KR100367659B1 - 선택적 안정화제의 첨가에 따른 자가분해(autolysis)를 통한 고역가 판크레아틴의 제조방법 - Google Patents

선택적 안정화제의 첨가에 따른 자가분해(autolysis)를 통한 고역가 판크레아틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선택적 안정화제의 첨가에 따른 자가분해(autolysis)를 통한 고역가 판크레아틴의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 돼지 췌장과 소 췌장을 파쇄하여 혼합하고, 여기에 염화칼륨, 치오황산나트륨, 인산수소나트륨, 폴리소르베이트(Tween 80) 10%, 디-소르비톨(d-sorbitol)20% 용액(90 L)을 각각 투여, 혼합하여 상온에서 6시간 반응시킨 후, 섬유질을 여과하여 제거하고, 원심분리로 판크레아틴을 회수하여 이소프로필 알콜(아세톤으로 대체 가능)로 세척한 후, 건조·멸균하는 공정에 의하여 생산단가가 낮고 지방의 제거율도 높으며 나아가 각 효소들의 역가가 우수한 판크레아틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

선택적 안정화제의 첨가에 따른 자가분해(autolysis)를 통한 고역가 판크레아틴의 제조방법{The method of preparing pancreatin by adding selective stabilizers}
본 발명은 돼지 췌장과 소 췌장을 혼합하여 고역가의 판크레아틴(pancreatin)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지 췌장과 소 췌장을 혼합하고 선택적으로 안정화제를 첨가한 숙성공정을 통하여 고역가의 판크레아틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
판크레아틴은 소나 돼지의 동물성 췌장의 외분비샘에서 분비되는 복합효소로서, 전분소화효소(α-Amylase), 지방소화효소(Lipase), 단백소화효소(Protease)가 모두 들어 있어 의약용 소화제의 원료로서 우수하며 기타 식품공업 및 피혁공업 등에도 널리 사용되고 있다. 한편, 췌장에서 분비되는 소화효소 중 단백분해효소인 프로테아제는 불활성화된 상태로 분비되었다가 엔테로키나제에 의해 활성화된다. 또한, 췌장의 소화효소들은 약알칼리성에서 활성을 유지하므로, 췌장의 소화효소가 분비되어 작용하는 십이지장은 약알칼리성의 상태를 유지하고 있다.
판크레아틴은 현재 주로 독일 및 선진 각국에서 수입되고 있으나 수입원가가 비싸며 수송과정에서 효소의 실활을 초래하여 활성이 많이 떨어지는 단점이 있다.
상기와 같은 판크레아틴의 제조방법으로서 오늘날 일반적으로 이용되고 있는 공정은 췌장을 건조하여 아세톤(acetone) 또는 알콜(alcohol)류의 수용성용매를 이용하여 지방을 제거하는 방법이다. 그중 가장 잘 알려진 방법으로서 췌장을 동결건조하여 지방을 휘발성 용매로 제거하는 방법이 있다. 하지만 이 공정은 제조 공정이 길며, 동결건조를 비롯하여 생산단가를 높이는 요인이 많으며, 섬유질을 완전히 제거하기가 어려워 고역가의 판크레아틴을 얻기가 어렵다는 문제점이 있다. 섬유질은 의학적인 가치가 없고 효소의 활성을 저해하며, 또한 판크레아틴 제제의 의약품 제조 시 타정을 어렵게 하며 제조된 제품의 붕해도를 저해하는 요인이 된다. 따라서 섬유질의 완전한 제거는 효소의 역가 및 판크레아틴 제제의 제조에 있어 매우 중요하므로 이의 완전한 제거가 필요하다.
또한 고역가의 제품을 얻기 위해서는 효소의 자가분해(autolysis)를 통한 단백분해효소의 활성화가 필요하다. 즉, 췌장의 단백분해효소는 불활성화된 엔자이모겐(enzymogen)의 형태로 존재하기 때문에 엔테로키나아제(enterokinase)를 이용한 활성화로 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)의 형태로 전환시켜 주어야 한다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 생산단가가 저렴하면서도 전분소화효소, 단백소화효소 및 지방소화효소들의안정화가 우수한 고역가의 판크레아틴 제조방법을 제공함으로써 수입대체효과 및 안정된 제품의 공급을 확보하는 것이다.
현재 수입되고 있는 판크레아틴은 미국약전규격(USP) 기준으로 했을 때 4.5배산으로서 그 기준은 다음과 같으며, 본 발명에서는 미국약전규격(USP) 기준으로 했을 때 8배산의 고역가 판크레아틴 제조 방법의 기술을 확보하고자 한다.
도 1은 본 발명의 최적공정을 나타낸 예시도
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 돼지 췌장과 소 췌장을 파쇄하여 혼합하고, 여기에 염화칼륨(KCl), 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O), 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O), 폴리소르베이트(Polysorbate, Tween 80) 10%(10 L), 디-소르비톨(d-sorbitol) 20% 용액(90 L)을 각각 투여, 혼합하여 상온에서 6시간 반응시킨 후, 그 다음에는 당업계에서 공지된 방법에 따라 섬유질을 여과하여 제거하고, 원심분리로 판크레아틴을 회수하여 이소프로필 알콜(acetone으로 대체 가능)로 세척한 후, 건조·멸균하는 공정을 채택하였으며, 이에 따라 생산단가가 낮고 지방의 제거율도 높으며 나아가 각 효소들의 역가가 우수한 판크레아틴을 얻을 수 있음을 확인하였다.
이와 같은 결과는, 돼지췌장과 소췌장을 혼합하고 선택적으로 안정화제를 첨가하여 특이적 숙성공정을 거치는 것을 포함하는 판크레아틴의 제조에 관한 아래의 실험결과에 따른 것이다.
이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 다만, 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 자가분해(Autolysis)
실시예 1-1. 돼지췌장과 소췌장의 효소 함량 비교
일반적으로 단백소화효소를 활성화시키기 위해 소췌장을 선택적으로 사용하였으며, 이것은 엔테로키나아제가 많이 함유되어 있기 때문에 주로 이들을 사용한다.
실시예 1-1-1.
돼지췌장 1kg을 파쇄하고 정제수 1 L를 첨가하여 12시간을 반응시킨 후 20% 이소프로필 알콜(IPA)을 첨가해 섬유질을 걸러내고 다시 80%의 이소프로필 알콜을 첨가하여 효소를 침전시킨 다음 원심분리로 판크레아틴을 회수하여 고농도의 이소프로필 알콜로 수회 세척하여 탈수 및 지방을 제거한 후 일반 건조하고(25～50℃) 마쇄하여 제품을 얻는다.
실시예 1-1-2.
소췌장 1kg을 파쇄하고 정제수 1 L를 첨가하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 수행한다.
실시예 1-1-3.
돼지췌장 1kg을 파쇄하고 소췌장 100g(10%)을 파쇄하여 첨가하고 정제수 1 L를 첨가하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 수행한다.
위 실험결과 돼지 췌장에 비해 소 췌장의 판크레아틴 효소의 함량이 떨어졌으며, 돼지 췌장과 소 췌장을 혼합하였을 때 단백소화효소(protease 107,543 USP U/g)의 활성화가 이루어졌음을 알 수 있었다. 반면, 전분소화효소와 지방소화효소의 함량이 단백소화효소의 활성화와 함께 실활됨을 알 수 있었다. 따라서 이후의실험에서는 우선 단백소화효소의 활성화를 최적화하는 조건을 찾은 다음, 전분소화효소와 지방소화효소의 안정화를 높이는 조건을 찾는 순서로 실험을 진행하였다.
실시예 1-2. 소췌장의 농도에 따른 효소의 역가 변화
돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 각각 10%, 20%, 30% 파쇄하여 투여한다. 12시간을 반응시킨 후 20% 이소프로필 알콜을 첨가해 섬유질을 걸러내고 다시 80%의 이소프로필 알콜을 첨가하여 효소를 침전시킨 다음 원심분리로 판크레아틴을 회수하여 고농도의 이소프로필 알콜로 수회 세척하여 탈수 및 지방을 제거한 후 일반 건조하고(25～50℃) 마쇄하여 제품을 얻는다.
위 실험결과, 단백소화효소의 활성화에는 소췌장의 농도가 20%일 때가 적당한 것으로 판단된다. 그러나 단백소화효소의 활성화에 따라 무첨가의 판크레아틴 효소의 전분소화력 및 지방소화력이 역가의 소실을 보여 이에 대한 안정화제의 검토가 요구된다.
실시예 1-3. 무기염류에 의한 효소역가의 변화
실시예 1-3-1. 염화칼륨(KCl)의 투여
돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 염화칼륨(KCl)을 각각 1.0, 2.0, 3.0, 4.0%를 투여하여 무첨가군과 함께 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
위 실험결과 염화칼륨(KCl)의 농도가 2.0%일 때, 판크레아틴 효소의 안정화 효과가 높은 것으로 판단된다.
실시예 1-3-2. 치오황산나트륨(NaS 2 O 3 ·5H 2 O)의 투여
돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O)을 각각 1.0, 2.0, 3.0, 4.0%를 투여하여 무첨가군과 함께 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
위 실험결과 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O) 3.0%의 첨가가 염화칼륨(KCl)의 농도 2.0%보다 판크레아틴 효소의 안정화 능력이 우수한 것으로 판단된다.
실시예 1-3-3. 복합성분의 첨가 효과
복합성분 ①. 돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O) 3.0%, 염화칼륨(KCl) 2.0%, 황산마그네슘(MnSO4·4H2O) 3%를 투여하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
복합성분 ②. 돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O) 3.0%, 염화칼륨(KCl) 2.0%를 투여하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
복합성분 ③. 돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 염화칼륨(KCl) 2.0%, 황산마그네슘(MnSO4·4H2O) 3.0%를 투여하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
복합성분 ④. 돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O) 3.0%, 황산마그네슘(MnSO4·4H2O) 3.0%를 투여하여 12시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
위 실험결과, 효소의 안정화에 있어서 복합성분 ②(염화칼륨 2.0% + 치오황산나트륨 3.0%)가 효과가 높은 것으로 판명되었다.
실시예 1-3-4. 소르브산(sorbic acid)(3%)의 첨가 효과
다음의 실험에서는 복합성분 ②에 소르브산(sorbic acid)을 첨가했을 경우의 효과를 알아보았다.
방법 : 돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O) 3.0%, 염화칼륨(KCl) 2.0%를 투여하고 소르브산(sorbic acid)을 3.0% 첨가하여 각각 12, 24시간을 반응시킨 후 상기조작과 동일하게 처리한다.
소르브산(sorbic acid)을 첨가한 경우, 단백소화력에 대해 약간의 안정성의 향상을 얻을 수 있었으나, 전분소화력 및 지방소화력의 안정성의 향상은 얻을 수 없었다.
실시예 2. 단백소화효소(Protease)의 안정화
앞서의 결과들로 미루어 단백소화력의 활성화 단계에서 시간이 경과할수록 단백소화력의 역가는 향상되는 반면, 전분소화력 및 지방소화력의 경우는 역가가실활됨을 알 수 있었다. 그래서 이후의 실험에서는 활성화의 시간에 따른 안정성을 확인하였다.
실시예 2-1.
돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g), 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O)을 3.0%(30g)를 투여하여 각각 3, 6, 9, 12시간별로 반응시킨 후 상기 다음의 조작을 행한다.
실시예 2-2.
돼지 췌장 1kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(200g)을 파쇄하여 투여한 다음, 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g), 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O)을 3.0%(30g), 소르브산(sorbic acid) 3.0%(30g)를 투여하여 각각 3, 6, 9, 12시간별로 반응시킨 후 상기 다음의 조작을 행한다.
위 실험결과 자가분해(autolysis)는 6시간이 가장 적합하였으며 실시예 2-2. 소르브산의 첨가는 유의할 효과를 보이진 못했다.
앞의 실험결과에서 전분소화력과 지방소화력이 매우 불안정하여 그에 대한 안정화제의 첨가효과에 대한 실험을 수행하였다.
실시예 3. 전분소화효소(α-amylase)의 안정화
실시예 3-1.돼지 췌장(1kg) + 소 췌장 20%(200g) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g) + 정제수 1L ⇒ 섬유질 여과 ⇒ 6h 숙성
실시예 3-2.돼지 췌장(1kg) + 소 췌장 20%(200g) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g) + 정제수 1L ⇒ 6h 숙성 ⇒ 섬유질 여과
실시예 3-3.돼지 췌장(1kg) + 소 췌장 20%(200g) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g) + 20% 이소프로필 알콜용액 1L ⇒ 6h 숙성 ⇒ 섬유질 여과
실시예 3-4.돼지 췌장(1kg) + 소 췌장 20%(200g) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g) + 폴리소르베이트(Polysorbate, Tween 80) 10%(100ml) + 정제수 900m1 ⇒ 6h 숙성 ⇒ 섬유질 여과
실시예 3-5.돼지 췌장(1kg) + 소 췌장 20%(200g) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g) + 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O) 3.0%(30g) + 정제수 900ml + 폴리소르베이트(Tween 80) 10%(100ml) ⇒ 6h 숙성 ⇒ 섬유질 여과
위의 실험결과에서 전분소화력과 단백소화력의 활성이 높은 실시예 3-5로 다음의 스케일업(scale-up)공정을 수행하였다.
실시예 3-6(Scale-up)
돼지 췌장(10kg)을 파쇄하고 소 췌장 20%(2kg)를 파쇄하여 혼합한 다음 염화칼륨(KCl) 2.0%(200g), 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(300g), 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O) 3.0%(300g)를 첨가하고 정제수 9L, 폴리소르베이트(Tween 80) 10%(1 L)를 첨가하여 6시간을 반응시킨 후 상기조작을 동일하게 조작한다.
위의 결과에서 리파제의 활성이 불안정한 것이 문제점으로 대두되어 이에 대한 안정화의 필요성이 제기되었다.
실시예 4. 지방소화효소(Lipase)의 안정화
지방소화효소(Lipase)의 안정화제로서 디-소르비톨(d-sorbitol)의 첨가효과를 알아보았다.
방법 : 돼지 췌장(1kg)을 파쇄하고 소 췌장 20%(200g)를 파쇄하여 혼합한 다음 염화칼륨(KCl) 2.0%(20g), 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(30g), 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O) 3.0%(30g)를 첨가하고 정제수 900ml, 폴리소르베이트(Tween 80) 10%(100ml)를 첨가하고 디-소르비톨(d-sorbito1)을 각각 10, 20, 30, 40, 50%를 첨가하여 6시간을 반응시킨 후 상기조작을 동일하게 수행한다.
위의 결과 전체적으로 지방소화효소(Lipase)가 안정화되었으며, 생산단가의 입장에서 디-소르비톨(d-sorbito1)의 농도를 20%로 정하였다.
실시예 5. 종합적인 효소의 안정화
지금까지 얻어진 결과를 바탕으로 생산단가를 낮추는 조건하에서 가장 적합한 조건을 설정하였다.
방법 : 돼지 췌장 100kg을 파쇄하고 소 췌장을 20%(20kg)을 파쇄하여 투여한 다음, 염화칼륨(KCl) 2.0%(2.0kg), 치오황산나트륨(NaS2O3·5H2O)을 3.0%(3.0kg), 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O) 3.0%(3.0kg), 폴리소르베이트(Tween 80) 10%(10 L), 디-소르비톨 20% 용액(90 L)을 각각 투여하고 3, 6, 9, 12시간 반응시킨 후 상기 다음의 조작을 행한다.
위 실험결과 전분소화효소, 단백소화효소, 지방소화효소들의 안정화가 괄목할 수준으로 향상되었다. 자가분해(autolysis) 시간은 6시간이 가장 적당한 것으로 판단된다.
이상의 실험결과로부터 본 발명의 가장 바람직한 공정은 다음과 같다.
돼지 췌장(100kg) + 소 췌장 20%(20kg) + 염화칼륨(KCl) 2.0%(2.0kg) + 치오황산나트륨(Na2S2O3·5H2O) 3.0%(3.0kg) + 인산수소나트륨(Na2HPO4·12H2O) 3.0%(3.0kg) + 폴리소르베이트(Tween 80) 10%(10 L) + 디-소르비톨(d-sorbitol) 20%용액(90L)
↓
파쇄, 혼합
↓
상온, 6h 숙성
↓
섬유질을 여과하여 제거
↓
원심분리로 판크레아틴을 회수
↓
이소프로필 알콜(아세톤으로 대체 가능)로 세척
↓
열풍 건조(50℃)
↓
멸균(γ-멸균)
↓
제품(USP 8배산 pancreatin)
위 방법으로 생산된 판크레아틴은 수분함량은 4.0% 이하였으며, 지방은 1.0% 이하로 지방의 제거율도 상당히 우수한 방법으로 판명되었으며, 이상의 방법에 따라 미국약전규격(USP) 8배산 이상의 고역가 판크레아틴을 생산할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 동물성 췌장으로부터 판크레아틴을 제조하는 방법에 있어서, 돼지췌장과 소췌장을 혼합하여 선택적으로 안정화제를 첨가하되 선택적 안정화제는 염화칼륨, 치오황산나트륨, 인산수소나트륨, 폴리소르베이트, 디-소르비톨 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 돼지 췌장과 소 췌장 및 선택적 안정화제의 혼합 후 상온에서 3시간 내지 9시간 숙성시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 제조방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 돼지 췌장, 소 췌장, 염화칼륨, 치오황산나트륨, 인산수소나트륨, 폴리소르베이트, 디-소르비톨 용액의 비율이 100(kg):10~30(kg):1~3(kg):2~4(kg):2~4(kg):1~20(L):80~100 (L) 인 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 제조방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 돼지 췌장, 소 췌장, 염화칼륨, 치오황산나트륨, 인산수소나트륨, 폴리소르베이트, 디-소르비톨 용액의 비율이 100(kg):20(kg):2(kg):3(kg):3(kg):10(L):90(L)인 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 제조방법.
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