DE2512606A1 - Verfahren zur herstellung eines cholesterin-oxidase-enzyms - Google Patents

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10. März 1975 25/93 Reg.Nr. 124

Eastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester,
Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms

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Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms durch Züchtung von Bacterium Nocardia cholesterolicum, Gattung NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem wässrigen Medium mit einem primären Kohlenstofflieferanten.

Microorganismen, die zur Metabolisierung von Cholesterin (engl. Cholesterol) befähigt sind, sind bekanntlich potentielle Lifeferanten von Enzymen, die sich für enzymatische Bestimmungen von Cholesterin in komplexen Mischungen, z.B. Blutserum, eignen. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Microorganismen Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden können, da bei diesem metabolischen Verfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.

T.C. Stadtman, in "Methods in Enzymology", Herausgeber S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Verlag "Academic Press", N.Y. 1955, Seite 678 und T.C. St-adtman, A. Cherkes und J. Anfinsen in "Biol. Chem." (1954), 206, Seite 511, berichten über die vorläufige Reinigung eines Enzyms aus Bacterium Nocardia cholesterolicum, einem Organismus, der von Schatz und Mitarbeitern (vergl. A. Schatz,- K. Savard und I. J. Pintner in "J. Bacteriol.", (1949) 58, Seiten 117-125) isoliert wurde. Das Stadtman'sche Enzym als "Cholesterin Dehydrogenase" bezeichnet, wurde in ausreichender Weise für die Verwendung zur Cholesterinbestimmung durch Messung des Anstiegs der Absorption bei 240 nm aufgrund der Bildung von Cholest-4-en-3-on, gereinigt.

Da, wie nunmehr ermittelt wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterinelektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist, sollte das Enzym in richtiger Weise "Cholesterinoxidase" (Cholesteroloxidase) in Obereinstimmung mit der üblichen Bezeichnungsweise genannt werden.

- 1a -

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_ 4-t -

Die von Stadtman beschriebenen Bakterienstämme liefern bei der Kultivierung in der in den angegebenen Literaturstellen beschriebenen Weise sehr geringe Enzymkonzentrationen, welche sich nicht

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in technischem Maßstabe verwerten lassen. Die anfallenden Konzentrationen sind derart gering, daß eine Reinigung des Enzyms kaum eine Möglichkeit für die Anwendung eines technischen Verfahrens bietet.

Aufgabe der Erfindung war es, ein technisch durchführbares Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms durch Züchtung von Bacterium Nocardia cholesterolicum, Gattung NRRL 5767 oder NRRL 5768 anzugeben.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich die gestellte Aufgabe dadurch lösen läßt, daß man das Bacterium Nocardia cholestericum in einem Medium züchtet, welches Cholesterin oder ein geeignetes Derivat des Cholesterins als Hilfs-Kohlenstofflieferanten enthält. Nach dem Wachstum können übliche Isolationsmethoden dazu angewandt werden, um das Enzym aus den Bakterienzellen und dem Kulturmedium zu extrahieren.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms durch Züchtung von Bacterium Nocardia cholesterolicum, Gattung NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem wässrigen Medium mit einem primären Kohlenstofflieferanten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Medium verwendet, das als sekundären Kohlenstofflieferanten Cholesterin, Cholest-4-en-3-on und/oder Cholesteryllinoleat enthält.

In besonders vorteilhafter Weise werden beim Verfahren der Erfindung verwendet:

(1) Kohlenstofflieferanten, die gleichzeitig als "Enzym-Inducer" wirken und

(2) Suspensionen des "Enzym-Inducer'¹ von (1) und ein Substrat in einer Mischung von Wasser und einer zweiten mit Wasser mischbaren Flüssigkeit.

Nach dem Verfahren der Erfindung läßt sich ein Cholesterin-Oxidase-Enzym in hoher Ausbeute herstellen. Zusätzlich bietet das Verfah-

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ren der Erfindung folgende Vorteile:

(a) Es läßt sich in üblichen Fermentationsvorrichtungen durchführen;

(b) es ermöglicht die Herstellung von stabilen, zell-freien Systemen mit dem aktiven Enzym;

(c) es induziert eine Enzymbildung in Konzentrationen, die bis zu etwa 100 mal größer sind, als sie sich bisher nach den bisher üblichen Verfahren erzielen ließen und

(d) es ermöglicht die Herstellung sehr stabiler Produkte (die beispielsweise mindestens ein Jahr stabil sind), die sich einfrieren und auftauen lassen, ohne daß dabei ein sichtbarer Aktivitätsverlust eintritt.

Nach den Zell-Herstellungsmethoden, die von Stadtman in den erwähnten Literaturstellen beschrieben werden, wurde von Stadtman ein Kulturmedium verwendet, das einen Ammoniaklieferanten, vorzugsweise Ammoniumsulfat, einen Kalium- und Phosphorlieferanten, vorzugsweise K-HPO₄, Spuren von Metallionen, für die Metabolisierung und Glyzerin als Kohlenstofflieferanten enthielt. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf etwa 5,0 bis 8,0 eingestellt. Die Kulturen wurden 18 bis 40 Stunden lang bei 24 bis 3S°C unter kräftiger Belüftung inkubiert.

Das Verfahren der Erfindung geht von zwei Nocardia-cholesterolicum-Kulturen aus, die gekennzeichnet werden können als "rauhe" und "glatte" Stämme und die Bezeichnungen NRRL 5767 bzw. NRRL 5768 aufweisen, auf Grund ihrer Niederlegung im "Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois, USA".

Die Organismen lassen sich wie folgt beschreiben.

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Beschreibung von "Nocardia cholesterolicum"

I. Cellular-Morphologie.

A. Glatter Stamm. Gram-positiv, schwach säurefest, Coryneform, kein gut entwickeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verzweigungen erkennbar. In älteren Kulturen erscheinen coccoide Formen.

B. Rauher Stamm. Siehe wie oben.

II. Colonial-Morphologie.

A. Nährboden Agar (5 Tage, 30⁰C).

1. Glatter Stamm. Kreisrund, konvex, dünnflüssig, vollständig,

glatt, perlartig, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

2. Rauher Stamm. Kreisrund, konvex, vollständig, glatt bis

rauh, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

B. Hefe-Glukose-Agar (5 Tage, 3O°C).

1. Glatter Stamm. Krem-bis gelbbraun-farbig, dünnflüssig, glatt, rund und erhaben.

2. Rauher Stamm. Trocken, krem- bis gelbbraun-färbig, rund und erhaben.

C. Casein-Agar (5 Tage, 30⁰C).

1. Glatter Stamm. Krem- bis gelbbraun-farbig, dünnflüssig, rund, glatt, erhaben.

2. Rauher Stamm. Gelbbraun bis rosa, trocken, erhaben.

D. Gelatine-Agar.

1. Glatter Stamm. Kreisrund, konvex, vollständig* glatt, dünnflüssig, krem-färbig.

2. Rauher Stamm. Kreisrund, konvex, vollständig, trocken, krem-farbig.

von engl. "entire", d.h. runde vollständige Zellen ohne geschuppte oder gezackte Kanten.

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III. Wachstum in flüssiger Kultur (Nährbrühe, 5 Tage, 30⁰C).

A. Glatter Stamm. Fast weißer bis hellbrauner flockenförmiger Niederschlag, keine Häutchen.

B Rauher Stamm. Fast weiß bis gelbbraun flockiger Niederschlag, kein Häutchen.

IV. Physiologie (Glatte und rauhe Stämme sind identisch).

Belüftung aerob

Gelatine-Hydrolyse*

Casein-Hydrolyse

Stärke-Hydrolyse*

Oxidase

Catalase⁺⁺ +

Il ^{+ +}

Urease

lndol⁺⁺⁺

Methyl-Rot⁺⁺⁺

Phenylalanin-deaminierung

Litmus-Milch alkalisch

= Das Minuszeichen bei der Gelatine-, Casein- und Stärke-Hydrolyse bedeutet, daß der Organismus diese Stoffe nicht hydrolysiert.

Das Minus- bzw. Pluszeichen bedeutet hier, daß der Organismus den in der linken Spalte der Tabelle aufgeführten Bestandteil nicht enthält bzw. enthält.

Das Minuszeichen bedeutet hier, daß diese Komponenten nicht erzeugt oder freigesetzt werden, wenn der Organismus in ein Standard-Testmedium gebracht wird.

Das Minuszeichen bedeutet hier, daß der Organismus keine Deaminierung von Phenylalanin herbeiführt.

Der Organismus wächst auf Litmus-Milch und macht diese alkalisch.

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Verwendung von Verbindungen als Kohlenstoff-Lieferanten

Citrat +

Lactat +

MaIat +

Succinat +

Fructose +

Glucose +

Sucrose +

Maltose +

Glyzerin +

Sorbitol +

Trehalose +

Raffinose

Dulcitol

Lactose

Mannitol +

Stärke

Arabinose

Dem Organismus wurden sämtliche erforderlichen Nährmedien mit Ausnahme von Kohlenstoff zugeführt. Proben des Organismus wurden dann mit jeweils einem der angegebenen Verbindungen als Kohlenstofflieferanten versetzt. Ein "+"-Zeichen bedeutet, daß der Organismus bei Zusatz der angegebenen Verbindung wuchs. Ein "-"-Zeichen bedeutet, daß kein Wachstum erfolgte. Ein gleichzeitiges "+"-Zeichen und "-"-Zeichen bedeutet, daß ein Wachstum nicht positiv ermittelt werden konnte.

Die erfindungsgemäße Modifizierung des erwähnten Stadtman¹sehen Verfahrens, welche zu einem beträchtlichen und nicht erwarteten Anstieg in der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase führt, wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt, besteht in der Verwendung eines primären oder hauptsächlichen Kohlenstofflieferanten, z.B. Glyzerin, und einem Hilfs-Kohlenstofflieferanten, nämlich Cholesterin oder einem Derivat desselben, bestehend aus Cholest-4-en-3-on und Cholesteryllinoleat. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die zuletzt aufgeführten Verbindungen nicht nur als Hilfs-Kohlenstofflieferanten wirken, sondern gleichzeitig auch als sogenannte "Enzym-Inducer" wirken, welche die von der Kultur erzeugte Entzymmenge wesentlich erhöhen.

Erfindungsgemäß läßt sich bei Verwendung eines üblichen primären

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Kohlenstofflieferanten, z.B. Glyzerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfs-Kohlenstofflieferanten, wie Cholesterin, Cholest-4-en-3-on oder Cholesteryllinoleat, die gleichzeitig als "Enzym-Inducer" wirken, die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase-Enzym drastisch erhöhen, und zwar derart, daß bis zu 100 mal höhere Ausbeuten erzielt werden, im Vergleich zu Verfahren, bei denen kein Hilfs-Kohlenstofflieferant verwendet wird oder Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant benutzt wird.

Erfindungsgemäß wird somit das Bacterium in einem üblichen Nährmedium gezüchtet, das enthält: einen Stickstofflieferanten, z.B. Ammoniumsulfat, einen Kalium- und einen Phosphor-Lieferanten, z.B. in Form von Kaliumphosphat, Spuren von Metallionen und eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z.B. Glyzerin und einem sekundären Kohlenstofflieferanten, bestehend aus Cholesterin, Cholest-4-en-3-on, Cholesterinlinoleat sowie Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums wird dabei zweckmäßig auf etwa 5,0 bis 8,0 eingestellt, vorzugsweise auf 6,5 bis 7,5. Zweckmäßig wird bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 35°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 30⁰C, gearbeitetr Die Züchtungsdauer liegt zweckmäßig bei etwa 18 bis etwa 40, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 24 Stunden.

Die verwendeten Mengen an Stickstoff, Kalium, Phosphor und Spuren Metallionen entsprechen den üblicherweise in Verfahren des beschriebenen Typs verwendeten Mengen. Typische Mengen werden beispielsweise in den angezogenen Literaturstellen erwähnt.

Vorteilhafte primäre Kohlenstofflieferanten, die sich zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen, sind außer Glyzerin beispielsweise Glykose und Essigsäure. Die primären Kohlenstofflieferanten können ebenfalls in üblichen bekannten Konzentrationen angewandt werden, beispielsweise in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-U Die Konzentration des sekundären Kohlenstofflieferanten liegt zweckmäßig bei etwa 0,05 bis etwa 0,5 Gew.-I. Vorzugsweise wird der sekundäre Kohlenstofflieferant in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,2 Gew.-I angewandt. Die Konzentrationen beziehen sich auf das Gesamtgewicht des Nähr«e<HöÄ5.

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„ 2512608

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Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird der sekundäre Kohlenstofflieferant in Wasser suspendiert. Auf diese Weise lassen sich weiter verbesserte Ergebnisse erzielen. Zu diesem Zweck wird der sekundäre Kohlenstofflieferant direkt in Wasser suspendiert, unter kräftiger Bewegung oder nach anderen üblichen bekannten Suspensionsmethoden oder aber der sekundäre Kohlenstofflieferant wird zunächst in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst, worauf die erhaltene Lösung gründlich mit Wasser vermischt wird, unter Suspendieren des Kohlenstofflieferanten im wässrigen Medium. Das hierzu verwendete Lösungsmittel zur Lösung des sekundären Kohlenstofflieferanten ist ganz offensichtlich von geringer Bedeutung, solange es nur mit Wasser mischbar ist und den Kohlenstofflieferanten zu lösen vermag. Es inhibiert die Enzymproduktion oder Enzymaktivität nicht« Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Alkohole von vergleichsweise geringem Molekulargewicht und Äther, z.B. Methanol, Äthanol sowie Polyvinylalkohole von geringer und mittlerer Viskosität.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung lassen sich Suspensionen des sekundären Kohlenstofflieferanten unter Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung in Konzentrationen, die die Herstellung einer stabilea Suspension ermöglichen, herstellen. Besonders vorteilhafte oberflächenaktive Verbindungen für diesen Zweck sind die Polyoxyäthylenglykolsorbitanmonoester,, beispielsweise solche, die im Handel unter der Handelsbezeichnung "Tween", Hersteller Atlas Chemical Industries, USA, erhältlich sind. Andere geeignete oberflächenaktive Verbindungen sind solche vom Typ der Phenoxypolyäthoxyäthylene (erhältlich von/oG^ 1OG, sowie Renex Bile-Steroids) und Polyäthylenglykol. Jedoch können alle üblichen oberflächenaktiven Verbindungen verwendet werden, welch® die Enzymproduktion oder Enzymaktivität nicht inhibieren* Die oberflächenaktiven Verbindungen können dabei in Konzentrationen von etwa 0,01 bis 0,20, vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 0,05 I, verwendet werden« Wie das später folgende Beispiel- 7 zeigt _s können höhere Konzentratioaea die Enzymbiidung inhibieren» /" der Firma Rohm und Haas Company, OSA₉ unter der Handelsbezeichnung

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Erhöhte Ausbeuten an Zellen können durch optimale Belüftung und konstante Bewegung erzielt werden. Eine Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,25 bis etwa 0,5 VVM (Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute) und eine mäßig kräftige Bewegungsgeschwindigkeit führen im allgemeinen zu einem optimalen Wachstum.

In dem Fall, indem das Ausgangs-Inoculum des Mikroorganismus, das in das Kulturmedium eingeführt wird, gering ist, kann eine Verzögerungsphase von etwa 8 bis etwa 20 Stunden auftreten. Die Verzögerung ist dabei eine Funktion der Inoculumgröße und keine oder nur eine geringe Verzögerung tritt dann auf, wenn die Menge an injiziertem Material größer ist als 5 % des erwarteten Gesamtzellgewichtes bei Beendigung des Herstellungszyklus.

Das Enzym-Präparat kann in flüssiger oder fester Form aufbewahrt werden, beispielsweise in gefrier-getrocknetem oder in einem lyophilisierten Zustand. Wird das Präparat in festem Zustand aufbewahrt, so soll es in einer Pufferlösung gelöst werden, bevor es zur Cholesterol-Bestimmung verwendet wird.

Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Enzym weist eine hohe spezifische Cholesterin-Oxidasen-Aktivität auf, und zwar von mindestens einer Einheit pro mg Protein-Stickstoff und kann hergestellt werden durch Reinigung zur Demonstration von Aktivitäten von bis zu mindestens etwa 20 Einheiten pro mg Protein-Stickstoff.

Die Isolierung des Intracellular-Enzyms kann nach üblichen bekannten Methoden bewirkt werden.

Die Zellen können nach üblichen bekannten Zentrifugier- oder Filtrations-Verfahren gewonnen werden. Es läßt sich zeigen, daß die Zellen selbst eine Cholesterin-Oxidase-Aktivität aufweisen, bei einer typischen, spezifischen Aktivität der Zelle des "rauhen" Stammes von ungefähr 10 E/g (Einheiten pro g auf Trockengewichtsbasis).

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Eine Einheit der Cholesterin-Oxidase ist dabei definiert als die Menge an Cholesterin-Oxidase, welche ein ja-Mol Cholesterin zu Wasserstoffperoxid und Cholest-4-en-3-on in einer Minute bei 37⁰C und einem pH-Wert von 7 überführt.

Die Intracellular-Cholesterin-Oxidase kann aus den gewonnenen oder geernteten Zellen extrahiert werden durch Aufbrechen der Zellen und Entfernung der Zellfragmente nach den üblichen bekannten Methoden der Enzymherstellung. Ein geeignetes Verfahren zum Aufbrechen der Zellen besteht in einer Behandlung mit einem Ultraschallgerät, z.B. vom Typ Branson Model S 75, bei einer Behandlungsdauer von 10 Minuten bei 100 Watt und 5 bis 10⁰C. Geeignet ist des weiteren beispielsweise ein übliches Homogenisiergerät (z.B. vom Typ Gaulin homogenizer), um die Zellen aufzubrechen und das Intracellular-Enzym zu befreien.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Aufbrechen der Zellen beruht auf der Ultraschall-Anwendung. Andererseits läßt sich, wie in dem späteren Beispiel 9 veranschaulicht wird, mindestens ein Teil der Enzymaktivität freilegen durch Einfrieren und Auftauen der zentrifugierten Zellen.

Die aufgebrochenen Zellen können durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Das meiste der Cholesterin-Oxidase sedimentiert mit den aufgebrochenen Zellen und den Zellüberbleibseln oder Zelltrümmern. Das Enzym kann aus diesem Sediment gelöst werden, beispielsweise durch Behandlung mit entweder Deoxycholat- oder einer Octylphenoxypolyäthoxyäthanollösung.

Geeignete Methoden zur Reinigung der hergestellten Enzympräparate, die als Ergebnis der Extraktion der Zellentrümmer mit oberflächenaktiven Verbindungen erhalten werden, bestehen beispielsweise in der Ausfällung mit Ammoniumsulfat und/oder in chromatographischen Methoden und/oder einer Konzentrierung durch Ultrafiltration. Bei der Anwendung derartiger Methoden wird auch das begleitende Enzym Catalase, entfernt. Beispielsweise läßt sich das erhaltene Präparat konzentrieren durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat und von SaI-

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zen befreien mittels einer Kolonne mit einem 3-dimensional quervernetzten Polysaccharid (Handelsbezeichnung Sephadex), worauf das Ganze einer Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen werden kann. In dieser Stufe ist es möglich, die Aktivität des Präparates um ungefähr 15 bis 40 mal zu erhöhen.

Vorzugsweise wird das hergestellte Enzympräparat zunächst durch Ionen-Austausch-Chromatographie aufgearbeitet, vorzugsweise in einem chromatographischen Verfahren mit Hilfe von einem schwach basischen Anionenaustauscher mit einem Diäthylaminoäthyl- oder Triäthylaminoäthylrest auf einem funktioneilen Rest eines 3-dimensional quervernetzten Polysaccharides (z.B. DEAE- oder TEAE-Cellulose) oder mittels eines schwach sauren Kationenaustauschers mit einer funktioneilen Carboxymethy1gruppe auf einem 3-dimensional quervernetzten Polymer (CM-Cellulose), worauf das Ganze durch Ultrafiltration konzentriert werden kann. Die beschriebenen DEAE-, TEAE- und CM-Cellulosen sind im Handel erhältlich (Hersteller Sigma Chemical Company, USA).

Eine bevorzugt angewandte Reinigungsmethode, die eine Ultraschallbehandlung, eine Zentrifugierung und eine Extraktion/einschließt, unter Verwendung der oberflächenaktiven Verbindung Deoxycholate wird in dem später folgenden Beispiel 10 beschrieben. Jedoch können auch andere übliche bekannte Reinigungsmethoden angewandt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung des Verfahrens der Erfindung. Wenn nicht anders angegeben, wurde bei den angegebenen Verfahrensweisen der rauhe Stamm verwendet.

Beispiel 1: Erhaltung der Kultur

Die beiden Stämme von Nocardia cholesterolicum wurden auf einem Glukose-Hefeextrakt-Kulturmedium erhalten. Sie wurden bbi wöchentlichwrxS*s4*xauf ein Glyzerin-Cholesterin-Kulturmedium übertragen.

Die Zusammensetzung der beiden Kulturmedien ergibt sich aus der /" der durch die Zentrifugierung erhaltenen festen Masse

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folgenden Tabelle I.

Nach einer Inkubierung von 3 Tagen bei 30⁰C wurden die Kulturmedien in einen kalten Raum gebracht. Vor Verwendung als Inoculum wurden die Kulturen wiederum auf Glukose-Hefeextrakt-Kulturmedien übertragen. Die Kulturen wurden des weiteren durch Lyophilisierung konserviert, d.h. einem Verfahren zur Herstellung einer Kultur in trockener Form durch rasches Einfrieren und Dehydratisieren im gefrorenen Zustand unter hohem Vakuum.

Tabelle I Kultur-Medium

1. Glukose-Hefe-Extrakt g/Liter

Glukose 10

Hefe-Extrakt 10

K₂HPO₄ 1

Salz-Lösung A 2 ml

Eingestellt auf pH 7,0.

Zusatz von 1,5 % Agar zur Bereitung eines festen Medium.

2. Glyzerin-Cholesterin g/Liter

Glyzerin 5

Cholesterin 1

Trypton (Difco) 0,5

(NH₄)₂SO₄ 2

K₂HPO₄ 2

Salz-Lösung C 10 ml

Bei Verwendung für ein festes Medium wurde das Cholesterin zunächst in warmem 0,1%igem Polyvinylalkohol suspendiert und dann mit den oben angegebenen Bestandteilen gemeinsam mit 1,5 % Agar vermischt.

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MgSO4 ·	7	H2O
MnSO4 ·	7	H2O
FeSO4 -	7	H2O
NaCl
CaCl2 ·		H2O
ZnSO4 ·	7	H2O
Sal ζ-Lösung A

" "'AS

Salz-Lösung C g/100 ml

2,5

0,17

0,28

0,06

0,01

0,006

g/200 ml

MgSO₄ · 7 H₂O 20,0

FeSO. · 7 H-O 5*

4 Z

CaCl₂ 2

MnSO₄ · H₂O 0,2

NaMoO₄ · 2H₂O 0,1

Beispiel 2: 1-Liter-KuItüren

Eine kleine Menge der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kultur wurde dazu verwendet, um 25 ml eines Glyzerin-Cholesterin-Mediums ohne Cholesterin (Tabelle I) in einem 125 ml fassenden konischen Kolben zu inoculieren. Nachdem der Kolben 24 Stunden lang geschüttelt worden war (400 U/Min.) bei 30⁰C, wurde die Kultur dazu verwendet, um ein 1-Liter-Glyzerin-Cholesterin-Medium in einem Fernbach-Kolben zu inoculieren. Der Kolben kann entweder einen engen oder einen weiten Hals haben.

In den meisten Fällen verläuft die Inkubation innerhalb von 20 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln (150 U/Min.). Die Bakterien-Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt.

Nach einmaligem Waschen in einer 0,05 molaren Kaliumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,5 wurden die Zellen von neuem in der gleichen Puffer-Lösung in einer Konzentration von etwa 40 mg pro ml (Trockengewicht) suspendiert. Dieses Zeil-Präparat behielt seine Enzymaktivität mehrere Tage lang bei 0 bis 5⁰C bei. Für längere Aufbewahrungszeiten kann das Präparat entweder eingefro-

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ren oder lyophilisiert werden. Das Enzym in solchen Zellen ist mindestens 1 Jahr lang stabil. Die normale Ausbeute an Zellen lag bei 750 bis 1000 mg/1 (Trockengewicht).

Beispiel 3: Enzym-Bestimmung (zur Bestimmung der Kinetik und dergl.)

Zellen (50 mg Trockengewicht) wurden zu 5 ml Wasser oder 5 ml einer Cholesterin-Alkohol-Wasser-Suspension zugegeben. Gleiche Teile (1 ml) wurden aus jedem Kolben entnommen und wie im folgenden beschrieben extrahiert. Die verbleibende Mischung wurde unter Schütteln (300 U/Min.) bei 30°C 1 Stunde lang inkubiert, worauf die Mischung extrahiert und analysiert wurde, zusammen mit den vorerwähnten Prüflingen, und zwar auf den Cholesteringehalt nach der modifizierten Lieberman-Burchard-Methode. Die zu extrahierenden Proben wurden zu einem halben Volumenteil absolutem Äthanol und zwei Volumenteilen Äther zugegeben. Diese Mischungen wurden 3 Minuten lang in mit Glasstopfen verschlossenen Gefäßen geschüttelt und zur Abtrennung von Zelltrümmern stehen gelassen. Geeignete Anteile wurden unter Stickstoff eingedampft. Die Rückstände wurden in Essigsäure aufgenommen und zur Cholesterinbestimmung verwendet.

Die Lieberman-Burchard-Methode wurde von der Methode, die in "Methods in Enzymology", Seite 392 (3) beschrieben wird, modifiziert, durch Verlängerung der Reaktionsdauer auf 30 Minuten, wobei die Reaktion im Dunkeln bei Raumtemperatur ablaufen gelassen wurde. Es wurde Standard-Kurven autgenommen mit entweder Cholesterin oder Cholesteryllinoleat, je nachdem, was zu bestimmen war. Die Cholesterol-Oxidase-Aktivität wurde berechnet in Form von internationalen Einheiten LuMoIe Cholesterin oxidiert pro Minute bei 30°C und einem pH-Wert von 7,5).

Beispiel 4: Wachsturns-Kinetik

Die Wachs turnskurve des glatten Stammes von N, cholesterolicum im Glyzerinmedium ohne Cholesterin ist in der beigefügten Zeichnung

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darstellt,
ge

Der glatte Stamm wurde in diesem Fall verwendet, da er zu einer homogeneren Kultur führt. Cholesterin wurde vom Medium weggelassen, da es die turbidimetrische Messung des Wachstums stört. Das Wachstum erreichte ein Maximum in etwa 40 Stunden nach einer längeren logarithmischen Wachstumsphase von etwa 14 Stunden (vergl. Kurve 2). Nachdem ein maximales Wachstum erreicht war, trat ein beträchtlicher Zerfall oder Abbau der Zellen ein (Lysis).

Zu Vergleichs zwecken wurden zwei Vergleichsmedien mit zusätzlich Cholesterin hergestellt. Eines dieser Medien wurde mit dem beschriebenen Stamm Nocardia cholesterolicum inocculiert. Das andere Medium wurde nicht inocculiert. Der Verbrauch an Cholesterin im inocculierten Vergleichsmedium wurde durch Messung des Cholesteringehaltes des Mediums verfolgt. Das Cholesterin war in etwa 40 Stunden verbraucht. Nach 20 Stunden waren noch etwa 30% vorhanden. Es trat kein Verlust an Cholesterin aufgrund einer Auto-Oxidation oder anderer Verfahren in nicht inocculierten Kolben auf.

Ein-Liter-Kulturen der glatten Stämme wurden in Fernbach-Kolben, wie in Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet. Das Glyzerin-Cholesterin-Medium wurde zur Bestimmung des Cholesterin-Verbrauchs verwendet. Das Wachstum wurde im gleichen Medium ohne Cholesterin bestimmt. Das Wachstum wurde turbidimetrisch ermittelt. Cholesterin ind Cholesterin-Oxidase wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt,

Im einzelnen zeigen:

Kurve 1: Cholesterin in einem ininocculiertem Vergleich; Kurve 2: Wachstum;

Kurve 3: pH-Wert;

Kurve 4: Cholesterin in einem inocculierten Medium und Kurve 5: Cholesterin-Oxidasen-Aktivität. .

- 15a-509840/1076

- t&a Beispiel 5: Der Bffekt von Cholesterin im Wachstuntsmedium

N. cholesterolicum wurde 24 Stunden lang in einem Glyzerin-Cholesterin-Medium, wie in Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet.

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Die Cholesterin-Konzentration wurde, wie angegeben, geändert. Die Zellen wurden lyophilisiert (gefriergetrocknet) und auf ihre enzymatische Aktivität, wie in Beispiel 3 beschrieben, untersucht. Das Zellengewicht wurde entsprechend der Menge an vorhandenem Cholesterin korrigiert.

Tabelle II

Effekt der Cholesterin-Konzentration auf die Produktion von Cholesterin-Oxidase.

Versuch Nr.	Cholesterin *	Zellen mg/1	E/l	E/g Zellen
1	0,00	1060	0,07	0,07
2	0,01	1040	1,11	0,98
3	0,01	574	0,77	1,20
4	0,05	1000	1,50	1,50
5	0,10	894	2,58	2,90
6	0,10	474	3,76	4,21
7	0,10	1170	6,80	5,80
8	0,10	885	12,0	13,5
9	0,10	850	4,7	5,5
10	0,10	530	6,2	11,5
11	0,10	625	9,1	14,7

Sehr wenig Oxidase ist in Zellen vorhanden, welche ohne Cholesterin gezüchtet wurden (Tabelle II). Die Menge an Enzym stieg auf über das 10-fache, wenn nur 0,01 % Cholesterin zugesetzt wurden. Lagen im Medium 0,1 % Cholesterin vor, so stieg die Enzymaktivität auf das über 100-fache an (Tabelle II). Die durchschnittliche spezifische Aktivität in diesem Falle lag bei 8,8 E/g Zellen, verglichen mit 0,07 E/g Zellen, die ohne Cholesterin gezüchtet wurden. Es konnte keine bemerkenswerte Differenz in der Enzymaktivität von glatten und rauhen Stämmen erkannt werden.

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Beispiel 6: Induktion von Cholesterin-Oxidase

Ermittelt wurde der induzierende Effekt von Cholest-4-en-3-on, Cholesteryllinoleat und Cyclohexanol.

N. cholesterolicum wurde 24 Stunden lang in dem in Beispiel 2 beschriebenen Glyzerin-Cholesterinmedium gezüchtet mit der Ausnahme jedoch, daß das Cholesterin durch die angegebenen Verbindungen ersetzt wurde. Die Enzymbestimmung erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Cyclohexanol erwies sich als Inducer als unwirksam, jedoch zeigte sowohl Cholest-4-en-3-on als auch das Linoleat eine beträchtliche Aktivität (vergl. Tabelle III). Das Cholesteryllinoleat erwies sich als noch etwas besser als Cholesterin bei 0,05 I. Bei der gleichen Konzentration war Cholest-4-en-3-on um etwa 1/2 mal so gut wie Cholesterin.

	-	1060	-Induktion	E/g Zellen
	0,1	0	E/l	0,07
	0,05	1000	0,07	0
Tabelle III	0,05	1490	0	1,5
Cholesterin-Oxidase-	0,05	1920	1,5	2,9
Inducer Konzentration Zellen % mg/1	2,0	0,96
-	1,8
Cyclohexa nol
Cholesterin
Cholesteryl linoleat
Cholesteron (dispergiert mit oberflä chenaktiver Verbindung)

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Beispiel 7: Effekt des Substrat-Präparates auf die Enzym-Bestimmung

Vier Gruppen von Zellen wurden gezüchtet und für die Bestimmung, wie in Beispiel 2 beschrieben, präpariert. Die Zellen wurden dann zu verschiedenen Substrat-Suspensionen zugegeben, die, wie im folgenden beschrieben, hergestellt wurden. Die Enzymbestimmung erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben.

1.) Cholesterin-Alkohol-Wasser.

1 g Cholesterin wurde in 10 ml warmem Äthanol gelöst. Dann wurden 90 ml Wasser zu der Alkohollösung unter kräftigem Mischen zugegeben. Die Suspension erwies sich als nicht ganz so gut, wenn die Reihenfolge der Zugabe umgekehrt wurde.

2.) Cholesteryllinoleat-Äther-Wasser.

500 mg Cholesteryllinoleat wurden in 5 ml Äther gelöst, worauf die Lösung langsam zu 100 ml heißem Wasser und kräftigem Rühren zugegeben wurde.

3.) Cholesterin-Polyvinylalkohol-Wasser.

Als Polyvinylalkohol wurde ein handelsüblicher Polyvinylalkohol mittlerer Viskosität (Elvanol 52-22) verwendet. 1 g des Polyvinylalkohol wurde in 100 ml Wasser, vermischt mit 0,5 ml 0,1 normaler Chlorwasserstoffsäure, gelöst. Zur Lösung erwies sich ein Erhitzen auf 85⁰C als erforderlich. Dann wurden 500 mg Cholesterin zugegeben. Das Erhitzen und Rühren wurde weitere 5 Minuten lang fortgesetzt, worauf die Mischung 5 Minuten lang kräftig / gemischt wurde. Unter Verwendung von Cholesteryllinoleat läßt sich eine entsprechende Suspension herstellen.

4.) Cholesterin-Dimefchylformamid-Wasser.

1 g Cholesterin in 10 ml Dimethylformamid wurde zu 90 ml Wasser gegeben.

/" in einem Waring Blender

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5.) Cholesterin-Alkohol-PoIyoxyäthylensorbitanmonooleat-Wasser.

Diese Suspensionen wurden wie die Suspension Nr. 1 hergestellt mit der Ausnahme jedoch, daß eine bestimmte Menge an Polyoxyäthylensorbitanmonooleat zum Wasser zugesetzt wurde, bevor die Vermischung mit der Cholesterinlösung erfolgte. Das verwendete PoIyoxyäthylensorbitanmonooleat war ein Handelsprodukt (Tween 80, Hersteller Atlas Chemical Industries, USA).

In der folgenden Tabelle IV sind die Ergebnisse der erhaltenen Versuche zusammengestellt.

Tabelle IV
Cholesterin-Oxidase-Bestimmung: Effekt von Substraten.

Zell-Präparation	Suspension	E/g Zellen
1	Cholesterin-Alkohol-Wasser Cholesterin-DMF+-Wasser	12,9 2,8
2	Cholesterin-Alkohol-Wasser Cholesterin-PVA++-Wasser	5,8 14,9
3	Chölesterin-Alkohol-Wasser plus 0,021 PSM+++ plus 0,U PSM+++ plus 0,25». PSM+++	1,1 2,1 2,0 1,0

Cholesterin-Alkohol-Wasser 5,8

Choles teryllinoleat-Alkohol-

Wasser 30,7

⁺ = Dimethylformamid
= Polyvinylalkohol
= Polyoxyäthylensorbitanmonooleat (Tween 80)

Diese Studie mit intakten Zellen zeigt, daß die Substrat-Herstellung die Enzymaktivität wesentlich beeinflussen kann. Während Dimethylformamid die Enzymaktivität stark inhibiert, stimuliert Polyvinylalkohol die Enzymaktivität. Das Vorhandensein einer oberflächenaktiven Verbindung stimuliert offensichtlich die Enzymaktivität bei geringen Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung, inhibiert eine solche Aktivität jedoch bei einer Konzen-

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tration von 0,25 \. Der am meisten ins Auge fallende Effekt ergibt sich bei der Verwendung von Cholesteryllinoleat. In mindestens einem Fall wurde die Enzymaktivität um das etwa 5-fache gegenüber der Aktivität erhöht, die bei Verwendung einer wässrigen Suspension von Cholesterin beobachtet wurde.

Beispiel 8: Herstellung von Cholesterin-Oxidase in einem Laboratoriums -Fermentor

Ein üblicher 20 1 fassender Fermentor (Hersteller Chemapec Laboratory) wurde mit 14 1 des beschriebenen Glyzerin-Cholesterin-Mediums beschickt. Das Cholesterin (15 g) wurde 15 Min. lang in 200 ml Wasser beschallt, bevor es zugegeben wurde. Vor der Sterilisation des Fermentors und seines Inhaltes wurde eine vergleichsweise geringe Menge eines Antischaummittels (4 ml Dow Polyglycol P-2000) zugegeben. Der Fermentor wurde mit 1 Liter Kultur von N. cholesterolicum inoculiert, das, wie beschrieben, in dem GIyzerin-Cholesterin-Medium gezüchtet worden war. Das Röhren-Belüftungssystem wurde auf 1000 Umdrehungen pro Minute bei 0,25 Volumina Luft pro Volumen Medium pro Minute eingestellt. Die Temperatur lag bei 30°C. Der pH-Wert wurde mit einer zwei molaren KOH-Lösung auf 6,8 eingestellt.

Der ursprünglich gelöste Sauerstoff von 100 % fiel allmählich in 24 Stunden auf 77 % ab, worauf der Fermentationsprozess unterbrochen wurde. Das Schäumen war gering, nichtsdestoweniger hatte sich jedoch eine beträchtliche Menge an Cholesterin sowie Bakterienzellen an den Gefäßwänden gerade über dem Flüssigkeitsspiegel angesammelt. Hierdurch wurde die Enzymausbeute etwas vermindert. Die Zellen wurden in üblicher Weise durch Zentrifugation abgetrennt.

Beispiel 9: Isolation und Reinigung von Cholesterin-Oxidase

In vorteilhafter Weise können Zellen mit dem Enzym eingefroren

und wieder aufgetaut werden. Dieses Verfahren gfcflif li&ii^of fens ich t-

die
lieh

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Die Erfindung ermöglicht die Herstellung großer Mengen aktiver Zellen, die gegebenenfalls bis zur Verxvendung aufbewahrt werden können. Es ist auch möglich, die Zellen durch Schallbehandlung aufzubrechen. Nach dieser Behandlung liegt^die Aktivität in dem durch die Schallbehandlung und Zentrifugieren erhaltenen Zellkuchen vor. Das Zentrifugieren kann beispielsweise bei Anwendung einer Zentrifugalkraft erfolgen, die 17000 mal größer ist als die Schwerkraft (= 17000 G-Kuchen).

Die Aktivität des Enzyms, das nach diesem Verfahren erhalten wurde , ergibt sich aus Tabelle V. Es zeigte sich, daß der durch Schallbehandlung und Zentrifugieren erhaltene Kuchen stabil zum Einfrieren und Auftauen war und auch einer xveiteren Schallbehandlung unterworfen werden konnte.

Tabelle V Studien vor der Enzym-Reinigung

Vorgang E/g Zellen

Frische Zellen 4,2 Eingefroren, aufgetaut, im WaringBlender

behandelt, 10,0

Frisch 2,8 Eingefroren, aufgetaut, im Waring-Blender

behandelt 5,5

3 Minuten Ultraschallbehandlung 6,2

17000 Γι-Kuchen 10,3 überstehende Flüssigkeit über dem 17000 G-Kuchen 0,0

Beispiel 10

Zellen wurden hergestellt und bestimmt mit einer Cholesterin-Äthanol-Wasser-Suspension, wie beschrieben. Die Schallbehandlung erfolgte mit einer handelsüblichen Vorrichtung (Branson Model S75). Der Prüfling befand sich während der Behandlung in einem Eisbad.

Die Reinigung erfolgte durch 10 Minuten lange Schallbehandlung und 15 Minuten langes Zentrifugieren bei einer Zentrifugalkraft, die

- 21a -

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27000 mal größer war als die Schwerkraft. Der 27000 G-Kuchen wurde in einer 5OmM Kaliumphosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,5 resuspendiert, worauf Deoxycholat zugesetzt wurde. Die Teströhrchen mit dem resuspendierten Kuchen wurden 15 Minuten lang bei O⁰C gehalten und dann bei 27000 G 15 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode untersucht. Das Protein wurde nach der Biuret-Methode bestimmt.

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Claims (8)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms durch Züchtung von Bacterium Nocardia cholesterolicum, Gattung NRRL 5 76 oder NRRL 5768 in einem wässrigen Medium mit einem primären Kohlenstoff lief eranten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium verwendet, das als sekundären Kohlenstofflieferanten Cholesterin, Cholest-4-en-3-on und/oder Cholesteryllinoleat enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wässriges Medium verwendet, in dem der sekundäre Kohlenstofflieferant in einer Konzentration von 0,5 bis 0,5 Gew.-% vorliegt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur des Mediums bei 24 bis 35°C hält und daß die Wachsturnsdauer 18 bis 40 Stunden beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als primären Kohlenstofflieferanten Essigsäure, Glykose und/oder Glyzerin verwendet.

als

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man/sekundären Kohlenstofflieferanten Cholesterin verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als primären Kohlenstofflieferanten Glyzerin verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des sekundären Kohlenstofflieferanten im Medium bei 0,1 bis 0,2 Gew.-I liegt.

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"η"

Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der sekundäre Kohlenstofflieferant in einer Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel für den zweiten Kohlenstofflieferanten suspendiert wird.

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