DE69206001T2 - Verfahren zur hochsensitiven Bestimmung von NADH mit NADH Kinase. - Google Patents
Verfahren zur hochsensitiven Bestimmung von NADH mit NADH Kinase.Info
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Description
- Die Erfindung erlaubt die genaue Diagnose hauptsächlich von Erkrankungen und ähnlichen Zuständen durch hochempfindliche Bestimmung einer Substanz, die als Marker einer Pathose dienen kann, durch Verwendung einer für NADH hochspezifischen NADH-Kinase, und kann im Bereich der klinischen Diagnose, Therapie usw. eingesetzt werden.
- Zur Zeit wird weitverbreitet ein diagnostisches Verfahren eingesetzt, bei dem die Menge einer Substanz, die als Marker für eine Pathose dienen kann, unter Verwendung einer Enzym- Reaktion bestimmt wird. Es gibt jedoch Spurenmarker, die nach konventionellen Verfahren schwierig zu messen sind, und die Menge einer Testflüssigkeit ist in einigen Fällen auf eine kleine Menge eingeschränkt, z.B. bei medizinischen Untersuchungen von Neugeborenen. Es besteht das Bedürfnis nach hochempfindlichen analytischen Verfahren, die zur Lösung dieser Probleme in der Lage sind.
- Eines dieser Verfahren ist ein analytisches Sensibilisierungsverfahren unter Verwendung einer cyclischen Reaktion. Als cyclische Reaktion kennt man die β-NAD&spplus; NADH cyclische Reaktion, die β-NADP&spplus; β-NADPH cyclische Reaktion usw. ["Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiments)", Bd. 5, 5. 121-131]. Wie z.B. in der ungeprüften Japanischen Patentoffenlegung Nr. 59-213400 offenbart, kann β-NAD&spplus; mit hoher Empfindlichkeit durch Phosphorylierung von nur β-NAD&spplus; in einer β-NADH- und β-NAD&spplus;haltigen Lösung in β-NADP&spplus; unter Verwendung einer für β-NAD&spplus; spezifischen Kinase und Durchführen der cyclischen Reaktion für das β-NAD&spplus; bestimmt werden.
- Wenn jedoch eine kleine Menge an NADH in einer NAD&spplus;- (im folgenden als β-NAD&spplus;, Thio-NAD&spplus; oder α-NAD&spplus; bezeichnet, und NADH (β-NADH, Thio-NADH oder α-NADH)-haltigen Mischung vorliegt, kann sie nach dem obigen Verfahren, offenbart in der japanischen ungeprüften Patentoffenlegung Nr. 59-213400 nachgewiesen werden. Es wurden daher bislang ein Fließinjektionstest unter Verwendung von HPLC und ein Verfahren, das Erhitzen zum Sieden umfaßt (japanische ungeprüfte Patentoffenlegung Nr. 58-129994) eingesetzt, diese Verfahren sind jedoch dahingehend nachteilig, daß sie eine teuere Apparatur, ein mühevolles Verfahren und eine lange Zeit erfordern. Es gibt auch ein hochempfindliches Verfahren, wobei man β-NADH unter Verwendung von Luciferase eine Luminiszenzreaktion eingehen läßt, und ein Verfahren, bei dem man β-NADH einer Chemiluminiszenz unterzieht, jedoch erfordern diese Verfahren einen speziellen und teuren Detektor und werfen das Problem der Stabilität der Reagenzien auf.
- Im Hinblick auf solche Bedingungen haben die Erfinder ernsthaft nach einem Verfahren zur Bestimmung einer kleinen Menge von NADH mit hoher Empfindlichkeit in einem Fall, wo ein Überschuß NAD&spplus; vorliegt, untersucht. Es wurde gefunden, daß dieses Ziel unter Verwendung einer Kinase, die spezifisch mit NADH reagiert, erreicht werden kann. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, daß auch in einer NAD&spplus; und eine kleine Menge an NADH enthaltenden Mischung NADH mit hoher Empfindlichkeit durch Phosphorylieren von nur NADH in NADPH und anschließendes Unterwerfen des NADPH's einer cyclischen Reaktion nachgewiesen werden kann, und daß die hochempfindliche Bestimmung einer kleinen Menge XTP ebenfalls ermöglicht wird, worauf die Erfindung beruht.
- Die Erfindung stellt ein Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von NADH zur Verfügung, wobei man eine für NADH hochspezifische NADH-Kinase auf eine NAD&spplus;- und NADH-haltige Lösung in Gegenwart eines divalenten Metallions und XTP [worin X A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin), C (Cytidin), I (Inosin), dT (Thymidin), dA (Deoxyadenosin), dU (Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin), dO (Deoxycytidin) oder dI (Deoxyinosin) ist] unter Herstellung von XDP (worin X wie oben definiert ist, und NADPH einwirken läßt, Unterwerfen des NADPH's einer cyclischen Reaktion unter Einsatz einer katalytischen Reaktion, die zur Oxidation von NADPH in NADP&spplus; in der Lage ist, und eine katalytische Reaktion, die zur Reduktion von NADP&spplus; in NADPH in der Lage ist, Messung der variablen Menge eines durch die cyclische Reaktion verbrauchten Substrats oder eines durch die cyclische Reaktion gelieferten Produkts, wodurch die Menge nur des NADH's in der Lösungsmischung, enthaltend NAD&spplus; und NADH, bestimmt wird.
- Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von XTP zur Verfügung, wobei man eine für NADH hochspezifische NADH-Kinase auf eine Lösung, enthaltend XTP [worin X A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin), Cc (Cytidin), I (Inosin), dT (Thymidin), dA (Deoxyadenosin), dU (Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin), dC (Deoxycytidin) oder dI (Deoxyinosin) ist] in Gegenwart eines divalenten Metallions und NADH unter Bereitstellung von XDP (worin X wie oben definiert ist) und NADPH einwirken läßt; Unterwerfen des NADPH's der cyclischen Reaktion unter Einsatz einer katalytischen Reaktion, die zur Oxidation von NADPH in NADP&spplus; in der Lage ist, und einer katalytischen Reaktion, die zur Reduktion von NADP&spplus; in NADPH in der Lage ist, Messen der variablen Menge eines durch die cyclische Reaktion verbrauchten Substrats oder durch die cyclische Reaktion gebildeten Produkts, wodurch die Menge an XTP bestimmt wird.
- Das obige NAD&spplus; umfaßt β-NAD&spplus;, Thio-NAD&spplus; und α-NAD&spplus;. Das obige NADH umfaßt β-NADH, Thio-NADH und β-NADH.
- Das obige divalente Metallion umfaßt Mg²&spplus;, Mn2&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus; usw. Ein Katalysator für die Oxidation umfaßt Dehydrogenasen, Diaphorasen NAD(P)H-Oxidase und Elektronenträger. Die Elektronenträger umfassen Meldola's Blau (9-Dimethylaminobenzo-α-phenazoxoniumchlorid), 1-Methoxy PMS (1-Methoxy-5- methylphenaziniummethylsulfat), PMS (Methylphenaziniummethylsulfat), PQQ (Pyrrolchinolinchinon) usw. Ein Katalysator für die Reaktion umfaßt Dehydrogenasen und NADP&spplus;-abhängige Dehydrogenasen sind besonders bevorzugt.
- In den anliegenden Zeichnungen bedeutet Figur 1 einen Graph mit der Darstellung des pH-Optimums des vorliegenden Enzyms ( - : Phosphat-Puffer, O - O: Tris-HCl-Puffer, - : Glycinnatriumhydroxid-Puffer).
- Figur 2 ist eine graphische Darstellung des erfindungsgemäßen Enzyms ( - : Phosphat-Puffer, O - O: Tris-HCl-Puffer, - : Glycinnatriumhydroxid-Puffer).
- Figur 3 ist eine graphische Darstellung des für die Reaktion des erfindungsgemäßen Enzyms geeigneten Temperaturbereichs.
- Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Hitzestabilität des erfindungsgemäßen Enzyms.
- Figur 5 zeigt eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 2 durch Auftragen von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen die NADH- Konzentration.
- Figur 6 zeigt eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 3 durch Auftragen von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen die Natriumcholat-Konzentration.
- Figur 7 zeigt eine Kalibrierungskurve, erhalten durch die Verwendung von β-NAD&spplus; in Beispiel 4 durch Auftragen von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen die Natriumcholat-Konzentration.
- Figur 8 zeigt eine Kalibrierungskurve, erhalten unter Verwendung von Thio-NAD&spplus; in Beispiel 4 unter Auftragung von ΔOD&sub5;&sub5;&sub0; nm/min gegen Natriumcholat-Konzentration.
- Figur 9 ist ein Diagramm, welches die Korrelation zwischen den Meßwerten, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und denjenigen, erhalten nach dem 3α-HSD-Formazan- Verfahren, welches in Beispiel 5 bestimmt wurde.
- Figur 10 ist eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 6 durch Auftragen von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen das Maß der 3-Hydroxybutylatdehydrogenase-Aktivität.
- Figur 11 ist eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 7 durch Auftragen von ΔOD&sub5;&sub5;&sub0; nm/min gegen Glycerin- Konzentration.
- Figur 12 ist eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 8 durch Auftragen von ΔOD&sub5;&sub5;&sub0; nm/min gegen das Maß der Alkoholdehydrogenase-Aktivität.
- Figur 13 ist eine Kalibrierungskurve, erhalten in Beispiel 9 durch Auftragen von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen ATP- Konzentration.
- Die Erfindung wird im folgenden in Einzelheiten beschrieben.
- Zunächst wird eine Übersicht der Reaktionen bei der hochempfindlichen Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. Divalente Metallionen NADH-Kinase
- worin die Symbole die folgenden Bedeutungen haben:
- E&sub1;: ein Oxidations-Katalysator, der zur Katalyse einer Reaktion in der Lage ist, aus der NADP&spplus; und P&sub1; aus den Substraten NADPH und S&sub1; gebildet werden kann.
- E&sub2;: ein Reduktions-Katalysator, der zur Katalyse einer Reaktion in der Lage ist, nach der NADPH und P&sub2; aus den Substraten NADP&spplus; und P&sub2; gebildet werden können.
- S&sub1;: eine oxidierte Form des Substrats für E&sub1;.
- S&sub2;: eine reduzierte Form des Substrats für E&sub2;.
- P&sub1;: ein Produkt in reduzierter Form aus P&sub1; durch E&sub1;.
- P&sub2;: ein Produkt in oxidierter Form aus S&sub2; durch E&sub2;.
- XTP: X = A: Adenosins-5'-triphosphat
- = U: Uridin-5'-triphosphat
- = G: Guanosin-5'-triphosphat
- = C: Cytidin-5'-triphosphat
- = I: Inosin-5'-triphosphat
- = dT: Thymidin-5'-triphosphat
- = DA: 2'-Deoxyadenosin-5'-triphosphat
- = dU: 2'-Deoxyuridin-5'-triphosphat
- = dG: 2'-Deoxyguanosin-5'-triphosphat
- = dC: 2'-Deoxycytidin-5'-triphosphat
- = dI: 2'-Deoxyinosin-5'-triphosphat
- XDP: jeweils die gleichen Verbindungen wie oben mit Ausnahme, daß das Triphosphat durch ein Diphosphat ersetzt ist.
- Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchende Lösung kann jede Lösung sein, so lange sie NAD&spplus; und NADH in einer Mischung enthält. Als eine solche Lösung können z.B. Lösungen exemplifiziert werden, die sowohl NAD&spplus; als auch NADH enthalten, und Lösungen, die freigesetztes NADH enthalten und solches, das nach irgendwelchen verschiedenen enzymatischen Reaktionen gebildet wurde. Spezifische Beispiele von Lösungen sind Reaktionslösungen enthaltend NADH aus NAD&spplus;, das als Substrat durch enzymatische Reaktion mit einer Dehydrogenase verbraucht wurde, z.B. den Reaktionslösungen 1 bis 20, wie unten gezeigt. Diese beispielhaften Reaktionssysteme sollen jedoch nicht in irgendeiner Weise die zu untersuchende Lösung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einschränken. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren zu untersuchende Lösung kann jede Lösung sein, so lange sie XTP enthält. Als solche Lösung können Reaktionslösungen beispielhaft dargestellt werden, die XTP enthalten, welches aus XDP, verbraucht durch enzymatische Reaktion mit einer Kinase, gebildet wurden, z.B. die Reaktionslösungen 21 bis 29 wie unten gezeigt. Diese beispielhaften Reaktionssysteme sollen jedoch nicht in irgendeiner Weise die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchende Lösung einschränken.
- In den folgenden Beispielen wird das Symbol "DH" als Abkürzung einer Dehydrogenase verwendet.
- (worin R eine Alkyl-Gruppe oder ähnliches ist)
- (worin X U, 1, G, C, A, dT, dU, dI, dG, dC oder A ist)
- Die Lösungen 1 bis 20 sind Beispiele für Lösungen zur Bestimmung von NADH, das durch Enzym-Reaktion aus jeder Dehydrogenase erzeugt wurde. Bei diesen Lösungen kann einer der Faktoren in einem solchen Enzym-Reaktionssystem, z.B. die enzymatische Aktivität der Dehydrogenase, die Menge an NAD&spplus; und die Menge an Substrat für das Enzym, welche zusammen mit dem NAD&spplus; verbraucht wird, durch die Bestimmung der Menge des NADH's gemessen werden. Die Lösungen 21 bis 29 sind Beispiele von Lösungen zur Bestimmung von ATP, das durch Enzym-Reaktion einer jeden Kinase gebildet wurde. Bei diesen Lösungen kann einer der Faktoren in solchen Enzym-Reaktionssystemen, z.B. die enzymatische Aktivität einer Kinase, die Menge an ADP und die Menge einer phosphorhaltigen Verbindung als Substrat für das Enzym, welches verbraucht wird, zusammen mit ADP durch Bestimmung der Menge an ATP nachgewiesen werden.
- Die obigen, quantitativ zu bestimmenden Substanzen können solche sein, die durch eine weitere Reihe an Reaktionssystemen gebildet werden. In diesen Fällen kann einer der Faktoren, der in einer Reaktion, die ganz am Anfang durchgeführt wird, teilnimmt, quantitativ bestimmt werden. Die obigen verschiedenen Enzym-Reaktionen können gleichzeitig mit der Enzym-Reaktion durch die NADH-Kinase ausgeführt werden.
- Eine Übersicht über die Gesamtreaktion in diesem Fall ist im folgenden gezeigt. Divalente Metallionen NADH-Kinase
- worin die Symbole die folgenden Bedeutungen haben:
- E&sub0;: eine Dehydrogenase, die zur Katalyse einer Reaktion in der Lage ist, nach der NADH und B aus den Substraten NAD&spplus; und A gebildet werden.
- A: Substrat in reduzierter Form für die Dehydrogenase E&sub0;.
- B: Substrat-Produkt in oxidierter Form, gebildet aus A durch die Dehydrogenase E&sub0;.
- E&sub1;, E&sub2;, S&sub1;, S&sub2;, P&sub1; und P&sub2;: haben die gleichen Bedeutungen wie oben.
- In den obigen Enzym-Reaktionssystemen werden die Bedingungen (d.h. Temperatur, pH und die Notwendigkeit für einen Stabilisator und Metall-Ionen) zur Durchführung der Reaktionen geeignet nach üblichen Techniken ausgewählt. Die Reaktionstemperatur kann im allgemeinen 20 bis 40ºC sein. Der pH bei der Reaktion wird geeignet auf 6,0 bis 9,5 je nach Enzym-Reaktion, durch Auswahl und Verwendung einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH in diesem Bereich eingestellt. Als Pufferlösung kann z.B. Phosphat-Puffer und verschiedene Good's-Puffer verwendet werden. Die Reaktionszeit ist eine Zeit, die für jede Enzym-Reaktion erforderlich ist und nicht kritisch ist.
- Als erfindungsgemäß verwendete NADH-Kinase kann jede Kinase verwendet werden, so lange sie spezifisch auf NADH wirkt und eine für den praktischen Zweck ausreichende Stabilität hat. Es kann die folgende NADH-Kinase als Beispiel mit den folgenden physiochemischen Eigenschaften angegeben werden (im folgenden als "vorliegendes Enzym" bezeichnet).
- Das vorliegende Enzym, wie in der obigen Reaktionsformel gezeigt, katalysiert eine Reaktion, nach der NADPH und XDP (worin X wie oben definiert ist) aus den Substraten NADH und XTP (worin X wie oben definiert ist) über die Phosphorylierung von NADH in Gegenwart von mindestens eins der Ionen ausgewählt aus der Gruppe Mg²+-, Mn²&spplus;-, Qa²&spplus;- und Co²&spplus;-Ionen gebildet werden.
- NADH + XTP Mg²&spplus;, Mn²&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus;/ vorliegendes Enzylm NADPH + XDP
- worin X wie oben definiert ist.
- Das vorliegende Enzym hat eine sehr hohe Spezifität für NADH und wirkt kaum auf NAD&spplus;.
- die Substratspezifität des vorliegenden Enzyms wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen getestet. Tabelle 1 Substratlösung 10 mM NADH oder NAD&spplus; 0,5 mM HEPPS*-Puffer (pH 8,5) 10 mM ATP 0,1 M Magnesiumchlorid 2,0 M Natriumacetat Destilliertes Wasser * HEPPS: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-3-propansulfonsäure
- Jeweils zu 0,9 ml der Substratlösungen, enthaltend NADH oder NAD&spplus;, wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden 0,1 ml 23 E/ml vorliegendes Enzym zugegeben, und die Reaktion wurde bei 30ºC 20 min durchgeführt. Dann wurde die Reaktion durch Hitzebehandlung bei 100ºC für 2 min abgebrochen, und das denaturierte Protein wurde entfernt, nachdem die Menge an NADPH oder NADP&spplus;, produziert durch die Reaktion des entsprechenden Substrats, wie folgt gemessen wurde. Als Kontroll-Lösung wurde eine Mischung einer jeden Substrat- Lösung mit dem vorliegenden Enzym verwendet, bei der die Reaktion sofort nach Vermischung abgebrochen worden war.
- Mit 1 ml aus jeder Reaktionslösung, erhalten wie oben, wurde 1 ml einer farbgebenden Lösung, bestehend aus 10 mM G-6-P, 50 mM HEPPS-Puffer (pH 8,0), 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 2,5 IE/ml G-6-P Dehydrogenase (NADP&spplus;- abhängig), 5 IE/ml Diaphorase und 250 uM 2,6- Dichlorphenolindophenol vermischt. Die erhaltene Mischung wurde sofort in eine konstant temperierte Kuvette von STASAR III Spektrophotometer von Gilford eingefüllt und einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit der Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 600 nm mit verstreichender Zeit gemessen, und der Unterschied (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) zwischen den Absorptionswerten 1 Minute und 2 Minuten nach Einleitung der Farbreaktion wurde als Meßwert genommen. Bezüglich der relativen Aktivität (%) wurde ein Meßwert (ΔOD&sub6;&sub0; nm/min), erhalten unter Verwendung von NAD&spplus; als Substrat, als Prozentsatz, bezogen auf den Meßwert (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) erhalten unter Verwendung von NADH als Substrat, angegeben.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt: Substrat Relative Aktivität (%)
- (3) Meßverfahren für den Titer Tabelle 2 Substratlösung 10 mM NADH 0,5 M HEPPS-Puffer (pH 8,5) 10 mM ATP 0,1 M Magnesiumchlorid 2,0 M Natriumacetat Destilliertes Wasser
- 0,9 ml der Substrat-Lösung, enthaltend NADH wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden auf 30ºC vorerhitzt, worauf 0,1 ml einer Lösung des erfindungsgemäßen Enzyms mit der geeigneten Konzentration zugegeben wurden, die Reaktion erfolgte bei 30ºC für 20 min. Anschließend wurde die Reaktion durch Hitzebehandlung bei 100ºC für 2 min abgebrochen, und das denaturierte Protein wurde entfernt. Dann wurde die Menge des produzierten NADPH's durch die Reaktion des Substrats wie folgt gemessen. Als Kontroll-Lösung wurde eine Mischung einer Substrat-Lösung und des erfindungsgemäßen Enzyms, bei der die Reaktion sofort nach Mischung abgebrochen worden war, verwendet.
- Mit jeweils 1 ml der Reaktionslösung, erhalten wie oben, wurden 1 ml einer farbgebenden Lösung vermischt, welche dieselbe Zusammensetzung hatte wie die farbgebende Lösung, beschrieben oben unter Punkt "Substratspezifität". Die erhaltene Mischung wurde unmittelbar hierauf in eine konstant temperierte Kuvette eines STASAR III Spektrophotometers von Gilford eingefüllt und einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit der Reaktion wurde die Absorptionsveränderung bei 600 nm mit verstreichender Zeit gemessen, und der Unterschied (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 Minute und 2 Minuten nach Einleitung der Farbreaktion wurde als Meßwert erhalten. Unter Verwendung einer Kalibrierungskurve von ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min gegen die NADPH- Konzentration, wie zuvor gebildet, unter Verwendung von NADPH-Lösungen bekannter Konzentrationen, wurde die Menge des produzierten NADPH's aus dem gemessenen Wert berechnet.
- Eine Menge an Enzym, bei der NADPH in einer Menge von 1 Nanomol pro Minute bei 30ºC produziert wird, wird als eine Einheit genommen.
- Der Km-Wert (Michaelis-Konstante) des vorliegenden Enzyms für NADH ist 27 umol bei 30ºC und pH 7,8 (Tris-Puffer).
- Das pH-Optimum des vorliegenden Enzyms ist in Figur 1 gezeigt, pH 8,0 bis 9,0, wenn NADH als Substrat verwendet wird.
- Das vorliegende Enzym wurde in jeweils Puffer-Lösungen mit verschiedenen pH gelöst, und nach Stehen lassen bei 4ºC für 16 h wurde die Restaktivität gemessen, wobei herausgefunden wurde, daß das Enzym bei pH 7,0 bis 9,0, wie in Figur 2 gezeigt, stabil war.
- Der für die Reaktion des erfindungsgemäßen Enzyms geeignete Temperaturbereich ist 30ºC bis 45ºC wie in Figur 3 gezeigt.
- Das vorliegende Enzym wurde in einer Puffer-Lösung gelöst, und nach Stehen lassen bei jeder Temperatur für 10 min, wurde die Restenzymaktivität gemessen, wodurch die thermische Stabilität bestimmt wurde. Folglich zeigte das vorliegende Enzym eine Restaktivität im Prozentsatz von 83 % bei 35ºC, 60 % bei 40ºC und 30 % bei 45ºC, wie in Figur 4 gezeigt.
- Das vorliegende Enzym wird stark durch SDS (Natriumlaurylsulfat), p-CMB (p-Chlormercuribenzoesäure), Pb²&spplus;, Zn²&spplus;, Cd²&spplus;, Cu²&spplus;, Hg²&spplus; usw. inhibiert, und wird durch Natriumacetat usw. aktiviert. Zusätzlich wird es durch Saccharose, Mg²+, Mn²&spplus;, Dithiothreitol, N-Acetyl-L-cystin, Ammoniumsulfat usw. stabilisiert.
- Das vorliegende Enzym kann durch Einsatz üblicher Verfahren zur Reinigung von Enzymen gereinigt werden, wie z.B. Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration usw. einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr davon.
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms ist ca. 160 000 gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Superose 6 HR10/30 Säule [hergestellt von Pharmacia AB (Schweden)] gemäß dem Verfahren von Andrews [Biochem. J. 96, 595 (1965)].
- Der isoelektrische Punkt des vorliegenden Enzyms ist pI 6,40, gemessen durch Elektrophorese unter Verwendung eines ampholythaltigen Agarosegels.
- Vergleich des erfindungsgemäßen Enzyms mit in gut bekannten Referenzen beschriebenen NADH-Kinasen, d.h. NADH-Kinase A (J. Biochem. 105, 588 - 593, 1989) und NADH-Kinase B (J. Biochem. 247, 1473 - 1478, 1972> , ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Erfindungsgemäßes Enzym Quelle pH-Optimum Thermische Stabilität Spezifität Molekulargewicht Pichia membranaefaciens 10 % inkativiert bei 35ºC in 5 min Saccharomyces cerevisiae Sehr instabil
- Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, ist das vorliegende Enzym von bekannten NADH-Kinasen hinsichtlich enzymologischer und physikochemischer Eigenschaften unterschiedlich und insbesondere in der thermischen Stabilität diesen überlegen. Daher kann das erfindungsgemäße Enzym für praktische Zwecke, z.B. die hochempfindliche Analyse unter Verwendung des vorliegenden Enzyms in Kombination mit anderen verschiedenen Enzymen eingesetzt werden, und ist daher sehr vorteilhaft.
- Das erfindungsgemäße Enzym kann durch Kultur von Pichia membranaefaciens Y527 (FERM BP-3208) in einer Nährbrühe gebildet werden. Das vorliegende Enzym kann im allgemeinen bei einem pH von ca. 6,5 bis 9,5 reagieren und üblicherweise bei ca. 20 bis 40ºC. Obwohl die Menge des verwendeten Enzyms nicht kritisch ist, ist sie im allgemeinen ca. 1 bis 500 Einheiten.
- Als das divalente Metallion, das für die Reaktion mit der NADH-Kinase erforderlich ist, z.B. das Magnesium-Ion, Mangan- Ion, Calcium-Ion oder Kobalt-Ion, können wasserlösliche Salze verwendet werden, die diese Metall-Ionen freisetzen können, z.B. Magnesiumchlorid, Manganchlorid und Calciumchlorid. Im Reaktionssystem können die wasserlöslichen Salze im allgemeinen in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 100 mM, vorzugsweise 1 bis 20 mM verwendet werden.
- Betreffend die zur Bestimmung von NADH verwendete Menge an ATP kann ein ATP-Überschuß über NADH in der Lösung verwendet werden. Im allgemeinen wird ATP vorzugsweise in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 10 mM im Reaktionssystem eingesetzt.
- Eine Überschußmenge an NADH über ATP in der Lösung kann zur Bestimmung von ATP verwendet werden, jedoch ist NADH vorzugsweise in einer Konzentration von ca. 0,05 bis 5 mM im Reaktionssystem zu verwenden.
- Wenn die Reaktion mit irgendeinem der verschiedenen Enzyme für E&sub0; und die Enzym-Reaktion mit der NADH-Kinase gleichzeitig durchgeführt wird, oder wenn eine Reihe von vielen Enzym-Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden, können die Reaktionen durch geeignete Auswahl von Temperatur und pH, bei denen die Gesamtreaktion glatt verläuft und allen Bedingungen betreffend die verschiedenen Additive usw. genügt, durchgeführt werden.
- Für den oben erwähnten Katalysator E1 für die Oxidation von NADPH, der erfindungsgemäß verwendet wird, kann jedes Enzym eingesetzt werden, so lang es auf zusammen mit ADP enzymatische Reaktion ATP und NADH mit NADH-Kinase produziertem NADPH wirkt, um eine Reaktion zu katalysieren, nach der Produkt P&sub1; in reduzierter Form und NADP+ aus dem NADPH und einem Substrat P&sub1; in oxidierter Form gebildet werden.
- Als Katalysator E&sub2; zur Reduktion von NADP&spplus;, der zur Ausbildung der cyclischen Reaktion in Kombination mit Katalysator E&sub1; verwendet wird, kann jedes Enzym verwendet werden, so lange es auf NADP&sbplus;, gebildet durch E&sub1; wie oben beschrieben, unter Katalyse einer Reaktion, nach der Produkt P&sub2; in oxidierter Form und NADPH aus NADP&spplus; und einem Substrat S&sub2; in reduzierter Form gebildet werden, wirkt.
- Wenn die enzymatischen Reaktionen durch E&sub1; und E&sub2; in Kombination durchgeführt werden, wird NADPH, gebildet durch die NADH-Kinase, durch E&sub1; in NADP&spplus; umgewandelt, und das NADP&spplus; wird in NADPH durch E&sub2; umgewandelt, nachdem dieses NADPH der Reaktion durch E&sub1; zugeführt wurde. Durch diesen Mechanismus wird eine cyclische Reaktion gebildet.
- Wenn wenigstens E&sub1; oder E&sub2; von NADP&spplus; abhängig ist, entsteht keine cyclische Reaktion für NAD(H), und daher kann nur NADPH mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden.
- In jedem Cyclus der cyclischen Reaktion führt die Reaktion durch E&sub1; zum Verbrauch von P&sub1; in einer Menge, die äguimolar der Menge von NADPH und der Produktion äquimolarer Mengen von P&sub1; und NADP&spplus; ist, und die Reaktion durch E&sub2; führt zu einem Verbrauch von P&sub2; in einer Menge die äquimolar mit der Menge von NADP+ und der Produktion äquimolarer Mengen von P&sub2; und NADPH ist. Für eine bestimmte NADPH-Menge in der Lösung ist die Geschwindigkeit der cyclischen Reaktion schneller als die der Reaktion durch E&sub1; allein. Daher wird jedes Substrat in einer Menge von Ahzahl von Molekülen benötigt, die größer als die Anzahl der cyclen ist pro Mol der quantitativ zu bestimmenden Komponente. Im allgemeinen wird jedes Substrat in großem Überschuß verwendet. Z.B. kann es in einer Menge von 10 bis 10 000 mal soviel NADH der Lösung eingesetzt werden. Jeweils E&sub1; und E&sub2; werden in der cyclischen Reaktion in einer optionalen Menge ausgesetzt, die ausreichend ist, die cyclische Reaktion fortzuführen. Hierfür kann eine Menge, die ausreichend ist, eine Anzahl von Cyclen durchzuführen, die die erwünschte Empfindlichkeit erlaubt, geeignet je nach der Menge der zu messenden Komponente ausgewählt werden. Es ist z.B. bevorzugt, zehn Zyklen oder mehr der Reaktion pro Minute durchzuführen. Zu diesem Zweck ist die Menge an jeden verwendeten Enzym vorzugsweise 1 bis 100 Einheiten. Wenn ein Elektronenträger verwendet wird, ist seine Menge vorzugsweise 0,01 bis 10 mM. Als pH-Bereich für die cyclische Reaktion kann jeder pH-Bereich eingesetzt werden, so lange in diesem Bereich die verwendeten Enzyme stabil sind und ausreichend agieren, und die cyclische Reaktion glatt durchgeführt werden kann. Im allgemeinen wird ein pH-Bereich von ca. 6,0 bis 9,5 durch Auswahl einer geeigneten Puffer-Lösung eingesetzt. Es können z.B. Phosphat-Puffer und Good's-Puffer verwendet werden. Die Reaktion wird im allgemeinen bei ca. 25 bis 40ºC 1 min oder länger durchgeführt, obwohl die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit nicht kritisch sind.
- Anschließend ist es zur Messung einer variablen Menge, die in der cyclischen Reaktion detektierbar ist, das die Veränderung der Menge von S&sub1; oder S&sub2; Verbrauch oder die Menge an produzierten P&sub1; oder P&sub2; gemessen wird. Diese Komponenten können geeignet nach einem üblichen Verfahren gemessen werden. Oxidase, Peroxidase und ähnliche, die auf diese Komponenten als ein Substrat einwirken, können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes Beispiel ist wie folgt. Wenn NADPH-Diaphorase als E&sub1; verwendet wird und ein Tetrazoliumsalz 2,6- Dichlorphenolindophenol oder ähnliches als S&sub1; verwendet wird, kann die variable Menge in der cyclischen Reaktion als Farbveränderung oder Verblassung eines Farbstoffs beobachtet werden. Daher kann die variable Menge in der cyclischen Reaktion leicht kolorimetrisch durch Messen der Absorption mit fortschreitender Zeit gleichzeitig mit der Reaktion gemessen werden. Es ist auch möglich, die variable Menge nach Abbruch der cyclischen Reaktion zu messen. Wenn NAD(P)H- Oxidase als E&sub1; verwendet wird, und man Peroxidase in Kombination damit einwirken läßt um H&sub2;O&sub2;, gebildet durch NAD(P)H-Oxidase, in ein farbproduzierendes System einzuführen, kann die variable Menge der cyclischen Reaktion entweder simultan mit der Reaktion oder nach Abbruch der Reaktion gemessen werden.
- Die Menge einer in der cyclischen Reaktion verbrauchten Komponente oder die Menge einer darin produzierten Komponente wird so bestimmt, wodurch die Menge von NADH oder ATP in der Lösung mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung einer Kalibrierungskurve NADH oder ATP bestimmt werden kann. Ferner kann aus der Menge von so bestimmten NADH einer der Faktoren im Enzym-Reaktionssystem durch Dehydrogenase E&sub0;, wie in der verwendeten Lösung aufgebaut, d.h. die enzymatische Aktivität von E&sub0; und die Menge an NAD&spplus; und die Menge eines Substrates für Dehydrogenase E&sub0; kann bestimmt werden. Aus der Menge an bestimmten ATP kann einer der Faktoren im Enzym- Reaktionssystem durch Kinase, aufgebaut in der verwendeten Lösung, d.h. die enzymatische Aktivität der Kinase, die Menge an ADP und die Menge einer phosphorhaltigen Verbindung als Substrat für die Kinase, bestimmt werden. Wenn das NAD&spplus;, das Substrat A, das ADP oder die phosphorhaltige Verbindung als ein Substrat für die Kinase durch eine andere Reihe von Reaktionen produziert wird, kann einer der Faktoren, der an der Reaktion ganz am Anfang teilnimmt, quantitativ gemessen werden.
- Die Enzyme und notwendigen Reagenzien, die der Durchführung der Quantifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können in Form wäßriger Lösung(en) oder trockener Pulver als ein System oder als Vielzahl von Systemen gelagert werden. Die Mengen an Enzymen und die notwendigen Reagenzien werden bestimmt und wäßrige Lösungen einer geeigneten Kombination der Enzyme und Reagenzien für die Quantifizierung verwendet. Obwohl die Volumen der pro Test verwendeten wäßrigen Lösungen nicht kritisch sind, sind sie im allgemeinen 50 ul bis ca. 5 ml. Obwohl das Volumen einer Lösung, die einer Quantifizierung unterworfen werden soll, ebenfalls nicht kritisch ist, ist es im allgemeinen ca. 5 ul bis ca. 5 ml.
- Die enzymatische Reaktion in der Lösung, nach der NADH freigesetzt wird, und produziert wird, kann entweder zuvor und getrennt oder gleichzeitig mit der enzymatischen Reaktion durch NADH-Kinase im gleichen System durchgeführt werden. Dann wird die cyclische Reaktion durchgeführt und eine variable Menge, die in der Reaktion nachweisbar ist, gemessen.
- Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert.
- Pichia membranaefaciens YS27 (FEEM BP-3208) wurde in 50 ml des Kulturmediums A (pH 5,5) aus 2 % Glucose, 1 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,9 % Monokaliumhydrogenphosphat, 0,6 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Calciumchlorid und 0,05 % Magnesiumsulfat in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30ºC 24 h unterzogen. Die so erhaltene Anzuchtkultur wurde in 20 ml eines Kulturmediums A inokuliert und 18 h bei 30ºC in einem 30-l Schüttel-Fermenter unter Bedingungen einer Belüftungsrate von 20 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 300 Upm kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation unter Erhalt von 1 406 g Zellen gesammelt. Die gesamten Zellen wurden in 20 l eines Kulturmediums B (pH 5,5) aus 0,5 % Glucose, 1 % Hefe-Extrakt, 1 % Pepton, 0,9 % Monokaliumhydrogenphosphat, 0,6 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Calciumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat und 2 % Natriumsuccinat inokuliert und bei 30ºC 6 h in einem 30 l Schüttelfermenter unter Bedingungen einer Belüfungsrate von 20 l/min und einer Rührrate von 300 Upm kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation unter Erhalt von l 428 g Zellen gesammelt. Die gesamten Zellen wurden in einem 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), enthaltend 0,1 M Saccharose und 0,5 % Triton X-100 dispergiert, um ein totales Volumen von 5 l herzustellen, und die erhaltene Dispersion wurde unter Verwendung von Glasperlen mit einer DYNO-Mühle [WAB (Schweiz)] gemahlen.
- Anschließend wurden 5 280 ml des gemahlenen flüssigen Produktes wiedergewonnen und vom Präzipitat durch Zentrifugation befreit, und die Enzymlösung wurde gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), enthaltend 0,05 M Natriumchlorid unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschluß Molekulargewicht: 6 000) dialysiert.
- Anschließend wurden 5 260 ml der so erhaltenen Enzymlösung durch eine CM-Sephadex C-50 Säule (Pharmacia AB), die zuvor mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), enthaltend 0,05 M Natriumchlorid, geleitet, um hierauf adsorbiert zu werden, und wurde dann mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid gewaschen. Anschließend erfolgte die Elution mittels eines Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,4 M unter Sammlung einer aktiven Fraktion.
- Der Puffer in 455 ml des Eluats wurde in 10 mM HEPPS-Puffer (pH 7,5), enthaltend 10 % Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl&sub2; unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschluß- Molekulargewicht: 6 000) dialysiert. Die so erhaltene Lösung wurde über eine Phenyl-Toyopearl 650 Säule (Tosoh Ltd.), die zuvor mit demselben Puffer wie oben gepuffert worden war, unter Adsorption hieran geleitet, und mit 10 mM HEPPS-Puffer (pH 7,5), enthaltend 10 % Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl&sub2;, gewaschen.
- Anschließend erfolgte die Elution mittels eines Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 10 bis 0 % unter Sammlung einer aktiven Fraktion.
- Anschließend wurden 372 ml des Eluats auf einem Volumen von 25 ml unter Verwendung einer als Ultrafiltrationsapparatur (Ausschluß-Molekulargewicht: 10 000), hergestellt von Amicon, konzentriert und auf eine Sephacryl S-300 HR Säule (hergestellt von Pharmacia AB), die zuvor mit 10 mM HEPPS- Puffer (pH 7,5) enthaltend 0,2 M Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl2, aufgegeben, und es erfolgte die Gel-Filtration. Die aktive so erhaltene Fraktion wurde konzentriert und dann unter Erhalt von 117,3 mg (Ausbeute: 34 %) einer Präparation des vorliegenden Enzyms gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität dieser Präparation war 102 E/mg.
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge an NADH, das im System vorlag, welches eine große Menge an NAD&spplus; enthielt, wurden 0,4 ml einer Proben-Lösung, enthaltend 2 mM NAD&spplus; und verschiedene Konzentrationen (0 bis 10 uM) NADH wurden zu 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung 1 wie oben gezeigt zugesetzt, und die Reaktion erfolgte bei 35ºC für 20 min. Nach Abbruch der Reaktion wurden 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der unten gezeigten Reagenzlösung II mit der Reaktionslösung gemischt, und die erhaltene Mischung wurde sofort in eine Kuvette mit konstanter Temperatur von STASAR III Spektrophotometer von Gilford eingeführt einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit dieser Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 60 nm mit Verstreichen der Zeit gemessen, wodurch der Unterschied (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; rim/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Einleitung der Farbreaktion als Meßwert erhalten wurden. Konsequenterweise wurde wie in Figur 5 gezeigt, ein gute Linearität zwischen der NADH-Konzentration und der ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min mit hoher Empfindlichkeit erhalten.
- Die Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 8,5):
- 100 mM HEPPS
- 7,5 mM ATP
- 15 mM Magnesiumchlorid
- 0,3 M Natriumacetat
- 10 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II (pH 8,0):
- 50 mM HEPPS
- 10 mN Magnesiumchlorid
- 0,1 % Rinderserumalbumin
- 2,5 IE/ml G-6-P Dehydrogenase (NADP&spplus;-abhängig)
- 5 IE/ml Diaphorase
- 300 um 2, 6-Dichlorphenolindophenol
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge Natriumcholat wurden 80 ul einer Probenlösung, enthaltend jeweils eine Konzentration (0 bis 100 uM) Natriumcholat zu 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung I wie im folgenden gezeigt, zugegeben, und die Reaktion erfolgte bei 35ºC für 20 min. Nach Abbruch der Reaktion wurden 0,8 ml der Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II wie unten gezeigt mit der Reaktionslösung vermischt und die erhaltene Mischung wurde sofort in eine konstant temperierte Kuvette eines STASAR III Spektrophotometers von Gilford eingefüllt und einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit dieser Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 600 nm mit Verstreichen der Zeit gemessen, wodurch der Unterschied (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) zwischen Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Einleitung der Farbreaktion als Meßwerte bestimmt wurden. Als Konsequenz wie in Figur 6 gezeigt, konnte eine gute Linearität zwischen der Natriumcholat-Konzentration und der ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min mit hoher Empfindlichkeit erhalten werden.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 8,5):
- 67 mM HEPPS
- 5 mM ATP
- 20 mM Magnesiumchlorid
- 0,2 M Natriumacetat
- 2 mM NAD&spplus;
- 0,3 IE/ml 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (erhältlich von Oriental yeast Co., Ltd.)
- 7 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- Es ist dieselbe wie die Zusammensetzung der Reagenzlösung II aus Bedeutung 2.
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge an Natriumcholat, wurden jeweils 50 ul einer jeden Natriumcholat-Lösung mit den Konzentrationen 50, 100, 150, 200 und 250 uM zu einer Probe von 300 ul einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung I wie oben gezeigt, zugemischt. Man ließ die erhaltene Mischung 5 min bei 30ºC stehen, worauf 300 ul der unten gezeigten NK-Lösung zugegeben wurde, und die Reaktion wurde bei 30ºC 20 min durchgeführt. Dann wurden 3,0 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II wie unten gezeigt, mit der Reaktionslösung vermischt. Die erhaltenen Mischungen wurden einer Reaktion bei 30ºC unterworfen, und die mittlere Veränderung der Absorption bei 550 nm pro Minute von 1 min bis 6 min nach der Einleitung der Reaktion gemessen. Konsequenterweise wurden eine gute Linearität ausgehend von Nullpunkt mit hoher Empfindlichkeit zwischen Natriumcholat-Konzentration und der mittleren Veränderung der Absorption bis zu einer Natriumcholat- Konzentration von 200 um, wie in Figur 7 gezeigt, bei Verwendung von β-NAD&spplus; und wie in Figur 8 bei Verwendung von Thio-NAD&spplus; gezeigt, erhalten.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 8,5):
- 65 mM Dikaliumphosphat
- 8 mM ATP
- 20 mM Magnesiumchlorid
- 0,5 M Natriumacetat
- 5 mM NAD&spplus; (β-Form oder Thio-Form)
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 10 IE/ml 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
- Zusammensetzung der NK-Lösung:
- 7,7 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- 0,2 M Ammoniumsulfat
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II (pH 8,0):
- 20 mM G-6-P
- 50 mM Dikaliumphosphat
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 1,2 mM Nitrotetrazolium-Blau
- 0,1 M EDTA-2Na
- 0,5 % Triton X-100
- 3 IE/ml G-6-P Dehydrogenase aus Hefe (6 IE/ml im Fall der Thio-Form)
- 3 IE/ml Diaphorase aus einem Bacillus (6 IE/ml Diaphorase aus einem
- Clostridium im Fall der Thio-Form)
- Zur Messung der Konzentration von Gallensäure im Serum wurden bei 200 ul von 24 humanen Seren als Proben oder 200 ul einer 50 uM Natriumcholat-Lösung als Standortlösung zur 300 ul einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung 1, wie unten gezeigt, zugegeben. Man ließ die erhaltene Mischung bei 30ºC 5 min stehen, worauf 300 ul der NK-Lösung, wie unten gezeigt, zugegeben wurden, und die Reaktion wurde bei 30ºC 20 min durchgeführt. Dann wurden 3,0 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II mit der Reagenzlösung vermischt. Die so erhaltene Mischung wurde einer Reaktion bei 30ºC unterworfen, und die Veränderung der Absorption bei 550 nm/min von 2 min bis 3 min nach der Einleitung der Reaktion wurde gemessen. Die Messung erfolgte für die Proben wie oben nach einem üblichen Verfahren, dem 3CL-HSD-Formazan-Verfahren. Als Folge zeigt der Vergleich zwischen dem vorliegenden Verfahren und dem 3α-HSD-Formazan-Verfahren wie in Tabelle 4 gezeigt, einen Korrelationskoeffizienten von 0,995 % eine gute Korrelation zwischen den beiden Verfahren. Die Gallensäure- Konzentrationen, berechnet auf Basis der Veränderung der Absorption in der Standardlösung, waren wie in Figur 9 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen wurde gefunden, daß das vorliegende Verfahren in guter Korrelation mit den üblichen Verfahren steht, d.h. dem 3α-HSD-Formazan-Verfahren, und es ermöglicht die genaue Messung von Gallensäuren mit einer höheren Empfindlichkeit als beim 3α-HSD-Formazan-Verfahren.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 8,5):
- 65 mM Dikaliumphosphat
- 12 mM ATP
- 20 mM Magnesiumchlorid
- 0,75 M Natriumacetat
- 7,5 mM β-NAD&spplus;
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 60 mM Kaliumoxamat
- 15 IE/ml 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
- Zusammensetzung der NK-Lösung:
- 13,5 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- 0,2 M Ammoniumsulfat
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II (pH 8,0):
- 20 mM G-6-P
- 50 mM Dikaliumphosphat
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 1,2 mM Nitrotetrazolium-Blau
- 0,1 m EDTA-2Na
- 0,5 % Triton X-100
- 3 IE/ml G-6-P Dehydrogenase aus Hefe
- 3 IE/ml Diaphorase aus einem Bacillus
- 40 mM Kaliumoxamat Tabelle 4 Probe 3α-HSD-Formazan-Verfahren Erfindungsgemäßes Verfahren (NK-Verfahren) Standardlösung Humanserum Formazan-Verfahren: Absorption x 10&sup4; bei 550 nm Erfindungsgemäßes Verfahren: Absorption x 10&sup4; bei 550 nm
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge 3- Hydroxybutyratdehydrogenase wurden 400 ul einer Probe, enthaltend verschiedene Konzentrationen (0 bis 60 IE/l) 3-Hydroxybutyratdehydrogenase zu 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung I wie unten gezeigt, zugegeben, und die Reaktion erfolgte bei 35ºC für 10 min. Nach Abbruch der Reaktion wurden 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II, wie unten gezeigt, mit der Reaktionslösung vermischt, und die erhaltene Mischung wurde unmittelbar in eine konstant temperierte Kuvette eines Spektrophotometers eingefüllt und der Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit dieser Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 600 nm mit Verstreichen der Zeit gemessen, wodurch der Unterschied (ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Einleitung der Farbreaktion als Meßwert erhalten wurden. Als Folge wurde wie in Figur 10 gezeigt, eine gute Linearität zwischen der 3-Hydroxybutyrat-Aktivität und dem ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min mit hoher Empfindlichkeit erhalten.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 8,5):
- 100 mM HEPPS
- 7,5 mM ATP
- 15 mM Magnesiumchlorid
- 0,3 M Natriumacetat
- 3 mM β-NAD&spplus;
- 90 mM 3-Hydroxybuttersäure
- 10 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II:
- Entspricht der Zusammensetzung der Reagenzlösung II wie in Beispiel 2 verwendet.
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge an Glycerin wurden jeweils 50 ul von Glycerin-Lösungen mit Konzentrationen von 10, 20, 30, 40 und 50 uM als Probe zu 300 ul einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung I wie unten gezeigt zugegeben. Man ließ die erhaltene Mischung 5 min bei 30ºC stehen, worauf 300 ul der NK-Lösung, wie unten gezeigt, zugegeben wurden, und die Reaktion erfolgte bei 30ºC für 20 min. Dann wurden 3,0 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II, wie unten gezeigt, mit der Reaktionslösung vermischt. Die so erhaltene Mischung wurde einer Reaktion bei 30ºC unterworfen, und die Veränderung der Absorption bei 550 nm/min von 1 min bis zu 6 min nach Einleitung der Reaktion verfolgt. Es wurde wie in Figur 11 eine gute Linearität, ausgehend vom Nullpunkt zwischen der Glycerin-Konzentration und der mittleren Veränderung der Absorption mit hoher Empfindlichkeit gefunden.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung I (pH 9,0):
- 65 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan
- 8 mM ATP
- 20 mM Magnesiumchlorid
- 0,5 M Natriumacetat
- 5 mM α-NAD&spplus;
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 7 IE/ml Glycerindehydrogenase
- Zusammensetzung der NK-Lösung:
- 7,7 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- 0,2 M Ammoniumsulfat
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II (pH 8,0):
- 20 mM G-6-P
- 50 mM Dikaliumphosphat
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 1,2 mM Nitrotetrazolium-Blau
- 0,1 M EDTA-2Na
- 0,5 % Triton X-100
- 3 IE/ml G-6-P Dehydrogenase aus Hefe
- 3 IE/ml Diaphorase aus einem Bacillus
- Zur Bestimmung einer kleinen Menge von Alkoholdehydrogenase wurden jeweils 50 ul von Alkoholdehydrogenase-Lösungen mit Enzym-Konzentrationen von 1, 2, 3, 4 und 5 IE/l zu einer Probe von 300 ul einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung 1, wie unten gezeigt, zugegeben. Man ließ die erhaltene Mischung 10 min bei 30ºC stehen, worauf 300 ul der NK-Lösung wie unten gezeigt zugegeben wurden, und es erfolgte die Reaktion bei 30ºC für 20 min. Dann wurden 3 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II wie unten gezeigt mit der Reaktionslösung vermischt. Die erhaltene Mischung wurde einer Reaktion bei 30ºC unterworfen, und die mittlere Veränderung der Absorption bei 550 nm pro Minute von 1 min bis 6 min nach der Einleitung der Reaktion wurde gemessen. Wie in Figur 12 gezeigt, wurde eine gute Linearität ausgehend vom Nullpunkt zwischen der Alkoholdedhydrogenase-Aktivität und der mittleren Veränderung der Absorption mit hoher Empfindlichkeit erhalten.
- Zusammensetzung von Reagens I (pH 9,0):
- 65 mM Glycylglycin
- 8 mM ATP
- 20 mM Magnesiumchlorid
- 0,5 M Natriumacetat
- 014 mm Thio-NAD&spplus;
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 50 mM n-Amylalkohol
- Zusammensetzung der NK-Lösung:
- 7,7 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- 0,2 M Ammoniumsulfat
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II (pH 8,0):
- 20 mM G-6-P
- 50 mM Dikaliumphosphat
- 0,03 % Rinderserumalbumin
- 1,2 mM Nitrotetrazolium-Blau
- 0,1 M EDTA-2Na
- 0,5 % Triton x-100
- 6 IE/min G-6-P Dehydrogenase aus Hefe
- 6 IE/min Diaphorase aus einem Clostridium
- Zur Bestimmung einer geringen Menge an ATP wurden 400 ul einer Probenlösung, die jeweils eine Konzentration (0 bis 50 uM) ATP enthielt, zu 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung 1, wie unten gezeigt, zugegeben, und die Reaktion wurde bei 35ºC 20 min durchgeführt. Nach Abbruch der Reaktion wurden 0,8 ml einer Reagenzlösung mit der Zusammensetzung der Reagenzlösung II, wie unten gezeigt, mit der Reaktionslösung vermischt, und die erhaltene Mischung wurde sofort in eine konstant temperierte Kuvette eines Spektrophotometers eingefüllt und einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Gleichzeitig mit dieser Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 600 nm mit Verstreichen der Zeit gemessen, worauf der Unterschied ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min) zwischen den Absorptionswerten 1 min und 2 min nach Einleitung der Farbreaktion als Meßwert ermittelt wurde. Wie in Figur 13 gezeigt, konnte eine gute Linearität zwischen der ATP-Konzentration und dem ΔOD&sub6;&sub0;&sub0; nm/min mit hoher Empfindlichkeit erhalten werden.
- Zusammensetzung der Reagenzlösung 1 (pH 8,5):
- 100 mM HEPPS
- 3 mM NADH
- 15 mM Magnesiumchlorid
- 0,3 M Natriumacetat
- 10 E/ml NADH-Kinase (hergestellt in Beispiel 1)
- Zusammensetzung der Reagenzlösung II entspricht der Zusammensetzung der Reagenzlösung II aus Beispiel 2.
- Das erfindungsgemäße Bestimmungs-Verfahren ist ein neues Verfahren, welches eine hochempfindliche Bestimmung einer geringen Menge an NADH in einem System erlaubt, daß NAD&spplus; und NADH als Mischung enthält, ohne Einfluß durch NAD&spplus;. Ferner erlaubt das Verfahren aus Messung von einer der folgenden Komponenten Enzym-Aktivitäten, die in verschiedenen Enzym- Reaktionssystemen unter Verwendung von NAD&spplus; oder ADP als Substrat teilnehmen, NAD&spplus;, ADP und Substrate die zusammen damit reagieren. Demnach ermöglicht es das Verfahren die Bestimmung einer Menge einer Substanz, die als Marker einer Pathose dienen kann, genau mit hoher Empfindlichkeit in kurzer Zeit bei der Diagnose von Krankheiten und ähnlichen Zuständen und ist anwendbar in automatische Analysen, so daß eine exakte Diagnose erstellt werden kann. Daher ist das Verfahren industriell sehr nützlich im Bereich der klinischen Medizin usw.
Claims (4)
1. Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von NADH
umfassend:
Einwirken lassen einer NADH-Kinase, die hochspezifisch
für NADH ist, auf eine Lösung, enthaltend NAD&spplus; und NADH,
in Gegenwart von divalenten Metallionen und XTP [wenn X
A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin), C (Cytidin), I
(Inosin), dT (Thymidin), dA (Deoxyadenosin), dU
(Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin), dC (Deoxycytidin)
oder dI (Deoxyinosin) ist] unter Bildung von XDP (worin
X wie oben definiert ist) und NADPH,
Unterwerfen des NADPH's einer cyclischen Reaktion unter
Einsatz einer katalytischen Reaktion, die zur Oxidation
von NADPH in NADP+ und einer katalytischen Reaktion die
zur Reduktion von NADP+ in NADPH in der Lage ist,
Messen der variablen Menge eines Substrats, das durch
die cyclische Reaktion verbraucht oder eines Produkts,
das durch die cyclische Reaktion gebildet wurde, und
hierdurch Bestimmen der Menge von ausschließlich NADH in
der Lösungsmischung enthaltend NAD&spplus; und NADH.
2. Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von NADH nach
Anspruch 1, worin NAD&spplus; ist β-NAD&spplus;, Thio-NAD&spplus; oder
α-NAD&spplus;, und NADH ist β-NADH, Thio-NADH oder α-NADH.
3. Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von XTP
umfassend: Einwirken lassen einer NADH-Kinasel die
hochspezifisch für NADH ist, auf eine Lösung, enthaltend
NAD&spplus; und NADH, in Gegenwart von divalenten Metallionen
und XTP [wenn X A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin),
C (Cytidin), I (Inosin), dT (Thymidin), dA
(Deoxyadenosin), dU (Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin),
dC (Deoxycytidin) oder dI (Deoxyinosin) ist] unter
Bildung von XDP (worin X wie oben definiert ist) und
NADPH,
Unterwerfen des NADPH's einer cyclischen Reaktion unter
Einsatz einer katalytischen Reaktion, die zur Oxidation
von NADPH in NADP&spplus; und einer katalytischen Reaktion die
zur Reduktion von NADP&spplus; in NADPH in der Lage ist,
Messen der variablen Menge eines Substrats, das durch
die cyclische Reaktion verbraucht oder eines Produkts,
das durch die cyclische Reaktion gebildet wurde, und
hierdurch Bestimmen der Menge an XTP.
4. Verfahren zur hochempfindlichen Bestimmung von XTP nach
Anspruch 3, worin NAD&spplus; ist NAD&spplus; ist β-NAD&spplus;, Thio-NAD&spplus;
oder α-NAD&spplus;, und NADH ist β-NADH, Thio-NADH oder β-NADH.
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