DE1230751B - Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Zuechten von Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Zuechten von MikroorganismenInfo
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. Cl.:
C12d
Deutsche Kl.: 6a- 22/05
Nummer: 1230 751
Aktenzeichen: M 54287IV a/6 a
Anmeldetag: 21. September 1962
Auslegetag: 22. Dezember 1966
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen
in hierfür üblichen Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen.
Früher wurde mit Bezug auf die Herstellung von Lipase mittels Hefen von Peters et al. 1948 bei
Verwendung von Mycotorula lipolytica die Bildung von Lipase beobachtet, während 1952 Nelson
in gleicher Weise die Bildung von Lipase bei Verwendung von Deotricum candidum festgestellt hat.
Da jedoch im ersteren Fall der Zweck die Denaturierung und Reifung von Butterfett bei der Herstellung
von Butter Käse od. dgl. war, während im letzteren Fall die Aktivität der erhaltenen Lipase
niedrig war, war es unmöglich, eine Lipase von hoher Aktivität unter Verwendung dieser Hefepilze herzustellen.
Es ist ein Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Aspergillus luchuensis bekannt,
bei dem aus dem Kulturmedium durch Extraktion ein Lipase enthaltendes Produkt mit einer Aktivität
von 1350 Olivenöleinheiten erhalten wird. Ebenfalls ist die Herstellung von Lipase unter Verwendung
von Penicillium oxalicum, Pseudomonas fluorescens, Serratia marescens und Aspergillus flavus bekannt.
Auch diese Verfahren sind, wie im nachstehenden Vergleichsversuch gezeigt wird, nicht zufriedenstellend.
Aufgabe der Erfindung ist nun, Lipase in größerer Menge im Nährmedium anzureichern. Zu diesem
Zweck wurden zahlreiche Mikroben aus der Luft, dem Boden, Kloaken- oder Sielwasser od. dgl. isoliert
und deren Lipasebildungsvermögen untersucht. Hierbei wurde ein Hefestamm, der zur Gattung Candida
gehört, gefunden, dessen Erzeugungsvermögen von Lipase in einem Nährmedium beachtlich hoch war.
Das Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen
Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen ist nun dadurch gekennzeichnet, daß
man als Mikroorganismus Candida cylindracea ATCC 14 830 verwendet
Der gemäß der Erfindung verwendete lipaseerzeugende Hefestamm Candida cylindracea ATCC
14 830 wurde aus dem Boden isoliert.
»ATCC« bedeutet die Hinterlegungsstelle, nämlich American Type Culture Collection, und »14 830«
die Hinterlegungsnummer.
Die mikrobiologischen Kennzeichen sind:
(1) Zelle in Malzextrakt: Nach 3 Tagen bei 25°C sind die Zellen lang-oval bis zylindrisch oder
pseudomyzelartig, (0,8 bis 3,5) · (2,0 bis 21) μ,
Verfahren zur Herstellung von Lipase durch
Züchten von Mikroorganismen
Züchten von Mikroorganismen
Anmelder:
Meito Sangyo Kabushiki Kaisha, Nagoya (Japan)
Vertreter:
Dr. E. Wiegand und Dipl.-Ing. W. Niemann,
Patentanwälte, München 15, Nußbaumstr. 10
Als Erfinder benannt:
Koichi Yamada, Tokio;
Haruo Machida, Saitama-Ken (Japan)
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 25. September 1961 (34 236)
einzeln, in Paaren, in Ketten als Pseudomyzelium.
(2) Kulturen auf KartofFelagar: Gut entwickeltes Pseudomyzelium wird gebildet.
(3) Häutchenbildung: Grauer, leicht rauher und kriechender Festfilm wird auf dem Malzmedium
gebildet.
(4) Sporenbildung: Keine Bildung.
(5) Strich- oder Streifenkultur: Gräulichweiß, an der Erhebung höckerig, am Rand gewellt, sehr
feucht, trüb, runzelig für die netzförmige Ausbildung an der Oberfläche.
(6) Vergärung: Glucose+, Galactose—, Saccharose
+ (sehr schwach), Maitose —, Lactose —, Raffinose —.
(7) Zuckerassimilation: Glucose -f-, Galactose -{-,
Saccharose +, Maltose -f- (sehr schwach), Lactose
—, Xylose +.
(8) KNO3-Assimilation: Negativ.
(9) Wachstum im Äthanolmedium: Ein Häutchen wird gebildet.
(10) Spaltung von Arbutin: Negativ.
Die sich aus den vorstehenden Merkmalen ergebenden Unterschiede zwischen dem Hefestamm
Candida cylindracea ATCC 14 830 und Candida solani und Mycotorula lipolytica sind in der nachfolgenden
Tabelle I aufgeführt. Daraus geht hervor, daß es sich bei Candida cylindracea ATCC 14 830
um einen neuen Stamm handelt.
609 748/71
I 230
Mycotorula lipolytica
Candida solani
Candida cylindracea 14 830
ATCC
ATCC
Zelle
Kolonien
Vergärung . .. : -U
Glucose
Saccharose
Zucker
Assimilation
Galactose
Maltose .... .....->
Sucrose :.
Spaltung von Arbutin
(2 bis 4,5) · (4 bis 22) μ
glatt,
gelblich
gelblich
(2 bis 4) · (4 bis 13) μ
glatt,
gelblich
gelblich
(sehr schwach)
+ (sehr schwach)
(0,8 bis 3,5) · (2 bis 21) μ
runzlig,
netzförmig,
gräulichweiß
+ (sehr schwach)
+ (sehr schwach)
fehlt oder leicht positiv
Als Medium für :die Züchtung des gemäß der
Erfindung verwendeten Hefestammes kann ein natürliches oder synthetisches Medium verwendet werden,
sofern es mindestens reine Kohlenstoffquelle und eine anorganische Substanz enthält. Die Kohlenstoffquelle
und die· Stickstoff quelle können beliebiger Art sein, solange sie durch Candida cylindracea
ATCC 14 830 verwertbar sind. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen z. B. Saccharose, Lactose,
Glucose, Xylose, Stärke od. dgl. In ähnlicher Weise kommt als Stiekstoff'lieferndes Material ein weiter
Bereich von Stickstorfquellen in Frage, solange sie assimilierbar sind; z. B. können anorganische Ammoniumsalze,
Aminosäuren und eine große Vielzahl anderer Proteinsubstanzen od. dgl. verwendet werden.
Als anorganische Salze sind beispielsweise Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze und zahlreiche andere
anorganische Salze geeignet. Es ist ersichtlich, daß die Mengen von Kohlenstoff- und Stickstorfquellen
und anorganischen Salzen sowie die Zusammensetzung des Mediums selbst, in Abhängigkeit von
der Anpassungsfähigkeit der erfindungsgemäß für die Erzeugung von Lipase verwendeten Hefe, variieren.
Bei der Züchtung wird eine optimale Temperatur für das Wachstum gewählt, wobei normalerweise
20 bis 35° C, vorzugsweise 25 bis 33° C geeignet sind, der pH-Wert des Mediums liegt zweckmäßig bei 5,0
bis 8,0. Normalerweise wird die Züchtung während 1 bis 7 Tagen durchgeführt. Obgleich die Züchtung
mit einer festen oder flüssigen Kultur durchgeführt werden kann, werden im allgemeinen günstigere
Ergebnisse mit flüssiger Kultur erhalten. Vorzugsweise wird die Kulturentwicklung unter aeroben
Bedingungen ausgeführt. Obgleich bei flüssiger KuI-tür
eine Oberflächenkultur angewendet werden kann, werden jedoch bessere Ergebnisse mittels Schüttelkulturen
oder Eintauchkulturen erhalten.
Bei der vorstehend beschriebenen Kulturentwicklung wird eine große· Menge Lipase in dem Medium
gebildet. Um die Lipase aus dem Kulturmedium zu sammeln, wird dies im Fall von fester Kultur durch
Extraktion mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung ,erreicht. Im Fall von flüssiger Kultur wird die Lipase
aus der Fermentationsflüssigkeit nach Abtrennung der Zellen gewonnen. Als wäßrige Lösungen können
hierbei wäßrige Lösungen, welche Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid od. dgl., enthalten,
wäßrige Lösungen, welche Säuren, wie Salzsäure, Citronensäure, Essigsäure od. dgl., enthalten, und
außerdem zahlreiche Pufferlösungen verwendet werden.
Die so erhaltene Lipaselösung kann dann konzentriert werden, indem man Reinigungsbehandlungen,
wie Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Konzentrierung unter vermindertem Druck
und Reinigung durch Ionenaustauscher od. dgl., durchführt. Die hierfür- verwendeten organischen
Lösungsmittel umfassen wassermischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol,
Aceton od. dgl. Bei Verwendung eines Lösungsmittels ist die Konzentration, bis zu welcher das organische
Lösungsmittel zugegeben wird, derartig, daß bei 20 Volumprozent das Enzym gelöst bleibt, jedoch
bei 60 Volumprozent die Sammlung eines ausfallenden Anteils möglich ist. Als Aussalzmittel können
beliebige Salze, welche sich leicht in Wasser lösen, verwendet werden, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat,
Magnesiumsulfat od. dgl. Die Konzentration, bis zu welcher diese Salze zugegeben werden, ist z. B.
bei Ammoniumsulfat so, daß bei 10%iger Sättigung das Enzym in Lösung bleibt, während jedoch bei
einer 30%igen Sättigung die Sammlung eines ausfallenden
Anteils möglich ist. Es kann auch eine Reinigung mit einem Ionenaustauschharz ausgeführt
werden.
Das durch diese Maßnahmen gewonnene Lipaseprodukt von hoher Aktivität kann, wenn es nach
der Trocknung gelagert wird, selbst bei Raumtemperatur während einer langen Zeitdauer ohne eine
Erniedrigung seiner Aktivität eine Lagerung überstehen. Der optimale pH-Wert des Enzyms liegt bei
etwa 7, und .es ist in einem pH-Wert-Bereich von 5,0 bis 8,5 äußerst stabil. Selbst bei einem pH-Wert
von 3,0 ist es in beträchtlichem Ausmaß säurestabil, wobei nur 45% seiner Aktivität beim Aussetzen
während 30 Minuten an eine" Temperatur von 30° C inaktiviert werden. Diese Eigenschaft der Lipase ist
besonders vorteilhaft, wenn sie für medizinische Zwecke verwendet werden soll.
Gemäß der Erfindung kann nun wirtschaftlich und sehr vorteilhaft im technischen Maßstab Lipase
erzeugt werden, die nicht nur für medizinische Zwecke brauchbar ist, sondern auch für andere
Verwendungszwecke, wie die Verwendung als Reinigungsmittel, die Verwendung auf kosmetischem
Sektor, die Verwendung als Nahrungsmittelzusatz od. dgl. geeignet ist. Die Erfindung wird nachstehend
an Hand der Beispiele näher erläutert.
Ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Gehalt von 2% Stärke, 2% Sojabohnenmehl,
0,1% Ammoniumsulfat, 0,5% Kaliumdiphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat wird in Anteilen von
jeweils 50 ml in einen Schüttelkolben von 500 ml Fassungsvermögen gegossen, und nach der Sterilisierung
während 5 Minuten bei 115° C wird es mit Candida cylindracea ATCC 14 830 inokuliert, worauf
die Kultur bei 30° C geschüttelt wird. 72 Stunden später wird die Zelle mittels Zentrifugieren entfernt.
Bei allmählicher Zugabe von Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit fällt die Lipase in
der Flüssigkeit aus, wenn der Sättigungsgrad auf 30% gebracht wird. Die Ausfällung wird
mittels Zentrifugieren gesammelt. Bei Trocknung unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur
wird Lipase in Pulverform erhalten. Die Ausbeute beträgt etwa 2%>
bezogen auf das Volumen des Mediums. Die Aktivität dieser pulverförmigen Lipase,
welche mittels Hydrolyse von Fett bestimmt wird, ist nachstehend angegeben:
Vorliegende pulverf örmige Lipase
(ungereinigt)
(ungereinigt)
Pulverförmige Lipase (gereinigt),
hergestellt nach Mann
Forschungslaboratorien
hergestellt nach Mann
Forschungslaboratorien
Ausmaß
der Hydrolyse
von Fett
5 mg
5 mg
5 mg
26% 25%
Der vorstehende Versuch wurde gemäß der folgenden Methode von Nord und anderen durchgeführt.
Es wurden 5 ml einer Emulsion von Olivenöl, 3 ml einer Pufferlösung und 1 ml der Enzymlösung bei
370C während 4 Stunden inkubiert und das Ausmaß
der Hydrolyse von Fett mittels Titration der Fettsäure mit einer Sodalösung gemessen.
Ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Gehalt von 2% Xylose, 2% Sojabohnenmehl,
0,1 % Ammoniumsulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat und 0,5% Kaliumdiphosphat wird in 50-ml-Anteilen in
einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegossen, und nach der Sterilisierung
während 5 Minuten bei 115°C wird es mit Candida cylindracea ATCC 14 830 inokuliert, worauf das
Schütteln der Kultur bei 30°C durchgeführt wird. 72 Stunden später wird die Zelle mittels Zentrifugieren
entfernt. Bei allmählicher Zugabe von Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit, bis die Konzentration
ίο desselben auf 60 Volumprozent gebracht ist, fällt
die gesamte Lipase in der Flüssigkeit aus. Diese wird gesammelt und unter vermindertem Druck bei
Raumtemperatur getrocknet, wobei Lipase in Pulverform erhalten wird. Die Ausbeute an dieser pulver-
i5.förmigen Lipase beträgt etwa 2%, bezogen auf das Volumen des Mediums. Diese pulverförmige Lipase
verlor selbst bei Lagerung während mehr als einem Monat bei Raumtemperatur ihre Aktivität nicht,
welche, in Angaben der Hvdrolvse von Fett, 25%
20. betrug.
Nachstehend wird an Hand eines Vergleichsversuches gezeigt, daß das Verfahren gemäß der
Erfindung zu überlegenen Ergebnissen im Vergleich mit denjenigen führt, welche bei dem bekannten
Verfahren unter Anwendung von Penicillium oxalicum Currie und Thorn (IFM 5748), Aspergillus
flavus (IFM 6343), Aspergillus luchuensis, Inui (IFM 4281) Pseudomonas fluorescens (IFM 3461)
und Serratia marescens (IFM 3736) erhalten werden. (»IFM« gleich »Institute for Fermentation«, Osaka,
Japan).
Ein Nährmedium aus 4,0% Maisquellwasser, 2,86% Sojabohnenmehl, 0,5% K2HPO4, 0,1%
(MLJ2SO4 und 0,1% MgSO4 -7H2O mit einem
Anfangs-pH-Wert von 4,9 wurde in sechs 500-ml-Kolben jeweils in einer Menge von 50 ml eingebracht.
Nach Erhitzen auf 120° C während 10 Minuten zur Sterilisierung wurden die Nährmedien mit Candida
cylindracea ATCC 14 830, Penicillium oxalicum Currie und Thorn (IFM 5748), Aspergillus flavus
Link (IFM 6343), Aspergillus luchuensis Inui (IFM 4281) Pseudomonas fluorescens (IFM 3461) und
Serratia marescens (IFM 3736) beimpft. Die Medien wurden bei 25 und 30°C geschüttelt, worauf nach
einer bestimmten Zeitdauer die Flüssigkeit durch eine Zentrifugal-Trenneinrichtung abgetrennt wurde.
Anschließend wurde die Lipaseaktivität der erhaltenen Flüssigkeiten bestimmt. Es wurden die in der nachstehenden
Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten.
Stamm
Züchtungstemperatur
Lipolytische Aktivität (Einheiten
je Milliliter) gemäß Züchtungszeit
24 Stunden I 48 Stunden 72 Stunden
Pen. oxalicum
Asp. flavus
Asp. luchuensis J
Pseud. fluorescens J
S. marescens J
C. cylindracea ATCC 14 830 j
30
25
25
30
25
25
30
25
25
30
25
25
30
25
25
30
25
25
0,6
0,3
0,3
10,9
0,8
0,8
0,1
0,0
0,0
3,6
0,2
0,2
2,3
12,0
12,0
151,5
174,2
174,2
0,9
0,8
0,8
16,1
7,5
7,5
2,4
1,3
1,3
3,4
0,2
0,2
0,7
1,6
1,6
92,0
113,6
113,6
0,4
1,0
1,0
22,4
25,6
25,6
4,1
18,8
18,8
0,0
0,2
0,2
0,6
0,5
0,5
29,3
32,9
32,9
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der gemäß der Erfindung verwendete neue Stamm,
Candida cylindracea ATCC 14 830, eine größere Menge an Lipase im Vergleich mit den bekannten
Mikroorganismen erzeugt, wobei außerdem eine beträchtlich kürzere Züchtungszeit erforderlich ist.
Verfahren zur Messung der lipolytischen Aktivität
Eine Mischung von 75 ml von 2 %iger Polyvinylalkohollösung (einer Lösung von 1 Teil Polyvinyl- ίο
alkohol mit einem Polymerisationsgrad von 1725 ± 25 und einer Verseifungszahl von 88 ± 1 % in 9 Teilen
Polyvinylalkohol mit einem Polymerisationsgrad von 1725 ± 25 und einer Verseifungszahl von 28,8 ±2%)
und 25 ml Olivenöl wurde auf 5 bis 10°C gekühlt, und diese Mischung wurde bei dieser Temperatur in
einen Homogenisator eingebracht, in dem sie 10 Minuten homogenisiert wurde.
Die gut homogenisierte Mischung zeigte eine Art von gleichförmiger Emulsion. 5 ml dieser Emulsion
und 4 ml einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurden in ein Reagensrohr
gebracht und auf 37° C vorerhitzt. 1 ml der unter (1) beschriebenen Flüssigkeit wurde dann zugegeben und
einer Reaktion während genau 20 Minuten unterworfen. Danach wurde die Mischung in einen Erlenmeyer-Kolben
mit 10 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Aceton und Alkohol im Verhältnis von 1 : 1
übergeführt. Anschließend wurde die Innenseite des Reagensrohrs mit 10 ml desselben Lösungsmittelgemisches
gewaschen, welches danach in den gleichen Kolben gegossen wurde.
Die oben beschriebene Reagenslösung wurde unter Anwendung einer wäßrigen Lösung von n/20-NaOH
mit Phenolphthalein als Indikator titriert (Test). Außerdem wurden zur Verwendung in einem Nullversuch
IQmI des Lösungsgemisches von Aceton und Alkohol und 1 ml der unter (1) beschriebenen
Flüssigkeit in einen Erlenmeyer-Kolben eingebracht und die Flüssigkeit zuvor inaktiviert. Hierzu wurden
dann 5 ml der obengenannten Emulsion, 4 ml der obengenannten Pufferlösung und 10 ml des Lösungsmittelgemisches
von Aceton und Alkohol gegeben, und die Titrierung wurde in der gleichen Weise wie
bei dem vorstehenden Test ausgeführt. Aus der Differenz der Titrationsergebnisse (P) zwischen dem
vorstehenden Test und dem Nulltest wurde die Lipaseaktivität als Lipaseeinheit aus der nachstehenden
Gleichung (1) bestimmt. Die unter (1) beschriebene Flüssigkeit wurde vor der Bestimmung in geeigneter
Weise verdünnt, so daß die Titrationsdifferenz innerhalb des Bereiches von 1,00 bis 2 ml lag.
Lipaseeinheit (w) = P · F ■ D · 2,5
(wobei
P = Titrationsdifferenz,
F = abweichende Konzentration von n/20-NaOH, D = Verdünnungsverhältnis der Flüssigkeit
" In der vorgenannten Lipaseeinheit entspricht 1 u
der Menge von Lipase, die 1 μ Mol Fettsäure je Minute freisetzen kann.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Candida cylindracea ATCC 14 830 verwendet.In Betracht gezogene Druckschriften:
.USA.-Patentschrift Nr. 2 480 090;
O. Hoffmann — Ostenhof, »Enzymologie«, 1954, S. 177.609 748/71 12.66 © Bundesdruckerei Berlin
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3423661 | 1961-09-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1230751B true DE1230751B (de) | 1966-12-22 |
Family
ID=12408504
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DEM54287A Pending DE1230751B (de) | 1961-09-25 | 1962-09-21 | Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Zuechten von Mikroorganismen |
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DE (1) | DE1230751B (de) |
GB (1) | GB976415A (de) |
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