DE2445819A1 - Verfahren zur herstellung stabiler, gegen seruminhibitoren resistenter h tief 3 n tief 2 -influenzavirusstaemme und diese virusstaemme enthaltende vakzinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung stabiler, gegen seruminhibitoren resistenter h tief 3 n tief 2 -influenzavirusstaemme und diese virusstaemme enthaltende vakzinen

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DE2445819A1 DE19742445819 DE2445819A DE2445819A1 DE 2445819 A1 DE2445819 A1 DE 2445819A1 DE 19742445819 DE19742445819 DE 19742445819 DE 2445819 A DE2445819 A DE 2445819A DE 2445819 A1 DE2445819 A1 DE 2445819A1
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Description

RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUT!QUES R.I.T. Genval, Belgien
" Verfahren zur Herstellung stabiler, gegen Seruminhibitoren resistenter H-z^-Influenzavirusstämme und diese Virus stamme enthaltende Vakzinen "
Priorität: 27. September 1973, V.St.A., Nr. 401 335
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilen, gegen Serurainhibitoren vollkommen resistent'en H^Np-Influenzavirus stammen. Ferner betrifft die Erfindung Influenza-Lebendvirusvakzinen, die diese Virusstämme enthalten.
Es wurde festgestellt, daß ein Zusammenhang zwischen der Abwehr' von viralen Infektionen der Atmungsorgane und einer lokalen Immunität in den Schleimhäuten der Atmungsorgane besteht; vgl. Rossen et al., Progr. Med. Virol., Bd. 13 (1971), S. 194. In den letzten Jahren wurden verschiedene Versuche unternommen, Immunität gegen Influenza durch intranasale Verabreichung von inaktivierten Vakzinen zu erreichen; vgl. beispielsweise Waldman et al., Nature, Bd. 218 (I968), S. 594; J. Immunol., LBd. 207 (1969), S. 520 und VHO Bull., Bd. 41 (I969), S. 543. _j
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·· 2 —
Dabei wurden jedoch widersprüchliche Ergebnisse erhalten. Dies ist vermutlich auf eine unzureichende Stimulierung des Imraunsystems durch das inaktivierte Antigen zurückzuführen; vgl. Tyrrell et al., J. Hyg., Bd. 68 (1970), S. 359.
Ferner sind Influenza-Lebendvakzinen bekannt, die jedoch einen unterschiedlichen Schutz bieten. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, z.B. durch Serienpassagen an Eiern, die pathogene Wirkung dieses Virus zu vermindern. Derartige Influenzavakzinen v/erden in der Sowjetunion seit mehreren Jahren verwendet und bieten einen guten Schutz bei Influenzaepidemien; vgl. Smorodintsev et al., WHO Bull., Bd. 41 (I969), S. 585. Aus klinischen Versuchen, die mit von Patienten isolierten Viren in der Hoffnung, daß sich einige dieser Viren als nicht pathogen erweisen würden, durchgeführt wurden, wurde geschlossen, daß gegen Pferdeseruminhibitoren resistente Viren weniger Reaktionen hervorrufen als solche, die gegen pferdeseruminhibitoren empfindlich sind; vgl. A.A. Smorodintsev, G.A. Alexandrova, O.M. Chalkina und A.A. Selivanov, Applied Virology (1965): 1st Annual Symposium, Boca Raton, Florida, 1964, Herausgeber M. Saunders und E.H. Lennete, S. 142, Sheboygan, Wisconsin, Ellis.
Es wird jedoch zugegeben, daß zur Verminderung der Nebenreaktionen nach Verabreichung einer Influenza-Lebendvirusvakzine eine vollständige Inhibitorresistenz erreicht werden muß, da bei weiterem Auftreten von inhibitorempfindlichen Teilchen - selbst in kleinen Mengen - ein Virus für die Anwendung beim Menschen zu pathogen sein kann. Es wurden verschiedene Versuche ge-
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macht, gegen Pferdeseruminhibitoren vollkommen resistente Influenzavirusstamme zu isolieren. Die bisher beschriebenen Verfahren zu einer Verbesserung der inhibitofresistenz von Influenzaviren bestehen im wesentlichen darin, Sefienpassagen mit Inflüenzavirusstammen in Eiern in Gegenwart von Serum durchzuführen.
Allantoispassagen Von Gemischen aus Influenzaviren und Pferdeserum in bestimmter Zusammensetzung ergäben eine vollständige Pferdeserumresistenz beim Influenzavirusstamm A2/Tokyö/3/67 (HpNp), während die Ergebnisse beim Virusstamm A2 Hong-Kong (H3N2)/i/68 nicht schlüsälg waren; Vgl« A4S. Beare, M*L. Bynoe und D.A.J. Tyrrell, British Medical Journal, Bd. 4 (1968), S. 482.
Ferner ist es bekannt, daß Allantoispassagen von Geraischen aus dem Influenzavirus A^ Hong-Kong (H-J^)/i/68 und Meerschweinchenserum in bestimmten Zusammensetzungen vor der 17. Passage nicht zu positiven Ergebnissen führen; vgl. D. Ikic, N. Pasini, N. Rajner, B. Jancikic, M. Juzbasic und M. Hecimovic, Proc. Symposium on Acute Respiratory DiseaseSj I969,· Jugoslawische Akademie der Wissenschaften und Künste, Zagreb.
Ferner wurde gezeigt, daß es möglich ist, die Inhibitorresistenz mit einer begrenzten Anzahl von Passagen vollkommen zu machen, wenn nacheinander Pferdeserum und Meerschweirichenserum bei den Passagen verwendet wird, d.h., daß es möglich ist, stabile und immunogene, gegen Seruminhibitoren vollkommen resistente A? Hang-Kong (H^W2)-Influenzavirusstämme zu erhalten, wenn man einen
50981 5/125t
— H τ·
A2 Hong-Kong (HJN2)-Influenzavirusstamm Serienpassagen in der Allantois von Eiern in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Meerschweinchenserura unterwirft, nachdem vorher Serienpassagen in der Allantois von Eiern in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Pferdeserum durchgeführt worden sind.
Es sind H^Np-Influenzavirusrekombinantenstämme bekannt, die sich durch Rekombination von HJNfp-Influenzaviren und dem A/PRö-Influenzavirus erhalten lassen. Es ist möglich, daraus Rekombinantenklonen mit hoher V/achstumskapazität auszuwählen^ E.D. Kilbourne, Bull. WHO., Bd. 41 (1969) Seiten 643 bis 645. Einige aus solchen Rekombinationen isolierte Virusklonen erwiesen sich gegenüber dem Menschen als abgeschwächt. Es stehen jedoch weder in vitro- noch in vivo-Marker zur Verfügung, die der Abschwächung entsprechen. Die abgeschwächten Eigenschaften der verschiedenen Virusklonen müssen durch Infektion von Menschen getestet werden; vgl. A.S. Beare und T.S. Hall, Lancet 1971 II, Seiten 1271 bis 1273.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, Influenza-Lebendvakzinen zur Verfugung zu stellen, die einen stabilen in vitro-Marker aufweisen und bei denen zur Auswahl der ausreichend abgeschwächten Virusklone kein Testverfahren am Menschen notwendig ist.
Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß sich stabile, gegen Seruminhibitoren vollkommen resistente und zur Verwendung in intranasal zu verabfolgenden Vakzinen wertvolle H^N2-Influenzavirusstämme erhalten lassen, indem man einen
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durch Rekombination eines HU^-Influenzavirus und eines A/PRg-Influenzavirus erhaltenen Influenzavirusrekombinantenstamm einer Passage in der Allantois von embryonierten Eiern in Gegenwart von Serum unterwirft. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise Hühnereier und Meerschweinchenserum verwendet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein H,N2-Influenzavirusrekombinantenstamra, der aufgrund seines starken Y/achstu'ms ausgewählt worden ist, gegen Seruminhibitoren resistent gemacht. Das so erhaltene modifizierte Influenzavirus, der die antigene Zusammensetzung von H^N2 hat, weist das ursprüngliche starke Wachstum auf. Demgemäß gelingt es.nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Influenza-Lebendvakzine herzustellen, für die zur Auswahl der ausreichend abgeschv/ächten Virusklone kein Test am Menschen notwendig ist und die einen stabilen in vitro-Marker besitzt. Diese Vakzine wird, wie bereits erwähnt, nach lediglich ein oder zwei Passagen des ausgewählten H^N2-Rekombinanteninfluenzavirus in der Allantois von embryonierten Eiern in Gegenwart von Seruminhibitoren erhalten. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von stabilen, gegen Seruminhibitoren vollkommen resistenten Η,Νρ-Influenzavirus-
einen stammen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man / aus einem HjN2-Influenzavirusstamm und dem A/PRg-Influenzavirusstamm erhaltenen Rekombinantenstamm mindestens·einer Passage in der Allantois von embryonierten Eiern in Gegenwart von Serum unterwirft, wobei die Züchtungen bei verschiedenen VirusVerdünnungen
_-j _y physiologischer
von 10" bis 10"' in / Kochsalzlösung und bei verschiedenen
physiologischer Serumverdünnungen von 1 : 4 bis 1 : 1000 in Kochsalzlösung
werden
durchgeführt / und die erhaltenen, gegen.Seruminhibitoren ,
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24A5819 π
resistenten Stämme isoliert. Vorzugsweise werden solche Stämme isoliert, die bei den höchsten Serumkonzentrationen und bei den niedrigsten Viruskonzentrationen erhalten werden.
Als H^N2-Influenzavirusstamm wird vorzugsweise der A/England/ 42/72-Stamm und als A/PRo-Influenzavirusstamm der Mount Sinai A/PRg/34-Stamm verwendet. Als Beispiel für einen Rekornbinantenstamm wurde der MRC-2-Klon bei der ATCC unter der Nummer VR 777 hinterlegt. Ein erfindungsgemäß erhaltener, gegen Serum« inhibitoren vollkommen resistenter H^^-Influenzavirusstamm wird als "Alice"-Stamm bezeichnet. Eine Probe dieses Stamms wurde bei der ATCC unter der Nummer VR 776 hinterlegt.
Sowohl der Rekombinantenstamm als auch der isolierte resistente Stamm können geklont oder mehreren Verdünnungspassagen unterworfen v/erden, ohne daß der Erfindungsbereich verlassen wird.
Der Alice-Virusstamm wird aus dem MRC-2-Klon erhalten, der fünf Grenzverdünnungspassagen und anschließend einer Passage bei einer Konzentration von 10 in Gegenwart einer 1 : 16-Verdün~
physiologischer nung von Meerschweinchenserum in / Kochsalzlösung und einer
-7 Passage bei einer Konzentration von 10 in Gegenwart einer
physiologischer
•1 : 4-Verdünnung von Meerschweinchenserum in / Kochsalzlösung und weiteren drei Grenzverdünnungspassagen in Abwesenheit von Serum und einer zusätzlichen Passage in Abwesenheit von
kultur Serum zur Bildung einer Anzucht/ unterworfen worden ist.
diese Kultur entspricht der 12. Passage des MRC-2-Klons, wobei der ab der 7. Passage verwendete Stamm gegen Seruminhibitoren resistent ist.
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Die auf diese Weise erhaltenen, gegen Seruminhibitoren vollkommen resistenten Virusstämme sind nicht-pathogen und immunogen. Sie sind wertvoll zur Herstellung von Influenzavirus-Lebendvakzinen, wobei man sich bekannter Verfahren zur Herstel lung und/oder Stabilisierung von Influenza-Lebendvakzinen bedient. Die Erfindung betrifft demgemäß auch die abgeschwächten Influenzavirusvakzinen, die zumindest einen gegen Seruminhibitoron resictenten Viraasstamm enthalten. Schließlich betrifft die Erfindung auch die Herstellung dieser Vakzinen aus diesen Stammenο
Erfindungsgemäß wird eine abgeschwächte Influenzavirusvakzine dadurch hergestellt, daß man einen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten H-J^-Influenzävirusstamm, der gegen Seruminhibitoren reslstent ist, in der Allantols von embryonierten Hühnereiern solange inkubiert, bis sich der Virus in ausreichender Menge vermehrt hat, das erhaltene Virusmaterial erntet und gegebenenfalls gefriertrocknet.
Die so erhaltenen abgeschwächten Influenzavirusvakzinen werden lokal in die Nasenhöhle verabfolgt.
Vorzugsweise wird der Virus in gefriergetrockneter Form aufbeval-j-t, Zur Rekonstituiion der Vakzinen werden dann zum Verwendung f.Zeitpunkt V/asser oder andere pharmakologisch verträgliche Verdünnungsmittel und/oder Zusatzstoffe zugegeben, wobei nasal anzuwendende Präparate, wie Tropfen oder Sprühmittel, erhalten werden. ·
L- ■'
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2U5819
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Verfahren
Eine Probe eines MRC-2-Klons, die fünf Grenzverdünnungspassagen unterworfen worden ist, und gegen normale Seruminhibitoren stark empfindlich ist, wird als Ausgangsvirusmaterial verwen-
-1 -7) -5 det. Verschiedene Verdünnungen, d.h. 10 , 10 , 10 und
_ry physiologischer
10 , dieses Virusraaterials in / Kochsalzlösung werden mit verschiedenen Verdünnungen, d.h. 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 40,
1 : 200 und 1 : 4000 von sterilem, normalen Meerschweinchenphysiologischer
serum in / Kochsalzlösung vermischt. Vom Serum wurde vorher eine 1 ϊ 4-Verdünnung hergestellt, die 15 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erwärmt, sodann verdünnt, homogenisiert und schlief31ich 30 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert wurde. Der dabei erhaltene Überstand wird zur weiteren Versuchsdurchführung verwendet, wobei die Virus/Serum-Gemische 1 Stunde bei 370C inkubiert und anschließend jeweils 0,2 ml dieser Gemische in die Allantois von embryonierten Hühnereiern überimpft werden. Die Hühnereier wurden vorher 9 bis 10 Tage bei 37 C inkubiert und durchleuchtet (nur die lebensfähigen Eier werden beimpft).
Anschließend werden die Eier weitere 24 bis 96 Stunden inkubiert. Am Ende dieser Inkubationszeit werden die Eier durchleuchtet . Die lebensfähigen Eier werden auf 4°C gekühlt. Die Allantoisflüssigkeit der lebensfähigen Eier wird getrennt gewonnen und mit Hilfe des Hämagglutinationstests auf die Anwesenheit von Influenzavirus untersucht. Das geerntete
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Virus, das durch das Inoculum mit der höchsten Virusverdünnung in Gegenwart der höchsten Serumkonzentration gebildet wird und das Ilämagglutinierungsaktivität aufweist (d.h. Virusverdünnung 10"*^ und Serumverdünnung 1 : 16) wird für eine zweite Passage, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wird, verwendet. Das geerntete Virus, das durch das Inoculum mit der höchsten Virusverdünnung (d.h. 10""') in Gegenwart der höchsten Serumkonzentration (d.h. 1 : 4) gebildet wird, zeigt Ilämagglutinierungsaktivität und ist gegenüber normalen Seruminhibitoren vollkommen resistent, wie 'aus Tabelle I hervorgeht. In Abwesenheit, von Serum werden drei weitere Passagen bei Grenzverdünnungen durchgeführt, um die erhaltene resistente Mutante zu klonen und, die Stabilität der Resistenzeigenschaften zu prüfen. Wie aus Tabelle I hervorgeht^"ist das bei jeder Passage geerntete Virus vollkommen resistent gegenüber den Inhibitoren von Normalserum. Das nach der letzten Passage erhaltene Virus wird als Inoculum zur Herstellung der Anzuchtkultur des Alice-Stammes verwendet. Die geernteten Allantoisflüssigkeiten werden gesammelt und vereinigt, auf Sterilität und Sicherheit überprüft und mit Pepton bis zu einer Endkonzentration von 5 Prozent vermischt. Jeweils 0,5 ml der erhaltenen Virussuspension werden in 3 ml fassende Ampullen eingefüllt und anschließend gefriergetrocknet.
In vitro- und in vivo-Eigenschaften des modifizierten Virus 1) Inhibitorresistenz
Zur Untersuchung der Resistenz gegenüber in normalem, erhitztem, tierischem Serum (Pferde-, Meerschweinchen- und Kälberseren, die vorher 1 Stunde auf 750C erhitzt wurden) werden Serien-Zwei-
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fachverdünnungen des erhitzten Serums mit vier Hämagglutinierungseinheiten des AusgangsStamms bzw. des modifizierten Virus vermischt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur v/erden Hühnererythtocyten zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Ausgangs stamme modifizierte /Jj λ» Viren cd ίί cd Θ
A2/Eng/ I .•μ hos
•Η Φ 3		 ä ö -P "^ cd
Serum 42/72 MRC-2 Φ hOS
-P Φ ρ*		 OÜ h -μ ho a
■μ φ 3		 co -μ CO -PfQ
W O M £ Φ •Η CiJ μ I ^ CO
U Φ N (4 CO U ^ Φ Φ O Φ Γί I ίι
Q) pj CO •Η ti κ co ο 2 O-P • Φ ρ<
•Η •Η ' ■Η N •Η rH O -Ι-5
U Ö Φ O) O U β H ^ •Η H
Φ φ O -d hfl> Φ Φ O <% ιΗ ί3
ti bO}> cd XJ W) f> (20 (20 <ίΜ
cd Λ ω -μ cd: ■-. (20 (20 «(20
Λ ω -P- ü W J-i .£J ω-μ
ϋ to U 		(20 (20 (20
ÜKIIh cd cJ cd cd cd cd <20
cd cd cd <20 <20
Pferd >1O 000 >10 000 <20 <20 <20
Meer
schwein		 )1O 000 >10 000 <20 (20 (20
chen
Kalb		 1 000 1 000 <20
Die Ergebnisse zeigen für die Anzuchtkultur und die beiden daraus hergestellten Versuchskulturen eine vollkommene Resistenz.
2) Stabilität der Inhibitor-Resistenzeipenschaften Die Resistenzeigenschaften des Alice-Stammes werden an Eiern und an Labortieren (Frettchen) untersucht. Nach fünf weiteren Passagen des Alice-Stamrnes in embryonierten Hühnereiern werden keine Veränderungen der Resistenzeigenschaften festge-, stellt. Das 3 Tage nach intranasaler Inoculation ( 10
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aus Frettchen isolierte Virus ist gegen Seruminhibitoren vollkommen resistent.
3) Antigenität und Abwesenheit von Nebenwirkungen
Einer ersten Gruppe von vier Frettchen wird der Alice-Stamm in
•7 ·
einer Menge von 10' EID™ intranasal verabfolgt. Die Temperatur der Testtiere wird während 5 Tagen täglich p.i. festgestellt. Es ergibt sich kein signifikanter Temperaturanstieg (Maximaltemperatur 39,8°C). Einer zweiten Gruppe von zwei Frettchen wird der A2/Eng/4272-Ausgangsstamm in einer Menge-von 10' EID™ intranasal verabfolgt. 2 Tage nach der Inoculation steigt die Temperatur der beiden Testtiere auf 40,8 bzw. 41,20C. Einer dritten Gruppe von zwei Frettchen wird ein im Jahre 1972 in
/in- einer Menge von Io' K
Australien isolierter Stamm (Ap/Victoria/iOI/^^auf intranasalem Wege verabfolgt. Beide Frettchen zeigen am zweiten Tag nach der Verabfolgung eine positive Reaktion (Temperatur höher als 40,50C). Die Hämagglutinations-Hemmungsversuche zeigen, daß die Inhibitorresistenz die Antigenität des Virus bei Frettchen nicht verändert. 1.4 Tage nach der intranasalen Verabfolgung ist der Serum-Antikörpertiter der inoculierten Tiere (Titer 1/1024) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Titer >1/8) sehr hoch.
Beispiel 2
Eine Anzuchtkultur des gemäß Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Virusmaterials, d.h. der Alice-Stamm, wird zur Vakzineherstellung im Großmaßstab verwendet. Dazu wird eine weitere Passage in der Allantoisflüssigkeit einer weiteren Reihe von embryonierten Hühnereiern durchgeführt, die dazu 3 Tage bei 36 C inkubiert werden,
509815/1257.
Die Allantoisflüssigkeiten werden gewonnen, vereinigt, auf ihre Sterilität und Sicherheit untersucht, bis zu einer Endkonzentration von 5 Prozent mit Pepton vermischt und in 3 ml fassende Glasampullen abgefüllt, wobei Dosiseinheiten des Virus in einer Menge von mindestens 10 EIDc0 hergestellt v/erden. Das
Produkt wird anschließend gefriergetrocknet und die Ampullen werden schließlich verschlossen oder fest verstöpselt.
Das so erhaltene Virusmaterial wird zur Vakzineherstellung verwendet. Zur Verabreichung als Vakzine wird der Inhalt einer Ampulle durch Zusatz von 0,5 ml Yfasser, Salzlösung oder einer 5prozentigen Saccharoselösung rekonstituiert und in die Nasenlöcher getropft.
. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Allantoisflüssigkeit-Peptonpräparat in größere Ampullen abzufüllen, wodurch Mehrfachdosen der Vakzine erhalten werden.
Beispiel 3
Vakzination mit der abgeschwächten Influenzavakzine; Alice-Stamm
Materialien und Verfahren
Zehn Personen im Alter von 18 bis 44 Jahren (Eurchschnittsalter 28 Jahre) mit einem H.I.-Antikörpertiter von ^ 32 werden als Versuchspersonen ausgewählt. Diesen Personen werden in einem Abstand von 14 Tagen zweimal zum entsprechenden Zeitpunkt rekonstituierte Vakzinen des Alice-Stammes verabfolgt. Bei den Verabfolgungen erhalten alle Personen jeweils 5 Tropfen pro Nasenloch der gemäß Beispiel 2 hergestellten Vakzine. 14 Tage
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nach der ersten Verabfolgung, d.h. am Tag der zweiten Verabfolgung, werden den Versuchspersonen Nasenflüssigkeits- und Blutproben zur Antikörperbestimmung (A/England 42/72-Stamm) entnommen. Ebenso wird 3 bis 4 Wochen nach der zweiten Verabfolgung verfahren.
Ergebnisse
I. Klinische Ergebnisse
An den der Verabfolgung folgenden 5 Tagen wird die Temperatur festgestellt. Wie aus Tabelle II hervorgeht, zeigt nur die Versuchsperson Nr. 3' am ersten Tag einen leichten Temperaturanstieg auf 37,20C. Sieben Versuchspersonen zeigen geringfügige- klinische Befunde: sechs von ihnen zeigen 1 bis 2 Tage lang eine seröse Rhinitis oder Nasenverstopfung, während eine Versuchsperson an leichten Kopfschmerzen mit Pharynx-Hypersecretion leidet.
II. Virusisolierung
Am zweiten Tag v/erden von acht Patienten (Nr. 3» 5» 6, 9, 12, 14, 22 und 27) Nasen- und Rachenabstriche gewonnen. Alle Proben erweisen sich nach zwei Blindpassagen an embryonierten Eiern als negativ.
III. Serologische Ergebnisse
a. Hämagfflutinations-Hemmung (H.I.)-Antikörpertiter 14 Tage nach der ersten Verabfolgung wird bei sechs von zehn Patienten eine Serokonversion festgestellt. Nach der zweiten Verabfolgung zeigen sieben von zehn Patienten die Serokonversion. . ,
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„14- 24Λ5819 -ι
b. Serumneutralisation (S.N.)-Antikörpertiter 14 Tage nach der ersten Verabfolgung wird bei sechs von zehn Versuchspersonen ein signifikanter Anstieg des Antikörpertiters festgestellt. Nach der zweiten Verabfolgung wird bei neun von zehn Personen dieser Anstieg beobachtet.
Bei Berücksichtigung der Η.Γ. und S.N.-Titer stellt man fest, daß von den zehn Versuchspersonen lediglich bei der Versuchsperson Nr. 6 keine Serokonversion nach zwei Verabfolgungen eingetreten ist.
IV. Lokale Antikörper
Die lokalen N-Antikörpertiter für alle zehn Personen sind in Tabelle III angegeben. Bei sieben von neun Personen läßt sich 14 Tage nach der ersten Verabreichung und bei acht von zehn Personen 21 bis 28 Tage nach der zweiten Verabreichung ein signifikanter Anstieg des Antikörpertiters feststellen.
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co cx>
Tabelle III Seruisantikörper und klinische Befunde
■Ρ
1-1		 H.I-Antikörper 14 Tage
isch der
srsten
ITerab-
Colgung		 5-4 Wo
chen nacl·
ier zwei-
ben Ve r-
ibfolgung		 S-N--Antikörper 14 Tage
ns. ch del
ersten
Verab-
folguni		 3-4 Wo
chen
nach der
zv-eiten
Yerab-
τ ο ι ρ*] 2T\ o*		 Tempera klinische Symptome έ
Person.
: Nr." '		 Ge s chi eel /or der
7erab-
folgung·		 64 64 vor der
Verab-
fοIgung		 256- 256 turan
stieg		 geringfügige Nasenver
stopfung am Tag 1 und 2
3 W 16 <8 16 16 32 128 37,2° C
am 1.Tag		 -
5 . M <8 32 32 32 Ϊ6 32 kein An- leichte Kopfschmerzen
am Tag O (abends)
leichte Pharynx-Hyper-
sekretion
6 W 16 ' 8 16 - 16 16 64 sxieg
Il		 —
9 1W 8 16 16 16 16 32 Il ' '- O
12 M 8 32 ■ 64 8 64 64 It Rhinitis - Tag 4 und 5 >>
>».
14 M 8 128 128 <8 >512 >512 Il Rhinitis - Tag 1,2 u.3 η
D
22 M 32 128 128 32 256 256 I» Rhinitis - Tag 2 und 3 f
23 M 16 ■ 128 128 16. 256 256 Il Rhinitis - Tag O abends
26 M 16 32 "32 16 64 64 Il Rhinitis - Tag 2 \
•
27 M 8 16 II-
Tabelle III
lokale N-Antikörper
Person Nasenflüssiftkeit 14 Tage nach
der ersten
Verabfolgunp;		 (x)
Nr. vor der
Verabfolgung		 16 3-4 Wochen nach
der zv/ ei ten
VerabfolRunp;
3 <2 2 - 32
5 <2 4 4
6 <2 16 4
9 <2 < 2 n<2
12 <2 16 2
14 <2 16 16
22 <2 NT 5· 64
23 <2 64 8
26 <2 8 128
27 <2 4
(x) Nasenflüssigkeit nach Standardisierung für Immunoglobulin A (IgA) = etwa 200 jig/ml.
5 0 9 815/1257

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    @ Verfahren zur Herstellung von stabilen, gegen Seruminhibitoren vollkommen resistenten HJ^-Influenzavirusstammen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen aus einem EU^-Influenzavirusstamm und dem A/PRg-Influenzavirusstamm erhaltenen Rekombinantenstamm mindestens einer Passage in der Alüantois von embryonierten Eiern in Gegenwart von Serum unterwirft, wobei die Züchtungen bei verschiedenen Virusver-
    _y, η physiologischer dünnungen von 10" bis 10" in / Kochsalzlösung und bei
    verschiedenen Serumverdünnungen von 1 : 4 bis 1 : 1000 physiologischer
    /Kochsalzlösung durchgeführt werden, und die erhaltenen, gegen
    Seruminhibitoren resistenten Stämme isoliert.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man embryonierte Hühnereier verwendet.
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Meerschweinchenserum verwendet.
    h. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm A/England/42/72 als H,N2-Influenzavirusstamm verwendet.
    5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Mount Sinai A/PRq/34 als A/PRQ-Influenzastamm verwendet.
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    6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm MRC-2 als Rekombinantenstamm verwendet.
    7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man einen in Gegenwart der höchsten Serurnkonzentration und der geringsten Viruskonzentration erhaltenen Stamm isoliert.
    8. Verfahren zur Herstellung von abgeschwächten Influenzavirusvakzinen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gemäß Anspruch 1 bis 7 erhaltenen, gegen Seruminhibitoren resiistenten H7Np-Influenzavirusstamm in der Allantois von embryonierten Eiern solange inkubiert, bi s der Virus in ausreichende!" Menge gewachsen ist, das erhaltene Virusmaterial erntet und gegebenenfalls gefriertrocknet.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man embryonierte Hühnereier verwendet.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als gegen Seruminhibitoren resistenten H^I^-Influenzavirusstamm den Alice-Stamm verwendet.
    Ί1. Abgeschwächte Influenzavirusvakzine, enthaltend mindestens einen gemäß· Anspruch 1 bis 10 hergestellten, gegen Seruminhibitoren resistenten H^Np-Influenzavirurjstamm und übliche Verdünnungsmittel und/oder Zusatzstoffe.
    J 5098 15/1257
    12. Influenzavirusvakzine nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie als resistenten H^^-Influenzavirusstamm den Alice-Stamm enthält.
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