DE2550011A1 - Antihaemophiles mittel und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

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BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)

Aktenzeichen: _Hoe 75/B 012 - Ma 217

Datum: 5. November 1975 Dr.Li/Pt

Antihämophiles Mittel und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein antihämophiles Mittel, das insbesondere eine Aktivität des Gerinnungfaktors VIII aufweist, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie Zubereitungen, insbesondere Hämostyptika und gerinnungsaktive Diagnostika, welche das antihämophile Mittel als eine wesentliche Wirksubstanz enthalten.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische sowie pathologische Ursachen ausgelöst wird und dessen Ablauf von etwa 30 fördernden und hemmenden Faktoren abhängt. Durch Verminderung oder Vermehrung einzelner dieser Blutgerinmingsfaktoren können Störungen der Blutgerinnung auftreten, die sich teilweise als Krankheiten manifestieren.Die Hämophilie A wird durch eine Verminderung des Faktors VIII der Blutgerinnung bedingt und ist durch Blutungen besonders in Gelenken und der Muskulatur charakterisiert. Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, daß die Prognose der an dieser Hämophilie Erkrankten durch substituierende Therapie mit den Faktor VIII enthaltenden Präparaten wesentlich gebessert werden kann.

Als Ausgangsraaterial für die Herstellung von Fakt or-YHI-

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substituierenden Arzneimitteln waren bislang nur Blutplasma oder Blutplasmafraktxonen bekannt. Es war jedoch auch schon längere Zeit bekannt, daß der wäßrige Extrakt von Placenten ein stark gerinmmgsaktives Material darstellt, dessen Aktivität als thromboplastisches Material zu kennzeichnen ist.

Auch die Extraktion von Placenten mit Lxpidlosungsmethoden führt zu gerinnungsaktivem Thromboplastin. Das auf diese Weise gewonnene gerinnungsaktive Material hat jedoch nicht die für die Antihämophilie-Substitutionstherapie geforderten Eigenschaften des Faktors VIII der Blutgerinnung.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß ein durch wäßrige Extraktionen aus Placenten gewonnenes thromboplastisches Material sich in eine Faktor-VIII-spezifische Komponente und eine thromboplastische Restaktivität trennen läßt. Die so erhaltene antihämophile Komponente kann isoliert und gegebenenfalls weiter gereinigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein antihämophiles Mittel, das nach einem Verfahren erhältlich ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zerkleinerte blutfrei gewaschene Placenten mit einem wäßrigen hypotonen Medium bei einem pH-Wert im schwach sauren, neutralen oder alkalischen Bereich extrahiert werden, der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt, die spezifische Dichte des Extraktes durch Zusatz einer inerten wasserlöslichen Verbindung bis zum Aufrahmen von gerinnungsaktiven Komponenten mit Faktor-VIII-Aktivität erhöht, das sich bildende Flotat gewonnen und gewünschtenfalls weitergereinigt wird.

Zur Weiterreinigung kann die Flotation wiederholt werden. Als inerte wasserlösliche Verbindungen im Sinne der Erfindung

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kommen alle physiologisch unbedenklichen, mit den Bestandteilen der Extrakte keine chemische Bindung eingehenden Stoffe in Frage. Besonders geeignet sind physiologisch verträgliche Salze oder wasserlösliche Kohlenhydrate.

Die Weiterreinigung kann auch durch Extraktion des mit einem wäßrigen Medium verdünnten Flotats bei niedriger Leitfähigkeit und schwach saurem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide, vorzugsweise einem Kohlenwasserstoff oder Alkylather mit einem Siedepunkt zwischen 40° und 80°, in Gegenwart eines gerinnungsinerten Schutzkolloids und einer zur Komplexbildung mit Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten polaren polyionischen Verbindung, vorzugsweise eines Polyanions wie einer Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung, z.B. Heparin oder eines Polykations, z.B. Protamin, vorgenommen werden. Dabei reichert sich das antihämophile Mittel mit Faktor-VIII-Aktivität in der wäßrigen Phase an und kann aus dieser gewonnen werden. Sie kann ferner durch Ultrazentrifugation des wieder aufgelösten Flotats in Gegenwart eines gerinnungsinerten Proteins vorgenommen werden.

Sie kann auch durch Behandlung des Flotats mit wäßriger Alkalilauge und Abtrennung der dialysablen Stoffe vorgenommen werden.

Schließlich kann die Weiterreinigung durch Auflösung des Flotats in einer wäßrigen Salzlösung wie weiter unten beschrieben und Shromatografieren dieser Faktor-VIII enthaltenden Salzlösung in Gegenwart eines gerinaungsinerten lipophilen Proteins durch ein Molekularsieb durchgeführt werden, wonach die Faktor-VIII enthaltenden Fraktionen des Eluats gewonnen werden.

Die Reinigung der Faktor-VIII-aktiven placentären Substanz kann zudem auch durch Maßnahmen erfolgen, wie sie zur Entfernung bekannter, die Gerinnung beeinflussender Faktoren bereits beschrieben wurden. So läßt sich eventuell noch vorhandenes Prothrombin, das die Faktor-VIII-Aktivität des erfindungsgemäßen

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Produkts herabzusetzen vermag, durch Absorption an Aluminiumhydroxid oder Bariumsulfat, durch Fällung mit Acridinbasen oder Chromatographie an Ionenaustauscherharzen entfernen.

Das nach diesen Verfahren erhaltene Phospholipid ist z.B. als Diagnostikum in all den Gerinnungstesten einzusetzen, bei denen eine Faktor-VIII-Aktivität vorhanden sein soll.

Das vorliegende Verfahren geht von zerkleinerten, blutfrei gewaschenen Placenten aus. Menschliche Placenten werden bevorzugt. Es können sowohl frisch gewonnene als auch bereits zur Lagerung eingefrorene Placenten zerkleinert und zur Entfernung von Blut- und Plasmabestandteilen mit einer isotonischen Salzlösung mehrfach gewaschen werden. Das gewaschene Placentenhomogenat wird durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen und anschließend gegebenenfalls getrocknet. Als besonders schonende Trocknung wird die Lypophilisation bevorzugt. Das blutfrei gewaschene und getrocknete Piacentengewebe wird vorzugsweise in einer 4~lO %igen, insbesondere δ-7 %igen Suspension, mit einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 extrahiert, wobei das wäßrige Medium hypoton sein soll. Vorteilhaft werden hierfür Wasser oder hypotone Salz- oder Pufferlösungen verwendet, deren Konzentration und Elektrolytzusammensetzung zu einer osmotischen Konzentration von <33O mM/l führen. Besonders geeignet sind Neutralsalz-Lösungen, deren pH-Wert nach der Suspension des Placentengewebes in der Lösung mit Basen wie Natronlauge oder Kalilauge auf den gewünschten pH-Wert eingestellt wird. Es ist nicht entscheidend, bei welchem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 die Extraktionen des Placentengewebes mit der hypotonen Lösung vorgenommen wird.

In einer besonderen Ausführungsform werden zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placenten bei einem pH-Wert > 4,5 mit einem wäßrigen

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Medium einer Osmolarität J$33O mM/1 extrahiert, der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt und einer Flotation unterworfen. Dazu wird der wäßrige Extrakt zur Erhöhung der Dichte der Lösung mit einer inerten wasserlöslichen Verbindung, z.B. einem Neutralsalz oder einem Kohlenhydrat, vorzugsweise einem Alkalioder Erdalkali-Halogenid wie KBr, NaCl, NaBr, CsCl₀ oder Saccharose versetzt, wobei mit der zugesetzten Menge der geeigneten Stoffe eine Dichte der Lösung von mindestens 1, nach oben begrenzt durch die Löslichkeit der Salze, vorzugsweise eine Dichte von

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1,06 bis 1,20 g/cm eingestellt wird. Die Lösung wird danach bei einer Beschleunigung von ^ 25.000 χ g, vorzugsweise 50.000 χ g, mindestens 60 Minuten, vorzugsweise 120 Minuten, zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird die auf der klaren darunter stehenden Salzlösung flotierte etwas trübe Schicht gewonnen. Die Flotation der trüben Schicht in der Zentrifuge wird zweckmäßig unter den gleichen oder unter vergleichbaren Bedingungen z.B. bei 50.000 - 150.000 χ g wiederholt und das überstehende Flotat schließlich gewonnen.

Geeignete Flotationssysteme sind im übrigen dem Fachmann für die Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma geläufig. Bei der Anwendung von 20 %iger wäßriger Kaliumbromidlösung und einer

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Umdrehgeschwindigkeit der Ultrazentrifuge entsprechend 50.000 χ g flotiert die antihämophil aktive Fraktion nach etwa 2 Stunden an der Oberfläche der Lösung weitgehend frei von restlichen Proteinbestandteilen, welche sedimentiert werden bzw. gelöst bleiben. Das in der beschriebenen Weise erhaltene Flotat wird in Wasser oder verdünnter Salzlösung, beispielsweise 0,5 bis 1,2 ^iger Kochsalzlösung, vorzugsweise 0,9 %iger Kochsalzlösung, dispergLert und in einer darauf zu entnehmenden Probe die Aktivität an Faktor VIII bestimmt. Danach wird die Verdünnung in der Weise vorgenommen, daß die verdünnte Lösung des Flotats 10-200, vorzugsweise 20 Einheiten an Faktor VIII enthält.

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Die durch Flotation gewonnene rohe Faktor-VIII-enthaltende Präparation kann gewünschtenfalls einer oder mehrerer der folgenden Reinigungsoperationen unterworfen werden. Sofern, das Produkt zur intravenösen Therapie angewandt werden soll, ist zumindest eine dieser Reinigungsoperationen erforderlich.

1. Reinigungsverfahren durch Extraktion

Das durch Flotation über einer konzentrierten Salzlösung erhaltene Produkt, dessen Aktivität an Faktor VIII 10-200, vorzugsweise 20 Einheiten beträgt, wird mit einem gerinnungsinerten Protein, beispielsweise Albumin, vorzugsweise Humanalbumin, in einer Konzentration von 1-10 %, vorzugsweise 5 %, versetzt, danach mit einem zur Komplexbildung mit basischen Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten Polyanion, insbesondere eine PoIysaccharid-Polyschwefelsäure·-Verbindung wie Heparin, vorzugsweise dessen Natriumsalz, in einer Menge von 0,005-0,5 mg/ml, bei Heparin entsprechend 1-50 Einheiten pro ml der vorhandenen Lösung, versetzt. Danach wird durch Verdünnung oder Salzzusatz - in der Regel ist letzteres erforderlich - auf eine Leitfähigkeit von ^ 14m§6n eingestellt und mit Säure, vorzugsweise einer Mineralsäure wie Salzsäure, auf einen pH-Wert von 3,5-6 einreguliert. Ein Volumenteil der erhaltenen Suspension wird mit mindestens 1 Teil eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Lipide mit einem Siedepunkt von 40 bis 80 C, vorzugsweise mit einem aliphatischen Äther oder einem Kohlenwasserstoff, dessen Siedepunkt in dem vorgegebenen Siedebereich liegt oder einer Mischung derselben, wobei das Mischungsverhältnis beliebig sein kann, vorzugsweise jedoch mit einer Mischung von 8 Volumenteilen Petroläther und 2 Volumenteilen Diäthylather, 2-8 Stunden bei 1O-4O°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, mindestens einmal

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geschüttelt oder gemischt, wozu mit Vorteil ein mechanisches Schüttel- oder Mischgerät verwendet wird. Nach kurzzeitigem Stehenlassen kann die organische Phase abgetrennt, und verworfen werden. Die wäßrige Phase wird, vorteilhaft im Vakuum, von restlichen Lösungsmitteln befreit. Danach erfolgt die Bestimmung der Faktor-VIII-Aktivität in der bekannten Weise. Das Produkt kann parenteral angewandt werden. ·

Statt einer Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung kann im vorliegenden Verfahren auch eine polykationische Verbindung wie Protamin, vorzugsweise als dessen Chlorid oder Sulfat, in einer Konzentration von 1-10 mg/ml eingesetzt werden, um zu einem Produkt mit vergleichbarer Faktor-VIII-Aktivität zu kommen.

Für die parenterale Applikationsform werden 10-500 Einheiten Faktor VIII, vorzugsweise 20 Einheiten Faktor VIII, in der Verbrauchslösung als Einzeldosis angestrebt. Vorher ist eine Sterilfiltration zur Entfernung von kontaminierenden Mikroorganismen erforderlich. Die Präparation kann danach in die für die parenterale Applikation geeignete Zubereitungsform gebracht werden, mit stabilisierenden Schutzkolloiden, z.B Protein, versetzt und gegebenenfalls anschließend lyophil getrocknet werden. Das in. einer physiologisch verträglichen Lösung vorliegende Verfahrensprodukt oder das wieder aufgelöste Trockenpräparat kann für die Substitutionstherapie der Hämophilie A verwendet v/erden.

Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise: Destilliertes Wasser, physiologische NaCl-Lösung, gewünschtenfalls mit Zusatz einer Puffersubstanz, wie O,O2 molares Na-Citrat mit einem pH-Wert von 7,0.

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Der Präparation können vor der Gefriertrocknung zur Stabilisierung Schutzkolloide wie Albumin und/oder Kohlenhydrate wie Fruktose zugesetzt werden. Im Hinblick auf eine therapeutische Verwendung des Endproduktes beim Menschen wird zweckmäßig Humanalbumin verwendet.

Weitere Möglichkeiten für eine Weiterreinigung sind beispielsweise die folgenden, wenn auch anzumerken ist, daß das nachstehend beschriebene· Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutisch applizierbaren Präparation weniger gut geeignet ist. *unter 2

2. Reinigungsverfahren durch Alkalibehandlung

Die auf 10-200 Faktor-VII!-Einheiten eingestellte Lösung wird mit Alkalilauge auf einen pH-Wert zwischen 10 und 14, vorzugsweise 12 eingestellt. Hierzu dient beispielsweise 2-7 n, vorzugsweise 5 n, NaOH. Der Ansatz wird danach 15 Minuten bis 48 Stunden bei diesem pH-Wert stehengelassen. Anschließend wird neutralisiert, d.h. auf einen pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes, vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 8, eingestellt, Hierfür können anorganische Säuren beispielsweise 2-10 n, vorzugsweise 5 η HCl, verwendet werden. Zur Abtrennung niedrigmolekularer Bestandteile wird die neutralisierte Lösung einer Dialyse gegen eine physiologisch verträgliche Salzlösung, z.B. isotonische Kochsalzlösung, unterworfen. Vor, während oder nach der Dialyse können gegebenenfalls g;erinnungsinerte Zusätze zur Stabilisierung der Aktivität des antihämophilen Mittels zugefügt werden. Besonders vorteilhaft erweist sich hierfür

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inertes Proteinmaterial wie beispielsweise Albumin.

3. Reinigungsverfahren durch Chromatographie

Eine Reinigung der auf 10-200 Faktor-VIII-Einheiten eingestellten wäßrigen Lösung läßt sich ferner mit einer Fraktionierung auf einem Molekularsieb vornehmen, beispielsweise durch Gelfiltration in einer Säule. Als Molekularsieb in diesem Sinne wird vorteilhaft eine besonders aufgearbeitete Agarose verwendet, beispielsweise die unter dem geschützten Warenzeichen Sepharose^v ' von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden oder als Biogel A^v ' von der Firma Biorad Laboratories, Richmond/Calif erhältliche. Der Fraktionierungsbereich dieses Materials soll für globuläre

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Moleküle bei Molekulargewichten zwischen 10 und 10 liegen. Vor der Durchführung der Molekularsieb—Chromatographie wird das antihämophile Mittel vorteilhaft einer Dialyse gegen eine verdünnte, vorzugsweise weitgehend isotonische Salzlösung unterworfen und danach zweckmäßig sowohl qualitativ als auch quantitativ hinsichtlich weiterer Zusätze zur Lösung möglichst weitgehend der Elutionslösung angeg_lichen, die für die Elution des gewünschten Produktes bei der Molekularsieb-Chromatographie Verwendung findet. Die Elutionslösung enthält Neutralsalze wie beispielsweise Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,7 % bis 5,8 %, vorzugsweise 4,5 bis 5 %_t und einen stabilisierenden Zusatz eines inerten Proteins, beispielsweise Albumin, in einer Konzentration von 1 - 10 %, vorzugsweise 3 %. Die Chromatographie wird in bekannter Weise vorgenommen. Danach erfolgt die Testung der einzelnen dabei erhaltenen Fraktionen hinsichtlich der Faktor-VIII-Aktivität und ihrer thromboplastischen Aktivität, wobei diejenigen Fraktionen ausgewählt werden, deren Faktor-VIII-Aktivität zur Restaktivität Thromboplastin ^5 : 1 ist. Danach

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werden die entsprechenden Fraktionen gesammelt und vereint und gegebenenfalls mit einer physiologisch verträglichen Salzlösung auf die gewünschten Einheiten an Faktor VIII eingestellt, oder falls dies erforderlich ist, mit einem Ultrafilter auf die gewünschte Anzahl von Einheiten an Faktor VIII konzentriert.

Das vorbeschriebene Reinigungsverfahren ist zudem geeignet als eine zusätzliche Weiterreinigung der nach den aufgezeigten Schritten erhaltenen Produkte und insbesondere statt der Dialyse im Verfahren zur Alkalibehandlung angewendet zu werden.

4. Reinigungsverfahren durch Zentrifugation

Das durch Flotation über konzentrierten Salzlösungen erhaltene Rohprodukt wird mit destilliertem Wasser auf 10-200 Einheiten, vorzugsweise 100 Einheiten, verdünnt und mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von 0,075 - 1,OM, vorzugsweise 0,15 M, versetzt. Danach wird der Lösung ein gerinnungsinertes, lipophiles Protein, z.B. Albumin, vorzugsweise Humanalbumin, bis zu einer Konzentration von 1 - 10 %, vorzugsweise 2,5 - 5 %, zugesetzt. Die Mischung wird für 1-10 Stunden, vorzugsweise 5 Stunden, bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Mischung bei 50.000 χ gf zentrifugiert und die überstehende Lösung mit der Faktor-VIII-Aktivität gewonnen. Nach Zusatz von üblichen Schutzkolloiden und entsprechenden Stabilisatoren kann das annähernd klare Zentrifugat steril filtriert werden.

Die Ausbeute an Faktor-VIII-Aktivitat wird zweckmäßig während des jeweiligen Aufarbeitungsverfahrens und/oder im Anschluß daran

* für 30-120 Minuten, vorzugsweise etwa 60 Minuten^

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überprüft. Seine Bestimmung erfolgt beispielsweise nach folgender Methode:

1 Teil, z.B. 0,1 ml, partielles Thromboplastin (z.B. hergestellt nach der Patentanmeldung P 23 16 43Q.9-52 (= Ma 160)), wird mit einem Teil Faktor-VHI-Mangel-Plasma und einem Teil verdünntem Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 6 Minuten bei 37°C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37°C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchlorid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Calciumchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines festen Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor-VI I I-enthaltenden. Lösung sich ergebende Gerinnungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. 1 Einheit Faktor VIII entspricht der Faktor-VIII-Aktivität von 1 ml Normalplasma.

Der Bestimmung der thromboplastischen Restaktivität wird die Überlegung zugrundegelegt, daß Thromboplastin u. a. Faktor-IX-Aktivität zeigt. Somit ist die Bestimmung des Faktor IX ein Maß für die thromboplastische Restaktivität der Präparation. Die Bestimmung der Faktor-IX-Aktivität kann nach der vorangehend beschriebenen Methode zur Faktor-VII!-Bestimmung erfolgen, indem anstelle des Faktor-VIII-Mangelplasmas ein Faktor-IX-Mangelplasma eingesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein antihäiaophiles Mittel mit Faktor-VIII-Aktivität erhältlich nach einem der vorbeschriebenen Verfahren.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein zur intravenösen Substitutionstherapie der Hämophilie A geeignetes Arzneimittel bestehend aus oder enthaltend ein antihämophiles Mittel erhält-

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lieb. , gemäß einem der vorbeschriebenen Verfahren und das gegebenenfalls pharmazeutisch üblichen Trägerstoffe als Zusätze

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mäßig in trockener lyophiler Form gelagert. Vor der intravenösen Applikation ist das Trockenprodukt in für derartige Präparate bekannter Weise zu rekonstituieren.

Die Erfindung soll an dem nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.

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Beispiel

Blutfrei gewaschenes lypophilisiertes Placentengewebe wird in einer 5 %igen Suspension in 0,05 M Na-Citratlösung 20 Minuten bei Zimmertemperatur kräftig durchmischt. Das Homogenat wird in einer Zentrifuge 30 Minuten bei 30.000 χ g geschleudert, das Sediment verworfen und der sich bildende Überschuß mit festem

Kaliumbromid auf eine 20 %ige Sättigung gebracht. In einer Ultrazentrifuge wird der Extrakt bei 50.000 χ g 2 Stunden lang geschleudert, wobei ein gut abtrennbares Flotat entsteht. Diese überstehende Zone wird abgeschöpft. Da hierfür eine physiologische Verträglichkeit der Präparation die Voraussetzung ist, werden zur intravenösen Substitutionstherapie zweckmäßig nur Präparationen verwendet, welche einem der vorbeschriebenen Reinigungs- „ verfahren unterzogen wurden. Nach einer erneuten Flotation bei 150.000 χ g ist das Präparat als Faktor-VIII-Präparation gebrauchsfertig. Es wird die Aktivität an Faktor VIII getestet. Die Aktivität beträgt 200 E/ml.

Weiterreinigung:

a) Das bei 150.000 χ g flotierte Präparat wird mit einer wäßrigen 10 %igen Humanalbumin-Lösung, welche 10 E/ml an Heparin-Natrium enthält, zu gleichen Teilen verdünnt. Dabei muß beachtet werden, daß der Gesamt-Salzgehalt der Mischung einer elektrischen Leitfähigkeit von etwa 8m§bnentspricht. Der pH-Wert wird mit 1 N HCl auf 4,5 eingestellt.

Die Mischung wird in eine Extraktionsapparatur nach Kutscher und Steudel gegeben und über 2 Stunden kontinuierlich mit 2 Teilen eines Petroläther (Fr. 6O-8O°)/Diäthyläther-Gemisches= 80/20 (Vol/Vol) extrahiert.

Nach der Operation wird der organische Lösungsmittelanteil unter schonenden Bedingungen im Vakuum bei 20°C mit einem Rotationsverdampfer beseitigt und die verbleibende wäßrige Phase mit 1 N NaOH auf pH 7,5-8,0 eingestellt. Nach 2 Stunden ...14

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Rühren bei Zimmertemperatur und Sterilfiltration ist das Präparat zur Substitutionstherapie von Faktor-VHI-Mängeln gebrauchsfertig. Die Faktor-VIII-Aktivität einer Probe wird auf etwa 30 E/ml eingestellt.

Statt mit Heparin-Natrium kann die Faktor-VIII-Präparation im ersten Verfahrensschritt auch mit Protaminsulfat (5 mg/ml) versetzt werden.

b) Das bei 150.000 χ g flotierte Präparat wird mit einer 0,15 M NaCl-Lösung, welche 5 %ig an Humanalbumin ist, auf eine Aktivität von etwa 100 Einheiten Faktor VIII verdünnt. Nach Inkubation von 5 Stunden bei 37°C wird dieser Ansatz 1/2 Stunde bei 50.000 χ g zentrifugiert und nach einem Zusatz von 1 % Fructose das nahezu klare Zentrifugat steril filtriert.

Diese Präparation zeigt sich in Tierversuchen, z.B. in Kaninchen toxikologisch verträglich. Sie hat bei gesunden Tieren eine dem antihämophilen Globulin-Konzentrat aus Plasma vergleichbare Wirkung.

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Claims (9)

1. PATENTANSPRÜCHE:

   - V*^x*f "hrsfli 2?.ir HerstsHiin⁰* sines antihanic^hilen: Mittels dadurch gekennzeichnet, daß zerkleinerte blutfrei gewaschene Placenten mit einem wässrigen hypotonen Medium im schwach sauren bis alkalischen Bereich extrahiert werden, der Extrakt vom
   Geweberückstand abgetrennt, die*spezifische Dichte des
   Extraktes durch Zusatz einer inerten wasserlöslichen Verbindung bis zum Aufrahmen erhöht und das Flotat gewonnen wix*d.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Flotat einer weiteren Reinigung unterzogen wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterreinigung durch Wiederholung der Flotation durchgeführt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterreinigung durch Extraktion des mit einem wässrigen
   Medium verdünnten Flotats bei niederiger Leitfähigkeit und schwach saurem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide in Gegenwart eines gerinnungsinerten Schutzkolloids und einer zur Komplexbildung mit Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten polaren polyionischen Verbindung vorgenommen wird, wonach sich das antihämophile Mittel mit Faktor-VIII-Aktivität in der wässrigen Phase anreichert und diese gewonnen wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterreinigung durch Behandlung des Flotats mit wässriger Alkalilauge und Abtrennung der dialysablen Stoffe vorgenommen wird.

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6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterreinigung der den Faktor VIII enthaltenden Salzlösung durch Dispergieren es Flotats in einer wässrigen Salzlösung und Chromatographieren unter Zusatz eines gerinnungsinerten Proteins durch ein Molekularsieb vorgenommen wird und die Faktor-VIII enthaltenden Fraktionen gewonnen werden.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterreinigung durch Dispergieren des Flotats in einer wässrigen Salzlösung, Zusatz eines gerinnungsinerten Proteins zu dieser Lösung und deren Zentrifugation vorgenommen und der den Faktor-VIII-enthaltende Zentrifugenüberstand gewonnen wird.
8. 8. Antihämophiles Mittel mit Faktor-VIII-Aktivität erhältlich nach einem Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7.
9. 9. Zur intravenösen Substitutionstherapie der Hämophilie A geeignetes Arzneimittel bestehend aus oder enthaltend ein antihämophiles Mittel erhältlich nach Anspruch 2 bis 7 und gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Trägerstoffe.

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