DE2512746B2 - Verfahren zur Herstellung von keimarmem, faserfreiem Pankreatin - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein kontinuierliches vi Verfahren zur Herstellung von Pankreatin mit hohen amylolytischen, lipolytischen und proteolytischen Aktivitäten unter gleichzeitiger Herabsetzung der Keimzahl bei völliger Ausschaltung der nach USP XVIII unerwünschten Keime. "·-,

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Pankreatin werden gewöhnlich tiefgefrorene Pankreasdrüsen verwendet, da sich nur das eingefrorene Material über längere Zeiträume ohne große Verluste an Enzymaktivitäten lagern laut. Wegen des hohen w» Gehaltes an amylolytischen und lipolytischen Aktivitäten werden die Pankreasdrüsen der Schweine bevorzugt verwendet.

In der Literatur werden unterschiedliche Herstellungsverfahren beschrieben. So stellt man z. B. durch *·* Behandlung des zerkleinerten, gefrorenen oder aufgetauten Drusenmaterials mit Wasser, Salzlösungen oder Lösungsmitteln (verd. Glycerin, 25% Äthanol, 20% Essigsäure) einen Extrakt her, in dem in verschiedenen Fällen unter Zugabe von Trypsin oder Enterokinase die Proenzyme der Proteasen aktiviert werden. Dieser Extrakt wird anschließend einer Fällung mit anorganischen Salzen, organischen Lösungsmitteln oder Tannin unterworfen und durch schonende Trocknung in ein Pulver überführt. Man kann auch durch schonende Entfernung des Wassers aus dem zerkleinerten Drüsenmaterial (z. B. Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, azeotrope Destillation) mit nachfolgender Entfettung (organische Lösungsmittel) oder durch gleichzeitige Entwässerung und Entfettung (z. B. Aceton, Alkohole bzw. Aceton-Äther) mit nachfolgender Trocknung Pankreatin herstellen.

Im Brit PaL Nr. 8 22 741 v. 28.10.1959 und im Franz. Pat. Nr. 12 95 302 v. 8. 7. 1962 werden Pankreasdrüsen mechanisch vorentfettet, auf eine Korngröße --on 1 bis 2 mm zerkleinert, in einem Behälter mit Diäthyläther chargenmäßig weiter entfettet und anschließend durch Zentrifugation in drei Phasen (Äther-Fett-Phase, Pankreas-SaÜ, Fleischrückstand) überführt Aus dem Pankreas-Saft werden durch Zugabe von Ammoniumsulfat Produkte von therapeutischem Wert gefällt.

Da Schweinepankreasdrüsen als Ausgangsmaterial zur Pankreatingewinnung heute ausschließlich in Großschlachthöfen gesammelt werden und da beim Entfernen dieser Drüsen aus den »Magen-Darm-Paketen« der frisch geschlachteten Tiere unter normalen Schlachthofbedingungen Kontaminationen praktisch nicht verhindert werden können, werden bei Untersuchungen an so gesammelten Drüsen Keimzahlen (pathogene plus apathogene Keime/1 g) von 10⁴ bis 10⁸ gefunden.

Mikrobiell reine Arzneimittel, die man in die drei Gruppen »steril«, »frei von pathogenen Keimen« und »keimarm« unterteilen kann, werden seit langem von der pharmazeutischen Industrie als Injektabilia, Dermatica, Ophthalmica und Schleimhautpräparate hergestellt Aber auch für Oralia wird in letzter Zeit immer mehr eine gewisse mikrobielle Reinheit angestrebt, eine Forderung, die bei Organpräparaten besonders schwer erfüllbar ist.

Pankreatin ist als Naturprodukt mit seinen empfindlichen Enzymsystemen unterschiedlich kontaminiert und häufig nicht frei von pathogenen Keimen.

Einige Arbeiten zur Reduzierung der Keimzahl wurden bereits am Pankreatin vorgenommen. So behandelt z. B. B. Schlatter (Dissertation ETH Zürich, 1971; Pharm. Acta Helvetiae 49 (1974J 41) Pankreatin mit Isopropanol und Wasser, oder mit y-Strahlen oder mit beiden gleichzeitig. Nach der Isopropanol-Wasser-Behandlung wird das Lösungsmittelgemisch durch azeotrope Destillation entfernt. In dem tschechoslowakischen Patent Nr. 147 274 wird ebenfalls eine Behandlung des Pankreatins mit /Strahlen zur Keimreduzierung beschrieben. Schließlich wurden Versuche zur Reduzierung der Keimzahl mit Äthylenoxyd durchgeführt (Libicky A, et al.: Die Pharmazie, 22 [ 1967] 311 und23[l968]2i)-

Gemäß dem in der DE-OS 21 35025 beschriebenen Verfahren wird die Keimreduzierung des Pankreatins mit halogenierten Kohlenwasserstoffen mit einem Siedepunkt zwischen 15 und 100°C bzw. mit aliphatischen Ketonen in Gegenwart von Wasser und Cellulosederivaten durchgeführt. Als geeignete halogenierte Kohlenwasserstoffe werden ausschließlich chlorierte Kohlenwasserstoffe, nämlich Methylenchlorid und Chloroform genannt. Das dabei erhaltene fließfähi-

ge Pankreatingranulat ist per 100 g frei von Salmonellen und per 1 g frei von Enterobakterien und Pseudomonaden bei einer Gesamtkeimzahl von kleiner als 10*.

Nach dem in der DE-OS 21 06 706 beschriebenen Verfahren wird Pankreatin, das mit Calciumverbindungen versetzt ist, mehrere Stunden bei 82° C unter Normaldruck erhitzt, um Salmonellen abzutöten.

Während in den obigen Verfahren Pankreatin als Ausgangsprodukt für die Keimrediizierung verwendet wurde, ist für die Abtötung von Salmonellen auch ein Verfahren mit Pankreasdrüsen als Ausgangsmaterial bekannt (E. ]. G. Glencross: BriL Med. Journal 2 (1972) 376). Hiernach werden Pankreasdrüsen mit einer wäßrigen Lösung von Hypochlorit behandelt, vermählen, vakuumgetrocknet und entfettet

Alle beschriebenen Verfahren zur Reduzierung der Keimzahl sind sehr umständlich und führen außerdem zu z. T. sehr erheblichen Aktivitätsverlusten.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von keimarmem, faserfreiem Pankreatin mit hohen amylolytischen, Iipolitischen und proteoiyüschen Aktivitäten gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in kontinuierlicher Arbeitsweise bei tiefen Temperaturen feinstzerkleinerte Pankreasdrüsen nach Zusatz von Wasser im Gewichtsverhältnis Pankreasdrüsen zu Wasser von etwa 1 :0 bis 1 :10 in wenigen Sekunden bei erhöhter Temperatur mit einem Gemisch aus flüssigen Chlorkohlenwasserstoffen und flüssigen Fluorchlorkohlenstoffen entfettet und entkeimt, wobei die Chlorkohlenwasserstoffe und die Fluorchlorkohlenstoffe im jo Gewichtsverhältnis von etwa 1 :0,05 bis 1 :2 eingesetzt werden und das Gewichtsverhältri" der bei tiefen Temperaturen feinstzerkleinerten Pankreasdrüsen zu dem halogenierten LösungsmittelgenuVh etwa 1 :2 bis 1 :50 beträgt und daß man nach ADtrennung der Fett-Lösungsmittel-Phase die Enzymphase konzentriert und unter schonenden Bedingungen trocknet

Überraschend dabei ist daß während der Entfettung eine beträchtliche Reduzierung der Keimzahl bei gleichzeitiger Abtötung aller Keime, die nach den USP XVIlI (The United States Pharmacopeia, 18^th Revision) unerwünscht sind, stattfindet und daß als Endprodukt ein faserfreies Pankreatin mit hohem Schüttgewicht erhalten wird.

Der kontinuierliche Prozeß ermöglicht weiterhin eine 4 > sehr kurze Aufarbeitungszeit der Drüsen unter schonenden Bedingungen.

Das helle Endprodukt das aufgrund seiner rieselfähigen Beschaffenheit galenisch leicht verarbeitbar ist zeichnet sich durch hohe enzymatische Aktivitäten aus, 51) die einerseits auf die neuartige Art der kontinuierlichen Aufarbeitung, andererseits auf die Anwesenheit von Fluorkohlenstoffen während des Entfettungsvorganges zurückzuführen sind

Erfindungsgemäß wird das Drüsenmaterial bis zur r> Zerstörung der Zellen feinst zermahlea Dadurch ist eine hochgradige kurzzeitige Entfettung bei der Behandlung mit dem Gemisch aus Chlorkohlenwasserstoffen und Fiuorchlorkohlenwasserstoffen gewährleistet. Außerdem wird durch diese Aufmahhing ein m praktisch faserfreies Material erhalten, so daß sich eine weitere Aufmahhing des Pankreatins, die immer mit Enzymverlusten verbunden ist erübrigt Wichtig für die Zerkleinerung ist daß die Produkttemperatur niedrig gehalten wird. w>

Die feinstzerkleinerten Pankreasdrüsen werden nach Zusatz von Wasser im Gewichtsverhältnis Pankreasdrüsen zu Wasser von etwa I : 0 bis 1 :10 in wenigen Sekunden bei erhöhter Temperatur mit einem Gemisch aus flüssigen Chlorkohlenwasserstoffe^ und flüssigen Fluorchlorkohlenstoffen entfettet und entkeimt wobei diese halogenierten Kohlenwasserstroffe im Gewichtsverhältnis von etwa 1 : 0,05 bisl : 2 eingesetzt werden.

Die Entfettung, mit der die Keimreduzierung gekoppelt ist wird in der angegebenen kurzen Zeit bei erhöhten Temperaturen (etwa 30—6O⁰C durchgeführt Hierbei treten keine nennenswerten Enzymschädigungen auf. Als geeignet erwies sich eine Gegenstromextraktion in Zentrifugalextraktoren. Die Extraktionszeiten liegen zwischen 30 und 300 Sekunden bei einer max. Temperatur von 6O⁰C. Die Verwendung dieser Gemische verhindert bei guter Entfettung und ausreichender Keirnreduzierung trotz erhöhter Temperatur Verluste an Enzymaktivitäten. Das Gewichtsverhältnis der bei tiefen Temperaturen feinstzerldeinerten Pankreasdrüsen zu dem halogenierten Kohlenwasserstoffgemisch beträgt hierbei etwa 1 :2 bis 1 :50.

Als Lösungsmittel werden Chlorkohlenwasserstoffe, deren Siedepunkte zwischen 20 und 150°C liegen, vorzugsweise Dichlormethan und Trichlormethan und Fluorkohlenwasserstoffe, deren Siedepunkte zwischen 20 und 150⁰C liegen, vorzugsweise Trichlorfluormethan und Trichlortrifluoräthan, eingesetzt

Die Konzentrierung der Enzymphase soli im Vakuum bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden. Empfehlenswert ist eine Konzentrierung in Kurzzeitverdampfern bei Verweilzeiten von max. 5 Sekunden, wobei diese Produktteraperatur nicht über 6O⁰C steigen soll. Werden diese Werte überschritten, treten Aktivitätsverluste ein.

Die Trocknung des Pankreatins erfolgt unter schonenden Bedingungen. Hierfür bieten sich die in der Technik bekannten Trocknungsverfahren an (Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, Sprühtrocknung).

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daß das Pankreatin nach der schonenden Trocknung mit einem relativ hohen Sdwtlgewicht etwa zwischen 500 und 700 g/l und sehr feinteilig, d h. mit einem mittleren Teilchendurchmesser von etwa 30—50μΐτι anfällt Die Kombination dieser beiden Eigenschaften ermöglicht bei der therapeutischen Anwendung des Pankreatins eine hohe Dosierung bei geringem Volumen; gleichzeitig tritt infolge der Teilchenfeinheit eine beschleunigte Freigabe der Enzyme im Verdauungstrakt ein.

Bei den bisher üblichen Aufarbeitungen von Pankreasdrüsen werden im allgemeinen Produkte mit merklich niedrigeren Schüttgewichten von etwa 300 bis 400 g/l erhalten. Eine Erhöhung dieser Schüttgewichtes ist nur in einem zusätzlichen Granulations- oder Verdichtungsverfahren möglich. Es ist auch möglich, ein höheres Schüttgewicht durch Fällung des Pankreatins aus Extrakten mit Salzen zu erhalten; dann ist allerdings das hohe Schüttgewicht durch Verunreinigung des Pankreatins mit dem Fällungsmittel bedingt

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt zeichnet sich durch Faserfreiheit aus, wahrend der Faseranteil der bekannten Produkte oft sehr groß ist Ein nicht faserfreies Produkt ist durch Ballaststoffe belastet, so daß das Endprodukt pro Gewichtsteinheit eine niedrigere enzymatische Aktivität besitzt Aus solchen Produkten werden auch die Enzyme langsamer freigegeben. Die Herstellung von Tabletten und Dragees ist durch die Anwesenheit von Fasern erschwert; außerdem neigen solche Formen durch die Anwesenheit von Fasern zur Rißbildung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Produkt von der Zerkleinerung bis zur Trocknung in fließfähigem Zustand gehalten. Nach Verfahrensschritten, bei denen erhöhte Temperaturen auftreten, wird das Produkt sehr schnell wieder auf Temperaturen abgekühlt, bei denen es zu keinen Enzymschädigungen kommt Der günstige Temperaturbereich nach der Abkühlung liegt zwischen etwa 0 und 8° C.

Das erfinaungsgemäße Verfahren hat weiter den Vorteil, daß der Anlagentrakt nach der Keimreduzierungsstufe (Entfettungsstufe) gegen mikrobielle Kontamination geschützt ist

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß in einem Arbeitsgang bei der Aufarbeitung der Pankreasdrüsen gleichzeitig eine Entfettung und Entkeimung stattfindet, ohne daß ein Verlust an Enzymaktivität in Kauf genommen werden muß. Es ist bisher kein Verfahren zur Gewinnung von Pankreatin bekannt geworden, bei dem die Gesamtkeimzahl reduziert wird und die nach USP XVIII unerwünschten Keime sogar völlig ausgeschaltet werden. Bei dem einzigen bisher bekannt gewordenen Verfahren, bei dem schon das Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Pankreatin, nämlich die Pankreasdrüsen, zur Abtötung der Salmonellen mit einer Hypochloritlösung behandelt werden, treten erhebliche Verluste an Enzymaktivitäten auf.

Beispiel 1

In einer kontinuierlich arbeitenden Anlage werden pro Stunde 25 kg tiefgefrorene Pankreasdrüsen ( — 20° C) in mehreren Stufen fein zerkleinert Der dabei entstehende Brei (0⁰C) wird in einem Durchlaufmischer mit 6 kg Wasser von 20⁰C per 1 Stunde vermischt, und aus der Mischung wird in einem Zentrifugalextraktor im Gegenstrom mit einem Gemisch aus Dichlormethan und Trichlorfluormethan (150 kg Dichlormethan plus 50 kg Trichlorfluormethan per 1 Stunde) das Fett in 60 Sekunden extrahiert Hierbei erwärmt sich die Enzymphase bis auf 50⁰C Aus der anfallenden Fett-Lösungsmittel-Phase wird durch Redestillation das Lösungsmittelgemisch kontinuierlich zurückgewonnen und dem Prozeß wieder zugeführt Die entfettete Enzymphase wird in einem Wärmeaustauscher auf 5⁰C abgekühlt und danach in einem Kurr.zeitverdampfer bei 40°C/150 mm Hg auf einen Trockengehalt von ca. 25% eingeengt Die Berührungszeit des Produktes mit dem Heizmedium beträgt etwa 1 Sekunde. Das anfallende Konzentrat wird in einem Wärmeaustauscher auf 5° C gekühlt und anschließend auf einem Zerstäubungstrockner mit gefilterter Zuluft getrocknet. Die Ausbeute an Pankreatin beträgt ca. 5 kg/1 Std. Das erhaltene Produkt hat folgende Eigenschaften:

Keimizahl

Keimdif'eren-

zierung

2 χ 1(P Keime/1 g

Amylase-

Aktivität

Lipase-

Aktivität

Protease-

Aktivität

HzO-Gehalt

Fett-Gehalt

Schüttgewicht

Teilchengröße
30-50 μιη
10—30μπι
kleiner ΙΟμπι

42 000 FIP-Einheiten*)/ 1 Gramm
58 000FIP-Einheiten^#)/1 Gramm

2 800 FIP Einheiten')/! Gramm
2,0%
0,6%
510 g/l I

80%
20%
10%

Im Endprodukt wurden nur die im Ausgangsmaterial vorhandenen apathogenen Sporenbildner gefunden.

Nach USP XVIII unerwünschte Keime konnten im Endprodukt nicht mehr nachgewiesen werden.

*) Bestimmt nach den Vorschriften der Federation Internationale Pharmaceutique (s. Hennrich, Bestimmung von Pankreatin inPharm.Ind.31 (1969) S. 228.

Beispiel 2

In einer kontinuierlich arbeitenden Anlage werden pro Stunde 30 kg tiefgefrorene Pankreasdrüsen (-40⁰C) in mehreren Stufen fein ^arkleinert Das dabei entstehende feine Pulver (—20"CJ wird in einem Misdikneter zunächst mit 15 kg/1 Std. eines Gemisches (20°C) aus Trichlormethan und Trichlortrifli.'oräthan (7,5 kg + 7,5 kg) und danach mit 60 kg/1 Std. Wasser

(20⁰C) gemischt Danach wird der Brei in einem Wärmeaustauscher auf 15° C erwärmt und aus diesem in einem Zentrifugalextraktor unterhalb 30° C im Gegenstrom mit einem Gemisch aas Trichlormethan und Trichlortrifluoräthan (500 kg + 500 kg) per eine Stunde das Fett in 60 Sekunden extrahiert Hierbei erwärmt sich die Enzyniphase auf maximal 40° C. Aus der anfallenden Fett-Lösungsmittel-Phase wird durch Redestillation das Lösungsmittelgemisch kontinuierlich zurückgewonnen und dem Prozeß wieder zugeführt Die entfettete Enzymphase wird in einem Wärmeaustauscher auf 5° C gekühlt und danach im Kurzzeit verdampfer bei 40°C-50°C/150-230mm Hg auf einen Trockengehalt von 18% eingeengt Die Berüiirungszeit des Produktes mit dem Heizmedium beträgt ca 3

ίο Sekunden. Das anfallende Konzentrat wird kontinuierlich gefriergetrocknet

Die Ausbeute an Pankreatin beträgt 53 kg/1 Stunde. Das erhaltene Produkt hat folgende Eigenschaften:

Amylase-

Aktivität

Lipase-

Aktivität

Protease-Vi Aktivität

H₂O-GeIIaIt

Fett-Gehalt

Sci.üitgewicht

Teilchengröße
30-50 μιη
10-30 μιη
kleiner als ΙΟμπι

Keimzahl

Keimdifferenzierung

44 500 FIP-Einheiten/1 Gramm 57 200 FIP-Einheiten/1 Gramm

2 500 F'P-Einheiten/l Gramm 1,5%
1,1%
500 g/l

80%
10%
10%
4 χ 103Keime/lg

Im Endprodukt wurden nur die im Ausgangsmaterial vorhandenen apathogenen Sporenbildner gefunden.

Nach USP XVIII unerwünschte Keime konnten im Endprodukt nicht mehr nachgewiesen werden.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von keimarmem, faserfreiem Pankreatin mit hohen amylolytischen, lipolytischen und proteolytischen Aktivitäten, dadurch gekennzeichnet, daß man in kontinuierlicher Arbeitsweise bei tiefen Temperaturen feinstzerkleinerte Pankreasdrüsen nach Zusatz von Wasser im Gewichtsverhältnis Pankreasdrüsen zu Wasser von etwa 1 :0 bis 1 :10 in wenigen Sekunden bei erhöhter Temperatur mit einem Gemisch aus flüssigen ChlorkohienWasserstoffen und flüssigen Fluorchlorkohlenstoffen entfettet und entkeimt, wobei die Chlorkohlenwasserstoffe und die Fluor- ΐϊ kohlenstoffe im Gewichtsverhältnis von etwa 1 :0,5 bis 1 :2 eingesetzt werden und das Gewichtsverhältnis der bei tiefen Temperaturen feinstzerkleinerten Pankreasdrüsen zu dem halogenierten Lösungsmittelgemisch etwa 1 :2 bis 1 :50 beträgt und daß man nach Abtrennung der Fett-Lösungsmittel-Phase die Enzymphase konzentriert und unter schonenden Bedingungen trocknet.

2. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfettung und Keimreduzierung 30 bis 300 Sekunden dauert und bei Temperaturen zwischen 30 und 60° C durchgeführt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Siedepunkte der Chlorkohlenwasserstoffe und der Fluorkohlenstoffe to zwischen 20 und 150⁰C liegen, daß als chlorierte Kohlenwasserstoffe Trichlormethan und/oder DicMormethan und als Fluorchlorkohlenstoffe Triehlorfluormethanund/oder Trichlortrifluoräthan eingesetzt werden. J

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrierung der entfetteten Enzymlösung in Kurzzeitverdampfern mit max. 5 Sekunden Berührungszeit bei einer Temperatur bis 60° C im Vakuum durchgeführt wird. 4»

5. Verfahren zur Herstellung von keimarmem, faserfreiem Pankreatin mit hohen amylolytischen, lipolytischen und proteolytischen Aktivitäten, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß dem Beispiel 2 gearbeitet wird. 1 >