CH630805A5

CH630805A5 - Verfahren zur herstellung eines antihaemophilen mittels.

Info

Publication number: CH630805A5
Application number: CH1392076A
Authority: CH
Inventors: Horst Dr Schwinn; Norbert Dr Heimburger
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1976-11-04
Publication date: 1982-07-15
Also published as: ATA819476A; AT358737B; BE848111A; FR2330408B1; NL7612139A; DE2550011A1; IT1063617B; AU1934176A; LU76145A1; AU500621B2; IL50847A; US4067964A; ZA766647B; DK502176A; DE2550011C2; JPS5257310A; ES452923A1; SE7612396L; FI763165A; IL50847A0

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines breit wirksamen antihämophilen Mittels das vorwiegend Faktor VIII-, aber auch Faktor IX-, Faktor VII- und Faktor X-Aktivität besitzt. Das neue Mittel kann in Zubereitungen, insbesondere Hämostyptika und gerinnungsaktiven Diagnostika, welche das antihämophile Mittel als eine wesentliche Wirksubstanz enthalten, eingesetzt werden.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische sowie pathologische Ursachen ausgelöst wird und dessen Ablauf von etwa 30 fördernden und hemmenden Faktoren abhängt. Durch Verminderung oder Vermehrung einzelner dieser Blutgerinnungsfaktoren können Störungen der Blutgerinnung auftreten, die sich teilweise als Krankheiten manifestieren. So wurden z.B. die Hämophilie A und B durch eine Verminderung der Faktoren VIII bzw. IX der Blutgerinnung bedingt und sind durch Blutungen besonders in Gelenken und der Muskulatur charakterisiert.

Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass die Prognose der an Hämophilie Erkrankten durch substituierende Therapie mit Faktor VIII bzw. IX enthaltenden Präparaten wesentlich verbessert werden kann.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Faktor VIHund Faktor IX-substituierenden Arzneimitteln waren bislang nur Blutplasma oder Blutplasmafraktionen bekannt. Es war auch schon längere Zeit bekannt, dass der wässrige Extrakt von Placenten ein stark gerinnungsaktives Material darstellt, dessen Aktivität als thromboplastisches Material zu kennzeichnen ist. Derartige Präparationen sind physiologisch unverträglich. Sie können therapeutisch nicht angewandt werden.

Auch die Extraktion von Placenten mit Lipidlösungsme-thoden führt zu gerinnungsaktivem Thromboplastin. Das auf diese Weise gewonnene gerinnungsaktive Material hat jedoch nicht die für die Antihämophilie A- und B-Substitu-tionstherapie geforderten Eigenschaften.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass ein durch wässrige Extraktionen aus Placenten gewonnenes thromboplastisches Material sich in eine für die Substitutionstherapie geeignete Form bringen lässt. Das so erhaltene antihämo-s phile Mittel kann isoliert und gegebenenfalls weiter gereinigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels, das in Mangelplasmen die Gerinnungsfaktoren Vili, IX, VII und X zu io substituieren vermag. Es ist u.a. charakterisierbar durch das Aktivitätsverhältnis der Faktoren Vili, IX, VII und X.

Es ist nach einem Verfahren erhältüch, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placenten mit einem wässrigen hypotonen Medium bei ei-15 nem pH-Wert im schwach sauren bis alkalischen Bereich extrahiert werden, der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt, die spezifische Dichte des Extraktes durch Zusatz einer inerten wasserlöslichen Verbindung bis zum Aufrahmen von gerinnungsaktiven Komponenten mit o.g. Gerinnungs-20 aktivitäten erhöht, das sich bildende Flotat gewonnen und gewünschtenfalls weitergereinigt wird.

Zur Weiterreinigung kann die Flotation wiederholt werden.

Als inerte wasserlösliche Verbindung im Sinne der Erfin-25 dung kommen alle physiologisch unbedenklichen, mit den Bestandteilen der Extrakte keine chemische Bindung eingehenden Stoffe in Frage. Besonders geeignet sind physiologisch verträgliche Salze oder wasserlösliche Kohlenhydrate.

Die Weiterreinigung erfolgt entweder durch Komplexbil-30 dung und Extraktion des mit einem wässrigen Medium verdünnten Flotats bei niedriger Leitfähigkeit und schwach saurem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide, vorzugsweise einem Kohlenwasserstoff oder Alkyläther mit einem Siedepunkt zwischen 40 und 35 80 °C, in Gegenwart eines gerinnungsinerten Schutzkolloids und einer zur Komplexbildung mit Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten polaren polyionischen Verbindung, vorzugsweise eines Polyanions wie einer Polysaccharid-Poly-schwefelsäure-Verbindung, z.B. Heparin oder eines Polykat-40 ions, z.B. Protamin. Dabei reichert sich das antihämophile Mittel in einer wässrigen Phase an und kann aus dieser gewonnen werden. Sie kann ferner durch Ultrazentrifugation des wieder aufgelösten Flotats in Gegenwart eines gerinnungsinerten Proteins vorgenommen werden. 45 Sie erfolgt alternativ auch durch Behandlung des Flotats mit wässriger Alkalilauge und Abtrennung der dialysablen Stoffe.

Die Reinigung der erfindungsgemäss erhaltenen antihämophilen placentären Substanz kann zusätzlich durch Massso nahmen erfolgen, wie sie zur Entfernung bekannter, die Gerinnung beeinflussender Faktoren bereits beschrieben wurden. So lässt sich eventuell noch vorhandenes Prothrombin, das die Faktor-VIII-Aktivität des erfindungsgemässen Produkts herabzusetzen vermag, durch Absorption an Alumiss niumhydroxid oder Bariumsulfat, durch Fällung mit Ac-ridinbasen oder Chromatographie an Ionenaustauscherharzen entfernen.

Das nach diesem Verfahren erhaltene antihämophile Mittel ist z.B. als Diagnostikum in all den Gerinnungstesten 60 einzusetzen, bei denen eine Faktor-VIII-, -IX, VII und -X-Aktivität vorhanden sein soll.

Das vorliegende Verfahren geht von zerkleinerten, blutfrei gewaschenen Placenten aus. Menschliche Placenten werden bevorzugt. Es können sowohl frisch gewonnene als auch 65 bereits zur Lagerung eingefrorene Placenten zerkleinert und zur Entfernung von Blut- und Plasmabestandteilen mit einer isotonischen Salzlösung mehrfach gewaschen werden. Das gewaschene Placentenhomogenat kann durch Filtration

oder Zentrifugation gewonnen und anschliessend ggf. getrocknet werden. Als besonders schonende Trocknung wird die Lyophilisation bevorzugt. Das blutfrei gewaschene und getrocknete Placentengewebe wird vorzugsweise in einer 4-10%igen, insbesondere 5-7%igen Suspension, mit einem wässrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 extrahiert, wobei das wässrige Medium hypoton sein soll. Vorteilhaft werden hierfür Wasser oder hypotone Salz- oder Pufferlösungen verwendet, deren Konzentration und Elektrolytenzusammensetzung zu einer osmotischen Konzentration von <330 mM/1 führen.

Besonders geeignet sind Neutralsalz-Lösungen, deren pH-Wert nach der Suspension des Placentengewebes in der Lösung mit Basen, wie Natronlauge oder Kalilauge, auf den gewünschten pH-Wert eingestellt wird. Es ist nicht entscheidend, bei welchem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 die Extraktion des Placentengewebes mit der hypotonen Lösung vorgenommen wird.

In einer besonderen Ausführungsform werden zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placenten bei einem pH-Wert >4,5 mit einem wässrigen Medium einer Osmolarität <330 mM/1 extrahiert, der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt und einer Flotation unterworfen. Dazu wird der wässrige Extrakt zur Erhöhung der Dichte der Lösung mit einer inerten wasserlöslichen Verbindung, z.B. einem Neutralsalz oder einem Kohlenhydrat, vorzugsweise einem Alkali- oder Erd-alkali-Halogenid, wie KBr, NaBr, CaCl2 oder Saccharose, versetzt, wobei mit der zugesetzten Menge der geeigneten Stoffe eine Dichte der Lösung von mindestens 1, nach oben begrenzt durch die Löslichkeit der Salze, vorzugsweise eine Dichte von 1,06 bis 1,20 g/cm3 eingestellt wird. Die Lösung wird danach bei einer Beschleunigung von 2:25 000 x g, vorzugsweise 50 000 x g, mindestens 60 Minuten, vorzugsweise 120 Minuten, zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird die auf der klaren darunter stehenden Salzlösung flotierte etwas trübe Schicht gewonnen. Die Flotation der trüben Schicht in der Zentrifuge wird zweckmässig unter den gleichen oder unter vergleichbaren Bedingungen z.B. bei 50 000-150 000 x g wiederholt und das überstehende Flotat schliesslich gewonnen.

Geeignete Flotationssysteme sind im übrigen dem Fachmann für die Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma geläufig. Bei der Anwendung von 20%iger wässriger Ka-liumbromidlösung und einer Umdrehungsgeschwindigkeit der Ultrazentrifuge entsprechend 50 000 x g flotiert die an-tihämophil wirksame Fraktion nach etwa 2 Stunden an der Oberfläche der Lösung weitgehend frei von restlichen Proteinbestandteilen, welche sedimentiert werden bzw. gelöst bleiben. Das in der beschriebenen Weise erhaltene Flotat wird in Wasser oder verdünnter Salzlösung, beispielsweise 0,5 bis l,2%iger Kochsalzlösung, vorzugsweise 0,9%iger Kochsalzlösung, dispergiert und in einer darauf zu entnehmenden Probe kann die Faktor VIII und -IX-Aktivität bestimmt werden.

Danach wird die Verdünnung in der Weise vorgenommen, dass die verdünnte Lösung des Flotats 10-200, vorzugsweise 20 Einheiten an Faktor VIII enthält.

Die durch Flotation gewonnene rohe Präparation des antihämophilen Mittels wird einem der beiden genannten Reinigungsverfahren unterworfen. Die Reinigungsverfahren werden bevorzugt wie folgt ausgeführt:

1. Reinigungsverfahren durch Extraktion und Komplexbildung

Das durch Flotation über einer konzentrierten Salzlösung erhaltene Produkt, dessen Aktivität an Faktor VIII

10-200, vorzugsweise 20 Einheiten beträgt, wird mit einem gerinnungsinerten Protein, beispielsweise Albumin, vorzugs-

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weise Humanalbumin, in einer Konzentration von 1-10%, vorzugsweise 5%, versetzt, danach mit einem zur Komplexbildung mit basischen Polypeptiden, Proteinen oder Phos-phorlipiden befähigten Polyanion, insbesondere einer Poly-saccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung wie Heparin, vorzugsweise dessen Natriumsalz, in einer Menge von 0,005-0,5 mg/ml, bei Heparin entsprechend 1-50 Einheiten pro ml der vorhandenen Lösung, versetzt. Danach wird durch Verdünnung oder Salzzusatz - in der Regel ist letzteres erforderlich - auf eine Leitfähigkeit von < 14 mS/cm eingestellt und mit Säure, vorzugsweise einer Mineralsäure wie Salzsäure, auf einen pH-Wert von 3,5-6 einreguliert. Ein Volumenteil der erhaltenen Suspension wird mit mindestens 1 Teil eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Lipide mit einem Siedepunkt von 40 bis 80 °C, vorzugsweise mit einem aliphatischen Äther oder einem Kohlenwasserstoff, dessen Siedepunkt in dem vorgegebenen Siedebereich liegt oder einer Mischung derselben, wobei das Mischungsverhältnis beliebig sein kann, vorzugsweise jedoch mit einer Mischung von 8 Volumenteilen Petroläther und 2 Volumenteilen Diäthyläther, 2-8 Stunden bei 10-40 °C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, mindestens einmal geschüttelt oder gemischt, wozu mit Vorteil ein mechanisches Schüttel- oder Mischgerät verwendet wird. Nach kurzzeitigem Stehenlassen kann die organische Phase abgetrennt oder verworfen werden. Die wässrige Phase wird, vorteilhaft in Vakuum, von restlichen Lösungsmitteln befreit. Danach erfolgt die Bestimmung der Faktor VIII und -IX-Aktivität in der bekannten Weise. Das Produkt kann parenteral angewandt werden.

Statt einer Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung kann im vorliegenden Verfahren auch eine polykationische Verbindung wie Protamin, vorzugsweise als dessen Chlorid oder Sulfat, in einer Konzentration von 1-10 mg/ml eingesetzt werden, um zu einem Produkt mit vergleichbarer Faktor VIII-Aktivität zu kommen.

Für die parenterale Applikationsform werden 10-500 Einheiten Faktor VIII, vorzugsweise 20 Einheiten Faktor VIII, in der Verbrauchslösung als Einzeldosis angestrebt. Vorher ist eine Sterilfiltration zur Entfernung von kontaminierenden Mikroorganismen erforderlich. Die Präparation kann danach in die für die parenterale Applikation geeignete Zubereitungsform gebracht werden, mit stabilisierenden Schutzkolloiden, z.B. Protein, versetzt und ggf. anschliessend lyophil getrocknet werden. Das in einer physiologisch verträglichen Lösung vorliegende Verfahrensprodukt oder das wieder aufgelöste Trockenpräparat kann für die Substitutionstherapie, z.B. der Hämophilie A verwendet werden.

Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise: Destilliertes Wasser, physiologische NaCl-Lösung, gewünschtenfalls mit Zusatz einer Puffersubstanz, wie 0,02 molares Na-Citrat mit einem pH-Wert von 7,0.

Der Präparation können vor der Gefriertrocknung zur Stabilisierung Schutzkolloide wie Albumin und/oder Kohlenhydrate wie Fruktose zugesetzt werden. Im Hinblick auf eine therapeutische Verwendung des Endproduktes beim Menschen wird zweckmässig Humanalbumin verwendet.

Die andere Möglichkeit für eine Weiterreinigung wird vorzugsweise wie nachfolgend beschrieben ausgeführt, wenn auch anzumerken ist, dass das nachstehend unter 2 beschriebene Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutisch applizierbaren Präparation weniger gut geeignet ist.

2. Reinigungsverfahren durch Alkalibehandlung

Die auf 10-200 Faktor VIII-Einheiten eingestellte Lösung wird mit Alkalilauge auf einen pH-Wert zwischen 10 und 14, vorzugsweise 12 eingestellt. Hierzu dient beispielsweise 2-7n, vorzugsweise 5n NaOH. Der Ansatz wird da3

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nach 15 Minuten bis 48 Stunden bei diesem pH-Wert stehengelassen. Anschliessend wird neutralisiert, d.h. auf einen pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes, vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 8, eingestellt. Hierfür können anorganische Säuren beispielsweise 2-1 On, vorzugsweise 5n HCl, verwendet werden. Zur Abtrennung niedrigmolekularer Bestandteile wird die neutralisierte Lösung einer Dialyse gegen eine physiologisch verträgliche Salzlösung, z.B. isotonische Kochsalzlösung, unterworfen. Vor, während oder nach der Dialyse können ggf. gerinnungsinerte Zusätze zur Stabilisierung der Aktivität des antihämophilen Mittels zugefügt werden. Besonders vorteilhaft erweist sich hierfür inertes Proteinmaterial wie beispielsweise Albumin.

Anstelle der Dialyse oder als zusätzliche Reinigung kann eine Fraktionierung auf einem Molekularsieb vorgenommen werden, beispielsweise durch Gelfiltration in einer Säule. Als Molekularsieb in diesem Sinne wird vorteilhaft eine besonders aufgearbeitete Agarose verwendet, beispielsweise die unter dem geschützten Warenzeichen Sepharose ® von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden oder als Biogel A ® von der Firma Biorad Laboratories, Richmond/Calif. erhältliche. Der Fraktionierungsbereich dieses Materials soll für die globulären Moleküle bei Molekulargewichten zwischen 104 und 10® liegen. Vor der Durchführung der Molekularsieb-Chromatographie wird das antihämophile Mittel vorteilhaft einer Dialyse gegen eine verdünnte, vorzugsweise weitgehend isotonische Salzlösung unterworfen und danach zweckmässig sowohl qualitativ als auch quantitativ hinsichtlich weiterer Zusätze zur Lösung möglichst weitgehend der Elutionslösung angeglichen, die für die Elution des gewünschten Produktes bei der Molekularsieb-Chromatographie Verwendung findet. Die Elutionslösung enthält Neutralsalze wie beispielsweise Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,7% bis 5,8%, vorzugsweise 4,5 bis 5%, und einen stabilisierenden Zusatz eines inerten Proteins, beispielsweise Albumin, in einer Konzentration von 1-10%, vorzugsweise 3%. Die Chromatographie wird in bekannter Weise vorgenommen.

Die Auswahl der einzelnen dabei erhaltenen Fraktionen erfolgt nach ihrem Gehalt an Faktor Vili, VII und -EX-Ak-tivität, wobei die Fraktionen mit angereicherter Faktor VIII-Aktivität gesammelt und vereint werden und ggf. mit einer physiologisch verträglichen Salzlösung auf die gewünschten Einheiten an Faktor VIII eingestellt, oder falls dies erforderlich ist, mit einem Ultrafilter auf die gewünschte Anzahl von Einheiten an Faktor VIII konzentriert werden.

Die Ausbeute an Faktor VIII und -IX-Aktivität wird zweckmässig während des jeweiligen Aufarbeitungsverfahrens und/oder im Anschluss daran überprüft. Seine Bestimmung erfolgt beispielsweise nach folgender Methode:

1 Teil, z.B. 0,1 ml, partielles Thromboplastin (z.B. hergestellt nach der deutschen Auslegeschrift Nr. 2 316 430), wird mit einem Teil Faktor VIII-Mangel-Plasma und einem Teil verdünntem Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 6 Minuten bei 37 °C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37 °C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchlo-rid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Cal-ciumchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines festen Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor VHI-enthaltenden Lösung sich ergebende Gerinnungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen.

1 Einheit Faktor VIII entspricht der Faktor VIII-Aktivi-tät von 1 ml Normalplasma.

Die Bestimmung der Faktor IX-Aktivität kann nach der vorangehend beschriebenen Methode zur Faktor VIII-Be-stimmung erfolgen, indem anstelle des Faktor VIII-Mangel-Plasmas ein Faktor IX-Mangel-Plasma eingesetzt wird.

Die Faktoren VII und X werden analog mit Hilfe von congenitalem Faktor VII- und X-Mangel-Plasma bestimmt.

Das erfindungsgemäss erhaltene Mittel kann zur intravenösen Substitutionstherapie der Hämophilie A und B in einem Arzneimittel, bestehend aus oder enthaltend das antihämophile Mittel und einen ggf. pharmazeutisch üblichen Trägerstoff als Zusätze, eingesetzt werden. Das Präparat wird aus Gründen der Haltbarkeit zweckmässig in trockener lyophiler Form gelagert. Vor der intravenösen Applikation ist das Trockenprodukt in für derartige Präparate bekannter Weise zu rekonstituieren.

Das Präparat substituiert:

1. Faktor VIII- und -IX-Mangelzustände, getestet nach der partiellen Thromboplastinzeit-Methode (PTT) an den entsprechend congenitalen Mangelplasmen. Die Aktivität lässt sich in Einzelheiten angeben bezogen auf Stan-dard-Human-Plasma (1 E/ml). Die Faktor IX-Aktivität wurde bei mehreren Chargen mit 0,5-1 E pro E Faktor VIII bestimmt;

2. Faktor VIII von Hemmkörperhämophilien, wie sie bei polytransfundierten Hämophilie-A-Patienten auftreten können;

3. congenitale Faktor X-Mängel, bestimmt in der PTT und Russel-Viper-Venom-Zeit.

Demzufolge ersetzt das Hämostyptikum aus Placenten alle Faktoren des endogenen Aktivierungsweges mehr oder weniger stark, am wirksamsten Faktor VIII; darüber hinaus werden aber auch

4. congenitale Faktor VII-Mangelzustände normalisiert, gemessen in der PTT und Einphasengerinnungszeit nach Quick;

5. Cumarin-induzierte Gerinnungsdefekte, die zur Bildung physiologisch nicht aktivierbaren Prothrombins (Prothrombin induced by Vitamin K Absence = PIVKA) führen, werden partiell substituiert. Die Korrektur erfolgt sehr wahrscheinlich in der Grössenordnung des noch aktivierbaren Prothrombins: 15-20% der Aktivität von Normalplasma bei gut eingestellten Patienten.

6. Prothrombin (hochgereinigt, Faktor VII und -X frei) wird stark aktiviert.

Nach Zusatz zu decalzifiziertem Human-Plasma ist das aktive Prinzip mehrere Stunden stabil; eine Hemmung tritt erst nach Zusatz von Heparin ein, das als Antidot wirkt. Zusammenfassend ist festzustellen:

Das Hämostyptikum aus Placenten substituiert von den Faktoren des endogenen Gerinnungssystems besonders wirksam Faktor VIII u. IX partiell aber auch Faktor VII und X des exogenen Systems. Der Zusammensetzung und den Eigenschaften nach ist das Hämostyptikum aus Placenten ein Komplex, der einen relativ kleinen Protein- aber hohen Phospholipidanteil enthält, der durch die Komplexie-rung mit Albumin die Eigenschaften einer echten Lösung erhält.

Das Hämostyptikum aus Human-Placenten enthält die für die Bildung des Faktor X-Aktivators erforderlichen Phospholipide in einer besonders wirksamen Form. Zur breiten therapeutischen Wirkimg trägt zusätzlich eine Substanz bei, die ähnlich, wenn nicht identisch, mit dem aktivierten Faktor X ist. Sie katalysiert direkt die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin in Umgehung der Faktoren VIII und IX und wird von Hemmkörpern in der Wirkung nicht beeinträchtigt. Mit dem Hämostyptikum aus Human-Placenta steht ein Präparat zur Verfügung, das die Therapie der Hämophilen auf eine neue Basis stellt. Das gilt sowohl für die breite Anwendung, als auch den Rohstoff. Das Hämostyptikum unterscheidet sich nach Herstellungsverfahren, Zusammensetzung und Wirkungsweise von den anderen bekannten Präparaten. Ein Indikationsschwerpunkt liegt

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wahrscheinlich in der Behandlung von Hemmkörper-Hämo-philien, die bisher z.T. nur mit tierischem antihämophilem Globulin Gerinnungsfaktoren oder mit aktivierten Faktoren behandelt werden können.

Die Erfindung soll an dem nachstehenden Beispiel näher erläutert werden:

Beispiel

Blutfrei gewaschenes lyophilisiertes Placentengewebe wird in einer 5%igen Suspension in 0,05 M Na-Citratlösung 20 Minuten bei Zimmertemperatur kräftig durchmischt. Das Homogenat wird in einer Zentrifuge 30 Minuten bei 30 000 x g geschleudert, das Sediment verworfen und der sich bildende Überstand mit festem Kaliumbromid auf eine 20%ige Sättigung gebracht. In einer Ultrazentrifuge wird der Extrakt bei 50 000 x g 2 Stunden lang geschleudert, wobei ein gut abtrennbares Flotat entsteht. Diese überstehende Zone wird abgeschöpft. Da hierfür eine physiologische Verträglichkeit der Präparation die Voraussetzung ist, werden zur intravenösen Substitutionstherapie zweckmässig nur Präparationen verwendet, welche einem der vorbeschriebenen Reinigungsverfahren unterzogen wurden. Nach einer erneuten Flotation bei 150 000 x g wird im Präparat die Aktivität der Faktoren VIII, IX, X und VII getestet.

Die Faktor VIII-Aktivität beträgt 200 E/ml.

Weiterreinigung

Das bei 150 000 x g flotierte Präparat wird mit einer wässrigen 10%igen Humanalbumin-Lösung, welche 10 E/ml an Heparin-Natrium enthält, zu gleichen Teilen verdünnt. 5 Dabei muss beachtet werden, dass der Gesamt-Salzgehalt der Mischung einer elektrischen Leitfähigkeit von etwa 8 mS/cm entspricht. Der pH-Wert wird mit 1 N HCl auf 4,5 eingestellt.

Die Mischung wird in eine Extraktionsapparatur nach io Kutscher und Steudel gegeben und über 2 Stunden kontinuierlich mit 2 Teilen eines Petroläther (Fr. 60-80°)/ Diäthyläther-Gemisches = 80/20 (Vol/Vol) extrahiert.

Nach der Operation wird der organische Lösungsmittelanteil unter schonenden Bedingungen im Vakuum bei i5 20 °C mit einem Rotationsverdampfer beseitigt und die verbleibende wässrige Phase mit 1 N NaOH auf pH 7,5-8,0 eingestellt. Nach 2 Stunden Rühren bei Zimmertemperatur und Sterilfiltration ist das Präparat zur Substitutionstherapie von Faktor VIII-Mängeln gebrauchsfertig. Die Faktor VIII-Ak-20 tivität einer Probe wird auf etwa 30 E/ml eingestellt.

Statt mit Heparin-Natrium kann die Faktor VHI-Präpa-ration im ersten Verfahrenssehritt auch mit Protaminsulfat (5 mg/ml) versetzt werden.

Tabellarische Zusammenstellung der Wirkung des Hä-25 mostyptikums aus Human-Placenten auf Plasmagerinnungszeiten von Normalplasma, Faktor Mangelplasmen und Hemmkörperplasmen bestimmt in der PTT*.

Hämostyptikum, Anwendungslösung l:20verd. l:10verd.

0,1 E**/Ansatz 0,2E/Ansatz

31,9732,6" 43,5743,9" 42,2742,4"

28,8728,8" 37,37 37,5" 33,7733,6"

39,4739,8" 44,3"/44,2"

73,7773,9"

31,7731,7" 34,8"/34,5" 64,0"/63,7"

Plasma

Kontrolle

Normalplasma Faktor VII-MPL Faktor VIII-MPL Hemmkörper-Hämophilie-Plasma Faktor IX-MPL Faktor-MPL

45,6"***/ 45,2" 56,6"/ 56,8" 137,67137,9"

128,67128,2"

136,67136,4" 126,0"/126,5"

* Testansatz für PTT:

0,1 ml Normal- bzw. Mangelplasma (MPL) 0,1 ml Placenten-F VIII (0,1 E bzw. 0,2 E) bzw. Puffer pH7 0,1 ml Pathromtin®

120 ml inkubieren 0,1 ml CaCl2

** bezogen auf die F VIII-Aktivität von Normalplasma: 1 E/ml

*** " = sec.

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Claims

630 805 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass man zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placenten mit einem wässrigen hypotonen Medium im schwach sauren bis alkalischen Bereich extrahiert, den Extrakt vom Geweberückstand abtrennt, die spezifische Dichte des Extraktes durch Zusatz einer inerten wasserlöslichen Verbindung bis zum Aufrahmen erhöht und das mit einem wässrigen Medium verdünnte Flotat bei niedriger Leitfähigkeit und schwach saurem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide in Gegenwart eines gerinnungsinerten Schutzkolloids und einer zur Komplexbildung mit Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten polaren polyionischen Verbindung extrahiert, wonach man das antihämophile Mittel mit Faktor Vili-, -IX-, -VII- und -X-Aktivität in der wässrigen Phase anreichert und diese gewinnt.

2. Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass man zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placenten mit einem wässrigen hypotonen Medium im schwach sauren bis alkalischen Bereich extrahiert, den Extrakt vom Geweberückstand abtrennt, die spezifische Dichte des Extraktes durch Zusatz einer inerten wasserlöslichen Verbindung bis zum Aufrahmen erhöht und man das Flotat mit wässriger Alkalilauge behandelt und die dialysier-baren Stoffe abtrennt.