaminodicarbonsäure Asparaginsäure oder Glutaminsäure; als Diaminomonocarbonsäure Ornithin, Lysin, Arginin; als aromatische Aminocarbonsäure Phenylalanin oder Tyrosin und als hetereocyclische Aminosäure Histidin oder Tryptophan einsetzt.709818/1102
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