DK145347B - Fremgangsmaade til rensning af hepatitis b antigen - Google Patents
Fremgangsmaade til rensning af hepatitis b antigen Download PDFInfo
- Publication number
- DK145347B DK145347B DK190776AA DK190776A DK145347B DK 145347 B DK145347 B DK 145347B DK 190776A A DK190776A A DK 190776AA DK 190776 A DK190776 A DK 190776A DK 145347 B DK145347 B DK 145347B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- antigen
- hepatitis
- rotor
- pepsin
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 19
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 16
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 16
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 10
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 8
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710202015 Protein 1.6 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L potassium L-tartrate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000001472 potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229940111695 potassium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011005 potassium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940079827 sodium hydrogen sulfite Drugs 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 238000013316 zoning Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(19) DANMARK fen
da FREMLÆGGELSESSKRIFT od 1 i+5347 B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 19°T/76 (51) |nt.CI.3 C 07 G 7/00 (22) Indleveringsdag 28. apr. 1976 A 61 K 39/29 (24) Løbedag 28. apr. 1976 (41) Aim. tilgængelig 15· nov. 1976 (44) Fremlagt 1 · nov. 1982 (86) International ansøgning nr.
(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 14. maj 1975, 57748}, US
(71) Ansøger MERCK & CO. INC., Rahway, US.
(72) Opfinder Alexander Urszu Bert land, US: Alfred A. Tytell, US:
George Peter Lampson, US: Eugene Bernard Buynak, US.
(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.
(54) Fremgangsmåde til rensning af hepatitis B antigen.
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af hepatitis B antigen fra et delvist renset koncentrat, som er opnået ud fra et klaret plasma indeholdende hepatitis B antigen.
Hepatitis B er en af to typer viral hepatitis, som resulterer i en systemisk infektion, hvorved forekommer væsentlige patologiske £ forandringer i leveren. Denne sygdom angriber hovedsageligt voksne > og opnås hovedsageligt ved overføring af infektion fra latente ^ bærere af dette virus. Den sædvanlige måde, hvorpå smitte fin- D der sted, er ved blodtransfusion, forurenede nåle og sprøjter, 4· gennem huden, som er gennembrudt af revner eller skrammer, ved ikke-steriliserede dentale instrumenter samt ved spyt, venerisk Sj kontakt eller påvirkning af aerosoliseret inficeret blod.
145347
Inkubationsperioden på type B hepatitis er forholdsvis lang, idet der kan gå fra 6 uger til 6 måneder mellem infektion og udbrud af kliniske symptomer. Sygdommen begynder sædvanligvis med træthed og anorexia undertiden ledsaget af myalgia og abdominalt ubehag. Senere fremkommer gulsot, mørk urin, lys afføring og øm hepato-megalia. I nogle tilfælde kan udbruddet være hurtigt, idet der opstår tidlig gulsot i forbindelse med feber, kuldegysninger og leukocytosis. I andre tilfælde kan gulsot aldrig påvises, og patienten føler kun en influenzalignende sygdom. Man skønner, at hovedparten af hepatitis infektioner resulterer i en mild anicterisk sygdom.
Selv om sygdommen kvalitativt ligner viral hepatitis A, kan den let diagnostiseres ved forekomsten af australske antigen partikler, som er betegnet HB_Ag ( overflade antigen), i blodet eller andre kliniske prøver (spyt, urin, galde, afføring). I blodet på inficerede patienter findes en forholdsvis stor population (10^-10^ /ml) af sfæriske partikler. Partiklerne har en diameter på 18-22 nm og har samme antigene determinant som overfladen af den 42 nm Dane partikel, som kan være virus fra hepatitis B, nu betegnet HBV, se f.eks. Dane et al., The lancet, 1969, II, 983.
US patentskrift nr. 3 735 004 viser, at kogt infektiøst serum er blevet anvendt til vaccination af børn med resulterende dannelse af antistof for HBcAg (anti-HB ), og at sådant serum giver be-
b S
skyttelse over for angreb. Den anvendte dosis kogt serum svarede 12 til ca. 1 x 10 HBs~partikler. Patienter, som fik dette serum, udviklede ikke klinisk eller biokemisk sygdom. Dette serum er dog ikke velegnet som en vaccine, fordi det er urent, på grund af manglende reproducibilitet og mangel på kendskab til hepatitis B overflade antigen titeren.
Det er fra Chemical Abstracts, bind 79 (1973), 64320t kendt at isolere australsk antigen ved en procedure med fire trin: pepsin-hydrolyse, ultracentrifugering, gelfiltrering og immunoadsorption.
Det eneste, denne metode har til fælles med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er pepsinbehandlingen. Desuden går man ved den kendte fremgangsmåde ud fra ubehandlet plasma, mens man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen går ud fra klaret plasma. Tilstedeværelsen 3 145347 af lipoproteiner i uklaret serum bevirker en mindre effektiv pep-sinhydrolyse, mens det klarede serum er frit for lipoproteiner. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver et renere produkt, der kan anvendes i humane vacciner.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte. Ved denne fremgangsmåde underkastes delvis rensede koncentrater af klarede plasma indeholdende hepatitis B antigen følgende operationer: 1) Koncentratet behandles med pepsin ved en pH-værdi, hvor pepsinet er aktivt, 2) koncentratet behandles med urinstof, og 3) koncentratet behandles eventuelt med formaldehyd.
Det dannede produkt, som er højt renset, reproducerbart, karakteristisk hepatitis B antigen, befriet for fremmede uønskede proteiner og/eller antigener, er velegnet til anvendelse i en vaccine..
Det er ved fremgangsmåden særlig hensigtsmæssigt at indstille koncentratets pH på ca. 2 med saltsyre.
Ved anvendelse af pepsin i en mængde på 1 microgram/ml for hver 40-500 microgram protein opnås en nedbrydning af al protein.
Urinstof, ved pH-værdien ca. 7, i en koncentration på 4 M - 8 M dissocierer effektivt proteinet.
Uvedkommende virus inaktiveres ved tilsætning af formaldehyd, idet en koncentration heraf på 50-200 microgram/ml er hensigtsmæssig.
Det er ved fremgangsmåden særlig effektivt at fjerne pepsin, pep-sinnedbrydningsprodukter og urinstof ved filtrering og chromato-grafi.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende forklares nærmere under henvisning til tegningen, som er et ultraviolet 4 U5347 spektrum af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen rensede antigeri.
Råmaterialet er plasma fra bloddonorer, f~.eks. opnået ved plas-maphorese. Mængden af antigen kan måles på i og for sig kendt måde ved radioimmunprøve, passiv hemagglutination eller komplementfiksering. Plasma afkøles, og cryopræcipitatet, som dannes, fjernes ved let centrifugering. Det resterende klarede plasme indeholdende HBsAg koncentreres på ønsket måde, f.eks. ved isopyk-nisk opdeling, zoneopdeling eller udfældning, f.eks. ved hjælp af polyethylenglycol, ammoniumsulfat eller natriumsulfat. Dette delvist rensede koncentrat er udgangsmaterialet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Ved isopyknisk opdeling behandles det delvist rensede koncentrat med et flydende medium med en densitetgradient, der inkluderer tætheden af det krævede specifikke antigen. Det flydende medium underkastes ultracentrifugering til opnåelse af en ligevægtsfordeling af serumkomponenterne gennem densitetsgradienten, i overensstemmelse med deres individuelle densiteter. På hinanden følgende fraktioner af mediet udtages derefter, og sådanne fraktioner indeholdende det ønskede antigen isoleres. Anvendelsen af denne teknik til rensning af australsk antigen er beskrevet i tysk patentskrift nr. 2.049.515 og USA patenskrift nr. 3.636.191.
Ved zoneopdeling underkastes det delvis rensede koncentrat en ul-tracentrifugering i berøring med et flydende medium med en densitetsgradient, men denne gang anvendes en rate-zoneteknik, det vil sige med en rate eller hastighed i et tidsrum, således at ligevægt ikke opnås, idet HBgAg og andre resterende serumkomponenter fordeles gennem mediet i overensstemmelse med deres sedimentationskoefficienter i mediet.
Det flydende medium, som anvendes ved processen, kan have en vilkårlig densitetsgradient i det pågældende område. Egnede opløselige stoffer til sådanne opløsninger omfatter f.eks. saccharose, kaliumbromid, caesiumchlorid, natriumbromid, kaliumtartrat og lignende. Det isopykniske adskillelsestrin udføres hensigtsmæssigt 145347 5 i en centrifuge, f.eks. af typen Electronucleonics-K, ved at fylde den stationære rotor med saltopløsning og derefter i rækkefølge at fortrænge saltopløsningen opad med tilsvarende mængder af flydende mediumopløsning med stigende vægtfylde, indtil der er dannet en tringradient.
Plasmaet indføres foroven i rotoren, hvorved en del af opløsningen med højest vægtfylde fortrænges fra bunden. Centrifugen indstilles på en hastighed ved hjælp af et programmeret hastighedskontrolsystem, som forhindrer blanding af den oprindelige reorien-terede fase. Når ligevægt er opnået, og når produktet findes i den rigtige densitetsposition, sænkes hastigheden af rotoren ved hjælp af samme system for at forhindre blanding ved reorientation til den oprindelige konfiguration. Det gradierede materiale udtømmes derefter fra neden, og den pågældende densitetsfraktion opsamles. En tilsvarende metode anvendes ved rate-zoneadskillelse.
Den søgte densitetsfraktion fra denne adskillelse er det partielt rensede koncentrat af hepatitis B antigen.
Proteinkoncentrationen af det delvis rensede koncentrat indstilles derefter på ca. 40 til ca. 200 microgram pr. ml ved tilsætning af steril pyrogen-fri phosphatpufret saltopløsning (PBS). Opløsningen gøres derefter sur til en pH-værdi på 2 til 4, fortrinsvis med saltsyre ved ca. 25° C.
En opløsning af renset pepsin i vand, fortrinsvis fremstillet af krystallinsk pepsin, tilsættes, således at opløsningen indeholder ca. 1 microgram pepsin pr. 40 til 500 microgram protein. Opløsningen inkuberes, indtil omsætningen af fremmed protein ved hjælp af pepsinet er afsluttet, typisk fra 8 til 24 timer ved en temperatur på ca. 50° C til 58° 0, Opløsningen indstilles derefter til pH 7 ved tilsætning af en base, f.eks. natriumhydroxid. Det med pepsin omsatte materiale koncentreres ved ultrafiltrering ved ca. 5° C, og urinstof tilsættes (fortrinsvis højt renset krystallinsk urinstof), indtil slutkoncentrationen er effektiv til at dissociere proteinstoffet, typisk fra 4 M til 8 M. Blandingen inkuberes derefter ved forhøjet temperatur, typisk fra 30° C til 6 1A 5 3 A 7 38° C og i 16 til 24 timer til opnåelse af yderligere rensning.
Den inkuberede blanding klares derefter ved filtrering og chro- matograferes på en kolonne til fjernelse af urinstof, pepsin og rester fra pepsin-nedbrydningen. Kolonnen elueres med steril, pyrogenfri physiologisk acceptabel puffer, som er forligelig med kolonnen, f.eks. PBS, en blanding af natriumdihydrogenphosphat og dinatriumhydrogenphosphat eller 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propanol. Fraktioner bestemt til at indeholde HB_Ag ved kendte metoder, f.eks. radioimmun-prøve, komplementfiksering og ultraviolet spektrophotometri, opsamles og fortyndes til en koncentration på 20 mierogram HB Ag pr. ml med steril pyrogenfri physiologisk acceptabel puffer, hvorpå der er givet eksempler i det efterfølgende. De fortyndede opsamlede fraktioner filtreres sterilt. Til den filtrerede fraktion sættes eventuelt formaldehyd ved en koncentration som vides at inaktivere virus, f.eks. fra 50 til 200 microgram pr. ml. Blandingen inkuberes derefter ved temperaturer fra 30° C til 38° C og fra 50 til 100 timer. En steril opløsning af et fysiologisk acceptabelt neutraliseringsmiddel, f.eks. natriumhydrogensulfit, tilsættes for i det væsentlige at neutralisere formaldehydet. Materialet overføres aseptisk til glasampuller og opbevares til fremtidig anvendelse.
Det rensede hepatitis B overflade antigen, der fremkommer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er et højt renset reproducerbart produkt og er karakteriseret ved at have en partikeldiameter på 1¾ 18 til 22 nm, et E278nm’ ^er ligger mellem 52 og 54, og et ultraviolet spektrum, som er vist på tegningen.
Tegningen viser som nævnt et ultraviolet spektrum af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen rensede hepatitis B antigen.
Efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen.
EKSEMPEL 1
Rotoren i en centrifuge af typen Electronucleonics K fyldes med 8400 ml af phosphatpuffer. Efter at rotoren er kørt op til 10000 omdr./min. for at afgasse blandingen, indpumpes følgende tringradient i bunden af den stationære rotor: 7 145347 1. 2.400 ml 10% Mr, P = 1,08 2. 1.000 ml 20# Mr, P = 1,17 3. 1.500 ml 30# Mr, P = 1,28 4. 3.500 ml 40# Mr, P = 1,41 P er densiteten.
Plasma indeholdende australsk antigen, 1750 ml, pumpes ind i toppen af den stationære rotor, hvorved fortrænges 1750 ml 40% natriumbromid-opløsning fra rotorens bund. Rotoren accelereres til 30 000 o/min og løber ved denne hastighed i 4 timer. Rotoren stoppes derefter, og 1750 ml 40% natriumbromidopløsning pumpes ind i bunden af rotoren, hvorved plasma presses ud fra toppen. Yderligere 1750 ml frisk plasma indeholdende australsk antigen pumpes ind i toppen af rotoren til fortrængning af samme rumfang 40 % natriumbromidopløsning fra bunden af rotoren. Rotoren løber derefter ved 30 000 omdrejninger i 18 timer. Efter at rotoren er afbrudt, opsamles HBgAg-rigt materiale i densitetsområdet 1,21 - 1,24, idet der opsamles 1000 ml, som dialyseres over for phosphatpuffer.
Rotoren fyldes derefter med phosphatpuffer, der er afgasset som ovenfor angivet, og følgende tringradient pumpes ind i bunden af den stationære rotor; 1. 2.400 ml 5% saccharose, P = 1,02 2. 1.750 ml 15% saccharose, P = 1,06 3. 1.750 ml 25% saccharose, P = 1,10 4. 2.500 ml 50% saccharose, P = 1,23 HB Ag-rigt materiale fra natriumbromid-isopyknisk adskillelsestrin, 1000 ml, pumpes ind i rotorens top til fortrængning af 1000 ml saccharose fra rotorens bund. Rotoren bringes derefter til at løbe med en hastighed på 28 000 omdrejninger pr. minut i 18 timer. Efter afbrydning af rotoren opsamles det HBsAg-rige materiale i 1,135 - 1,165 densitetsområde, idet der opsamles 1000 ml.
8 1453A7
Dette produkt fortyndes derefter til 40 microgram protein pr. ml til opnåelse af 56 1 materiale. Fortyndingsmidlet er phosphat-pufret saltopløsning. En 56 1 portion af zonecentrifuge-delvis renset hepatitis B antigen (HBgAG) ved 40 ^ug/ml gøres sur til pH 2 ved stuetemperatur under tilsætning af en normal saltsyre under omrøring. 56 ml af 1 mg/ml opløsning af krystallinsk pepsin i destilleret vand tilsættes. Slutkoncentrationen af pepsin var 1 ^ug/ml HBgAg-portionen inkuberes i 16 timer ved 37° C og neutraliseres til pH=7 ved tilsætning af 1 N natriumhydroxid.
Den pepsin-nedbrudte portion koncentreres 295 gange ved ultrafiltrering under anvendelse af et Amicon-apparat, udstyret med en XM100A membran. Pepsin-nedbrudt ikke-antigen-protein føres gennem membranen ind i ultrafiltratet, men HB Ag-partikler til-bageholdes.
Fast urinstof sættes til koncentratet til dannelse af en 4 - 8 molær urinstofopløsning, som derefter inkuberes i yderligere 16 timer ved 37° C. Det urinstofbehandlede HB Ag-koncentrat klares ved filtrering gennem et fiberglasfilter og chromatograferes på "Sephadex^" G-150. Antigenet elueres fra det tomme rumfang, og det er befriet for urinstof, pepsin og andre proteinurenheder. Fraktionen indeholdende HB Ag fortyndes til en praktisk værdi og sterilfiltreres. Formalin tilsættes til en koncentration på 90 -100 yug/ml i 72 timer ved 36° C til yderligere sikring overfor mulig tilstedeværelse af infektiøs virus. Efter afslutning af formalinbehandlingen neutraliseres overskud af formaldehyd med natriumbisulfit. Det rensede produkt har et Egyg ^ på 52,3 sammenlignet med et E^yg ^ på 23,8 for zonecentrifugeringsudgangsmaterialet. Det rensede produkt består af sfæriske partikler med en diameter på 18 - 22 nm og et UV-spektrum som vist på tegningen.
En opsummering af rensning, biologiske og fysiske egenskaber fremgår af efterfølgende tabel.
9 145347
Zonecentrifuge- Slutring sprodukt Produkt 0D 280 nm 0,095 0,115 OD 26q m 0,085 0,082
Volumen (ml) 56.000 23-300
Total OD ojan 5.320 2.680
Lowry-protein (^ug/ml) 40,0 22,0
Total protein (mg) 2.240 513 % Proteinfjernelse - 77 CF enheder pr. ml 64 128
Total CF enheder 3.584.000, 2.982.000 % udbytte i CF 83 CF enheder pr. ^ug/ml protein 1,6 5»8 RIA enheder/ml 2.000 8.000 TOTAL, RIA enheder 112.000.000 180.000.000 % udbytte i RIA - 160 RIA enheder pr. yug protein 50 364 EKSEMPEL 2
Ved subcutan injektion af en enkelt dosis (1,0 ml) indeholdende 20 microgram hepatitis B overflade antigen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, udvikler fire ud af seks chimpanser antistoffer. Efter to tilsvarende yderligere doser med fire ugers mellemrum udvikler fem ud af seks chimpanser antistoffer.
EKSEMPEL 3
Seksten chimpanser blev opdelt i tre grupper. Gruppe A (seks chimpanser) fik indsprøjtet intravenøst 1,0 ml hepatitis B virus; gruppe B (fire chimpanser) fik intravenøs indsprøjtet 1,0 ml af hepatitis B overflade antigen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen; gruppe C (seks chimpanser) var kontrolgruppen og blev ikke podet. Alle chimpanserne fra gruppe A havde tegn på klinisk hepatitis B infektion (enten antignemia, enzym-forøgelse og/eller antistof-reaktion) i løbet af 40 uger.
Ingen af chimpanserne fra gruppe B eller C udviste tegn på klinisk hepatitis B infektion i løbet af samme periode på 40 uger.
10 145347 EKSEMPEL 4
Tre grupper marekatte (seks aber i hver gruppe) fik indgivet 3 subcutane injektioner med 4 ugers mellemrum på 1,0 ml doser indeholdende forskellige mængder af det ved fremgangsmåden ifølge- opfindelsen rensede antigen. Efterfølgende tabel viser den indgivne dosis i hver gruppe og i hver injektion og antallet af dyr ud af det totale antal i den pågældende gruppe, som udviser antistofdannelse forud for næste injektion eller inden for fire uger efter sidste injektion.
Vaccine-dosis Antal dyr, som udviser ffl’U-PP6 _(jPg/ml) antistof-respons_
Uge 0 Uge 4 Uge 8 Å 20 2/6 2/6 5/6 B 2 0/6 1/6 4/6 c 0,5 0/6 1/6 2/6
Det ses, at mere end 50% af dyrene udviste et antistof-respons efter tre doser af vaccinen ved en dosisstørrelse på 2 microgram.
EKSEMPEL 5
Tre grupper marsvin (14 i hver gruppe) fik subcutan indsprøjtning med intervaller på 0, 14 og 56 dage med 1,0 ml doser indeholdende forskellige mængder af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen rensede antigen. Efterfølgende tabel viser dosis-størrelsen, som indgives på hver gruppe, idet hver injektion og antal dyr ud af det totale antal i gruppen viser antistofdannelsen, som blev påvist efter 0, 28, 56 og 84 dage. Nogle dyr døde før forsøgets afslutning.
Vaccine-dosis Antal dyr med antistof-
Gruppe (^ug/ml) _respons_
Dag 0 Dag 28 Dag 56 Dag 84 A 20 0/14 12/14 10/11 10/10 B 2 0/14 7/14 4/11 10/10 C 0,5 0/14 2/14 3/14 10/12
Det ses, at over 80% af marsvinene udviste antistofdannelse efter tre doser vaccine med dosisstørrelser på 0,5 microgram
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57748375 | 1975-05-14 | ||
| US05/577,483 US4017360A (en) | 1975-05-14 | 1975-05-14 | Method for purifying hepatitis B antigen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK190776A DK190776A (da) | 1976-11-15 |
| DK145347B true DK145347B (da) | 1982-11-01 |
| DK145347C DK145347C (da) | 1983-05-02 |
Family
ID=24308922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK190776A DK145347C (da) | 1975-05-14 | 1976-04-28 | Fremgangsmaade til rensning af hepatitis b antigen |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4017360A (da) |
| JP (2) | JPS51139619A (da) |
| AU (1) | AU504454B2 (da) |
| BE (1) | BE841811A (da) |
| CA (1) | CA1066191A (da) |
| CH (1) | CH629668A5 (da) |
| CY (1) | CY1034A (da) |
| DE (1) | DE2621276A1 (da) |
| DK (1) | DK145347C (da) |
| ES (1) | ES447858A1 (da) |
| FR (1) | FR2315947A1 (da) |
| GB (1) | GB1488774A (da) |
| HK (1) | HK86779A (da) |
| NL (1) | NL188621C (da) |
| SE (1) | SE431161B (da) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
| US4129646A (en) * | 1976-11-02 | 1978-12-12 | Merck & Co., Inc. | Isolating hepatitis B Dane particles |
| GB1554811A (en) * | 1977-02-23 | 1979-10-31 | Merck & Co Inc | Purifying hepatitis b surface antigen |
| EP0005408B1 (en) * | 1978-05-08 | 1982-12-01 | Merck & Co. Inc. | A process for the direct extraction of small size particles of up to 50 nm from a protein aceous liquid |
| US4217418A (en) * | 1978-05-08 | 1980-08-12 | Merck & Co., Inc. | Recovery of small particles by flow centrifugation |
| ZA792485B (en) * | 1978-06-07 | 1980-06-25 | New York Blood Center Inc | Vaccine for active immunization containing hepatitis b surface and/or e-antigens |
| US4181713A (en) * | 1978-10-30 | 1980-01-01 | Merck & Co., Inc. | Isolation of HBs Ag |
| US4395395A (en) * | 1979-05-21 | 1983-07-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
| DE2935634C2 (de) * | 1979-09-04 | 1981-12-10 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Tiermodell zur Prüfung der Inaktivierung von Impfstoffen gegen Virushepatitis Typ B und zur Prüfung von Chemotherapeutika gegen Virushepatitis Typ A |
| FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
| US4349539A (en) * | 1980-08-15 | 1982-09-14 | Merck & Co., Inc. | Separation of hepatitis B surface antigen |
| PL133476B1 (en) * | 1981-06-10 | 1985-06-29 | Akad Medyczna | Method of obtaining pure antigen hba from human serum |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
| GB8321789D0 (en) * | 1983-08-12 | 1983-09-14 | Biogen Nv | Vaccines and compositions against hepatitis |
| US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
| JPS61158798A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Japan Found Cancer Res | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
| US5026828A (en) * | 1987-02-27 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast |
| JPS63246335A (ja) * | 1987-09-17 | 1988-10-13 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド | 肝炎ｂ抗原 |
| US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| JPS5523254B2 (da) * | 1974-01-28 | 1980-06-21 |
-
1975
- 1975-05-14 US US05/577,483 patent/US4017360A/en not_active Expired - Lifetime
-
1976
- 1976-04-26 NL NLAANVRAGE7604429,A patent/NL188621C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 SE SE7604818A patent/SE431161B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-28 DK DK190776A patent/DK145347C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-05-04 AU AU13619/76A patent/AU504454B2/en not_active Expired
- 1976-05-04 CY CY1034A patent/CY1034A/xx unknown
- 1976-05-04 GB GB18194/76A patent/GB1488774A/en not_active Expired
- 1976-05-04 CA CA251,740A patent/CA1066191A/en not_active Expired
- 1976-05-11 FR FR7614109A patent/FR2315947A1/fr active Granted
- 1976-05-12 ES ES447858A patent/ES447858A1/es not_active Expired
- 1976-05-13 BE BE167016A patent/BE841811A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-05-13 DE DE19762621276 patent/DE2621276A1/de active Granted
- 1976-05-14 JP JP51054486A patent/JPS51139619A/ja active Granted
- 1976-05-14 CH CH607776A patent/CH629668A5/de not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-12-20 HK HK867/79A patent/HK86779A/xx unknown
-
1983
- 1983-02-24 JP JP58028652A patent/JPS58180432A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE841811A (fr) | 1976-11-16 |
| DK190776A (da) | 1976-11-15 |
| NL188621C (nl) | 1992-08-17 |
| NL7604429A (nl) | 1976-11-16 |
| JPS51139619A (en) | 1976-12-02 |
| US4017360A (en) | 1977-04-12 |
| GB1488774A (en) | 1977-10-12 |
| FR2315947B1 (da) | 1979-03-30 |
| DK145347C (da) | 1983-05-02 |
| DE2621276C2 (da) | 1988-05-11 |
| SE7604818L (sv) | 1976-11-15 |
| JPS6112894B2 (da) | 1986-04-10 |
| CA1066191A (en) | 1979-11-13 |
| CY1034A (en) | 1980-08-01 |
| JPS58180432A (ja) | 1983-10-21 |
| AU1361976A (en) | 1977-11-10 |
| CH629668A5 (de) | 1982-05-14 |
| DE2621276A1 (de) | 1976-11-25 |
| SE431161B (sv) | 1984-01-23 |
| FR2315947A1 (fr) | 1977-01-28 |
| NL188621B (nl) | 1992-03-16 |
| HK86779A (en) | 1979-12-28 |
| JPS6345645B2 (da) | 1988-09-12 |
| AU504454B2 (en) | 1979-10-18 |
| ES447858A1 (es) | 1977-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK145347B (da) | Fremgangsmaade til rensning af hepatitis b antigen | |
| Tabor | The epidemiology of virus transmission by plasma derivatives: clinical studies verifying the lack of | |
| US4542016A (en) | Non-a non-b hepatitis surface antigen useful for the preparation of vaccines and methods of use | |
| US5151023A (en) | Hepatitis a,b-combined adjuvanted vaccine | |
| JP3297433B2 (ja) | ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法 | |
| Yap | The viral safety of intravenous immune globulin | |
| US4174388A (en) | Method for preparing hepatitis B immune globulin | |
| Kedda et al. | An outbreak of hepatitis A among South African patients with hemophilia: evidence implicating contaminated factor VIII concentrate as the source | |
| RU2447898C2 (ru) | Вакцина ipv-dpt | |
| US4164565A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| US4695454A (en) | Process for preparing hepatitis B surface antigen containing particles in novel forms which are highly immunogenic | |
| US4639371A (en) | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom | |
| US4118478A (en) | Vaccine manufacture for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| JP4523164B2 (ja) | ワクチン | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| Schlumberger et al. | Antigenic and immunogenic properties of components contained in rabies virus-infected tissue culture fluids | |
| BG100212A (bg) | Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 | |
| US4118477A (en) | Hepatitis B antigen | |
| SU728720A3 (ru) | Способ получени вакцины против гепатита в | |
| RU2144379C1 (ru) | Противовирусный препарат и способ получения иммуноглобулина для профилактики и лечения вирусных заболеваний | |
| JPS584729A (ja) | 人の血漿からの純粋肝炎ｂ表面抗原の製造法 | |
| RU2033182C1 (ru) | Способ получения живой гриппозной вакцины | |
| Stephan et al. | Sterilized hepatitis B (surface) antigen for production of specific antisera | |
| Lee et al. | Vaccines for prevention of viral hepatitis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |