CH622827A5

CH622827A5 -

Info

Publication number: CH622827A5
Application number: CH719376A
Authority: CH
Inventors: Norbert Dr Heimburger; Friedrich Brauns; Kurt Fischer
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1975-06-10
Filing date: 1976-06-08
Publication date: 1981-04-30
Also published as: FI761619A; AT352902B; NO761979L; CA1067843A; DK254676A; IL49735A; FR2314251B1; ATA420176A; US4245039A; LU75107A1; SE7606613L; FR2314251A1; IT1061405B; GB1551064A; NL7606087A; BE842800A; JPS5953039B2; DE2525804B2; DE2525804A1; ES448571A1

Description

Die Erfindung betrifft einen lagerfähigen, stabilen Clum-ping-Faktor, geeignet als Reagenz zum Nachweis von Fibrinogen- und Fibrinspaltprodukten sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. 40

Die Aktivierung des fibrinolytischen Systems führt zu einem proteolytischen Abbau von Fibrinogen bzw. Fibrin.

Beim Abbau des Fibrinogens entsteht zunächst das sogenannte Fragment X und weitere Spaltprodukte, welche mit A, B und C bezeichnet werden. Das Fragment X zeigt in Grösse und Eigen- 45 schaft die stärkste Ähnlichkeit mit Fibrinogen und lässt sich mit Thrombin langsam zur Gerinnung bringen. Bei fortschreitendem proteolytischen Abbau des Fragments X entstehen die Fragmente Y und D. Das Fragment Y wird mit Thrombin nicht mehr zur Gerinnung gebracht. Eine weiterführende Proteolyse 50 des Fragments Y führt zu den Spaltprodukten D und E. Die kleineren Spaltprodukte D und E haben nicht mehr alle antige-nen Determinanten das Fibrinogens. Die Fibrinspaltprodukte sind Indikatoren für bestimmte Erkrankungen und teilweise Inhibitoren der Fibrinbildung, so dass ein klinisches Interesse 55 daran besteht, den Gehalt an Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten und damit das Ausmass einer intraversalen Fibrino-lyse zu bestimmen.

Die Grundlage eines Verfahrens zur Bestimmung der genannten Spaltprodukte besteht darin, dass gewisse Mikroor- 60 ganismen, insbesondere Stämme von Staphylokokken, mit Fibrinogen und den Fibrinspaltprodukten X und Y unter makroskopisch sichtbarer Verklumpung reagieren. Die Eigenschaft der Verklumpung der Staphylokokken wird einem zellgebundenen Enzym zugeschrieben, das nur unzureichend charakterisiert ist. Es wird als «Clumping-Faktor» bezeichnet. Zuweilen wird darunter auch die zellgebundene Koagulase verstanden. Die schnelle Durchführbarkeit und die hohe Empfindlichkeit des auf dem Clumping-Faktor beruhenden Testsystems, insbesondere für die Bestimmung der Fibrinspaltprodukte X und Y, macht dieses Testsystem für die Routinediagnostik der Fibrinolyse besonders geeignet.

Es hat sich jedoch gezeigt, dass die nach dem Stand der Technik hergestellten Suspensionen von geeigneten Staphylokokken nur wenige Stunden die erforderliche Aktivität zum Nachweis der Fibrinspaltprodukte aufweisen und dass die zum Zwecke der Konservierung der Aktivität gefriergetrockneten Produkte sich häufig nicht mehr homogen in Lösung suspendieren lassen oder unspezifisch verklumpen. Die Empfindlichkeit der resuspendierten Keime nimmt rapide ab. Sie sind nach wenigen Stunden als Reagens zum Nachweis von Fibrinspaltprodukten ungeeignet.

Es wurde nun gefunden, dass Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken, die in einer gepufferten wässrigen Lösung eines mehrwertigen Alkohols suspendiert sind, ihre Eigenschaft, in Gegenwart von Fibrinogen* und/oder Fibrinspaltprodukten zu verklumpen, auch nach monatelanger Lagerung bei Temperaturen unter +25 °C nicht verlieren.

Gegenstand der Erfindung ist demnach eine homogene Suspension von abgetöteten Clumping-Faktor-positiven Mikroorganismen, vorzugsweise Staphylokokken, in einer gepufferten wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 bis 7,7 enthaltend einen darin gelösten mehrwertigen Alkohol in einer Konzentration von 3 bis 50%.

Für das in Frage stehenden Testsystem wurde bereits häufig die Verwendung von Staphylococcus aureus Newman D2C beschrieben. Bei dem Stamm handelt es sich um eine Clumping-Faktor-positive, lösliche Koagulase-negative Variante des Stammes Newman, der von E.S.Duthie, Southampton, aus Kulturen des Staphylococcus aureus Newman, hinterlegt bei der National Collection of Type Cultures unter der Nummer 8178, im Hinblick auf die Bildung von Clumping-Faktor selektiert wurde.

Clumping-Faktor-positive Stämme, die zudem lösliche Koagulase zu bilden vermögen, sind wie aus der Literatur bekannt ebenfalls für die Bestimmung von Fibrinspaltungsprodukten zu verwenden, wenn die lösliche Koagulase beispielsweise durch einen Erhitzungsschritt zerstört wird. Derart vorbehandelte Staphylokokken können erfindungsgemäss ebenfalls stabilisiert werden. Besonders günstige Ergebnisse hinsichtlich der Empfindlichkeit und Stabilität des Reagenses zum Nachweis von Fibrinogen und Fibrinspaltprodukte liefert ein Staphylococcus aureus mit der Bezeichnung I.J.7 hinterlegt am 25. April 1975 bei der American Type Culture Collection (Parkhawn Drive 12301, Rockville, USA) unter der Nummer ATCC 31153, dessen Morphologie in folgender Weise beschrieben werden kann:

Der Stamm wurde ursprünglich von einem menschlichen Rachenabstrich isoliert und im Hinblick auf die Bildung zellgebundener Koagulase selektiert. In flüssigen Nährmedien wächst der Stamm in kleinen Gruppen oder paarweise mit einem Anteil von bis zu etwa 30% als einzelne Zellkolonien. Der Stamm wird mit den gebräuchlichen Anilin-Farbstoffen eingefärbt. Er ist grampositiv.

Die Charakteristika des Staphylococcus aureus I.J.7 auf folgenden festen Nährmedien sind:

3

622827

für die Isolierung (24 St., 37 °C)

für die Identifizierung (24 St., 37 °C)

Staphylococcus Medium 110 (Baltimore Biological Lab.) Pferdeblut-Agar

Nähr-Agar

Purpur-Pferdeserum-Agar

MacConcey-Agar Nr. 3 (Oxoid) C.L.E.D.-Agar

DNase-Agar gutes Wachstum. Gelbliche Kolonien mit ca. 1 mm Durchmesser Gutes Wachstum. Graue Kolonien ohne Hämolyse Gelbliche Kolonien zuweilen unregelmässig ausgebildet bedingt durch schnelles Wachstum Schwach gelbe Kolonien mit Durchmesser 1,3 mm. Mässig zusammenhängendes Wachstum

Kein Wachstum

Blassgelbe Kolonien auf schwach gelbem Untergrund Gelbliche Kolonien. Kein zusammenfliessen-des Wachstum. Nach Ansäuern mit 1 N HCl schwache DNase-Aktivität nachweisbar

Der Stamm Staphylococcus aureus I.J.7. zeigt folgende Stoff wechselleistungen

Vergärung von

Dextrose

+

nach 6 Tagen bei 37 °C

Lacoste

+

nach 6 Tagen bei 37 °C

Saccarose

+

nach 6 Tagen bei 37 °C

Maltose

+

nach 6 Tagen bei 37 °C

Mannit

+

nach 6 Tagen bei 37 °C

Salizin

-

nach 13 Tagen bei 37 °C

Inulin

-

nach 13 Tagen bei 37 °C

Äskulin

—

nach 13 Tagen bei 37 °C

Verflüssigung von

Gelatine

+

nach 13 Tagen bei 22 °C und 37 °'

Schon bei dem Fermentationsverfahren, nach welchem die Bakterienmasse gewonnen wird, ist auf eine gute Suspendier-barkeit der Keime und auf eine ausreichende Ausbeute hinsichtlich der Clumping-Aktivität zu achten. So ist es zweckmässig, die Vermehrung der Keime in einem Medium vorzunehmen, das im wesentlichen aus einer wässrigen Lösung von Fleischpepton, Milchsäure bzw. deren Salzen, Vitaminen und Glucose, Alkali- und Erdalkali-Ionen, vorteilhaft in Form ihrer physiologisch verträglichen Salzen wie Chloriden, Sulfaten und Phosphaten, besteht. Die in Flaschen, Kesseln oder Fermentern vermehrten, durch Filtration oder Zentrifugation vom Nährmedium abgetrennten Keime werden durch Massnahmen in ihrer Vermehrungsfähigkeit gehindert, die die Aktivität des Clum-ping-Faktors so wenig wie möglich verringern. In bewährter und bekannter Weise wird die Abtötung der Keime vorzugsweise durch Erwärmung auf etwa 60 bis 70 °C für 30 bis 90 Minuten vorgenommen.

Der wesentlich stabilisierende Effekt der Clumping-Faktor-aktiven Staphylokokken-Suspension liegt in dem Gehalt des

55

Suspensionsmediums an 3 bis 50% eines mehrwertigen Alkohols. Darunter sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Verbindungen zu verstehen, die in einem Kohlenwasserstoff-Gerüst, vorzugsweise einem aliphatischen Kohlenwasserstoff-Gerüst, an mehreren benachbarten C-Atomen je eine Hydroxylgruppe tragen und im allgemeinen einen Molekulargewichtsbereich von etwa 90 bis etwa 500 000 umfassen. Die einfachsten Verbindungen dieser Stoffklasse sind der zweiwertige Alkohol Glykol und der dreiwertige Alkohol Glycerin. Vorteilhafte stabilisierende Effekte zeigen beispielsweise auch die Vertreter der sechswertigen Alkohole wie das Mannit und der Kohlenhydrate wie Glukose. Neben den niedrigmolekularen Verbindungen sind erfindungsgemäss auch die hochmolekularen Glykole wie das Polyäthylenglykol zur Stabilisierung der Suspension einzusetzen. Besonders vorteilhafte Eigenschaften zeigen zudem Kohlenhydrate, insbesondere deren hochmolekularen Vertreter, die sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein können. Als Beispiele hierfür seien genannt das natürlich vorkommende Glukose-Polymerisat Dextran oder das synthetische Polysaccharid aus Rohrzucker, das als Ficoll® (Warenzeichen der Firma Pharmacia Uppsala) im Handel erhältlich ist.

Eine Voraussetzung für die Verwendbarkeit der mehrwertigen Alkohole ist ihre Löslichkeit in der gepufferten wässrigen Lösung, der ggf. Neutralsalze zugefügt werden können, um ein annähernd isotones Milieu für die zu suspendierenden Mikroorganismuszellen herzustellen.

Die Suspension der Staphylokokken wird zweckmässig mit Hilfe einer Puffersubstanz, wie sie bei biochemischen Arbeiten üblicherweise verwendet werden, auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Geeignete Puffersubstanzen sind hierfür beispielsweise diejenigen, die von Good u.a. in Biochemistry 5, 472 (1966) beschrieben wurden.

Geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten:

622827

4

Chemische Bezeichnung

Kurzbezeichnung

Formel

2- (N-Morpholino)-äthansulfonsäure

MES

0 lfacH„CHoS0 -\ l 2 2 3

N-(2-Acetamido)-iminodiessigsäur e

ADA

yCH C00-H NCOCH N^

H CHCOONa

Piper azin-N ,N' -Bis ( 2-äthansulf onsäur e) PIPES

Na05SŒ2CH2I\QîHCH2CH2S05 -

N- ( 2-Acetamido) -2-aminoäthansulf onsäur e ACES

H NCOCH„NH„CH„CH SCL -d d d d d j>

(2-Aminoäthyl)trimethylanmoniumchlorid- Cholamin-

hydrochlorid chlor id (CH^ ) ^ îN-Œ^C^NH^Cl-

N, N-Bis ( 2-hydr oxyäthyl) -2-aminoäthansulf onsäure

BES

(hoch2ch2)2=nhch2ch2so3-

N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-amino-äthansulf onsäure

TES

(HOCH ) =NHCH0CH SCL -2 3 2 2 3

N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansu If onsäur e

+/~\

HEPES HœH2CH2N^JJCH2CH2S03-

N-(2-Acetamido)glycin

Acetamidoglycin H2NCOCH2NH2CH2COO-

N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin

Tric in (HOCH2)? =cfe2CH2C00-

Glycinamid-hydrochlorid

Glycinamid H2NCOCH2NH2

Tris (hydroxymethyl) aminone than

Tris

(hoch2)3=cnh2

N,N-Bis(hydr oxyäthyl)glycin

Bicin

(hoch2ch2) 2=fecH2coo-

Glycylglycin

Glycylglycin H^NC^CONHCH^OO

622827

Die Konzentration der Bakterien, die in der gepufferten wässrigen, den mehrwertigen Alkohol enthaltenden Lösung suspendiert sind, beträgt 1-20- 1010/ml, falls die Staphylokok-ken-Suspension direkt in Testverfahren zur Bestimmung von Fibrinogen-und/oder Fibrinspaltprodukten eingesetzt werden soll. Die Stabilität des Clumping-Faktors ist jedoch auch gewährleistet, wenn die Keimdichte gegenüber dem angegebenen Wert wesentlich erhöht oder erniedrigt vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner das Verfahren zur Stabilisierung des an Mikroorganismen gebundenen Clumping-Faktors, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Clumping-Fak-tor-bildende Mikroorganismen, vorzugsweise Staphylokokken, die nach einem bekannten Verfahren gezüchtet und unter Erhaltung des Clumping-Faktors abgetötet werden, in einer auf pH 7,0 bis 7,7, vorzugsweise 7,3 bis 7,5, gepufferten wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 3 bis 50% eines mehrwertigen Alkohols homogen suspendiert werden. Es besteht natürlich kein Hinderungsgrund, zu der erfindungsgemäss stabilisierten Mikroorganismen-Suspension weitere aus der Biochemie, insbesondere der Enzymchemie, bekannten die enzymatische Aktivität erhaltenden oder aktivierenden Stoffe, wie z.B. Proteine, insbesondere Albumin oder Gelatineabbauprodukte, zuzusetzen. Zur Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination kann der Suspension ein antimikrobielles Mittel, beispielsweise ein Antibiotikum, zugesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemässen Suspension mit einer Keimzahl von 1 bis 20* 1010 Keime/ml als Reagens zum Nachweis von Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten.

Die Verwendung der stabilen Staphylokokken-Suspension erfolgt für die Bestimmung von Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise im Plasma oder Serum nach bekannten Verfahren. Die Bestimmung der Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukte wird beispielsweise in der Weise vorgenommen, dass das zu prüfende Serum, von dem eine Verdünnungsreihe hergestellt wird, mit einer konstanten, vorteilhaft einer gleichen Menge, der erfindungsgemässen Staphylokokken-Suspension versetzt wird, wonach innerhalb von wenigen Minuten diejenige höchste Serumverdünnung registriert wird, die noch eine positive Verklumpung der Keime aufweist. Wird dieser Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Personen erhaltenen Wert in Beziehung gesetzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden.

Die Bestimmung wird in bekannter Weise am einfachsten auf einem Objektträger vorgenommen, auf dem die Reaktionspartner zu gleichen Teilen vermischt werden.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel

Herstellung der Keimsuspension

Staphylococcus aureus I.J.7 (ATCC 31153) wird in einem Medium folgender Zusammensetzung

Fleischpepton 80,0 g

Natriumlactatlösung,50% 25,0 ml

Ammoniumchlorid 18,5g

Magnesiumsulfat (7H20) 0,8 g

Dikaliumhydrogenphosphat 4,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 4,0 g auf 41 mit Wasser aufgefüllt und mit folgenden Zusätzen versehen:

D(+) Biotin 0,02 mg

Calcium-D(+)-pantothenat 1,00 mg

Cholinchlorid 0,08 mg

Folsäure 0,20 mg meso-Inosit für biochem. und mikrobio. Zwecke Nicotinsäure Pyridoxalhydrochlorid Riboflavin

Thiaminiumdichlorid Glucose

0,08 mg 6,00 mg 0,50 mg 0,72 mg 2,448 mg 10g bis zu einer Konzentration von 15* 108 Keimen pro ml vermehrt.

io Danach wird der Fermenter, in der die Vermehrung vorgenommen wurde, 90 min lang auf 70 °C erwärmt. Die Keime werden mit Hilfe einer Zentrifuge bei 6500 UpM gewonnen. Das überstehende Nährmedium wird verworfen und die Keime mehrfach in isotonischer Kochsalzlösung suspendiert und zen-i5 trifugiert. Schliesslich werden die zentrifugierten Keime in einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung suspendiert. 0,1 M/1 Tris-hydroxymethyl-aminomethan 0,3 M/1 Natriumchlorid

0.02. Chloramphemicol 20 0,02% Humanalbumin

Der pH-Wert der Lösung wird mit 1 N Salzsäure auf 7,4 eingestellt, wonach zu einem Volumenteil der Pufferlösung ein Volumenteil Glycerin zugegeben wird. Danach wird die Keimdichte der Suspension auf 1 • 10n/ml eingestellt. 25 Die erhaltene Suspension zeigt im folgenden Testsystem ein gleichbleibendes Ergebnis über 12 Monate:

1. Gewinnung eines Serums von einer gesunden Normalperson

5 ml frisch entnommenes Blut werden sorgfältig mit 0,1 ml 30 eines polyvalenten Proteinaseninhibitors entsprechend 10 Enti-plasmin-Einheiten und 0,1 ml einer Thrombinlösung entsprechend 10 NIH-Einheiten vermischt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschliessend das überstehende Serum von dem entstandenen Blutgerinsel durch Zentrifuga-35 tion abgetrennt.

2. Testansatz

Unter Verwendung von 0,1 M Tris-hydroxymethyl-amino-methan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 7,4 wird eine geometrico sehe Verdünnungsreihe des Serums hergestellt, so dass eine Verdünnung von 1:1,1:2,1:4,1:8 usw. resultiert. Jeweils 0,05 ml der Serumverdünnungen werden mit 0,05 ml der entsprechend dem vorgelegten Beispiel hergestellten Staphylokokken-Suspension auf einem Objektträger vermischt. Man lässt die 45 Mischung 2 min lang vorsichtig rotieren und liest die Verklum-pungsreaktion gegen einen schwarzen Hintergrund ab. Es ist eine Verklumpung bis zu einer Verdünnung von 1:256 nachzuweisen. Das gleiche Ergebnis wird erhalten, wenn statt, wie im Beispiel angegeben, der verwendete Puffer mit 50% Glycerin 50 mit folgenden Substanzen vermischt wird.

Substanz

Gew.-%

Molekulargewicht

Glycerin

33

92

Glucose

10

180

Mannit

3

182

Mannit

10

182

Mannit

15

182

Polyäthylenglykol

3

4 000

Polyäthylenglykol

Î0

4 000

Dextran

3

40000

Dextran

10

40000

Dextran

3

250 000

Dextran

10

250 000

Ficoll

3

70000

Ficoll

10

70000

Ficoll

3

400 000

Ficoll

10

400000

Claims

622827 PATENTANSPRÜCHE

1. Homogene Suspension von abgetötetem Clumping-Fak-tor-positiven Mikroorganismen in einer gepufferten wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 bis 7,7 mit einem Gehalt von 3 bis 50% an mindestens einem darin löslichen mehrwertigen Alko- 5 hol.

2. Suspension nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass als Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen Clumping-Faktor-positive Keime von Staphylococcus aureus verwendet werden. io

3. Suspension nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen Keime des Staphylococcus aureus I.J.7 (ATCC 31153) verwendet werden.

4. Suspension nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch 15 gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des mehrwertigen Alkohols in dem Bereich zwischen 90 und 500 000 liegt.

5. Verfahren zur Herstellung der Suspension nach Anspruch 1 unter Stabilisierung des an Mikroorganismen gebundenen Clumping-Faktors, dadurch gekennzeichnet, dass 20 Clumping-Faktor-bildende Mikroorganismen gezüchtet, unter Erhaltung des Clumping-Faktors abgetötet und in einer gepufferten wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 bis 7,7 mit einem Gehalt von 3 bis 50% an mindestens einem darin löslichen mehrwertigen Alkohol homogen suspendiert werden. 25

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

dass der Mikroorganismus Staphylococcus aureus I.J.7 (ATCC 31153) ist

7. Verwendung der Suspension nach Anspruch 1 mit einer Keimzahl von 1 bis 20-1010 Keime/ml als Reagens zum Nach- 30 weis von Fibrinogen- und/oder Fibrinspaltprodukten.