DE2603889B2 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von cellulose zu wasserloeslichen zuckern - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von cellulose zu wasserloeslichen zuckern

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Description

.15
Die Erfindung betrifft die enzymatische Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Es sind bereits umfangreiche Versuche unternommen worden, um ein Verfahren zu entwickeln, das das reichliche Vorkommen von Cellulose in der Natur ausnutzt und von den milden Reaktionsbedingungen bei der enzymatischen Hydrolyse oder Verzuckerung von Cellulose zu einfachen Zuckern, wie Glucose, Gebrauch macht. So beschreibt z.B. die US-PS 36 42 580 ein A~, Verzuckerungsverfahren, bei dem eine konzentrierte Cellulase-Enzymlösung verwendet wird, um feinteilige trockene Cellulose zu einer Cellulose-Cellulase-Zuekeraufschlämmung zu hydrolysieren, die dann unter Druck ultrafiltriert wird, um den Zuckersirup von der unlöslichen Cellulose und löslichen Enzymbestandteilen zu trennen und dadurch die Wiederverwendung des Enzyms zu ermöglichen. Die US-PS 37 64 475 beschreibt ein ähnliches Verfahren, bei dem die in der US-PS 36 42 580 vorgeschriebene Ultrafiltration ver- 5s mieden wird, indem man während der Hydrolyse kontinuierlich trockene Cellulose zusetzt, um das Cellulase-Enzym durch Adsorption an überschüssige, nichthydrolysierte Cellulose unbeweglich zu machen. In neuerer Zeit haben Mandels, Hontz und N y - (>o strom in einer Arbeit in »Biotechnology and Bioengineering«, Band XVI, November 1974, Seite 1471 —1493, über die Verwendung von reiner Cellulose und Abfallcellulose aus verschiedenen Quellen als Substrat für die Enzymerzeugung und für die enzymati- <>s sehe Verzuckerung berichtet. Aus diesen Veröffentlichungen ist zu entnehmen, daß man es für notwendig ^ehalten hat, das Cellulase-Enzym vor seiner Verwendung zum Hydrolysieren von Cellulose von der Umgebung, in der es erzeugt worden ist, zu trennen.
Toy a ma und Mitarbeiter berichten in »Proc. IV I FS: Ferment. Technology Today«, 1972, Seite 743-757, über die Möglichkeit der Erzeugung von Zuckern durch enzymatische Verzuckerung von Celluloseabfällen unter Verwendung von Trichoderma viride-Cellulase. Auf Seite 753 und 754 dieser Arbeit wird die Entwicklung von Enzym in festen Kulturen auf Schalen (japanischer Koji-Kulturtyp) und die Verwendung der ganzen, so erhaltenen festen Kultur als Enzymquelle für eine nachfolgende enzymatische Verzuckerung der von Lignin befreiten Cellulosesubstrate beschrieben. Es wird auch die Verwendung eines wäßrigen Extraktes des Enzyms aus den gleichen festen Kulturen zur Verzuckerung der gleichen, von Lignin befreiten Cellulosesubstrate beschrieben. Tabelle 23 auf Seite 753 zeigt die mit diesen ganzen festen Kulturen erhaltenen Ergebnisse. Tabelle 24 auf Seite 754 zeigt die mit den aus den festen Kulturen gewonnenen wäßrigen Enzymextrakten erhaltenen Ergebnisse. Aus einem Vergleich der Tabellen 23 und 24 in bezug auf die Zuckerausbeuten ergibt sich, daß eine feste Kultur, nämlich Reisstroh, niedrigere Ausbeuten als der wäßrige Enzymextrakt aus der gleichen festen Kultur liefert, während für eine andere feste Kultur, nämlich rohes Druckpapier, das Gegenteil gilt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die enzymatische Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern mit höherem Wirkungsgrad durchzuführen.
Es wurde nun gefunden, daß dies möglich ist, wenn das Enzym bei der Hydrolysereaktion in Form einer wäßrigen Kulturmasse eingesetzt wird, die man erhält, wenn man einen extrazellulären cellulolytischen Enzymkomplex, der die Fähigkeit hat, natürliche (d. h.: nicht chemisch veränderte) Cellulose abzubauen, in einer gesonderten Enzymherstellungsstufe durch Züchten eines bekannten cellulolytischen Mikroorganismus, der befähigt ist, einen solchen Enzymkomplex zu enlwikkeln, in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial herstellt. Mit anderen Worten: Als Enzymquelle wird das rohe wäßrige Enzympräparat oder ein Teil desselben direkt für die Verzuckerungsreaktion verwendet, ohne daß irgendwelche Bestandteile davon abgetrennt werden. Abgesehen von der etwaigen Notwendigkeit, den pH-Wert der Kulturmasse auf den bei der enzymatischen Verzuckerung von Cellulose üblichen Wert einzustellen, bedarf es keiner sonstigen Vorbehandlung des Enzympräparates. Dadurch werden nicht nur Arbeitsstufen, wie die Filtration und Konzentrierung des Enzyms, überflüssig, sondern es wird auch eine überraschende Erhöhung der Hydrolysegeschwindigkeit und der Ausbeute an wasserlöslichen Zuckern erzielt.
Die gestellte Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird auf die Zeichnung Bezug genommen, die in graphischer Darstellung einen Vergleich der Hydrolysegeschwindigkeiten und der Ausbeuten an wasserlöslichen reduzierenden Zuckern bei der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose mit Hilfe des erfindungsgemäß verwendeten Enzympräparates und mit Hilfe der bisher verwendeten Enzymkulturfiltrate zeigt.
Der für die enzymatische Hyc /se von Cellulose gemäß der Erfindung verwendete cellulolytische Enzymkomplex ist imstande, natürliche Cellulose abzubau-
en. Als solcher enthält er die sogenannten Komponenten Q und Cv. die in derUS-PS 37 64 475 und in der obengenannten Arbeit von Mandcls und Mitarbeitern erwähnt werden. Diese Enzymkomplexe werden bekanntlich durch bekannte und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehende Mikroorganismen, wie Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum und dergleichen, entwickelt. Typische Stämme sind
T. viride QM6a (ATCC 13631),
T. koningii (ATCC 18649),
F. solani (ATCC 16372) und
F. javanicum (ATCC 22403).
T. viride QM9! 23 (ATCC 24449) und
T. viride QM9414 (ATCC 26921)
werden bevorzugt. Der Ausdruck »cellulolytischer Mikroorganismus« bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der einen cellulolytischen Enzymkomplex entwikkelt, welcher imstande ist, natürliche, kristalline Cellulose abzubauen.
Die den cellulolytischen Enzymkomplex enthaltende wäßrige Kulturmasse selbst wird in herkömmlicher Weise hergestellt, indem der cellulolytische Mikroorganismus in an sich bekannter Weise in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial in Schüttelkolben in Submerskultur gezüchtet wird. Typische Methoden sind in einer Arbeit von M a η d e I s und Weber in »Advances in Chemistry, Series ACS 95«, 1969, auf Seite 391-414 beschrieben. Nach beendeter Züchtung wird die wäßrige Kulturmasse oder ein Teil derselben direkt ohne weitere Behandlung in der Celluloseverzuckerungsstufe eingesetzt, wobei höchstens eine Einregelung des pH-Wertes erforderlich sein kann. Es ist also unnötig und unerwünscht, das Mycel oder das Cellulosematerial abzufiltrieren.
Abgesehen von dem Erfordernis, daß die wäßrige Kulturmasse als Enzymquelle verwendet werden soll, sind die enzymatischen Hydrolysebedingungen die herkömmlichen. Zu diesen Bedingungen gehört gewöhnlich ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,8 bis 5,2, wobei der optimale pH-Wert 5 beträgt, eine Temperatur im Bereich von 25 bis 5O0C, vorzugsweise von 45 bis 500C, eine Konzentration des cellulolytischen Enzymkomplexes von 0,01 bis 5 Gewichtsprozent des Reaktionsgemisches und eine Konzentration des Cellulosesubstrats von etwa 1 bis 30 Gewichtsprozent.
Als Quellen für Cellulose sowohl für die Herstellung der wäßrigen Enzymkulturmasse als auch für die enzymatische Hydrolyse kann verhältnismäßig reine Cellulose oder Abfallcellulose verwendet werden, wie es in den Arbeiten von Toy a ma und Mitarbeitern und von Mandels, Hontz und Nystrom beschrieben ist. So kann man z. B. mit Erfolg gereinigte Fichtenholzcellulose (»Solka Floc«), mikrokristalline Cellulose (»Avicel«), Zeitungsdruckpapier, Zeitungspapier, Hartfaserplatten, Milchkartons, Abfall von Papierfabriken, Cellulosefasern von der Naß- oder Trokkenzerkleinerung von städtischem Müll und dergleichen verwenden.
Suspensionen vereinigt und zu IO ml einer Spurenmetallösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt:
to
45
Beispiel 1
Eine wäßrige Enzymkulturmasse wird folgendermaßen hergestellt: < >s
Zu zwei Kartoffeiuextrose-Agar-Schrägröhrchen mit T. viride QM9123 werden je 5 ml sterilisiertes Wasser zugesetzt. Nach dem Schütteln werden die erhaltenen FeSO4 -7H2O
MnSO4 ■ H2O
ZnSO4 · 7 H2O
CoCl2 · 6 H2O
Entmineralisiertes Wasser
250 mg
80 mg
70 mg
100 mg
500 ml
1 ml dieses Gemisches wird dann zu 1,5 g nasser roher Fasern zugesetzt, die mit 29 mi entmineralisiertem Wasser verdünnt worden sind.
Die nassen rohen Fasern sind durch Naßzerfaserung und Einstampfen von städtischem Müll gewonnen worden und haben einen Feststoffgehalt von 30,1 Gewichtsprozent. Auf Trockenbasis haben die Fasern einen Ligningehalt von 10,3 und einen Cellulosegehalt von 68,1 Gewichtsprozent. Vor dem Verdünnen mit dem entmineralisierten Wasser sind die nassen rohen Fasern mit 100 ml Wasser gemischt und dann abzentrifugiert worden.
Das Gemisch aus T. viride, der Spurenelementlösung, den nassen rohen Fasern und dem entmineralisierten Wasser wird mit 20 ml eines wäßrigen Nährmediums versetzt, das hergestellt worden ist, indem 70 g Ammoniumsulfat, 100 g Monokaliumphosphat (KHjPO4), 15 g Harnstoff, 15 g CaCI. · 2 H2O, 15 g MgSO4 · 7 H2O und 37,5 g Pepton gründlich in einem Mörser gemischt und 5,05 g dieses Gemisches in 400 ml entmineralisiertem Wasser gelöst wurden.
Vor dem Beimpfen mit T. viride werden die Nährlösung und die nassen rohen Fasern durch 15 Minuten langes Erhitzen auf 121°C sterilisiert. Dann erfolgt die Inkubation in einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 24°C im Verlaufe von 7 Tagen. Der pH-Wert der so erhaltenen Kulturmasse beträgt 5,22; vor ihrer Verwendung als Enzymquelle zum Hydrolysieren von Cellulose wird die Kulturmasse mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt.
Die ganze wäßrige Enzymkultur wird dann für die nachfolgende erizymatische Hydrolyse von Cellulose in vier Teile geteilt. Ein Teil (A) wird direkt ohne weitere Behandlung zur Hydrolyse verwendet. Ein zweiler Teil (B) wird durch Glaswolle filtriert, um das Mycel und sonstige unlösliche Stoffe zu entfernen; das so erhaltene Kulturfiltrat wird für die Hydrolyse verwendet. Der dritte Teil (C) wird in einem Zellenzerreiß-Beschallungsgerät mit Ultraschallwellen behandelt, wofür eine Standard-Mikrospitze verwendet wird, und dann für die Hydrolyse eingesetzt. Die Beschallung erfolgt viermal mit Ultraschallstößen von je 15 Sekunden bei einer Gerätablesung von 55 bis 75 Watt. Der Zweck dieser Behandlung ist der Versuch, etwa an die Zellwandungen des T. viride-Mycels gebundenes Enzym in Freiheit zu setzen. Der vierte Teil (D) wird der gleichen Ultraschallbehandlung unterworfen wie der dritte Teil, aber dann durch Glaswolle filtriert, um die unlöslichen Stoffe zu entfernen. Das so erhaltene Kulturfiltrat wird für die Hydrolyse verwendet.
Für die Hydrolyse werden durch Zusatz von vier gesonderten Anteilen von je 300 mg eines in der Kugelmühle auf Teilchengrößen unter 74 μ vermahlencn Fichtenholzcellulose-Zellstoffs zu 4 ml eines jeden der obigen Enzympräparate vier wäßrige Cellulosesuspensionen mit einer Konzentration von 7,5 g/100 ml hergestellt. Jedes der vier Gemische wird mit 0,05molarem Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und bei 450C inkubiert. Aus jedem Gemisch werden
nach 1,2 und 3 Tagen Proben entnommen, 5 Minuten in einem siedenden Wasserband gehalten, um das Enzym zu entaktivieren und dann auf reduzierende Zucker, bestimmt als Glucose, nach der Dinitrosalicylsäuremcthode analysiert [vgl. G. L. Miller, »Analytical Chemistry«, Band 31, Seite 426 (1959)]. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Enzymquelle % reduzierender Zucker, als Glucose nach
1 Tag 2 Tagen 3 Tagen
A 3,53 4,70 5.04
B 2,72 3,53 4,22
C 3,00 3,93 4,30
D 2,51 3,41 3,81
Die Werte der obigen Tabelle sind in der Zeichnung in graphischer Form dargestellt.
Aus den Werten der Tabelle und der Zeichnung ergibt sich, daß durch Verwendung einer vollständigen wäßrigen Kulturmasse als cellulolytischc Enzymquellc gemäß der Erfindung eine Erhöhung sowohl der Hydrolysegeschwindigkeit der Cellulose als auch der Ausbeute an wasserlöslichen Zuckern erzielt wird. Wenn die Kulturmasse z. B. nur einfach filtriert und das Kulturfiltrat als Enzymquelle verwendet wird (Enzymquelle B, Kurve S), wie es bisher üblich war, erhält man eine bedeutend niedrigere Hydrolysegeschwindigkeit und Zuckerausbeute als bei Verwendung der ganzen Kulturmasse als Enzymquellc (Enzymquellc A, Kurve A). Obwohl die Beschallung mit Ultraschallwellen die cnzymalische Aktivität vermindert (Enzymquclle C, Kurve C), erhält man in diesem Falle immer noch eine günstigere Hydrolysegeschwindigkeit und Zuckerausbeuic als mit einer anderweitig gleichen F.nzymquclle, die aber außerdem filtriert und in Form des Kulturfiltrais für die Hydrolyse eingesetzt worden ist (Enzymquclle D, Kurve D).
Beispiel 2
Eine andere wäßrige Enzymkulturmasse wird gemäß Beispiel I hergestellt, wobei jedoch die Züchtung 18 Tage fortgesetzt wird. Die so erhaltene Kiilturmasse hat einen pH-Wert von 5,58, der vor ihrer Verwendung zur cnzymatischen Hydrolyse mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt wird.
Aus zwei 4-ml-Proben dieser wäßrigen Kulturmasse werden gesondert
(1) durch Zusatz von 300 mg des in Beispiel 1 beschriebenen Fichtenholzzellstoffs eine wäßrige Zellstoffsuspcnsion mit einer Konzentration von 7,5 g Feststoffen je 100 ml und
(2) durch Zusatz von 300 mg getrockneter roher Fasern, die aus den in Beispiel 1 beschriebenen nassen Fasern gewonnen worden sind, eine rohe Fasersuspension mit einer Konzentration von 7,5 g Fasern je 100 ml hergestellt. Vor dem Trocknen sind die nassen rohen Fasern mit Wasser gemischt und durch ein grobes Glasfrittenfilter abfiltriert worden, und der Filterkuchen ist dreimal mit je 5 I destilliertem Wasser gewaschen worden.
Eine jede Cellulosesuspension wird mit O.OSmolarem Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Die beiden Gemische aus Kulturmasse und Cellulosematerial werden bei 45°C inkubiert. Aus jedem Gemisch werden nach 1, 2 und 3 Tagen Proben entnommen, 5 Minuten in siedendem Wasser gehalten, um das Enzym zu entaktivieren, und dann auf reduzierende Zucker, bestimmt als Glucose, nach der gleichen Dinitrosalicylsäurcmethode wie in Beispiel 1 analysiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:
Substrat
% reduzierender Zucker,
als Glucose nach
I Tag 2 Tagen 3 Tagen
Fichtenholzzcllstoff 3,74 4,93 5,39
.vs Getrocknete rohe Faser 2,45 3,07 3,15
Wie die obige Beschreibung zeigt, kann man eine vollständige wäßrige Kulturmasse einschließlich des cellulolytischen Mikroorganismus, der cellulosehaltigen Kohlenstoffquelle und des wäßrigen Nährmediums erfolgreich als Enzymquclle für die enzymatische Hydrolyse von Cellulose einsetzen. Durch diese Maßnahme erzielt man erhöhte Hydrolysegeschwindigkeiten und Ausbeuten an wasserlöslichen Zuckern.
Hierzu I Hliitt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern, bei dem s
(a) ein extrazellulärer cellulosischer Enzymkomplex, der die Fähigkeit hat, natürliche Cellulose abzubauen, in einer Enzymherstellungsstufe durch Züchten eines bekannten cellulolytischen Mikroorganismus, der befähigt ist, diesen ι ο Enzymkomplex zu entwickeln, i,i einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von Cellulosematerial in Form einer wäßrigen Kulturmasse hergestellt und
(b) sodann ein Cellulosesubstrat ir. Gegenwart des is Enzymkomplexes untei enzymatischen Hydrolysebedingungen zu den Zuckern hydrolysiert wird,
dadurch gekennzeichnet, daßmanfürdie Hydrolysestufe die wäßrige Kulturmasse der En- :o zymherstellungsstufe verwendet, ohne irgendwelche Bestandteile daraus abzutrennen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als bekannten cellulolytischen Mikroorganismus einen Stamm von Trichoderma viride verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Enzymherstellungsstufe Cellulosematerial und in der Hydrolysestufc ein Cellulosesubstrat verwendet, die aus Abfallcellulose gewonnen worden sind.
DE2603889A 1975-04-28 1976-02-02 Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Cellulose zu wasserlöslichen Zuckern Expired DE2603889C3 (de)

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