CN114527117B - 一种测定糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种测定糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法，测定方法为紫外可见光谱法。分析糖溶液时：(1)标准溶液制备，(2)水解反应；(3)显色反应；(4)建立标准曲线或通用模型；(5)样品检测；(6)结果输出。分析烟草浸提液时：(1)烟草浸提液制备；(2)水解反应；(3)显色反应；(4)建立标准曲线或通用模型；(5)样品检测；(6)结果输出。由于采用间苯三酚显色剂、显色步骤位于水解步骤之后、水解采用浓盐酸与冰醋酸的混酸，常温条件，从而首次实现间苯三酚法用于葡萄糖的检测，且可葡萄糖与木糖同时测定，用于糖溶液、烟草浸提液中葡萄糖和木糖的检测时，操作快速简便、检测效率高、准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及烟草及烟草制品品质分析领域，尤其涉及一种测定糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法。
背景技术
烟草中的糖类物质在燃烧条件下可热裂解产生各种新生化合物，从而影响卷烟的香气和口感，并且不同的糖组分还会产生不同影响。研究表明，卷烟中葡萄糖含量能够丰富卷烟香气，提高烟气的圆润性；果糖含量有利于提高烟叶的绵延性和甜度，减少杂气；木糖含量有利于提高烟气的润感与口感的甜味，使得香气质感更细腻柔滑。因此，一种准确、快速的单糖分析检测方法是实现烟草行业品控分析的重要前提。
目前，烟草行业糖的测定方法主要有费林试剂法、连续流动分析法、气相色谱法和高效液相色谱法等。其中费林试剂法和连续流动分析法测定的都是总量，不能测定单个成分的含量；气相色谱法需要糖类化合物衍生化后才能分析，操作较麻烦；相对于气相色谱法，高效液相色谱经样品前处理后可直接进样，但同样存在前处理麻烦的问题，如需用固相萃取柱预分离等，且上述方法仪器设备成本普遍较高。因此在烟草行业当中，迫切需要开发一种简单、快速的单糖分析方法。
紫外可见色谱法由于其方法简单快速、仪器价格便宜，并且检测效率高而受到各行业的广泛应用。在高温酸性条件下糖类物质能够通过水解反应生成糠醛和羟甲基糠醛，在显色剂作用下生成能够在可见光区产生具有特征吸收的糠醛衍生物。基于此发现，近年来，研究人员开发出了蒽酮-硫酸比色法、苯酚-硫酸比色法、3,5-二硝基水杨酸比色法等一系列还原糖检测方法，使紫外可见色谱法可用于烟草行业糖的测定。然而，由于原料的特殊性，烟草中的烟碱、茄尼醇、单宁、色素等物质容易与糖类一起溶解到浸提液体中，使得液体呈深黄色从而干扰分析检测结果。在早期的工作中会加入一定量的活性炭粉末来消除这一干扰，然而需要较长的脱色时间(30～60min)，活性炭成本也较高，另外，加入的活性炭粉末不但会吸附一定量的待测组分，还会引入额外的干扰和污染，降低测量结果准确性。近年来有研究表明，采用高倍稀释法也可以降低干扰，但是对检测方法的准确性提出了更高的要求，目前还没有发展出满足此准确性的成熟检测方法。另外，现有大部分显色方法中使用浓硫酸，而浓硫酸是一种具有高腐蚀性的强矿物酸，脱水性强，导致糖碳化问题，而且浓硫酸对人体危险性较大。
间苯三酚法是一种准确度较高的分光光度法，目前主要应用于木糖的测定，对于葡萄糖的显色效果不佳。另外现有紫外可见色谱法很难实现两种以上糖类分别同时测定。
发明内容
为了解决现有间苯三酚法对葡萄糖显色效果不佳、现有紫外可见色谱法很难实现两种以上糖类分别同时测定、浓硫酸对人体危险性较大、烟草中生物碱等物质干扰测定结果紫外可见色谱法测定烟草中糖类的准确性有待提高等技术问题，本发明的第一方面提供一种测定糖溶液中葡萄糖与木糖含量的方法，本发明的第二方面提供一种测定烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法。
本发明的技术方案：
本发明的第一技术方案，一种测定糖溶液中葡萄糖与木糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液制备：配制不同浓度的单糖标准溶液以及混糖溶液，所述单糖标准溶液为葡萄糖标准溶液和木糖标准溶液，所述混糖溶液为等体积已知浓度的单糖标准溶液随机混合的混合物；
(2)水解反应：向含单糖标准溶液或混糖溶液的试管中加入浓盐酸和冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却；
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置；
(4)建立标准曲线：将步骤(1)中不同浓度的单糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2)和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；对于单糖标准溶液，根据不同浓度单糖标准溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型1，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2；
(5)样品检测：取与步骤(4)所用浓度不同的样品糖溶液，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录样品的光谱吸光度信号值，所述样品糖溶液为葡萄糖溶液，木糖溶液和混糖溶液中任一种；
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断样品糖溶液中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型1和通用模型2中，得到样品中葡萄糖与木糖含量。
本发明的第二技术方案，一种测定烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)烟草浸提液制备：采用水为萃取剂对烟草样品在恒温水浴振荡器上振荡萃取，过滤，弃去初始滤液，收集后续滤液备用，得到烟草浸提液；
(2)水解反应：向含单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液的试管中加入浓盐酸和冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却；
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置；
(4)建立标准曲线：将不同浓度的单糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2) 和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；对于单糖溶液，根据不同浓度单糖溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型1，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2；
(5)样品检测：将步骤(1)所得的未知浓度的烟草浸提液稀释后，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录烟草浸提液的光谱吸光度信号值；
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断所述烟草浸提液中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型1和通用模型2中，得到样品中葡萄糖与木糖含量。
在第一技术方案和第二技术方案中的所述步骤(2)中所述单糖标准溶液或混糖溶液或样品糖溶液或烟草浸提液与混酸的体积比为1:3-1:6，所述混酸中浓盐酸的体积大于冰醋酸的体积，优选的，所述浓盐酸与冰醋酸的体积比为2:1-5:1。
在第一技术方案和第二技术方案中的所述步骤(2)中所述恒温水浴温度为沸水浴温度，所述反应时间为40-80min。
在第一技术方案和第二技术方案中的所述步骤(3)进行所述显色反应时，采用间苯三酚 /乙醇显色剂，显色剂与所述单糖标准溶液或混糖溶液或样品糖溶液或烟草浸提液的体积比为 1：1，显色剂浓度为2％，静置时间为2min以内。
在第一技术方案和第二技术方案中的所述步骤(4)建立标准曲线时对于葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和混糖溶液的测定波长分别为470nm、478nm、471nm～477nm。
在第二技术方案中的所述步骤(1)中制备所述烟草浸提液时，所述烟草样品为0.1±0.0001 g时，所述萃取剂纯水的体积为20mL。所述恒温水浴振荡器的温度为30±0.5℃，转速为 200rpm，振荡萃取时间为30min。
在第二技术方案中的所述步骤(5)中所述烟草浸提液的稀释倍数通过所述烟草浸提液的光谱吸光度信号值处于0.7～1.0之间确定。
本发明的有益技术效果：
本发明的方法，不论分析糖溶液还是烟草浸提液，首先通过将不同浓度单糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液经水解和显色处理后，测定紫外可见光谱吸光度值，并分别建立葡萄糖标准曲线、木糖标准曲线和混糖通用模型1和2，在此基础上分别对样品糖溶液和烟草浸提液经过上述同样的水解和显色处理后，测定紫外可见光谱吸光度值。根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断所测样品糖溶液和烟草浸提液中糖的类型。若特征峰位于470nm处，则溶液中几乎只含有葡萄糖，带入葡萄糖标准曲线，即可求出样品糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖含量，木糖同理；若特征峰出现于471nm～477nm之间，表明溶液同时含有葡萄糖与木糖，带入通用模型1和2，得到样品糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量。
本发明的显色原理为通过间苯三酚络合葡萄糖和木糖水解液中的糠醛与羟甲基糠醛，在溶液中产生黄色醌型化合物，然后采用紫外可见色谱法测定溶液的光谱吸光度值。
由于本发明的方法采用了间苯三酚法显色，并将间苯三酚显色反应置于水解反应之后，水解反应中采用浓盐酸替代浓硫酸，并减少冰醋酸用量，以增加水解反应时间，从而增加葡萄糖的水解时间，使结构更为稳定的葡萄糖完全转化为羟甲基糠醛，以增加间苯三酚对葡萄糖水解产物的显色效果，从而减少葡萄糖与木糖的显色结果差异；并于常温下进行显色，避免间苯三酚显色时与糖水解出的醛基形成不稳定的醌型中间体在高温条件下易分解，增加显色效果。最终结果显示葡萄糖的显色效果得到大幅提高，显著提高了使用该方法检测葡萄糖时的灵敏度，从而首次实现将间苯三酚法应用于葡萄糖的检测，从而实现葡萄糖与木糖的同时测定，应用于糖溶液、烟草及烟草制品中葡萄糖和木糖的检测时，可以实现快速测定，且操作简便。
相对于目前文献记载的蒽酮比色法、苯酚硫酸比色法等类似检测烟草糖含量的方法，本发明具有更为优秀的准确度，对于0.01mmol/L的葡萄糖与木糖仍具有较明显的实验现象，可以实现低浓度糖的准确检测。
在此基础上，对于同时含葡萄糖与木糖的样品溶液，本发明的方法采用多维数据处理技术通过二维相关性矩阵分析，具体的，利用化学统计学软件进行偏最小二乘回归(PLSR)分析，建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量、木糖含量之间的映射，从而建立数据模型辅助，即混糖通用模型，计算葡萄糖和木糖浓度，以实现同步定量测定糖溶液和烟草浸提液中葡萄糖与木糖的含量。对于仅含单糖的样品，带入葡萄糖标准曲线、木糖标准曲线即可得知单糖浓度。
本发明水解步骤中使用的酸为浓盐酸和冰醋酸，相对于强脱水性的浓硫酸，能提供更加温和的反应环境，避免浓硫酸过强的吸水性而导致的糖碳化问题，而且浓盐酸和冰醋酸对人体危险性也比浓硫酸要小很多，更能保证实验人员操作过程中的安全问题。
本发明的检测烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法，采用高倍稀释方法消除烟草浸提液本身带来的颜色干扰，在此基础上采用上述间苯三酚紫外可见色谱法实现了高准确性的后续检测方法。所述烟草样品的浸提液稀释倍数通过所述烟草浸提液的光谱吸光度信号值处于 0.7～1.0之间确定。优选的，步骤(5)中所述浸提液稀释倍数为20倍，样品颜色由橙黄色变为淡黄色，最终对步骤(4)检测结果不造成影响。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中单一葡萄糖、单一木糖、混糖溶液的紫外/可见光谱特征吸收峰；其中葡萄糖、木糖浓度为0.4mmol/L；混糖A为0.2mmol/L葡萄糖+0.2mmol/L木糖；混糖A为0.1mmol/L葡萄糖+0.1mmol/L木糖；
图2为实施例1和实施例2中的紫外/可见光谱吸光度信号值—葡萄糖浓度标准曲线；
图3为实施例1和实施例2中的紫外/可见光谱吸光度信号值—木糖浓度标准曲线；
图4为实施例1和实施例2中通过通用模型1得到的预测数据与实测数据的相关性分析；
图5为实施例1和实施例2中通用模型1预测值与实测值之间的偏差值；
图6为实施例1和实施例2中通过通用模型2得到的预测数据与实测数据的相关性分析；
图7为实施例1和实施例2中通用模型2预测值与实测值之间的偏差值。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图1-7对本发明作进一步具体详细描述。本发明并不局限于以下实施方式。
一种测定糖溶液中葡萄糖与木糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液制备：配制不同浓度的单糖标准溶液以及混糖溶液，所述单糖标准溶液为葡萄糖标准溶液和木糖标准溶液，所述混糖溶液为等体积已知浓度的单糖标准溶液随机混合的混合物。
(2)水解反应：向含单糖标准溶液或混糖溶液的试管中加入浓盐酸与冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却，以等体积去离子水进行相同的水解反应为空白样。
此步骤中，采用浓盐酸替代浓硫酸，并减少冰醋酸用量。具体的，含糖溶液与混酸的体积比为1:3-1:6，所述混酸中浓盐酸的体积大于冰醋酸的体积，优选的，所述浓盐酸与冰醋酸的体积比为2:1-5:1，更优选的，所述浓盐酸与冰醋酸的体积比为4:1。所述恒温水浴温度为沸水浴温度，所述反应时间为40-80min。
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置。
将显色步骤与水解步骤分开，显色反应置于水解之后，以增加葡萄糖水解时间，从而缩小葡萄糖、木糖的水解产物与间苯三酚显色的显色结果差异；并于常温下进行显色，避免间苯三酚显色时与糖水解出的醛基形成不稳定的醌型中间体在高温条件下易分解，增加显色效果。
采用间苯三酚/乙醇显色剂，显色剂与糖溶液的体积比为1：1，显色剂浓度为2％，静置时间为2min以内。
(4)建立标准曲线：将步骤(1)中不同浓度的葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2)和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；
对于单糖标准溶液，根据不同浓度单糖标准溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；
对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型1，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2。
所述建立标准曲线时对于葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和混糖溶液的测定波长分别为 470nm、478nm、471nm～477nm。
(5)样品检测：取与步骤(4)所用浓度不同的样品糖溶液，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录样品的光谱吸光度信号值，所述样品糖溶液可以为葡萄糖溶液，木糖溶液和混糖溶液中任一种。
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断样品糖溶液中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型1和通用模型2中，得到样品中葡萄糖与木糖含量。
一种测定烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)烟草浸提液制备：采用水为萃取剂对烟草样品在恒温水浴振荡器上振荡萃取，过滤，弃去初始滤液，收集后续滤液备用，得到烟草浸提液；
所述烟草样品为0.1±0.0001g时，纯水的体积为20mL。所述恒温水浴振荡器的温度为 30±0.5℃，转速为200rpm，振荡萃取时间为30min。
(2)水解反应：向含单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液的试管中加入浓盐酸与冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却，以等体积去离子水进行相同的水解反应为空白样；
此步骤中，采用浓盐酸替代浓硫酸，并减少冰醋酸用量。具体的，含糖溶液与混酸的体积比为1:3-1:6，所述混酸中浓盐酸的体积大于冰醋酸的体积，优选的，所述浓盐酸与冰醋酸的体积比为2:1-5:1，更优选的，所述浓盐酸与冰醋酸的体积比为4:1。所述恒温水浴温度为沸水浴温度，所述反应时间为40-80min。
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置；
将显色步骤与水解步骤分开，显色反应置于水解之后，以增加反应时间，从而增大葡萄糖、木糖的水解产物与间苯三酚显色的显色结果差异；并于常温下进行显色，避免间苯三酚显色与糖水解出的醛基形成不稳定的醌型中间体在高温条件下易分解，增加显色效果。
采用间苯三酚/乙醇显色剂，显色剂与糖溶液的体积比为1：1，显色剂浓度为2％，静置时间为2min以内。
(4)建立标准曲线：将不同浓度的葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2)和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；
对于单糖标准溶液，根据不同浓度单糖标准溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；
对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型1，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2；
所述建立标准曲线时对于葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和混糖溶液的测定波长分别为 470nm、478nm、471nm～477nm。
(5)样品检测：将步骤(1)所得的未知浓度的烟草浸提液稀释后，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录烟草浸提液的光谱吸光度信号值。
所述烟草浸提液稀释倍数为以使得最终吸光度处于0.7～1.0之间的稀释倍数为准。通过对比稀释烟草浸提液5、10、15、20倍，并在稀释20倍时最终吸光度达到最佳范围。不同品种原料或有不同最佳稀释倍数，应以最终吸光度合适为准。
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断烟草浸提液中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型1和通用模型2中，得到样品中葡萄糖与木糖含量。
下面为具体实施例。
实施例1测定自制单糖、混糖溶液中的葡萄糖与木糖含量的方法
(1)标准溶液制备：准确配制10.00mmol/L的葡萄糖与木糖储备母液，经过稀释得到浓度范围为0.01-2mmol/L的不同单糖标准溶液；将制备好的葡萄糖标准溶液与木糖标准溶液等体积随机混合，得到已知浓度的混糖溶液；
(2)水解反应：移取lmL步骤(1)中制备好的单糖标准溶液或混糖溶液于25mL具塞比色管中，加入4mL浓盐酸与lmL冰醋酸，摇匀后置入沸腾的恒温水浴锅中反应40min，反应完成后立即取出试管，放入冷水中冷却5min，以lmL去离子水进行相同的水解反应为空白样；
(3)显色反应：移取1mL2％浓度的间苯三酚/乙醇显色剂溶液，加入到步骤(2)中冷却好的水解液中，迅速摇匀试管并静置1min；
(4)建立标准曲线：将步骤(1)中配制的不同浓度的葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液及二者的混糖溶液经步骤(2)、(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，具体谱图见图 1；
由图1可知，若所测溶液中只含有葡萄糖，光谱的特征吸收峰出现在470nm处；若所测溶液中只含有木糖，光谱的特征吸收峰出现在478nm处；若二者皆有，则光谱的特征吸收峰出现于471nm～477nm之间，具***置与葡萄糖、木糖相对含量有关；
对于单糖标准溶液，根据所得到的不同浓度单糖标准溶液的光谱吸光度信号值与葡萄糖含量、木糖含量分别建立标准曲线，得到葡萄糖标准曲线：Y＝1.4138x-0.0196，相关系数 R2＝0.9961，见附图2；木糖标准曲线：Y＝4.3425x+0.0191，相关系数R2＝0.9960，见附图3；
对于检测0.01mmol/L的葡萄糖与木糖，最终吸光度可达到0.14与0.41，仍具有较明显的实验现象，可以实现低浓度糖的准确检测；
对于混糖溶液，利用多维数据处理技术，即化学统计学软件进行偏最小二乘回归(PLSR) 分析，建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量、木糖含量之间的映射，从而得到一个通用模型 1，Y＝5.6823X1+1.1474X2+0.0571(Y为吸光度，X1为木糖浓度，X2为葡萄糖浓度)，见附图4、5；再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2，Y＝0.9517X3+0.0558(Y为吸光度增量，X3为葡萄糖浓度增量)，从而消去木糖的影响，见附图6、7。由通用模型2计算得出葡萄糖含量，代入通用模型1得出木糖含量；
(5)样品检测：分别另取与步骤(4)所用浓度不同的样品糖溶液1mL，每次取的所述样品糖溶液为葡萄糖溶液、木糖溶液和混糖溶液中任一种，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录样品的光谱吸光度信号值；
(6)结果输出：将步骤(5)所得光谱吸光度信号值与步骤(4)所得的通用模型或单糖标准曲线进行比较，即带入对应的通用模型1和2，或对应的单糖标准曲线中，得到样品中葡萄糖和/或木糖含量。
根据紫外光谱特征吸收峰位置可以初步判断样品溶液中糖的类型。若特征峰位于470nm 处，则溶液中几乎只含有葡萄糖，带入葡萄糖标准曲线，即可求出样品溶液中葡萄糖含量，木糖同理；若特征峰出现于471nm～477nm之间，表明样品溶液同时含有葡萄糖与木糖，带入通用模型1和2；
(7)测定结果：单糖溶液根据单糖标准曲线所得出的测定结果见表1；混糖溶液根据通用模型所得出的测定结果见表2。从表1和表2可知，本方法测定值与理论值的相对偏差绝对值在5％之内，说明本检测方法结果准确、可靠。
表1.单糖溶液根据单糖标准曲线所得出的测定结果
表2.混糖溶液根据通用模型所得出的测定结果
实施例2测定烟草制品中的葡萄糖、木糖含量
(1)制备烟草浸提液：称取0.1±0.0001g烟草样品于50mL具塞三角瓶中，加入20mL纯水后盖上塞子，在30±0.5℃的恒温水浴振荡器上以200rpm的转速振荡萃取30min。萃取结束后，用快速定性滤纸过滤，弃去初始过滤得到的2～3mL滤液，收集后续液体备用，得到烟草样品溶液，即烟草浸提液。
(2)水解反应：移取lmL制备好的单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液于25mL具塞比色管中，加入4mL浓盐酸与lmL冰醋酸，摇匀后置入沸腾的恒温水浴锅中反应40min，反应完成后立即取出试管，放入冷水中冷却5min，以lmL去离子水进行相同的水解反应为空白样；
所述单糖标准溶液和混糖溶液的浓度与实施例1相同；
(3)显色反应：移取1mL2％浓度的间苯三酚/乙醇显色剂溶液，加入到步骤(2)中冷却好的水解液中，迅速摇匀试管并静置1min；
(4)建立标准曲线：将配制的不同浓度的葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液及二者的混糖溶液经步骤(2)、(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，具体谱图见图1；
由图1可知，若所测溶液中只含有葡萄糖，光谱的特征吸收峰出现在470nm处；若所测溶液中只含有木糖，光谱的特征吸收峰出现在478nm处；若二者皆有，则光谱的特征吸收峰出现于471nm～477nm之间，具***置与葡萄糖、木糖相对含量有关；
对于单糖标准溶液，根据所得到的不同浓度单糖标准溶液的光谱吸光度信号值与葡萄糖含量、木糖含量分别建立标准曲线，得到葡萄糖标准曲线：Y＝1.4138x-0.0196，相关系数 R2＝0.9961，见附图2；木糖标准曲线：Y＝4.3425x+0.0191，相关系数R2＝0.9960，见附图3；
对于检测0.01mmol/L的葡萄糖与木糖，最终吸光度可达到0.14与0.41，仍具有较明显的实验现象，可以实现低浓度糖的准确检测；
对于混糖溶液，利用多维数据处理技术，即化学统计学软件进行偏最小二乘回归(PLSR) 分析，建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量、木糖含量之间的映射，从而得到一个通用模型 1，Y＝5.6823X1+1.1474X2+0.0571(Y为吸光度，X1为木糖浓度，X2为葡萄糖浓度)，见附图4、5；再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型2，Y＝0.9517X3+0.0558(Y为吸光度增量，X3为葡萄糖浓度增量)，从而消去木糖的影响，见附图6、7。由通用模型2计算得出葡萄糖含量，代入通用模型1得出木糖含量；
(5)样品检测：将步骤(1)中制备好的烟草样品溶液，即烟草浸提液，稀释20倍至淡黄色，移取lmL于25mL具塞比色管中，加入4mL浓盐酸与lmL冰醋酸，摇匀后置入沸腾的恒温水浴锅中反应40min，反应完成后立即取出试管，放入冷水中冷却5min后，加入1mL 2％浓度的间苯三酚/乙醇显色剂溶液，迅速摇匀试管并静置1min，然后进行紫外可见光谱法检测，记录样品的光谱吸光度信号值。
(6)结果输出：将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值代入通用模型1和2中，或葡萄糖标准曲线或木糖标准曲线中，经过计算得到样品中葡萄糖和/或木糖含量，记录数值即可。
根据紫外光谱特征吸收峰位置可以初步判断样品溶液中糖的类型。若特征峰位于470nm 处，则溶液中几乎只含有葡萄糖，带入葡萄糖标准曲线，即可求出样品溶液中葡萄糖含量，木糖同理；若特征峰出现于471nm～477nm之间，表明样品溶液同时含有葡萄糖与木糖，带入通用模型1和2；
(7)测定结果：实验结果见表3。
为了验证本方法的准确性，采用了常规的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(英文全称1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，简称PMP)衍生化高效液相色谱(HPLC)法进行对比，实验结果见表3。
表3.由本方法与高效液相色谱法所得的混糖含量测定结果对比
注：a:样品1-4分别为国内不同品牌烟草薄片；样品5为未知卷烟烟丝样品；样品6为国内某烟梗原料；样品7为国内某品牌造纸法再造烟叶。
b:表示未检测到该物质。
从表3可以看出，本方法与HPLC法检测结果的相对偏差绝对值在10％以内，两种方法测定结果无显著性差异。可见，本方法与HPLC法的测量结果一致性较好，准确性高。以上详细描述了本发明的有代表性的实施例和测试例，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，对于本领域技术人员而言显而易见的改变和组合，均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种测定糖溶液中葡萄糖与木糖含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)标准溶液制备：配制不同浓度的单糖标准溶液以及混糖溶液，所述单糖标准溶液为葡萄糖标准溶液和木糖标准溶液，所述混糖溶液为等体积已知浓度的单糖标准溶液随机混合的混合物；
(2)水解反应：向单糖标准溶液或混糖溶液的试管中加入浓盐酸和冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却；
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置；
(4)建立标准曲线：将步骤(1)中不同浓度的单糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2)和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；对于单糖标准溶液，根据不同浓度单糖标准溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型一，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型二；
(5)样品检测：取与步骤(4)所用浓度不同的样品糖溶液，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录样品的光谱吸光度信号值，所述样品糖溶液为葡萄糖溶液或木糖溶液或混糖溶液；
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断样品溶液中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型一和通用模型二中，得到样品中葡萄糖与木糖含量；
其中所述单糖标准溶液或混糖溶液或样品糖溶液与混酸的体积比为1:3-1:6，所述混酸中浓盐酸与冰醋酸的体积比为2:1-5:1；进行显色反应时，显色剂与所述单糖标准溶液或混糖溶液或样品糖溶液的体积比为1：1，显色剂浓度为2％。
2.一种测定烟草浸提液中葡萄糖与木糖含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)烟草浸提液制备：采用水为萃取剂对烟草样品在恒温水浴振荡器上振荡萃取，过滤，弃去初始滤液，收集后续滤液备用，得到烟草浸提液；
(2)水解反应：向单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液的试管中加入浓盐酸和冰醋酸的混酸，摇匀后置入恒温水浴锅中进行水解反应，反应完成后取出试管进行冷却；
(3)显色反应：向步骤(2)中冷却后的水解液中加入间苯三酚显色剂溶液，摇匀试管并静置；
(4)建立标准曲线：将不同浓度的单糖标准溶液和已知浓度的混糖溶液依次经步骤(2)和(3)处理后，对所得液体进行紫外可见光谱法检测，得到光谱吸光度信号值；对于单糖溶液，根据不同浓度单糖溶液的吸光度信号值与单糖含量，分别建立葡萄糖标准曲线和木糖标准曲线；对于混糖溶液，利用多维数据处理技术建立光谱吸光度信号值与葡萄糖含量和木糖含量之间的映射，从而得到通用模型一，再建立混糖溶液中木糖浓度不变时，光谱吸光度信号值增量对葡萄糖浓度增量的映射，建立通用模型二；
(5)样品检测：将步骤(1)所得的未知浓度的烟草浸提液稀释后，经步骤(2)、(3)处理后，进行紫外可见光谱法检测，记录烟草浸提液样品的光谱吸光度信号值；
(6)结果输出：根据紫外光谱特征吸收峰位置初步判断所述烟草浸提液样品中糖的类型，若为葡萄糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的葡萄糖标准曲线中，得到葡萄糖含量；若为木糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的木糖标准曲线中，得到木糖含量；若为混糖，则将步骤(5)所得的光谱吸光度信号值带入步骤(4)所得的通用模型一和通用模型二中，得到样品中葡萄糖与木糖含量；
其中所述单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液与混酸的体积比为1:3-1:6，所述混酸中浓盐酸与冰醋酸的体积比为2:1-5:1；进行显色反应时，显色剂与所述单糖标准溶液或混糖溶液或烟草浸提液的体积比为1：1，显色剂浓度为2％。
3.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中所述恒温水浴温度为沸水浴温度，所述反应时间为40-80min。
4.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)静置时间为2min以内。
5.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述步骤(4)建立标准曲线时对于葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液和混糖溶液的测定波长分别为470nm、478nm、471nm～477nm。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中制备所述烟草浸提液时，所述烟草样品为0.1±0.0001g时，所述萃取剂水的体积为20mL。
7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述恒温水浴振荡器的温度为30±0.5℃，转速为200rpm，振荡萃取时间为30min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中所述烟草浸提液的稀释倍数通过所述烟草浸提液的光谱吸光度信号值处于0.7～1.0之间确定。
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