ES2227853T3 - Metodo y aparato para la produccion de proteinas purificadas del plasma. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir proteínas purificadas a partir de plasma previamente no fraccionado por precipitación fría, que comprende las etapas de: poner en contacto el plasma previamente no fraccionado con una cantidad de gel cromatográfico no hidratado suficiente para reducir el volumen del plasma por la absorción de agua del mismo; separar el gel cromatográfico procedente del contacto con el plasma después de la absorción de agua por el gel; enfriar el plasma a una temperatura suficientemente baja para que la proteína precipite; separar el precipitado de proteína del plasma líquido; y redisolver el precipitado para producir una solución de proteína purificada.

Description

Método y aparato para la producción de proteínas purificadas del plasma.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método mejorado para producir factores antihemofilia o concentrados de la sangre y, más particularmente, a un método y aparato que permite la preparación fácil y eficiente de factores de coagulación a partir de la sangre de donantes individuales.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los individuos con alguna de una serie de anormalidades genéticas que afectan a las proteínas responsables de la coagulación de la sangre padecen una enfermedad en la que la sangre no coagula normalmente, sometiendo al individuo al peligro de hemorragias incontroladas. Durante muchos años esta condición se ha tratado mediante la administración de concentrados de las proteínas defectuosas o ausentes. Actualmente no existe un método económicamente efectivo para producir artificialmente cada una de estas proteínas, así que deben purificarse a partir de la sangre de voluntarios. Aunque ha habido métodos para preparar estos concentrados a partir de sangre donada por un mismo individuo, estos métodos han sido generalmente menos eficientes que la preparación a mayor escala a partir de sangre combinada. Actualmente la gran mayoría del factor antihemofilia (AHF, también conocido como factor VIII), y otros factores de la sangre se preparan a partir de plasma combinado. Debido a que un hemofílico requiere tratamiento de por vida, él (la mayoría de los hemofílicos son hombres) necesariamente recibe productos de la sangre de un gran número de donantes.

La presencia del virus del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) en la sangre suministrada significa que muchos hemofílicos han sido infectados con esta terrible enfermedad. Aunque las pruebas para cribar la sangre infectada con SIDA han mejorado, alguna sangre infectada se infiltra. Como los hemofílicos están expuestos a un gran número de donantes, tienen un riesgo altísimo. Incluso si el problema del SIDA se soluciona, el peligro de otras enfermedades relacionadas con la sangre, tales como los varios tipos de hepatitis y otros agentes infecciosos, hace deseable reducir el uso de sangre combinada para preparar concentrados de sangre. Si cada hemofílico recibiera AHF purificado únicamente de un donante único, o un pequeño número de donantes, los peligros de infección por la sangre estarían sustancialmente reducidos.

Los métodos básicos para la preparación de estos concentrados de coagulantes de la sangre no han cambiado grandemente en las últimas décadas. Generalmente, AHF se deriva de plasma combinado mediante una etapa de crioprecipitación. Se añaden usualmente varios aditivos tales como etanol o polietilenglicol para mejorar la eficiencia de la etapa de crioprecipitación. A continuación de la crioprecipitación, el AHF parcialmente purificado se purifica posteriormente por etapas de precipitación adicionales o por métodos cromatográficos, el más utilizado recientemente son los anticuerpos monoclonales. Para información adicional sobre las técnicas básicas de purificación de AHF y la historia del desarrollo de estos métodos, el lector puede dirigirse a los documentos de patente de los Estados Unidos del presente inventor Nº 3.560.475, 3.631.018, 3.682.881, 4.069.216, y 4.305.871, y a las referencias citadas en ellos.

Objetos y resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método en donde excelentes rendimientos de AHF así como de fibrinógeno, fibronectina y "cola de fibrina" o "sellador de fibrina" pueden producirse fácilmente de unidades individuales de sangre;

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un dispositivo fácil de uso para la práctica del método de la presente invención, el dispositivo es una modificación de o una adición a la tradicional bolsa de sangre; y

Es además un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método y un dispositivo para producir el complejo de protrombina a partir del mismo plasma que se usa para producir AHF.

Estos y objetos adicionales se alcanzan por el método de deshidratar una unidad de plasma individual anterior a una etapa de temperatura baja usada para producir el crioprecipitado. Esta deshidratación se consigue o por colocación de un material que absorba agua dentro de la bolsa de sangre de modo que el plasma que ocupa la bolsa será deshidratado o por colocación del material que absorbe agua dentro de un cartucho de modo que el plasma se deshidrate en el paso a través del cartucho. Generalmente, el material de absorción de agua preferido es un gel cromatográfico que tiene poros demasiado pequeños para admitir proteinas de coagulación, pero suficientemente grandes para admitir moléculas de agua. Los geles adecuados están hechos de carbohidratos o poliacrilamida y son comúnmente usados en varios procedimientos cromatográficos. Los geles de carbohidrato tales como SHEPHADEX® (marca registrada para geles de dextrina reticulados), comercializado por Pharmacia-Upjohn, son particularmente preferidos en la presente invención. Otras matrices deshidratantes como almidón, carboximetilcelulosa, polietilenglicol (por ejemplo Aquacides, marca registrada de Calbiochem) o gelatina podrían ser utilizadas en la presente invención, pero no son generalmente preferidas debido a la posibilidad significativa de que tales materiales absorberían cantidades significativas de proteinas de coagulación así como agua a menos que se usen con una membrana de diálisis. Una especificación alternativa de la invención sustituye el simple gel de absorción de agua con uno que también tiene capacidad para el intercambio iónico, tal como DEAE (dietil-aminoetil) SEPHADEX® (marca registrada de Pharmacia-Upjohn), que tiene una afinidad especial por un número de factores de coagulación de la sangre conocidos como complejo de protrombina. A continuación de la etapa de deshidratación, el DEAE SEPHADEX se eluye para producir el complejo de protrombina.

Breve descripción de los dibujos

Los objetos y aspectos de la presente invención que se cree son novedosos se establecen en adelante particularmente en las reivindicaciones que se adjuntan. La presente invención, tanto en su organización como en el modo de operación, junto con objetos adicionales y ventajas, pueden comprenderse mejor haciendo referencia a la descripción siguiente, hecha en relación con los dibujos que acompañan.

La figura 1 muestra el cartucho usado en la práctica de la presente invención;

La figura 2 muestra el dispositivo de la Figura 1 conectado entre dos bolsas de sangre;

La figura 3 muestra una realización alternativa donde el material deshidratante está incluido como un paquete permeable dentro de la bolsa de sangre; y

La figura 4 muestra el uso de una columna ancha para eluir el complejo de protrombina del paquete de la figura 3.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La siguiente descripción se proporciona para facilitar a cualquier persona familiarizada con la técnica llevar a cabo y usar la invención y establecer en adelante el mejor modo contemplado por el inventor de llevar a cabo su invención. Sin embargo, varias modificaciones serán inmediatamente aparentes a aquellos familiarizados con la técnica, ya que los principios generales de la presente invención se han definido aquí específicamente para proporcionar un método y un dispositivo para producir eficientemente AHF, y otras proteinas de la sangre, a partir de unidades individuales de plasma.

El método tradicional de producir AHF, así como los métodos usados actualmente, funcionan porque las proteínas claves del plasma precipitan (forma crioprecipitada) de la solución a bajas temperaturas cuando están suficientemente concentradas. Cuando una solución de proteína se congela, se forman cristales de hielo y las proteínas que están excluidas de los cristales aumentan su concentración. Dependiendo de las proteínas particulares, las proteínas pueden separarse de la solución, por ejemplo formar un precipitado, si la proteína interacciona más fácilmente con ella misma u otra proteína que con el agua. Este proceso puede desnaturalizar las proteínas (hacerlas irreversiblemente insolubles), de manera que es usual congelar soluciones de proteína rápidamente y a bajas temperaturas (por ejemplo, -20ºC o por debajo) para minimizar la formación de cristales de hielo y prevenir el crecimiento de aquellos cristales que se forman. Esto se hace para limitar la desnaturalización de las proteínas sobre la superficie del cristal de hielo. Aún cuando la congelación se lleve a cabo con gran cuidado, los cristales de hielo pueden causar "activación" del complejo de protrombina, resultando en la formación espontánea de un coágulo.

La primera etapa en el procedimiento típico para producir crioprecipitado de plasma es centrifugar la sangre entera para separar el plasma de los glóbulos rojos de la sangre. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y es a menudo llevado a cabo en centrífugas especiales que sostienen las bolsas de sangre individuales de modo que la separación del plasma/glóbulos rojos ocurre aún sin abrir la bolsa de sangre. Los métodos para mayor tamaño pueden usarse también, pero la presente invención está particularmente dirigida a purificar unidades individuales de sangre para minimizar el número de donantes a los que un paciente está expuesto. A continuación de la centrifugación es práctica común enviar el plasma sobrenadante a una bolsa de sangre "satélite" para procesado posterior. Una vez que el plasma se separa, el procedimiento típico es rápidamente congelar el plasma y después licuar despacio el plasma congelado a 4ºC, durante la licuación el AHF y otras proteínas forma un crioprecipitado que puede ser rápidamente recolectado por filtración o centrifugación. Este crioprecipitado no está irreversiblemente insolubilizado y puede ser fácilmente extraído (redisuelto) en una solución tampón de baja fuerza iónica, como es bien conocido en la técnica.

La crioprecipitación resulta cuando la eliminación de agua de la vecindad inmediata de las moléculas de proteína causa que las proteínas se asocien preferentemente unas con otras mejor que con el agua. Esta "eliminación" de agua puede conseguirse o aumentarse por el uso de aditivos que secuestran el agua y causan que interaccione menos con las proteínas. Estas sustancias de adición pueden ser cualquiera dentro de un número de materiales hidrofílicos tales como el etanol, polietilenglicol, heparina, y PLURONIC® polímeros de poliol. Estos y otros materiales usados para aumentar el rendimiento del coprecipitado operan generalmente disminuyendo la actividad efectiva del agua en la mezcla. Esto es, las moléculas de agua interaccionan preferentemente con el material hidrofílico añadido en lugar de con las proteínas. Esto permite que las proteínas interaccionen unas con otras y, por consiguiente, precipiten de la solución. Bajando la temperatura también disminuye la actividad del agua, permitiendo que predominen las interacciones proteína-proteína

Los aditivos hidrofílicos mencionados anteriormente tienen la ventaja de ser relativamente económicos y fáciles de usar. Sin embargo, su uso habitualmente necesita etapas adicionales de lavado para asegurar que los aditivos no contaminan al producto final AHF. Además al añadir materiales hidrofílicos se necesita manipulación adicional del plasma. Esto puede no ser un inconveniente significativo en grandes cantidades en donde se combinan muchas unidades de plasma de un número de donantes. Sin embargo, dicha manipulación adicional del plasma no se favorece en la presente invención, que usa unidades individuales de plasma y busca limitar el trabajo y contacto del operario con el plasma. El presente inventor se ha dado cuenta de que una manera adicional de limitar la actividad del agua y aumentar la formación del crioprecipitado es simplemente disminuir la cantidad actual de agua en la solución. Esto se consigue tratando el plasma con un material de deshidratación que absorbe agua pero no proteína del plasma. Muchos materiales de deshidratación diferentes son adaptables a la presente invención. Los criterios clave son que el material sea insoluble y que mínimamente desnaturalice o absorba las proteínas del plasma. Un gran número de materiales poliméricos tales como alcohol-acetal de polivinilo polimerizado, geles de carbohidratos, y polímeros orgánicos hidrofílicos (por ejemplo, poliacrilamida) son apropiados en la presente invención. Otros agentes deshidratantes tales como carboximetilcelulosa pueden usarse con la adición de una membrana semipermeable para evitar la absorción de la proteína. Sin embargo, esta membrana añade complejidad y generalmente lentifica la deshidratación.

El material deshidratante preferido actualmente es SEPHADEX (G-25 a G-100). Pueden usarse otros productos de SEPHADEX similares así como otros materiales poliméricos reticulados de propiedades parecidas. Los materiales de SEPHADEX consisten en pequeñas cuentas de dextrinas (polímeros de glucosa) reticuladas. El material está construido de manera que los poros entre las moléculas de carbohidrato reticuladas son demasiado pequeños para admitir nada más que las proteínas más pequeñas. Sin embargo, el agua y los solutos pequeños penetran fácilmente estos poros donde el agua está atrapada por la interacción con el carbohidrato (hinchamiento). Tales materiales se usan universalmente en la bioquímica de proteínas, en el desalado y el fraccionamiento cromatográfico de proteínas u otras mezclas de macromoléculas. Sin embargo, en el conocimiento del presente inventor, no se han aplicado directamente a la producción de AHF a partir de unidades de plasma individuales. Otros métodos de deshidratación tales como la ultrafiltración podrían conceviblemente usarse, pero dichos métodos no se prestan tan fácilmente a dispositivos deshechables y no forman parte de la presente invención.

Una ventaja significativa del uso de agentes deshidratantes es que pueden formarse cantidades útiles de crioprecipitado simplemente enfriando (por ejemplo a 4ºC) en lugar de requerirse la congelación y descongelación del plasma deshidratado, por lo tanto permitiendo la obtención de factores de coagulación que no han sido activados por contacto con los cristales de hielo. Desde luego que después de que se forme una primera cantidad de crioprecipitado por enfriamiento, se puede congelar y descongelar el plasma para obtener una segunda cantidad de crioprecipitado.

Diferentes tipos de SEPHADEX se hinchan a velocidades distintas. Para evaluar estas diferencias, se embebieron en 30 ml de agua destilada alícuotas de 1 g de cuatro tipos de Sephadex diferentes y se observó y midió el hinchamiento. La Tabla 1 muestra el volumen final de los geles totalmente hinchados después de 24 horas.

TABLA 1

SEPHADEX G-25	5,0 ml
SEPHADEX G-75	13,0 ml
SEPHADEX L-20	4,0 ml
SEPHADEX L-60	12,0 ml

Estos resultados muestran que los geles de "número alto" se hinchan mucho más (toman cantidades mayores de agua). Esto es consistente con el hecho de que estos geles están menos estrechamente reticulados y tienen tamaños de poro más grandes. Esencialmente, se prefieren los geles de número alto en la deshidratación de la presente invención ya que toman cantidades mayores de agua. Sin embargo, hay que fijarse en que estos mismas geles tienen poros más grandes que también absorben proteínas de peso molecular más alto. De esta forma al seleccionar los geles ideales para uso en la presente invención debe balancearse la eficacia de la deshidratación contra la posible pérdida de la proteína en la matriz del gel. Generalmente, el gel G-75 no absorbe una cantidad excesiva de proteína (comparado con sus favorables propiedades deshidratantes). Geles más abiertos, por ejemplo, G-100 y superiores, absorben más y más proteína y son menos favorecidos.

Ejemplo I

Este ejemplo utiliza un cartucho 10 deshidratante tal como el mostrado en la Figura I. Este cartucho tiene un cuerpo hueco 12 generalmente cilíndrico con un puerto de entrada 14 y un puerto de salida 16. El cuerpo hueco se llena con gel de SEPHADEX 18 suficiente para deshidratar eficientemente una unidad individual (alrededor de 500 mililitros) de plasma. Se proporciona una frita 19' (a menudo simplemente un disco de malla fina de nylon o un material similar) para evitar que se pierda SEPHADEX por el puerto de salida 16. Puede proporcionarse también una segundafrita 19 para evitar pérdidas por el puerto de entrada 14. Se ha descubierto que se obtienen resultados óptimos si se deshidrata el plasma al menos alrededor de un 50%; o sea, si se reducen 100 ml de plasma a 50 ml, pero cualquier eliminación de agua resultará en un aumento de proteína precipitada, El puerto de entrada 14 y de salida 16 están equipados con ajustes estándares 22 de manera que el cartucho 10 puede conectarse fácilmente con un tubo flexible 24 entre una bolsa de sangre 26 y una segunda bolsa de sangre 28 (véase la Figura 2). Dependiendo del tipo exacto de bolsas de sangre usado, el tubo puede venir ya unido a la bolsa de sangre, o si no lo está venir ya unido al cartucho. Alternativamente, pueden usarse tubos separados.

Aquellos familiarizados con el uso de SEPHADEX y materiales similares sabrán que se hinchan considerablemente cuando embeben agua. Por lo tanto, es esencial dejar suficiente espacio en el cartucho 10 para permitir este hinchamiento. La cantidad de volumen necesaria depende del tipo de SEPHADEX seleccionado, los materiales de números altos (por ejemplo, G-100 comparado con G-25) se hinchan en un grado mucho más alto (véase la Tabla 1). Si se usa una frita de entrada 19', esa frita 19'debe ser capaz de deformarse o cambiar de posición a medida que el gel de SEPHADEX se hincha.

En uso, el plasma fluye desde la primera bolsa de sangre 26, a través del cartucho 10 y dentro de la segunda bolsa de sangre 28. Normalmente, el flujo es simplemente por gravedad. Alternativamente, el flujo del plasma puede ser ayudado por cualquier método que evite la apertura de la bolsa arriesgando la contaminación del personal; son apropiados métodos tales como un sistema de bomba peristáltica aplicado al tubo 24 o algún sistema de puño o cámara de presión aplicado a la bolsa de sangre 26. El factor crítico es que la velocidad de flujo del plasma a través del cartucho sea suficientemente lenta para que ocurra una deshidratación adecuada. El grado de deshidratación conseguido es un producto de la velocidad de flujo y de la proporción entre el volumen total de plasma y el volumen del Sephadex. Una velocidad de flujo más lenta y/o un volumen mayor de SEPHADEX disponible producirán un mayor nivel de deshidratación. Sin embargo, una cierta cantidad de plasma es retenida permanente por el SEPHADEX de manera que a mayor volumen de SEPHADEX, mayor es la cantidad de plasma perdida. Además, si la deshidratación es excesiva, puede precipitar la proteína dentro del cartucho y perderse.

Después de que todo el plasma ha pasado a través del cartucho, es ventajoso esperar un tiempo adicional (unos pocos minutos) para que el plasma residual drene del cartucho. Es también posible extraer plasma adicional retenido pasando una cantidad pequeña (por ejemplo, a una velocidad de flujo de 1-5 ml/minuto de aire a baja presión) a través del cartucho. Después del tratamiento del plasma por deshidratación a través del cartucho se puso la segunda bolsa de sangre en un congelador a -80ºC para conseguir una congelación rápida del plasma deshidratado. Después de permanecer congelada al menos durante la noche, se descongeló lentamente la bolsa de sangre congelada en un baño de agua circulante a 4ºC. Después de la descongelación completa, el crioprecipitado, como un precipitado blanco fino, era obvio y se recogió centrifugando la bolsa. Alternativamente, puede transferirse todo el contenido de la bolsa a un tubo de centrífuga para la etapa de recolección o puede obtenerse el precipitado por filtración. Después de la centrifugación, el sobrenadante se eliminó por aspiración. Puede limitarse la contaminación de las proteínas sanguíneas del sobrenadante lavando suavemente la parte interna de la bolsa/botella y la superficie del pellet del crioprecipitado con solución salina isotónica fría.

El crioprecipitado puede a continuación reconstituirse disolviéndolo en cualquier solución fisiológicamente aceptable tal como agua pura libre de pirógenos, solución salina normal, solución salina cítrica, tampón Tris a alrededor de pH 7, u otras soluciones bien conocidas en la técnica. Se controla la concentración de AHF o Factor VIII por medio del volumen de líquido usado en la reconstitución del crioprecipitado. El método de la presente invención recobra alrededor de dos veces la cantidad de proteína comparado con el método usual, con una mejora aproximadamente del 100%. El crioprecipitado contiene otras proteínas en adición al Factor VIII. En particular, el crioprecipitado normalmente contiene fibrinógeno y fibronectina. Puede ser ventajoso eliminar éstos por desnaturación por calor (por ejemplo, el documento patente de Estados Unidos nº 4.305.871) u otros métodos bien conocidos en la técnica: sin embargo, estas proteínas pueden usarse para hacer "cola de fibrina" o "sellador de fibrina", que son valuables en el control de las hemorragias locales durante la cirugía. Si se desea puede someterse el Factor VIII que se produce en la redisolución del crioprecipitado a otras técnicas de purificación bien conocidas a fin de alcanzar niveles de pureza aún más altos, pero dichas etapas generalmente no son necesarias.

Ejemplo 2

Los otros factores de coagulación que no forman un crioprecipitado pueden ser muy importantes. De particular interés son los factores II, VII, IX y X, fabricados en el hígado y que forman el llamado complejo de protrombina. Aunque este material puede usarse en el tratamiento de la Hemofilia B (deficiencia de factor IX), es más valioso en el tratamiento de hemorragias no controladas relacionadas con la enfermedad avanzada del hígado (por ejemplo, úlcera péptica y varices del esófago). Un número sorprendente de pacientes con enfermedad del hígado requieren procedimientos quirúrgicos que les hacen susceptibles a hemorragias no controladas. Si se puede obtener el complejo de protrombina, representará un producto adicional para asegurar la producción del AHF. Puesto que muchos pacientes de enfermedad de hígado finalmente recibirán cirugía de transplante con el uso concomitante de fármacos inmunosupresores, es importante el evitar exponer a estos pacientes a un amplio rango de virus que podrían estar presentes en los productos de sangre combinados. La presente invención está diseñada para procesar unidades separadas de sangre de donantes conocidos de manera que es más probable que el complejo de protrombina esté libre de enfermedades. Adicionalmente, puesto que la presente invención permite la producción del crioprecipitado de plasma no congelado, el complejo de protrombina producido según la presente invención sin congelación tiene menos posibilidades de ser trombogénico puesto que la congelación tiende a activar el material.

Para producir el complejo de protrombina con la presente invención simplemente se reemplaza el SEPHADEX con DEAE (dietilaminoetil) SEPHADEX, un material útil en la cromatografía de intercambio de iones así como en la deshidratación. Se sabe que los materiales de intercambio de iones como el DEAE Sephadex tienen una afinidad poco corriente por las proteínas del complejo de protrombina. Todo lo que es necesario es asegurarse de que haya suficiente capacidad de intercambio de iones para absorber la mayor parte del complejo de protrombina presente en una unidad de plasma. Generalmente la cantidad de DEAE Sephadex necesaria para absorber el complejo de protrombina es menor que la cantidad necesaria para una deshidratación óptima; por lo tanto, es ventajoso añadir SEPHADEX adicional, preferiblemente Sephadex corriente, que es más económico y cuyo uso se prefiere. Una razón adicional para añadir Sephadex corriente es que el DEAE Sephadex se une a las proteínas mientras que deshidrata. El resultado final puede ser que aunque el volumen de plasma está sustancialmente reducido, la concentración de proteína soluble permanece igual de manera que no hay mejora en el rendimiento de crioprecipiado. La adición de Sephadex corriente (por ejemplo, G-75) produce la deshidratación adicional necesaria para mejorar el rendimiento de crioprecipitado. Además, para obtener una unión óptima de las proteínas al DEAE Sephadex puede ser deseable que este material esté pre-hidratado o pre-hinchado, en cuyo caso el gel de DEAE causa poca o ninguna deshidratación y la adición de Sephadex corriente es absolutamente esencial. Después de la deshidratación del plasma como se ha detallado anteriormente, el cartucho 10 se saca del sistema, se lava con unos pocos volúmenes de la columna de solución de tampón salina (por ejemplo, 0,8% cloruro sódico en tampón de Tris 0,02 M, pH 6,9) para eliminar proteínas contaminantes. El primer volumen de la columna de lavado puede guardarse y combinarse con el material de la segunda bolsa de sangre 28.

Después del lavado con solución salina del cartucho 10, el complejo de protrombina se eluye con un lavado de cloruro sódico 0,5M (tamponado con Tris como en el caso del tampón salino). Generalmente se eluye la mayoría del complejo de protrombina en los primeros mililitros que fluyen del cartucho. Naturalmente puede usarse un gradiente de elución, bien conocido en la técnica de la cromatografía, para obtener mejor pureza. El complejo eluído puede ser también purificado adicionalmente con otras técnicas varias bioquímicas bien conocidas en la técnica. Normalmente, se diluirá el material hasta la isotonicidad con agua o solución tampón, o puede dializarse en una solución salina fisiológica. El grado de dilución final dependerá de la fuerza deseada en el producto final. La estabilidad del complejo puede mejorarse añadiendo entre 1 y 5% de albúmina de suero humano esterilizada.

Ejemplo 3

El material deshidratante de la presente invención puede incorporarse directamente a la bolsa de sangre en lugar de incorporarlo al cartucho 10, lo que produce una disminución del volumen de material de deshecho. Aunque es posible incluir SEPHADEX suelto en la segunda bolsa de sangre 28, puede haber problemas en la eliminación del SEPHADEX del plasma deshidratado. Generalmente, la centrifugación no puede hacer eficazmente un pellet de SEPHADEX. Sin embargo puede incluirse un pequeño tapón de fibra de vidrio, PVAA (esponja de alcohol-acetato de polivinilo) o materiales similares dentro de la salida 16 para capturar el SEPHADEX y prevenir que contamine el crioprecipitado o el SEPHADEX suelto puede convenientemente capturarse en un cartucho de filtro más abajo (antes de la producción del crioprecipitado). Si se usa DEAE SEPHADEX suelto, el filtro de más abajo puede entonces servir como una columna para la elución del DEAE SEPHADEX. Alternativamente, puede ponerse el DEAE SEPHADEX en el cartucho de filtro más abajo. Una opción adicional es meter el material deshidratante de SEPHADEX en una envoltura permeable tal como una bolsa de malla de nylon o un material similar. Estas aproximaciones producen una bolsa de sangre especial 32 que contiene o SEPHADEX suelto o un paquete de SEPHADEX cerrado 34. Es también posible construir el paquete 34 con una membrana de permeabilidad diferente tal como un tubo de diálisis. Esto permite el uso de agentes deshidratantes en general (por ejemplo, Aquacides); sin embargo, esta aproximación resulta generalmente en una deshidratación mucho más lenta que cuando se usa el material cromatográfico suelto o en la bolsa de sangre o metido en un paquete totalmente permeable 34. Puede usarse la combinación bolsa-paquete con un cartucho de filtro colocado como se ha explicado anteriormente.

Cuando se usa este dispositivo después de que se haya metido la unidad de plasma en la bolsa 32, se coloca la bolsa llena de plasma 32 en un agitador o mezclador de rotación a fin de mover el plasma en el interior mientras ocurre la deshidratación. Ya que podría no haber un contacto tan íntimo entre el plasma y el SEPHADEX como sucede cuando se usa el cartucho, el proceso de deshidratación puede durar un poco más de tiempo. Después de la deshidratación, el plasma puede enfriarse o congelarse in situ o puede transferirse a otra bolsa de sangre antes de la etapa de precipitación por el frío.

El rendimiento puede ser ligeramente más bajo usando el paquete 34 ya que generalmente no es posible extraer tanto plasma retenido en el paquete 34 como en el cartucho de filtro 10. Además, esta realización no es tan conveniente para el uso con el DEAE SEPHADEX en el paquete 34 para la producción del complejo de protrombina. Esto es porque hay que cortar la bolsa de sangre 32 para abrirla a fin de alcanzar el paquete 34 para la elución. Esto también representa un cierto peligro ya que aumenta la posibilidad de contacto con plasma potencialmente contaminado. Pueden obtenerse buenos resultados meramente insertando el paquete 34 en una columna ancha vacía 36 como se muestra en la Figura 4, o también puede abrirse el paquete 34 y verter el contenido en una columna, como es bien sabido en la técnica. El paquete 34 puede fácilmente meterse a presión en la columna 36 e insertar un tapón 38. En este punto puede lavarse el paquete y eluirse exactamente como el cartucho-filtro 10 en el Ejemplo 2.

Alternativamente, puede obtenerse un rendimiento algo más bajo del complejo de protrombina eluyendo el paquete 34 in situ dentro de la bolsa de sangre 32. En este caso el volumen requerido de tampón eluyente se dispensa dentro de la bolsa de sangre 32 y se pone la bolsa en un agitador. En este caso la elución requiere un tiempo considerablemente más largo y es mejor repetirla con ambos volúmentes de eluatos combinados. Este proceso puede requerir manipulaciones adicionales para deshidratar este mayor volumen a fin de obtener el complejo de protrombina con el nivel de potencia deseado.

Para fines experimentales de evaluación de la metodología la aproximación que usa el SEPHADEX suelto 30 puede modelarse simplemente mezclando varios volúmenes de SEPHADEX con alícuotas de plasma. En este experimento se dispersaron 2.0, 1,5, 1,0 ó 0,5 g de SEPHADEX G-75 seco en volúmenes de 25 ml de plasma humano. Se mezcló bien el SEPHADEX disperso y a continuación se incubó durante una hora a temperatura ambiente para permitir que el SEPHADEX G-75 se hinchase completamente. Se filtró el SEPHADEX de cada muestra, y se almacenó una porción de 5 ml de cada muestra a 5ºC durante 24 horas. Durante este tiempo se formó un crioprecipitado que se recogió por centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos. Se midió el volumen del precipitado y se recogió. Se congeló el sobrenadante a -70ºC durante 2 horas y a continuación se descongeló a 5ºC durante 24 horas, produciendo un segundo crioprecipitado que también se recogió por centrifugación. La Tabla 2 compara los rendimientos de crioprecipitado según la cantidad de Sephadex G-75.

TABLA 2

1

Puede verse por estos resultados que el aumento en rendimiento del crioprecipitado en función de la cantidad de SEPHADEX añadida no es lineal. Un aumento del SEPHADEX de 0,5 g a 1,0 g (un aumento de 100% de SEPHADEX) produce un aumento de 125% de crioprecipitado. Un aumento del SEPHADEX de 1,5 g a 2,0 g (un aumento de 33% de SEPHADEX) produce un aumento adicional del 75% de crioprecipitado (esto representaría un rendimiento total de 225%). A medida que el plasma está más concentrado, proporciona una cantidad progresivamente mayor de crioprecipitado. Si se añaden cantidades excesivas de SEPHADEX, hay cierto peligro de disminuir la calidad del precipitado puesto que otras proteínas del plasma (además de los factores de coagulación) precipitan en mayor cantidad. Probablemente una proporción de alrededor de 1 g de SEPHADEX por cada 10 ml de plasma es prácticamente óptima.

Claims (18)

1. Un procedimiento para producir proteínas purificadas a partir de plasma previamente no fraccionado por precipitación fría, que comprende las etapas de:

poner en contacto el plasma previamente no fraccionado con una cantidad de gel cromatográfico no hidratado suficiente para reducir el volumen del plasma por la absorción de agua del mismo;

separar el gel cromatográfico procedente del contacto con el plasma después de la absorción de agua por el gel;

enfriar el plasma a una temperatura suficientemente baja para que la proteína precipite;

separar el precipitado de proteína del plasma líquido; y redisolver el precipitado para producir una solución de proteína purificada.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las etapas de poner en contacto el plasma con el gel cromatográfico y mantener el contacto se llevan a cabo pasando el plasma a través de un cartucho que contiene dicho material insoluble de absorción de agua.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las etapas de poner en contacto el plasma con un gel cromatográfico y mantener el contacto se llevan a cabo por la adición del gel cromatográfico suelto a un recipiente que contiene el plasma y agitar el contenedor para mantener el contacto entre dicha gel y el plasma.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el recipiente es una bolsa de sangre en la que el gel ha sido añadido antes de la introducción del plasma.

5. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa de separar el gel en contacto con el plasma se lleva a cabo por centrifugación.

6. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa de separar el gel en contacto con el plasma se lleva a cabo por filtración.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el plasma se enfría hasta alrededor de 4ºC y la proteína que precipita se separa después del plasma.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el plasma se congela después de la separación del precipitado de proteína y después se descongela a 4ºC para rendir un segundo precipitado de proteína.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el plasma se enfría por debajo de 4ºC hasta que se congela sólido y después se descongela a 4ºC para rendir el precipitado de proteína.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el gel cromatográfico es dextrina reticulada de marca SEPHADEX.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el gel cromatográfico contiene grupos intercambiadores de iones que se unen al complejo de protrombina y en donde el método comprende además la etapa de eluir el gel cromatográfico que contiene los grupos intercambiadores de iones para liberar el complejo de protrombina purificado.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el plasma es una unidad individual de plasma de un donador único.

13. Un sistema para producir proteínas purificadas del plasma, que comprende:

una bolsa de sangre que contiene una cantidad de gel cromatográfica que absorbe agua;

un cartucho de filtrar para separar el gel cromatográfico del plasma;

y

medios de conducción para operacionalmente conectar la bolsa de sangre con el cartucho de filtración.

14. El sistema de la reivindicación 13, en donde el gel cromatográfico es dextrina reticulada de marca SEPHADEX.

15. El sistema de la reivindicación 13, en donde el gel cromatográfico comprende material con grupos intercambiadores de iones.

16. El sistema de la reivindicación 15, en donde el gel cromatográfico con los grupos intercambiadoras de iones se coloca dentro del filtro del cartucho.

17. El sistema de la reivindicación 15, en donde el gel cromatográfico con los grupos intercambiadores de iones es una forma modificada de las dextrina reticulada de la marca SEPHADEX.

18. El sistema de la reivindicación 13, en donde el gel cromatográfico está contenido dentro de un sobre poroso.