DE2621276C2

DE2621276C2 -

Info

Publication number: DE2621276C2
Application number: DE2621276A
Authority: DE
Inventors: Alexander Urszu Bertland Ii; Alfred A. Lansdale Pa. Us Tytell; George Peter Hatfield Pa. Us Lampson; Eugene Bernard North Wales Pa. Us Buynak
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1976-05-13
Publication date: 1988-05-11
Also published as: NL188621B; DE2621276A1; DK145347C; HK86779A; NL188621C; AU504454B2; DK190776A; GB1488774A; CH629668A5; JPS6345645B2; SE7604818L; JPS58180432A; AU1361976A; JPS51139619A; DK145347B; FR2315947B1; US4017360A; JPS6112894B2; CY1034A; ES447858A1

Description

Die Hepatitis B ist eine der beiden Arten viraler Hepatitis, die eine systemische Infektion ergibt, wobei sich die hauptsächlichen pathologischen Veränderungen in der Leber einstellen. Die Erkrankung tritt hauptsächlich beim Erwachsenen auf und hat Bestand hauptsächlich durch Infektionsübertragung von Langzeitträgern des Virus. Die üblichen Ausbreitungswege sind die Bluttransfusion, verunreinigte Nadeln und Spritzen, ein Eindringen durch schnitt- oder kratzerbedingte Hautrisse, nicht-sterilisierte zahnärztliche Instrumente wie auch Speichel, geschlechtlicher Kontakt oder aerosolisiertes infiziertes Blut.

Die Inkubationszeit der Hepatitis des Typs B ist relativ lang. Zwischen der Infektion und dem Einsetzen klinischer Symptome können 6 Wochen bis 6 Monate verstreichen. Gewöhnlich beginnt die Krankheit mit Mattigkeit und Appetitlosigkeit, manchmal begleitet von Muskelschmerzen und Abdominalbeschwerden. Später können Gelbsucht, dunkler Urin, heller Stuhl und leichte Leberschwellung mit Druckempfindlichkeit auftreten. In dem einen oder anderen Fall kann das Einsetzen rasch ablaufen unter frühem Auftreten von Gelbsucht in Verbindung mit Fieber, Kältegefühl und Leukozytose. In anderen Fällen mag Gelbsucht nie erkennbar werden und der Patient sich nur "grippeartig" krank fühlen. Der Schätzung nach führt die Mehrzahl von Hepatitis- Infektionen zu einer leichten anikterischen Erkrankung.

Die Erkrankung ähnelt qualitativ der viralen Hepatitis A, ist aber leicht diagnostizierbar am Auftreten von Partikeln des Australia-Antigens - heute mit HB_sAg bezeichnet (Oberflächenantigen) - im Blut oder in anderen klinischen Proben (Speichel, Urin, Gallenflüssigkeit, Faeces). Im Blut der Infizierten findet sich eine relativ große Population kugelförmiger Partikel (10¹⁴ bis 10¹⁵/ml). Die Partikel haben einen Durchmesser von 18 bis 22 nm und die gleichen Antigendeterminanten wie die Oberfläche des 42-nm-Dane-Partikels, welches das Hepatitis- B-Virus - heute als HBV bezeichnet - sein kann.

Wie in US-PS 37 35 004 beschrieben, wurden Kinder mit aufgekochtem, infektiösem Serum unter Auftreten von HB_sAg-Antikörpern (Anti-HB_s) geimpft, wobei mit diesem Serum Schutz vor Infektion erhalten wurde. Die angewandte Dosis des aufgekochten Serums war etwa 1 × 10¹² HB_s-Partikeln äquivalent. Bei den Serumempfängern entwickelte sich keine klinische oder biochemische Erkrankung. Dieses Serum ist aber auf Grund seiner unreinen Natur, der mangelnden Reproduzierbarkeit und seiner Nichtquantifizierbarkeit zur Verwendung als Impfstoff nicht geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen mit einem Partikeldurchmesser von 18 bis 22 nm und einem E von 52 bis 54 aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B- Antigen gewonnenen Konzentrat, das erhältlich ist, indem man das Konzentrat mit Pepsin in einer zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer 4- bis 8-molaren Konzentration behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt und gegebenenfalls Formaldehyd in einer zur Vireninaktivierung wirksamen Konzentration zugibt.

Das anfallende Produkt, ein hochgereinigtes, reproduzierbares, kennzeichenbares, von unerwünschten Fremdproteinen und/oder -antigenen getrenntes Hepatitis-B-Antigen, eignet sich als Impfstoff.

Fig. 1 zeigt ein UV-Spektrum des Antigens gemäß der Erfindung.

Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Serumsumwandlungsgeschwindigkeit bei Erwachsenen nach Impfung mit dem erfindungsgemäßen Antigen zeigt.

Fig. 3 zeigt die beim Versuch von Fig. 2 erzielten Antikörpertiter.

Die Erfindung ist nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Das Ausgangsmaterial für das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB_sAg) gemäß der Erfindung ist Plasma, das von Spendern z. B. durch Plasmaphorese erhalten wird. Der Antigentiter läßt sich in bekannter Weise im radioimmunologischen Versuch, durch Passivhämagglutination oder Komplementbindung messen. Man kühlt das Plasma und entfernt das sich bildende Kryopräzipitat durch leichtes Schleudern. Das verbleibende, geklärte HB_sAg enthaltende Plasma wird nach einer oder mehreren Techniken konzentriert, z. B. nach der Isopycnic- Banding-Technik oder Rate-Zonal-Banding-Technik oder durch Fällung, z. B. mit Polyäthylenglykol, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und dergleichen. Dieses partiell gereinigte Konzentrat ist das Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung.

Bei der Isopycnic-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium zusammengebracht, das in sich einen Dichtegradienten aufweist, der die Dichte des benötigen, speziellen Antigens umfaßt. Das flüssige Medium wird dann auf der Ultrazentrifuge behandelt, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serum-Komponenten über den Dichtegradienten entsprechend ihren Einzeldichten zu erhalten. Man verdrängt dann aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums und trennt die das gewünschte Antigen enthaltenden ab. Die Anwendung dieser Technik auf die Reinigung des Australia-Antigens ist in DE-OS 20 49 515 und US-PS 36 36 191 beschrieben.

Bei der Rate-Zonen-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat auf der Ultrazentrifuge im Kontakt mit einem flüssigen Medium behandelt, in dem ein Dichtegradient vorliegt, wobei aber hier die Rate-Zonentechnik Anwendung findet, d. h. man arbeitet bei einer solchen Geschwindigkeit und solchen Behandlungszeit, daß das Gleichgewicht nicht erreicht wird, wobei das HB_sAg und andere Serum-Restkomponenten in dem Medium entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten in dem Medium verteilt werden.

Die bei dem Verfahren eingesetzten, flüssigen Medien können jeglichen Dichtegradienten in den geeigneten Bereichen aufweisen. Zu den bei der Bildung solcher Lösungen einzusetzenden, zu lösenden Stoffen, gehören z. B. Rohrzucker, Kaliumbromid, Cäsiumchlorid, Natriumbromid, Kaliumtartrat und dergleichen. Die Stufe des Isopycnic-Banding wird bequemerweise auf einer Zentrifuge, z. B. der Bauart Electronucleonics-K, durchgeführt, indem man den stehenden Rotor mit Kochsalzlösung füllt und dann aufeinanderfolgend die Salzlösung mit aliquoten Anteilen einer Flüssigmediumlösung zunehmender Dichte nach oben verdrängt, bis ein Stufengradient gebildet ist.

Das Plasma wird am Kopf des Rotors unter Verzögerung eines Teils der die höchste Dichte aufweisenden Lösung vom Boden eingeführt. Mit einem programmierten Geschwindigkeitsregelsystem, das ein Mischen während der Reorientierungs-Anfangsphase verhindert, wird die Zentrifuge auf die Arbeitsgeschwindigkeit gebracht. Wenn das Gleichgewicht erreicht ist und das Produkt sich in seiner richtigen Dichte-Position befindet, erfolgt die Herabsetzung der Rotordrehzahl unter Anwendung des gleichen Systems, um ein Mischen bei der Reorientierung zur ursprünglichen Konfiguration zu vermeiden. Dann wird das Gradient-Medium von unten ablaufen gelassen und der richtige Dichte-Schnitt gesammelt. Eine ähnliche Technik findet beim Rate-Zonal-Banding Anwendung. Der bei dieser Bandenbildung zu sammelnde richtige Dichte- Schnitt ist das partiell gereinigte Konzentrat des Hepatitis-B- Antigens.

Hierauf wird durch Zusatz keimfreier, pyrogenfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) die Protein-Konzentration des partiell gereinigten Konzentrats auf etwa 40 bis 200 µg/ml eingestellt. Dann wird die Lösung auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 4 angesäuert, vorzugsweise mit HCl bei etwa 25°C.

Eine Lösung von gereinigtem Pepsin in Wasser (vorzugsweise angesetzt mit kristallinem Pepsin) wird so hinzugegeben, daß die Lösung etwa 1 µg Pepsin pro etwa 40 bis 500 µg Protein enthält. Die Lösung wird inkubiert, bis die Digestion des Fremdproteins durch das Pepsin vollständig ist, was typischerweise in etwa 8 bis 24 h bei einer Temperatur von etwa 30 bis 38°C der Fall ist. Die Lösung wird nun durch Zusatz einer Base, z. B. NaOH, auf etwa pH 7 gebracht. Man konzentriert das pepsinaufgeschlossene Material durch Ultrafiltration bei etwa 5°C und gibt Harnstoff (vorzugsweise eine hochgereinigte, kristalline Sorte) bis auf eine Endkonzentration mit der Wirksamkeit zur Dissoziation proteinartiger Substanz, typischerweise etwa 4- bis 8molar, hinzu. Die Mischung wird dann bei erhöhter Temperatur inkubiert, typischerweise etwa 16 bis 24 h bei etwa 30 bis 38°C, um eine weitere Reinigung zu bewirken. Die inkubierte Mischung wird durch Filtration geklärt und auf einer Säule chromatographiert, um Harnstoff, Pepsin und Reste von der Pepsindigestion her zu entfernen. Die Säule wird mit einem keimfreien, pyrogenfreien, physiologisch akzeptablen Puffer eluiert, der mit der Säule verträglich ist, z. B. PBS, eine Mischung von NaH₂PO₄ und Na₂HPO₄ oder eine Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan-Lösung (Tris). Fraktionen, deren Bestimmung nach bekannten Methoden, z. B. im radioimmunologischen Versuch und durch Komplementbildung und UV-Spektrophotometrie, einen Gehalt an HB_sAg ergibt, werden zusammengegeben und mit keimfreiem, pyrogenfreiem, physiologisch akzeptablem Puffer (einige Beispiele für solche Puffer sind oben schon genannt) auf einen Titer von etwa 20 µg HB_sAg/ml verdünnt. Die verdünnten, vereinigten Fraktionen werden keimfrei filtriert. Wenn gewünscht, wird das filtrierte Gut mit Formaldehyd auf eine Viren inaktivierende Konzentration, z. B. etwa 50 bis 200 µg/ml, versetzt. Die Mischung wird dann etwa 50 bis 100 h bei etwa 30 bis 38°C inkubiert. Zur im wesentlichen Neutralisation des zugesetzten Formaldehyds gibt man eine keimfreie Lösung eines physiologisch akzeptablen Neutralisationsmittels, z. B. NaHSO₃, hinzu. Das anfallende Material wird keimfrei in Glasfläschchen oder -ampullen abgefüllt und für den Einsatz aufbewahrt.

Das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen gemäß der Erfindung ist ein hochgereinigtes, reproduzierbares Produkt und kennzeichnet sich durch einen Teilchendurchmesser von etwa 18 bis 22 nm, ein E von typischerweise etwa 52 bis 54 und ein UV-Spektrum wie in der Zeichnung gezeigt.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Der Rotor einer Zentrifuge (Bauart Electronucleonics-K) wurde mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nachdem der Rotor zur Entgasung des Systems auf 10 000 U/min hochgefahren war, wurde in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen folgender Stufengradient eingeführt:

1. 2400 ml 10%ige NaBr, p = 1,08
2. 1000 ml 20%ige NaBr, ρ = 1,17
3. 1500 ml 30%ige NaBr, ρ = 1,28
4. 3500 ml 40%ige NaBr, ρ = 1,41

Unter Verdrängung von 1750 ml der 40%igen NaBr vom Rotorboden wurden in den Kopf des stehenden Bodens 1750 ml Plasma eingepumpt, welches das Australia-Antigen enthielt. Der Rotor wurde auf 30 000 U/min hochgefahren und 4 h mit dieser Geschwindigkeit laufen gelassen. Dann wurde der Rotor stillgesetzt und in den Boden des Rotors 40%ige NaBr in einer Menge von 1750 ml eingepumpt, wobei das Plasma am Rotorkopf herausgedrückt wurde. In den Rotorkopf wurden nun weitere 1750 ml frisches, Australia- Antigen enthaltendes Plasma unter Verdrängung eines gleichen Volumens an 40%iger NaBr aus dem Rotorboden eingepumpt. Der Rotor wurde dann 18 h mit 30 000 U/min laufen gelassen. Nach Stillsetzung des Rotors wurde das an HB_sAg reiche Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 (1000 ml) gesammelt und gegen Phosphatpuffer dialysiert. Der Rotor wurde hierauf mit Phosphatpuffer gefüllt und dieser wie oben entgast, worauf in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen der folgende Stufengradient eingeführt wurde:

1. 2400 ml 5%ige Rohrzuckerlösung, ρ = 1,02
2. 1750 ml 15%ige Rohrzuckerlösung, ρ = 1,06
3. 1750 ml 25%ige Rohrzuckerlösung, ρ = 1,10
4. 2500 ml 50%ige Rohrzuckerlösung, ρ = 1,23

Unter Verdrängung von 1000 ml der 50%igen Rohrzuckerlösung aus dem Rotorboden wurde in den Rotorkopf das bei der NaBr-Isopycnic- Banding-Stufe erhaltene, an HB_sAg reiche Material (1000 ml) eingepumpt. Der Rotor wurde dann 18 h bei 28 000 U/min laufen gelassen. Nach Stillsetzen des Rotors wurde das an HB_sAg reiche Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 (1000 ml) gesammelt. Dieses Produkt wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel unter Anfall von 56 l Material auf einen Proteingehalt von 40 µg/ml verdünnt. Durch Einrühren von 1 n Salzsäure wurde der 56-l-Ansatz des durch die Zonenzentrifugiertechnik partiell gereinigten Hepatitis- B-Antigens (HB_sAg) von 40 µg/ml bei Raumtemperatur auf pH 2 angesäuert. Zu dem Gut wurden 56 ml einer Lösung von kristallinem Pepsin in destilliertem Wasser (1 mg/ml) zugesetzt. Die Pepsin-Endkonzentration betrug 1 µg/ml. Der HB_sAg-Ansatz wurde 16 h bei 37°C inkubiert und durch Zusatz von 1 n Natronlauge auf pH 7 neutralisiert.

Durch Ultrafiltration (mit einer Vorrichtung der Bauart Amicon, die mit einer Membran XM100a versehen war) wurde der pepsinaufgeschlossene Ansatz auf das 295fache konzentriert. Dabei tritt pepsinabgebautes Nichtantigen-Protein durch die Membran in das Ultrafiltrat über, während HB_sAg-Partikel zurückgehalten werden.

Durch Zusatz von festem Harnstoff zu dem Konzentrat wurde eine 4- bis 8molare Harnstofflösung gebildet, die dann weiter 16 h bei 37°C inkubiert wurde. Das harnstoffbehandelte HB_sAg- Konzentrat wurde durch Filtrieren durch ein Glasfaser-Filter geklärt und auf Sephadex G-150 chromatographiert. Das Antigen wurde beim Hohlraum-Volumen eluiert und war von Harnstoff, Pepsin und anderen Proteinverunreinigungen frei. Die gereinigtes HB_sAg enthaltende Fraktion wurde auf Gebrauchskonzentration verdünnt und keimfrei filtriert. Zur weiteren Absicherung gegen die Möglichkeit des Vorliegens infektiöser Viren wurde Formalin auf eine Konzentration von 90 bis 100 µg/ml 72 h bei 36°C zugesetzt. Am Ende der Formalinbehandlung wurde überschüssiger Formaldehyd mit Natriumbisulfit neutralisiert. E₁% des gereinigten Produkts betrug 52,3 im Vergleich mit 23,8 bei dem Zonenzentrifuge-Ausgangsmaterial. Das gereinigte Produkt bestand aus kugelförmigen Partikeln mit einem Durchmesser von 18 bis 22 nm und einem UV-Spektrum entsprechend Fig. 1.

Eine Zusammenfassung von Reinigungs- und biologischen und physikalischen Eigenschaften gibt die folgende Tabelle. In der Tabelle bedeutet OD die optische Dichte oder Absorbanz, KB die Komplementbindung und RIA den Radioimmunoassay.

Beispiel 2

Bei subkutaner Injektion mit einer Einzeldosis (1,0 ml) mit einem Gehalt von 20 µg an dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen gemäß der Erfindung zeigt bei einer Gruppe von 6 Schimpansen 4 der Tiere Antikörper-Bildung. Nach zwei zusätzlichen, in 4-Wochen-Abständen gegebenen entsprechenden Dosen lag bei 5 der 6 Tiere Antikörper-Bildung vor.

Beispiel 3

16 Schimpansen wurden in drei Gruppen unterteilt. Die Schimpansen der Gruppe A (6 Tiere) wurden intravenös mit 1,0 ml BOB-Hepatitis-B-Virus geimpft und diejenigen der Gruppe B (4 Tiere) mit 1,0 ml des Hepatitis-B-Oberflächen-Antigens gemäß der Erfindung, während die Gruppe C (6 Schimpansen) als Kontrollgruppe diente, bei der nicht geimpft wurde. Alle Schimpansen von Gruppe A zeigten Anzeichen einer klinischen Hepatitis-B-Infektion (Antigenemia, d. h. Auftreten von Hepatitis- B-Oberflächenantigen im Plasma des Infizierten, Enzymerhöhungen und/oder Antikörper-Ansprechen) innerhalb von 40 Wochen. Während des gleichen Zeitraums von 40 Wochen zeigte keiner der Schimpansen der Gruppen B oder C Anzeichen für eine klinische Hepatitis-B-Infektion.

Beispiel 4

Drei Gruppen von Grünaffen (zu je 6 Tieren) erhielten subkutan in 4-Wochen-Abständen drei Injektionen mit 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen an dem Antigen gemäß der Erfindung enthielten. Die jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die vor der nächsten Injektion oder innerhalb von 4 Wochen nach der letzten Injektion Antikörper-Bildung zeigten, nennt die folgende Tabelle.

Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Impfungen bei einer Dosierung von 2 µg mehr als 50% der Tiere Antikörper-Bildung.

Beispiel 5

Drei Gruppen von Meerschweinchen (zu je 14 Tieren) erhielten subkutan zu Anfang und in Abständen von 14 und 56 Tagen Injektionen in Form von 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen an dem Antigen gemäß der Erfindung enthielten. Die folgende Tabelle nennt die bei jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die bei Prüfung bei 0, 28, 56 und 84 Tagen Antikörper-Bildung zeigten.

Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Impfungen bei einer Dosierung mit 0,5 µg mehr als 80% der Meerschweinchen Antikörper- Bildung.

Beispiel 6 (nachgereicht)

Im Rahmen einer klinischen Untersuchung (Hilleman et al., Proceedings of the European Symposium on Hepatitis B, Herausg. Saul Krugman et al., Merck Sharp & Dohme International, Rahway, N. Y., 1981) erhielten 80 gesunde Erwachsene jeweils 3 Injektionen von gemäß Beispiel 1 erhaltenem Hepatitis-B- Oberflächenantigen. Die Einzeldosen betrugen jeweils 10, 20 oder 40 µg. In Fig. 2 sind die Serumsumwandlungsgeschwindigkeiten und in Fig. 3 die Antikörperreaktionen für diesen Versuch angegeben. Es zeigt sich, daß nach der zweiten Impfung bei 75-85% der Personen und nach der dritten Impfung bei über 90% Antikörper vorhanden sind. Wie Fig. 3 zeigt, läßt sich der nach 2 Impfungen erzielte hohe Antikörpertiter durch die dritte Impfung nochmals erheblich steigern.

Claims

1. Gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen mit einem Partikeldurchmesser von 18 bis 22 nm und einem E von 52 bis 54 aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat, erhältlich, indem man das Konzentrat mit Pepsin in einer zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer 4- bis 8- molaren Konzentration behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt und gegebenenfalls Formaldehyd in einer zur Vireninaktivierung wirksamen Konzentration zugibt.

2. Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Oberflächenantigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß man das Konzentrat mit Pepsin in einer zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer 4- bis 8- molaren Konzentration behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Konzentrats mit HCl auf 2 einstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pepsin auf eine Konzentration von 1 µg/ml pro 40 bis 500 µg/ml Protein hinzugibt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Entfernung von Pepsin, Pepsinabbauprodukten und Harnstoff Formaldehyd hinzugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Formaldehyd auf eine Konzentration von 50 bis 200 µg/ml hinzugibt.

7. Impfstoff, enthaltend als Wirkstoff das gereinigte Hepatitis- B-Oberflächenantigen gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.