DE2633728B2 - NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung - Google Patents
NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine neue NADH-Peroxidase aus Mikroorganismen, welche sich in verschiedenen
Eigenschaften von der bekannten NADH-Peroxidase unterscheidet, das Verfahren zu ihrer Gewinnung sowie
die Verwendung dieses neuen Enzyms zur Bestimmung von H2O2, insbesondere in gekoppelter Reaktion in
Gegenwart einer spezifischen Oxidase.
Zahlreiche wichtige Substanzen, wie Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Aminosäuren, Alkohole u.dgl.,
werden enzymatisch unter Verwendung von Oxidasen bestimmt, welche bei dieser Reaktion H2O2 bilden.
Letzteres wird anschließend nach verschiedenen Methoden, wie Oxidation eines Chromogens, Oxidation
von Alkoholen mit Katalase (Hantzsche Reaktion), mit Aldehyd-Dehydrogenase u. a., gemessen. Alle diese
bekannten Indikatorreaktionen weisen Nachteile auf.
So wird die Peroxidation von Chromogenen durch Pharmaka gestört, der Nachweis unter Verwendung der
r> Hantzschen Reaktion benötigt eine sehr lange Reaktionszeit, die Reaktionsführung über die Aldehyd-Dehydrogenase
ist umständlich, und das Enzym ist sehr unstabil u. dgl. Es besteht daher ein Bedarf nach einer
einfachen Nachweismethode für H2O2, welche diese
ίο Nachteile nicht aufweist und sich insbesondere auch in
Kombination mit spezifischen Oxidasen einsetzen läßt.
Ideal wäre es, die zur Bildung von H2O2 führende
spezifische Oxidasereaktion mit der für enzymatische Bestimmungen bevorzugt eingesetzten NADH-Reak-
)r, tion (NADH = Nicotin-amid-adenin-dinucleotid in
reduzierter Form) kuppeln zu können. Eine NADH-Peroxidase, welche die Reaktion
NADH — POD
NADH + H + + H2O2 —
NAD+ + 2H2O
katalysiert, ist bereits bekannt: ABB, 55,415 (1955); JBC,
225, 557 (1957). Dieses Enzym mit der EC-Nr. 1.11.1.1 wurde in Streptococcus faecalis 10 C I und in Lactobacillus
casei gefunden und zeichnet sich durch ein pH-Optimum bei 5,4 sowie durch Michaelis-Konstanten
Ä"Mfür H2O2 von 2 ■ ΙΟ-" und für NADH von 1,4 · ΙΟ-5
aus. Da für viele Oxidasen nur pH-Werte im alkalischen Bereich geeignet sind, die bekannte NADH-Peroxidase
aber bei pH 7,0 bereits praktisch inaktiv ist (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 [1965]) sowie aufgrund der
ungünstigen Michaelis-Konstanten eignet sich das Enzym in der Praxis nicht für die H2O2-Bestimmung in
gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
Nunmehr wurde eine weitere NADH-Peroxidase gefunden, welche die Nachteile der bekannten NADH-Peroxidase
von der sie sich klar unterscheidet, nicht aufweist und die sich vorzüglich zur Verwendung bei der
enzymatischen H2O2-Bestimmung, insbesondere in
gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase, eignet. Ein Erfindungsgegenstand ist daher eine
NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu NAD
und H2O oxidiert und gekennzeichnet ist durch eine Michaelis-Konstante Km gegenüber H2O2 von
2,8 · 10-5M und gegenüber NADH von 1,7 · IQ-5M,
4r) gemessen bei 25°C in 0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer
pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.
Das neue Enzym eignet sich wegen seiner niedrigen
Km wesentlich besser als das bekannte Enzym für eine
H2O2-Bestimmung. Je höher nämlich die Km ist, desto
r)<> höher muß bei einer Bestimmung auch die H202-Konzentration
im steady state sein. Je höher aber die H202-Konzentration ist, desto größer ist auch der
Einfluß der Katalase, die im Probenmaterial in der Regel vorhanden ist. Durch die Konkurrenz der Katalase um
51) das H2O2 werden aber die Resultate verfälscht.
Das neue Enzym der Erfindung ist wie das bekannte Enzym ein Flavoprotein und daher gelblich gefärbt. In
Glycerin/Wasser 1:1 ist das Enzym bei +4° C monatelang stabil. NADPH kann NADH nicht ersetzen
to im Gegensatz zum bekannten Enzym, welches mit
NADPH etwa 8% der Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber NADH aufweist.
Das Enzym weist in Trispuffer in Gegenwart von Acetat- oder Propionat-Ionen ein pH-Optimum bei 6,0
auf, die Aktivität in Natriumacetatpuffer bei pH 5,4, also unter den optimalen Bedingungen des bekannten
Enzyms, liegt etwa 20% niedriger. Bei pH 9,0 beträgt die Aktivität noch etwa 20% des Optimums.
Erfindungsgemäß wird das neue Enzym aus Streptococcus
faecalis ATCC 8043 gewonnen. Die Gewinnung erfolgt durch Aufschluß oder durch Behandlung des
Mikroorganismus mit einem oberflächenaktiven Mittel unter Freisetzung des Enzyms, welches dann aus der -,
Lösung isoliert werden kann. Geeignete Aufschlußmethoden sind beispielsweise Ultraschalleinwirkung, Zerreiben
mit Glasperlen, Einwirkung hoher Scherkräfte u. dgl. Alle diese Aufschlußmethoden sind bekannt und
für Mikroorganismen üblich. Die Behandlung mit einem ι»
oberflächenaktiven Mittel erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur zwischen 25 und 600C. Bevorzugt
wird eine Behandlung bei 45 bis 55° C bei schwach sauren pH-Werten zwischen etwa 4,5 und 6,0. In dei
Regel reichen 15 bis 30 Minuten aus, diese Einwirkungs- r,
dauer kann jedoch ohne Nachteil erheblich überschritten werden. So werden selbst bei dreistündiger
Einwirkung bei 55°C noch sehr gute Ausbeuten erzielt. Die Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln wird
bevorzugt, da hierbei weniger Verunreinigungen in .'ti
Lösung gehen als bei mechanischen Aufschlußmethoden und daher von vornherein ein reineres Enzym
gewonnen wird. Unter den oberflächenaktiven Mitteln werden die nichtionogenen bevorzugt. Besonders
bevorzugt werden Polyäthylenglycolester, z. B. Alkylarylpolyäthylenglycolester
wie p-Isooctylphenyläthylenglycoläther
mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten. Ein besonderer Vorzug dieser Aufschlußmethode
besteht auch darin, daß der Gehalt an störender NADH-Oxidase hierbei besonders gering ist. 1»
Zur Gewinnung des Enzyms werden die Lösungen von den ungelösten Stoffen befreit, z. B. dutch
Zentrifugieren, und aus dem gewonnenen klaren Überstand kann die das Enzym enthaltende Eiweißfraktion
gefällt werden. Zur Fällung eignen sich die hierfür >', in der Biochemie üblichen Mittel wie Aussalzen, z. B. mit
Ammoniumsulfat, Fällung durch organische Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol, Fällung mit Polyionen
wie Polyäthyleni?iiin u. dgl. Eine weitere Aufreinigung
des rohen Enzympräparats kann beispielsweise durch Chromatographie an Adsorbentien wie Carboxymethylcellulose,
vernetztem Dextran, Ionenaustauschern u. dgl. erfolgen. Außerdem zeigt es sich, daß das Enzym auch
durch Säurebehandlung von Begleitsubstanzen befreit werden kann. Zweckmäßig erfolgt die Säurebehandlung <r>
bei pH-Werten zwischen 4,2 und 4,8 während 10 bis 25 Minuten.
Eine bevorzugte Reinigungsmethode besteht daher in einer Einstellung der wäßrigen Enzymlösung auf pH 4,2
bis 4,8, Abtrennung des Unlöslichen und Fraktionierung >o
des im Überstand befindlichen Enzyms mit Polyäthylenimin.
Es versteht sich, daß alle Schritte des Gewinnungsverfahrens
in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Besonders geeignete Puffer sind dabei Phosphatpuffer, r»
TRIS-Puffer und Acetatpuffer. Aber auch die anderen üblichen Puffer wie Glycinpuffer, Borat-Citratpuffer
u. dgl. sind brauchbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der neuen NADH-Peroxidase zur Bestim- e>o
mung von H2O2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase. Die Bestimmung
erfolgt zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0. Auf diese Weise gelingt es, die spezifische
Oxidasereaktion mit der Messung der NADH-NAD- fe5 Reaktion zu koppeln. Letztere Reaktion läßt sich
bekanntlich besonders einfach durch Bestimmung der Extinktionsänderung, die der Änderung der NADH-Konzentration
proportional ist, verfolgen.
Unter »spezifischer Oxidase« werden im Rahmen der Erfindung Enzyme verstanden, welche mit bestimmten
Substraten und O2 unter Bildung von H2O2 reagieren.
Als spezifische Oxidasen werden im Rahmen der Erfindung bevorzugt Glucoseoxidase, D-Aminosäureoxidase,
L-Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase, Uricase und Xanthinoxidase verwendet.
Dementsprechend lassen sich in der gekoppelten Reaktion Glucose, D-Aminosäuren wie D-Alanin,
L-Aminosäuren wie L-Leucin, Cholesterin und Cholesterinester, niedere Alkohole^Harnsäure, Xanthin und
Hypoxanthin bestimmen. In einfacher Reaktion kann H2O2 selbst bestimmt werden, also nicht nur als
Zwischenprodukt wie in Gegenwart des Oxidasesystems.
Die Messung der NADH-Peroxidase der Erfindung läßt sich vorteilhaft nach folgendem Test durchführen:
2.68 ml TRIS-Kaliumacetatpuffer (0,2 M TRIS +
0,15 M Kaliumacetat): 2,42g TRiS + 1,42g Kaliumacetat in 70 ml H2O lösen, mit 2 N
Essigsäure auf pH 6,0 einstellen, mit H2O ad 100 ml auffüllen.
0,20 ml NADH (6 mM): 5 mg NADH mit 1 ml H2O
lösen.
0,02 ml Probe NADH-POD.
Mischen, bei 365 nm, d = 1 cm, 25°C Vorlauf registrieren ΔΕ/m'm. Dieser Vorlauf (Extinktionsabnahme)
dient zur Berechnung der »NADH-Oxidase«. Start mit
0,10 ml H2O2 (40 mM (0,05 ml 30%iges H2O2 werden
mit 10 ml H2O verdünnt)).
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (ΔΕ/m'm). Vor Berechnung der NADH-POD-Aktivität wird von ΔE/min der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (ΔΕ/m'm). Vor Berechnung der NADH-POD-Aktivität wird von ΔE/min der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.
Bevorzugt wird TRIS-Acetat-Puffer verwendet, doch ist die Anwendung der NADH-POD nicht auf dieses
Puffersystem beschränkt. Die Bestimmung von H2O2 mit
NADH-POD kann u. a. durchgeführt werden mit:
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphosphat, Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triäthanolamin.HCl oder HEPES (N-2-HydroxyäthyIpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphosphat, Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triäthanolamin.HCl oder HEPES (N-2-HydroxyäthyIpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.
In entsprechender Weise kann auch die H2O2-Bestimmung
durchgeführt werden, wobei NADH-POD im Überschuß zugegeben und die H2O2-Menge bestimmt
wird, die der Extinktionsänderung entspricht. Die Messung kann nach der Endpunktmethode oder
kinetisch, d. h. durch Messung der Extinktionsdifferenz innerhalb eines bestimmten kurzen Zeitraumes, erfolgen.
Präzision und zeitlicher Verlauf der H2O2-Bestimmung
bei pH 8,0 im oben beschriebenen TRIS-Kaliumacetatpuffer und bei den oben angegebenen Meßbedingungen
zeigt die Zeichnung. In dieser stellt dar:
F i g. 1 eine Eichkurve, in der die H2O2-Menge
(Abszisse) gegen die Extinktionsdifferenz (Ordinate) aufgetragen ist,
F i g. 2 die Extinktionsabnahme mit der Zeit bei 25°C.
Am Start wurden 0,4 μΜοΙ H2O2 zugesetzt.
Die beiden Figuren der Zeichnung lassen die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Enzyms für die
quantitative H2O2-Bestimmung erkennen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Gewinnung und Reinigung des Enzyms
Gewinnung und Reinigung des Enzyms
Streptococcus faecalis ATCC 8043 Biomasse wird mit einer l%igen Lösung von p-Isooctylphenyläthylengly- >
coläther mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 30
Minuten auf 55°C erhitzt. Dann wird auf 4°C abgekühlt
und das Unlösliche abgetrennt. Man erhält eine wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 1,77 U/ml und einer in
spezifischen Aktivität von 0,77 U/mg.
Die erhaltene Lösung wird Ammonsulfat zugesetzt, bis sich die gesamte enzymatische Aktivität im
Niederschlag befindet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Phosphatpuffer pH 0,5 aufgenommen und ι Γ>
durch Molekularsiebpassage entsalzt. Die so erhaltene Enzymlösung kann direkt oder nach vorheriger
Konzentrierung durch Lyophilisieren und Aufnehmen in 3,0 M Ammoniumsulfat-Lösung, pH ca. 7, für den
H2O2-TeSt verwendet werden.
Zweckmäßig erfolgt eine weitere Aufreinigung der Ausgangslösung ohne vorherige Abtrennung des
Enzyms durch Ammonsulfatfällung wie folgt:
Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 4,4 eingestellt und 20 Minuten stehengelassen. Dann wird vom
Unlöslichen abfiltriert. Dem Oberstand wird Polyäthyleniminlösung
portionsweise zugesetzt und vom jeweils auftretenden Unlöslichen filtriert. Die das Enzym
enthaltende Fraktion wird erneut in Puffer gelöst und über Diäthylaminoäthylcellulose chromatographiert.
Anschließend erfolgt eine Entsalzung über vernetztes Dextran. Man erhält so ein Präparat mit ca. 45 U/mg.
i>
Abhängigkeit der Aktivität der NADH-POD
vom im Test verwendeten Puffer
vom im Test verwendeten Puffer
Gemessen wird in 0,1 M Puffern (1 mM H2O2, 0,4 mM
NADH).
Enzymaktivitäten bei pH 7,5 in % in verschiedenen Puffern, bezogen auf die Aktivität in Natriumacetat-Puffer
(= 100%)
Puffer | % |
Natriumacetat | 100 |
TRlS · Acetat | 101 |
TRA · Acetat | 100 |
Piperazin · HCl | 100 |
HEPES | 89 |
Kaliumphosphat | 63 |
Kaliumdiphosphat | 61 |
Borat/Citrat | 25 |
TRA = Triäthanolamin. | |
Beispiel 3 |
Einfluß des pH-Wertes im Testsystem auf die Aktivität der NADH-POD.
>-, Gemessen wird in 0,1 M TRIS.Acetat-Puffer (1 mM
H2O2 und 0,4 mM NADH).
Tabelle J() pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität in %
pH %
5,0 5,4 6,0 7,0 7,5 8,0 9,0
67 98 100 88 56 37 19
Beispiel 4 *\ Harnsäurebestimmung mit Uricase
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
2 H2O + Harnsäure + O2
Uricase, NADH-POD gemäß Erfindung und NADH wurden in 0,2 M TRISAcetat-Puffer unterschiedlichen
pH-Wertes, welcher jeweils 0,15 M Kaliumacetat enthielt, gelöst. Dann wurde eine 0,2 μΜοΙ Harnsäure
enthaltende wäßrige Lösung zum Start zugesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Uricase
Tabelle 3 | Enzymmenge | Uri | Endablauf | % Wieder |
pH | im Test | case | zeit in min. | findung, |
U | bezogen auf | |||
NADH-POD | 1 | UV-lest = 100% | ||
I | ||||
U | ||||
0,1 | 16 | 95,5 | ||
6 | 0.1 | IO | 99 | |
7 | ||||
Allantoin + H,O, + CO
pH lin/ymmenge Kndahluuf-
im Tesi /eil in min.
NADIi-POD Uricase
0,1 0,1 0,1 0,2
2 0,2
5 16 10 10
% Wicderfindung, bezogen auf UV-test = 1001K
100 96,5 96,5 98
br> Referenzmethode: P. Scheibe, E. Bcrnt und II. U
Bergmeyer in H. U. Bergnieyer - Methoden der enzy
matischon Analyse, Bd. II, 3. AuIl., S. 1999, (1974).
Wiederfindung Harnsäure in %, bei 0,2 μΜοΙ Harnsäure/Testansatz
(Testbedingungen: 0,2 M TRIS 'Acetat, 0,15 M Kaliumacetat, 0,4μΜο1 NADH, 0,1 U
NADH-POD, 1 U Uricase aus Aspergillus flavus, 3 ml Testvolumen, 25CC, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsabiauf
bei pH 8 = 100%
6,0
7,0
8,0
8,5
9,0
10,0
7,0
8,0
8,5
9,0
10,0
71 95 100 98 76 69
Beispiel 5 Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase (GOD)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
GOD
D-Glucosc + H2O + O2
Gluconat + H2O2
Die Bestimmung wurde bei pH 7,0 unter Einsatz von 210 U GOD, 0,2 U NADH-POD und 60 U Mutarotase
durchgeführt. Die Bestimmung der Glucose im Harn ergab 100% des mit der Referenzmethode GOD-Perid
R (DBPS 1648 840 und H. U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Aufl., S. 1257 [1974]) erhaltenen Wertes.
Bestimmung von D-Alanin mit D-Aminosäureoxidase (D-AOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
D —AOD
D-Alanin + O2 + H2O
Pyruvat + NH, + H2O2
Bestimmung von L-Leucin mit L-Aminosäureoxidase (L-AOD) aus Crotalus terrificus
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung: L-Leucin + O2
L-AOD
— > Kctoisocapronsiiure + H2O2
Die Durchführung erfolgte bei pH-Werten zwischen 7,5 und 8,0 in TRIS.Acetat-Puffer 0,2 M, welcher 0,15 M
Acetat enthält. Bei Zusatz von 0,2 U NADH-POD gemäß Erfindung und 0,7 U L-AOD im Test betrug die
Wiederfindung etwa 100%. Bei einer Konzentration von 0,2 μΜοΙ L-Leucin betrug die Reaktionsdauer ca. 20
Minuten. Referenzmethode: nicht bekannt.
IO
Cholesterinester-Bestimmung
mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase
mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase
Die Bestimmung erfolgt gemäß nachstehenden Gleichungen:
25
1. Cholesterinester + H2O
Chol. Esterase
Chol. Esterase
Cholesterin + Fettsäure
2. Cholesterin + O2
Chol. Oxid.
Chol. Oxid.
Cholestenon + H2O2
JO Es wurden handelsübliche Cholesterin-Standardlösungen und Serum verwendet. Die Wiederfindung bei
einer handelsüblichen Standardlösung mit 0,2 μΜοΙ Cholesterin betrug 98 bis 102% bei pH-Werten
zwischen 6,0 und 9,0 innerhalb von 9 bis 12 Minuten. Eingesetzt wurden 0,1 U NADH-POD, 2 U Cholesterinoxidase
in 3 ml Testvolumen.
4(i Die Cholesterinbestimmung im Serum unter Verseifung
des veresterten Cholesterinanteils mit äthanolischer KOH ergab Wiederfindungswerte zwischen 95
und 105%.
Referenzmethode: P. Roeschlau, E. Bernt und
4i W. Gruber, H. U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Auf U S.
1938(1974).
Die Bestimmung wurde bei pH 8,5 unter Einsatz von 0,25 U NADH-POD, 20 U D-AOD, 5 U Lactatdehydrogenase
bei 25°C durchgeführt. Bei 20minütiger Inkubation bei 25° C betrug die Wiederfindung 100%.
Referenzmethode: M. G r a ß 1 in H. U. B e r g m e y er, Bd. 11,3.Aufl.,S. 1731(1974).
Bestimmung von Alkoholen
mit Methanol-Oxidase(MOD)
mit Methanol-Oxidase(MOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
Methanol -f O2
MOD
Formaldehyd + H2O2
bO
Die Bestimmung wurde bei pH-Werten zwischen 9,0 und 9,5 in Glycin-Na-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz
von Semicarbazid durchgeführt. Die eingesetzten Enzymmengen waren 0,3 U NADH-POD und 8 U
MOD. Die Wiederfindung bei 0,2 μΜοΙ Methanol und Äthanol lag um 100%. Auch mit Isopropanol konnte die
Bestimmung durchgeführt werden.
9 10
Beispiel 10 XOD
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin Xanthin + H>° + 0^ " Harnsäure + H2O2
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin Xanthin + H>° + 0^ " Harnsäure + H2O2
mitXanthinoxidase(XOD) „.. „ . , , . ,,
Die Bestimmung erfolgte bei pH 8,0 mit TRIS-Puffer
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgenden Gleichun- ->
wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die gen: Wiederfindung betrug 100% Xanthin bzw. Hypoxan
thin. Als Referenzmethode wurde die in B e r g m e y e r,
XOD »Methoden der enzymatischen Analyse«, 3. Aufl., Bd. II,
Hypoxanthin + H2O + O, ■* Xanthin + H2O2 S. 1988 (1974)beschriebenen Methode verwendet.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
1. NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu
NAD und H2O oxidiert, gekennzeichnet durch eine Michaeliskonstante Km gegenüber
H2O2 von 2,8 · 10"5 M und gegenüber NADH von
1,7 · ΙΟ-5 M, gemessen bei 250C in 0,2 M Trispuffer
pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.
2. Verfahren zur Gewinnung der NADH-Peroxidase von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Enzym aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 durch Aufschluß oder Behandlung mit einem
oberflächenaktiven Mittel freigesetzt und aus der Lösung gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung auf einen pH-Wert
von 4,2 bis 4,8 eingestellt, Unlösliches abgefenr.t und im Filtrat eine Fraktionierung mit Polyäthylenimin
durchgeführt wird.
4. Verwendung des Enzyms von Anspruch 1 zur Bestimmung von H2O2 in einfacher oder in
gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
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