DE2324717B2

DE2324717B2 - Verfahren zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VUI)

Info

Publication number: DE2324717B2
Application number: DE2324717A
Authority: DE
Inventors: Lajos F. Costa Mesa Fekete; Stephen L. Santa Ana Holst
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1972-05-17
Filing date: 1973-05-16
Publication date: 1980-01-03
Also published as: NL7306806A; IT1061433B; DE2324717C3; GB1372515A; FR2184898A1; ATA433573A; USRE29698E; DK136016B; SE430020B; AU465351B2; AU5584973A; CH630804A5; US3803115A; IL42221A0; ZA733138B; CA1007986A; JPS4956695A; DK136016C; ES414823A1; NO142381C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) mit erhöhter Ausbeute aus Blutplasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung gewonnen werden.

Das Verfahren der Blutkoagulierung ist ein komplizierter biologischer Vorgang und erfordert die Zusammenwirkung verschiedener, in normalem Gesamtblut auftretender Substanzen. Bekanntlich sind bei bestimmten Menschen bestimmte Faktoren, die mit dem Blutkoagulierungsmechanismus in Zusammenhang stehen, abwesend oder stark vermindert So ist bekanntlich die klassische Hämophilie (Hämophilie A) eine Mangelerkrankung aufgrund der Abwesenheit von AHF (Faktor VIII). Bei Patienten, die an angeborener Hämophilie, die als Hämophilie B bekannt ist, leiden, fehlt dem Blut die Plasmathromboplastinkomponente (PTC, Faktor IX). Verschiedene andere, für den Koagulierungsmechanismus wichtige Faktoren II, VII und X.

Bis vor wenigen Jahren bestand die Behandlung von Bluterpatienten in Transfusion mit Gesamtblut oder Blutplasma. Die verbesserte medizinische Praxis fordert jedoch, daß man dem Patienten, wenn möglich, nur solche Blutkomponenten verabreicht an denen es ihm fehlt Aufgrund der allgemeinen Knappheit an Blut ist es auch vorteilhaft, dieses in verschiedene Komponenten zu fraktionieren, wodurch sie je nach Erfordernis für die Behandlung des Patienten verwendet werden können.

Es sind verschiedene Verfahren zum Fraktionieren von Blut und Blutplasma in seine getrennten Komponenten oder deren Konzentrate bekannt. Besonders zu erwähnen ist die Arbeit von Edwin Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard Universität bei der Entwicklung des Alkoholfraktionierungsverfahrens. Mit besonderem Bezug auf die Produktion von AHF zeigen die neueren US-Patentschriften 36 31 018 und 36 52 530 verbesserte Verfahren zur Erzielung eines hochgradig reinen Konzentrates dieses Faktors.

Bei der Forschungsarbeit von Wagner, Thelin, Brinkhous und anderen, an der AHF-Produktion interessierten Gruppen wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Prothrombin (Faktor II) und seines assoziierten Komplexes von Faktoren für die langzeitige und kurzzeitige Stabilität des Faktors VIII nachteilig war. Die übliche Behandlung zur Umgehung dieses Problems bestand in der Entfernung des Prothrombin-Kompiexes mit verschiedenen Mitteln, wie Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, Rivanol (6,9-Diainino-2-äthoxyacridin]actat), IRC-50 Ionenaustauscherharz (»XE-64-RivanoI«) und -j Glycinäthylester.

Wenn auch diese Mittel gewöhnlich wirksam sind, wurden bei ihrer Verwendung in klinischem Mafistab verschiedene ernste Nachteüe offensichtlich. So wird z. B. der Einschluß von Spurenmengen von Aluminium

ίο klinisch als unsicher angesehen.

Seit der Cryo-Ausfällung und einstufigen Herstellung relativ hochwirksamer Konzentrate schien zunächst die Verwendung jeglicher Maßnahmen der Prothrombinkomplexentfernung umgangen zu sein (vgL Pool et al, »Nature«, Bd. 203, Seite 312 [1964]). In der Praxis wurde jedoch gefunden, daß eine hohe Schwankung von bis zu oder mehr als 50% der mittleren Werte der

AHF-Ausbeuten auftrat Die einzige Vorvercffentlichung, die tatsächlich

konkrete Schlußfolgerungen auf das nunmehr beanspruchte Verfahren vor dem Anmeldetag dieser Erfindung zuließ, war ein umfassender Artikel von A. E. Preston in »British Journal of Haematology« (Bd. 13, Nr. 1, Jan. 1S67, Seite 42 ff.). Die auf gründlichen Versuchen beruhenden Ausführungen dieses Autors mußten jedoch ein ganz anderes Ergebnis der Wirkung eines Zusatzes von Heparin zu einer Blutplasmafraktion erwarten lassen, als sie erfindungsgemäß tatsächlich erhalten wird.

Der Autor hat die Wirkung der Zugabe von Heparin zu Vollplasma quantitativ untersucht und die dabei erhaltenen Werte wurden in Tabelle III auf Seite 47 des genannten Artikels niedergelegt Es ist ersichtlich, daß nach einer Lagerungszeit von 18 Stunden bei 4° C das mit Trinatriumcitrat versetzte Blut eine sehr dramatische Abnahme an Faktor VIII zeigt welche um so höher ist je mehr Heparin-Einheiten dem Blut zugesetzt wurden. Die gleiche Erscheinung wurde mit Blut erhalten, das ein Säure-Citrat-Dextrode-Antikoagulationsmittel enthielt und 30 Tage bei -40° C gelagert war.

Aus diesen Ergebnissen mußte also die eindeutige Schlußfolgerung gezogen werden, daß die Zugabe von Heparin praktisch keine Wirkung auf die AHF-Aktivität des frischen Blutplasmas hat und daß sie sich ferner auffällig nachteilig auf die AHF-Aktivität während der Lagerung bei beispielsweise 4° C oder -40⁰C auswirkt Nach diesen Ergebnissen ist die Verwendung von Heparin als Zusatzmittel zu Blutplasma schädlich, und es mußten aufgrund naheliegender Schlußfolgerungen angenommen werden, daß auch der Zusatz von Heparin zu Blutplasmafraktionen in gleichem oder sogar verstärktem Maße schädlich sein würde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die

Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates mit beachtlich verbesserter Ausbeute, insbesondere bei Herstellungsverfahren in großem Maßstab, wobei keinerlei klinisch unsichere Verunreinigungen im Konzentrat erhalten werden.

bo Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) mit erhöhter Ausbeute aus Blutplasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnen und gegebenenfalls mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin weiterfraktioniert werden, das dadurch gekennzeichnet ist daß man dem erhaltenen Cryopräzipitatkonzentrat Heparin in Mengen von 0,01 — 10 Einheiten pro ml Lösung zufügt

Das wesentlichste Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also darin, zu einer durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnenen Plasmafraktion Heparin in einem bestimmten Mengenbereich zuzusetzen. Dabei erreicht man die besten Ergebnisse, wenn der Heparinzusatz unmittelbar nach der Cryo-Ausfällung, z. B. zu dem Cryopräzipitat, erfolgt

Das Cryopräzipitat wird vorzugsweise einer weiteren Fraktionierung unterworfen. Fraktionierungsmittel für eine solche Weitcrfraktionierung des Cryopräzipitats sind bereits bekannt Beispielsweise wurde die bekannte Cohn-Fraktionierungsmethode, welche Alkohol für diesen Zweck verwendet, bereits genannt Erfindungsgemäß wird bevorzugt für eine Weiterfraktionierung des Cryopräzipitats Polyäthylenglykol bzw. Glycin aus der Reihe der bekannten Fraktionierungsmittel ausgewählt

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das als Fraktionierungsmittel verwendete Polyäthylenglykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von 4O00. Dabei kann das Cryopräzipitatkonzentrat mit etwa 3 bis 4% Polyäthylenglykol behandelt werden, wobei man die überstehende Flüssigkeit mit 10% Polyäthylenglykol ausfällt und das erhaltene überstehende Material dann mit Glycin fraktioniert

Bei Verwendung von Glycin als Fraktionierungsmittel hat dieses vorzugsweise eine Molarität von etwa 1,8.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das mit Heparin versetzte Cryopräzipitatkonzentrat gefriergetrocknet werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, daß die Ausbeute an AHF insbesondere bei der Herstellung in großem Maßstab verbessert werden kann. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß im Gegensatz zur bisherigen Praxis ohne Verwendung von Heparin bei seiner Verwendung (1) die Zeil verunreinigung, z. B. aus dem Fraktionierungsverfahren, nicht zu niedrigeren Ausbeuten führt, (2) die Gewebeverunreinigung, wie sie z. B. während der intravenösen Verabreichung erfolgt, keine niedrigeren Ausbeuten liefert, (3) eine längere Behandlungszeit die Ausbeute nicht vermindert und (4) die Stabilität nach Rekonstituierung gegenüber nicht mit Heparin behandelten Plasmakonzentraten sehr beträchtlich erhöht wird. Erfindungsgemäß ist es daher nicht nötig, den Prothrombinkomplex zur Erzielung einer Stabilität der AHF-Konzentrate zu entfernen, und die üblichen Verluste der Ausbeute aufgrund von Zeil- und Gewebeverunreinigung oder längere Behandlungszeiten werden vermieden.

Die erfindungsgemäß während der Fraktionierung von AHF verwendete Heparinmenge kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde gefunden, daß eine Konzentration von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Plasmalösung oder -fraktion sehr gute Ergebnisse liefert Unter »Einheit Heparin« wird in der vorliegenden Anmeldung die »US.P.- Einheit« (United States Pharmacopoeia) verstanden. Die U.S.P.-Einheit an Heparin ist die Menge, die 1,0 ecm citratversetztes Schafsplasma 1 Stunde am Gerinnen hindert, nachdem 0,2 ecm einer 1:100 CaCl₂ Lösung zugegeben wurde. Die hier verwendete Bezeichnung »Heparin« umfaßt auch das Natriumsalz von Heparin, das aufgrund seiner Wasserlöslichkeit bevorzugt wird.

Die vorliegende Erfindung hat sich bei verschiedenen Verfahren zur Herstellung von AHF-Konzentraten durch Cryo-Ausfällung als sehr vorteilhaft erwiesen und ist auf jede Plasmafraktion anwendbar, die AHF ir.

Mischung mit irgendeinem der Prothrombinkomplexfaktoren enthält So kann es z. 3. auf Verfahren zur Fraktionierung von AHF aus Cryopräzipitat durch Glycinausfällung, aus Cryopräzipitat durch Polyäthylenglykolausfällung, aus Cryopräzipitat durch Polyäthylenglykol- und Glycinausfällung, aus Cryopräzipitat und aus Cryopräzipitat durch Polyäthylenglykol- und Glycinausfällung und anschließende »Ecteola«-Chromatographie angewendet werden.

ίο Eine bevorzugte Methode zur Herstellung von AHF-Konzentrat, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, ist das in der US-Patentschrift 36 31 018 beschriebene Verfahren, bei welchem Polyäthylenglykol (PEG) und Glycin zum Fraktionieren eines Cryopräzipitates verwendet werden. So wird in Beispiel 4 der genannten Patentschrift in der Stufe, in welcher die Cryo-Ausfällung in mit Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung gelöst wird, etwa eine Einheit Heparin pro ecm Lösung zugefügt Nach der Ausfällung mit Polyäthylenglykol bei 10%iger Konzentration wird der erneut gelöste Niederschlag wiederum auf einer Menge von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Lösung aufgrund des Verlustes an Heparin während der Fraktionierung mit 10% tigern Polyäthylenglykol behandelt Das Heparin wird zweckmäßig zu der mit Citrat bzw. Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösung zugefügt, die zum Lösen der jeweiligen Niederschläge verwendet wird.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorlie-

gende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In folgender Weise wurde ein stabiles AHF Konzentrat von Menschen in hoher Ausbeute und von hoher Wirksamkeit erhalten:

Reagenzien

Citrat-versetzte Kochsalzlösung — 1 Teil 0,1 molares Natriumeitrat zu 4Gew.-Teilen 0,9%iger

Kochsalzlösung

mit Glycin und Citrat versetzte Kochsalzlösung — zur oben hergestellten Citrat-versetzten Kochsalzlösung wurde ausreichend Glycin zugeführt, um die Lösung bezüglich Glycin 0,1 molar zu machen

gepuffertes Waschwasser — zu dest Wasser wurde Vioo Volumen gepuffertes Citrat zugefügt, hergestellt durch Einstellen von 0,5molarem Natriumcitrat mit 0,5molarer Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,88

Heparin — es wurde ein Material von U. S. Pharmacopoeia-Reinheit verwendet (»Lipo-Hepin« — wäßrige Natriumheparininjektion).
Essigsäure — hergestellt in 1,0 normaler und 0,1 normaler wäßriger Lösung

Glycin — hergestellt in 1,3- und l,8molarer wäßriger Lösung.

Verfahren

Aus dem Spendenzentrum wurde gefrorenes mensch-

liches Blutplasma (bei unterhalb 4° C) geliefert Das

Plasma wurde in Pfaudler-Kesseln gepoolt und bei einer Temperatur von 2° C bis 4° C durch kontinuierliche Fließ- oder Becherzentrifugierung zentrifugiert. Zum Cryopräzipitat wurde mit Glycin und Citrat versetzte

b5 Kochsalzlösung, die eine Einheit Heparin pro ecm enthielt, zugefügt, wobei die Menge ein Zehntel der

Menge des das Cryopräzipitat enthaltenden Plasmas

betrug.

Das Lösen erfolgte durch Mischen von Cryopräzipitat und mit Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung in einer warmen Umgebung (normaler Zimmertemperatur, jedoch nicht über 30° C.)

Das gelöste Cryopräzipitat wurde mit 0,1 normaler Essigsaure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt Zur Lösung wurde Polyäthylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 4000) bis zu ein«;r PEG Konzentration von etwa 3,5% zugefügt Die Mischung wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur mild bewegt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdr^min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und mit 0,1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt Zur Lösung wurde weiteres Polyäthylsnglykol bis zu einer endgültigen PEG Konzentration von etwa 10% zugefügt Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten mild bewegt und dann eine halbe Stunde bei 5000 Umdn/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde alxlekantiert und verworfen. Der Niederschlag wurde in kaltem Wasser (2°C) gewaschen, dann erfolgte 5 Minuten bei 5000 Umdn/min und einer Temperatur von -4'³C ein Rotationswaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Niederschlag erneut in mit 'Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung, die eine liinheit Heparin pro ecm enthielt, gelöst Wiederum ist die Menge des zur erneuten Lösung verwende- en Löüungsmittels etwa ein Zehntel des Plasmavolumens, düis den Niederschlag ergab.

Der erneut gelöste Niederschlag wurde mit 0,1 norma- jo ler Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt

AHF-Ausbeute

und erneut mit wäßrigem Glycin einer Molarität von 1,8 ausgefällt Während dieser Ausfällungsstufe wurde ausreichend Glycin zugefügt, um die Mischung bezüglich Glycin l,8molar zu machen. Die Mischung wurde 45—60 Minuten mild bei einer Temperatur von 2 — 10° C bewegt und dann durch kontinuierliches Fließ- oder Becherzentrifugieren zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und vorsichtig mit gepuffertem Waschwasser gewaschen und erneut in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung gelöst Die Lösung wurde durch Filtration unter Verwendung eines 293-mm-Milliporen-Filters (verwendete Membrane: 1,2 Micron, 0,45 Micron und 03 Micron) geklärt

Dann wurde das flüssige Produkt durch »Shell«-Einfrieren (-60⁰C) und mindestens 3-stündiges Lagern in einer Blitzeinfriervorrichtung (-20° C bis -30° C) eingefroren.

Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei kein Heparin zur mit Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösungzugeführt wurde, die zum Lösen des anfänglichen Cryopräzipitates oder zum Lösen des Niederschlages aus der Fraktionierung mit 10%igem Polyäthylenglykol oder an irgendeinem anderen Punkt während der Fraktionierung verwendet wurde.

Die obigen Verfahren wurden sowohl mit als auch ohne Heparinzugabe wiederholt

Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse aus den vier Fraktionierungsversuchen. Dabei gibt die Spalte »Cryo-Ausbeute« die aus dem Ausgangsplasma gewonnene AHF Menge an; die Spalte »Endproduktausbeute« gibt die endgültige AHF Ausbeute an.

Angew. Verfahren

Cryo-Ausbeute Endproduktausbeute Wirksamkeit
d. Verfahrens

Ges. Vol. d
Ausgangsplasmas: 1

Ohne Heparin	35	13,6	38	6000
Mit Heparin	35	17	49	300
Ohne Heparin	32	12,5	39	600G
Mit Heparin	33	17	52	300

Aus der obigen Tabelle geht hervor, dall die endgültige AHF Ausbeute bei Verwendung von Heparin 17% betrug, während sie ohne Heparin durchschnittlich zwischen 12,5 und 13,6 lag. Daher erhöhte die Heparinzugabe die Ausbeute gegenüber dem Verfahren ohne Heparin um 15 — 35%. Indem die Endproduktausbeute durch die Cryo-Ausbeute dividiert wurde, ist ersichtlich, daß sich die Wirksamkeil des Verfahrens von 38 und 39% (ohne Heparinzugabe) auf 49 und 52% (mit der Heparinzugabe) verbessert hai te.

Wurde im obigen Beispiel Polyäthylenclykol 60[IO für eine äquivalente Menge Polyäthylenglykol4000eiüetzt, dann erhielt man praktisch ähnliche Ergebnisse.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde bis zur Stufe des erneuten Suspendierens des anfänglichen Cryoprilzipitates in der mit Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösung mit und ohne Heparin in der Lösung wiederholt Die endgültige AHF-Ausbeute in diesen beiden Cryopräzipitatkonzentraten von AHF betrug ohne Verwendung von Heparin 34% und mit Heparinverwendung 41%. Dies entsprach einer Verbesserung der Ausbeute von 21 %.

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Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch die Cryopräzipitatkonzentrate mit und ohne Heparin lyophiliert, dann mit Wasser rekonstituiert und bei Zimmertemperatur (etwa 25⁰C) 24 Stunden stehen gelassen wurden. Die mit Heparin behandelte Probe bewahrte 98% ihrer anfanglichen AHF Aktivität vor dem Stehenlassen, während die nichtheparinisierte Probe nur 72% ihrer anfänglichen AHF Aktivität bewahrte.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) mit erhöhter Ausbeute aus Blutplasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnen und gegebenenfalls mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin weiterfraktioniert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man dem erhaltenen Cryopräzipitatkonzentrat Heparin in Mengen von 0,01 — 10 Einheiten pro ml Lösung zufügt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man weiteres Heparin im Laufe der anschließenden Fraktionierungen zufügt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit Heparin versetzte Cryopräzipitatkonzentrat gefriertrocknet