DE2525804B2 - Stabiler Clumping-Faktor, Verwendung desselben zum Nachweis von Fibrinogen- und Fibrinspaltprodukten und Herstellung desselben - Google Patents

Description

Die Erfindung ist durch die Patentansprüche 1,3 und 4 definiert. Der Patentanspruch 2 stellt eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.

Die Aktivierung des fibrinolytisehen Systems führt zu einem proteolytischen Abbau von Fibrinogen bzw. Fibrin. Beim Abbau des Fibrinogens entsteht zunächst das sogenannte Fragment X und weitere Spaltprodukte, welche mit A, B und C bezeichnet werden. Das Fragment X zeigt in Größe und Eigenschaft die stärkste Ähnlichkeit mit Fibrinogen und läßt sich mit Thrombin langsam zur Gerinnung bringen. Bei fortschreitendem proteolytischen Abbau des Fragments X entstehen die Fragmente Y und D. Das Fragment Y wird mit Thrombin nicht mehr zur Gerinnung gebracht. Eine weiterführende Proteolyse des Fragments Y führt zu den Spaltprodukten D und E. Die kleineren Spaltproduktc D und E haben nicht mehr alle antigenen Determinanten des Fibrinogens. Die Fibrinspaltprodukte sind Indikatoren für bestimmte Erkrankungen und teilweise Inhibitoren der Fibrinbildutig, so daß ein klinisches Interesse daran besteht, den Gehalt an Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten und damit das Ausmaß einer intraversalen Fibrinolyse zu bestimmen.

Die Grundlage eines Verfahrens zur Bestimmung der genannten Spaltprodukte besteht darin, daß gewisse Mikroorganismen, insbesondere Stämme von Staphylokokken, mit Fibrinogen und den Fibrinspaltprodukten X und Y unter makroskopisch sichtbarer Verklumpung reagieren. Die Eigenschaft der Verklumpung der Staphylokokken wird einem zellgebundenen Enzym zugeschrieben, das nur unzureichend charakterisiert ist. Es wird als »CIumping-Faktor« bezeichnet Zuweilen wird darunter auch die zellgebundene Koagulase verstanden. Die schnelle Durchführbarkeit und die hohe Empfindlichkeit des auf dem CIumping-Faktor beruhenden Testsystems, insbesondere für die Bestimmung der Fibrinspaltprodukte X und Y, macht dieses Testsystem für die Routinediagnostik der Fibrinolyse besonders geeignet

ίο Es hat sich jedoch gezeigt, daß die nach dem Stand der Technik hergestellten Suspensionen von geeigneten Staphylokokken nur wenige Stunden die erforderliche Aktivität zum Nachweis der Fibrinspaltprodukte aufweisen und daß die zum Zwecke der Konservierung der Aktivität gefriergetrockneten Produkte sich häufig nicht mehr homogen in Lösung suspendieren lassen oder unspezifisch verklumpen. Die Empfindlichkeit der resuspendierten Keime nimmt rapide ab. Sie sind nach wenigen Stunden als Reagens zum Nachweis von Fibrinspaltprodukten ungeeignet.

Es wurde nun gefunden, daß Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken, die in einer bestimmten gepufferten, wäßrigen Lösung eines bestimmten mehrwertigen Alkohols suspendiert sind, ihre Eigenschaft, in Gegenwart von Fibronogen- und/oder Fibrinspaltprodukten zu verklumpen, auch nach monatelanger Lagerung bei Temperaturen unter + 25° C nicht verlieren (vgl. hierzu Patentanspruch 3).

Für das in Frage stehende Testsystem wurde bereits

jo häufig die Verwendung von Staphylococcus aureus Newman D2C beschrieben. Bei dem Stamm handelt es sich um eine Clumping-Faktor-positive, lösliche Koagulase-negative Variante des Stammes Newman, der von E. S. Duthie, Southampton, aus Kulturen des Staphylo-

j-> coccus aureus r·' wman, hinterlegt bei der National Collection of Type Cultures unter der Nummer 8178, im Hinblick auf die Bildung von CIumping-Faktor selektiert wurde.

Clumping-Faktor-positive Stämme, die zudem lösliehe Koagulase zu bilden vermögen, sind, wie aus der Literatur bekannt, ebenfalls für die Bestimmung von Finbrinspaltungsprodukten zu verwenden, wenn die lösliche Koagulase beispielsweise durch einen Erhitzungsschritt zerstört wird. Derart vorbehandelte Sta-

Γ) phylokokken können selbstverständlich erfindungsgemäß ebenfalls stabilisiert werden.

Schon bei dem Fermentationsverfahren, nach welchem die Bakterienmasse gewonner, wird, ist auf eine gute Suspendierbarkeit der Keime und auf eine

",0 ausreichende Ausbeute hinsichtlich der Clumping-Aktivität zu achtem So ist es zweckmäßig, die Vermehrung der Keime in einem Medium vorzunehmen, das im wesentlichen jus einer wäßrigen Lösung von Fleischpepton, Milchsäure bzw. deren Salzen, Vitaminen und

-Γι Glucose, Alkali- und Eralkali-Ionen, am besten in Form ihrer physiologisch verträglichen Salzen wie Chloriden, Sulfaten und Phosphaten, besteht. Die in Flaschen, Kesseln oder Fermentern vermehrten, durch Filtration oder Zentrifugation vom Nährmedium abgetrennten

ho Keime werden durch Maßnahmen in ihrer Vermchrungsfähigkeit gehindert, die die Aktivität des Clumping-Faktors so wenig wie möglich verringern. In bewährter und bekannter Weise wird die Abtötung der Keime durch Erwärmung auf etwa 60-70°C für 30-90

bj Minuten vorgenommen.

Der wesentlich stabilisierende Effekt einer Clumping-Faktor-aktiven Staphylokokken-Suspension liegt also in dem Gehalt des Suspensionsmediums an 3 — 50% eines

bestimmten mehrwertigen Alkohols, Darunter sind im Sinne der Erfindung Verbindungen zu verstehen, die in einem Kohlenwasserstoff-Gerüst an mehreren benachbarten C-Atomen je eine Hydroxylgruppe tragen und ein Molekulargewicht zwischen 90 und etwa 500000 haben. Die einfachsten Verbindungen dieser Stoffklasse sind der zweiwertige Alkohol Glykol und der dreiwertige Alkohol Glycerin. Günstige stabilisierende Effekte zeigen beispielsweise auch die Vertreter der sechswertigen Alkohole wie das Mannit und der Kohlenhydrate wie Glucose. Neben den niedrigmolekularen Verbindungen sind erfindungsgemäß auch die hochmolekularen Glykole wie das Polyäthylenglykol zur Stabilisierung der Suspension einzusetzen. Besonders gute Eigenschaften zeigen zudem Kohlenhydrate, insbesondere deren hochmolekulare Vertreter, die sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein können. Als Beispiele hierfür seien genannt das natürlich vorkommende Glukose-Polymerisat Dextran oder das synthetische Poiysaccharid aus Rohrzucker, das am Anmeldetag unter dem Handelsnamen »Ficoll« erhältlich war.

Eine Voraussetzung für die Verwendbarkeit der mehrwertigen Alkohole ist selbstverständlich ihre Löslichkeit in der gepufferten wäßrigen Lösung, der selbstverständlich ggf. Neutralsalze zugefügt werden können, um ein annähernd isotones Milieu für die zu suspendierenden Mikroorganismuszellen herzustellen.

Die Suspension der Staphylokokken wird zweckmäßig mit Hilfe t./ier Puffersubstanz, wie sie bei biochemischen Arbeiten üblicherweise verwendet werden, auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Geeignete Puffersubstanzen sind fiierff·- beispielsweise diejenigen, die von Good u. a. in Biochemistry 5, 472 (1966) beschrieben wurden. Die Konzentration der Bakterien, die in der gepufferten wäßrigen, den mehrwertigen Alkohol enthaltenden Lösung suspendiert sind, beträgt 1 -20 χ 10"VmI₁ falls die Staphylokokken-Suspension direkt in Testverfahren zur Bestimmung von Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten eingesetzt werden soll. Die Stabilität des Clumping-Faktors ist jedoch auch gewährleistet, wenn die Keimdichte gegenüber dem angegebenen Wert wesentlich erhöht oder erniedrigt vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist also auch das im Anspruch 1 genannte Verfahren.

Es besteht natürlich kein Hinderungsgrund, zu der erfindungsgemäß stabilisierten Mikroorganismen-Suspension weitere aus der Biochemie, insbesondere der Enzymchemie, bekannte, die enzymatische Aktivität erhaltenden oder aktivierenden Stoffe wie z. B. Proteine, insbesondere Albumin oder Gelatineabbauprodukte zuzusetzen. Zur Verhinderung einer mikrowellen Kontamination kann der Suspension selbstverständlich ein antimikrobielles Mittel, beispielsweise ein Antibiotikum, zugesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch die im Anspruch 4 genannte Verwendung. Die Bestimmung der Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukte wird beispielsweise in der Weise vorgenommen, daß das zu prüfende Serum, von dem eine Verdünnungsreihe hergestellt wird, mit einer konstanten, zweckmäßig einer gleichen Menge, der erfindungsgemäßen Staphylokokken-Suspension versetzt wird, wonach innerhalb von wenigen Minuten diejenige höchste Serumverdünnung registriert wird, die noch eine positive Verklumpung der Keime aufweist. Wird dieser Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Personen erhaltenen Wert in Beziehung gesetzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden. Die Bestimmung wird in bekannter Weise am einfachsten auf einem Objektträger vorgenommen, auf dem die Reaktionspartner zu gleichen Teilen vermischt werden.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.

in Beispiel

Herstellung der Keimsuspension

Ein CIumping-Faktor-positiver Stamm von Staphylococcus aureus wird in einem Medium folgender is Zusammensetzung

Fleischpepton Natriumlactatlösung, 50% Ammoniumchlorid Magnesiumsulfat (7 H2O) Dikaliumhydrogenphosphat Kaliumdihydrogenphosphat

80,0 g

25.0 ml

18,5 g

0,8 g

4,0 g

4,0 g

auf 4 1 mit Wasser aufgefüllt und mit folgenden Zusätzen versehen:

D( + ) Biotin	0,02 mg
Calcium-D( + )-pantothenat	1,00 mg
Cholinchlorid	0,08 mg
Folsäure	0,20 mg
meso-Inosit für biochem. und
mikrobiol. Zwecke	0,08 mg
Nicotinsäure	6,00 mg
Pyridoxalhydrochlorid	0,50 mg
Riboflavin	0,72 mg
Thiaminiumdichlorid	2,448 mg
Glucose	10g

bis zu einer Konzentration von 15 κ 10" Keimen pro ml vermehrt.

Danach wird der Fermenter, in der die Vermehrung vorgenommen wurde, 90 Min. lang auf 70°C erwärmt. Die Keime werden mit Hilfe einer Zentrifuge bei 6500 UpM gewonnen. Das überstehende Nährmedium wird verworfen und die Keime mehrfach in isotonischer Kochsalzlösung suspendiert und zentrifugiert. Schließlich werden die zentrifugierten Keime in einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung suspendiert.

0,1 M/l Tris-hydroxymethyl-aminomethan 0,3 M/I Natriumchlorid 0,02% Chloramphenicol 0,02% Humanalbumin

Der pH-Wert der Lösung wird mit I N Salzsäure auf 7,4 eingestellt, wonach zu einem Volumenteil der Pufferlösung ein Volumenteil Glycerin zugegeben wird. Danach wird die Keimdichte der Suspension auf 1 χ 10¹VmI eingestellt.

Die erhaltene Suspension zc.igt im folgenden Testsystem ein gleichbleibendes Ergebnis über 12 Monate:

1. Gewinnung eines Serums von einer gesunden Normalperson

5 ml frisch entnommenes Blut werden sorgfältig mit 0,1 ml eines polyvalenten Proteinaseninhibitors entsprechend 10 Entiplasmin-Einheiten und 0,1 ml einer Thrombinlösung entsprechend lONIH-Einheiten vermischt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 37"C inkubiert und anschließend das überstehende Serum von dem

entstandenen Blutgerinsel durch Zentrifugation abgetrennt.

2, Testansatz

Unter Verwendung von 0,1 M Tris-hydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 7,4 wird eine geometrische Verdünnungsreihe des Serums hergestellt, so daß eine Verdünnung von 1 :1,1 :2,1 :4, 1 :8 etc. resultiert Jeweils 0,05 ml der Serumverdünnungen werden mit 0,05 ml der entsprechend dem vorgelegten Beispiel hergestellten Staphylokokken-Suspension auf einem Objektträger vermischt Man läßt die Mischung 2 Mi.'i. lang vorsichtig rotieren und liest die Verklumpungsreaktion gegen einen schwarzen Hintergrund ab. Es ist eine Verklumpung bis zu einer Verdünnung von 1 :256 nachzuweisen. Das gleiche Ergebnis wird erhalten, wenn statt, wie im Beispiel angegeben, der verwendete Puffer mit 50% Glycerin mit folgenden Substanzen vermischt wird.

Subs'anz

Gew.%

Molekulargewicht

Glycerin 33 92

Glucose IO 180

Mannit 3 182

Mannit 10 182

Mannit 15 182

Polyäthylenglykol 3 4.000

Polyäthylenglykol 10 4.000

Dextran 3 40.000

Dextran 10 40.000

Dextran 3 250.000

Dextran 10 250.000

Ficoll 3 70.000

FicoII 10 70.000

Ficoll 3 400.000

Ficoll 10 400.000

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Stabilisierung des an Mikroorganismen gebundenen Clumping-Faktors, dadurch gekennzeichnet, daß Clumping-Faktor-bildende Mikroorganismen nach einem bekannten Verfahren gezüchtet, unter Erhaltung des Clumping-Faktors abgetötet und einer gepufferten wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 bis 7,7 mit einem Gehall: von 3—50% an mindestens einem darin löslichen mehrwertigen Alkohol, der in einem Kohlenwasserstoffgerüst an mehreren benachbarten Kohlenstoffatomen je eine Hydroxylgruppe trägt und ein Molekulargewicht zwischen 90 und etwa 500 000 hat, homogen suspendiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen Clumping-Fakior-positive Keime von Staphylococcus aureus verwendet werden.

3. Homogene Suspension von abgetötetem Clumping-Faktor-positiven Mikroorganismen in einer gepufferten wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 bis 7,7 mit einem Gehalt von 3-50% an mindestens einem darin löslichen mehrwertigen Alkohol, der in einem Kohlenwasserstoffgerüst an mehreren benachbarten Kohlenstoffatomen je eine Hydroxylgruppe trägt und ein Molekulargewicht zwischen 90 und etwa 500 000 hat.

4. Verwendung einer Suspension gemäß Anspruch 3 als Reagens für die Bestimmung von Rbrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten in Körperflüssigkeiten.