DE3050077C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine aus Kletten erhaltene aktive
Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutabilität Aktivität
aufweist, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es ist seit einiger Zeit gut bekannt, daß praktisch alle
Carcinogene Mutagenität zeigen. Weiterhin ist die Möglichkeit,
daß die Mutagene carcinogen sind, groß. Beispiele
hierfür sind Substanzen, die in unserem täglichen
Leben angetroffen werden, wie AF-2-(2-furyl)-3-(5-nitro-
2-furyl)-acrylamid, Trp-P-1-(3-amino-1,4-dimetyl-5H-
pyrido[4.3-b]indol) und Trp-P-2-(3-amino-1-methyl-5H-
pyrido[4.3-b]indol, wobei die beiden letzteren in den angekohlten
oder verschmorten Teilen von beispielsweise gebratenem,
geröstetem oder gekochtem Fleisch und Fisch
anzutreffen sind. Es wurde berichtet, daß diese Substanzen
Mutagenität aufweisen und Substanzen sind, die in
Säugetieren eine Carcinogenese induzieren.
In der Literaturstelle S. Földeák, G. A. Dombradi, Acta
Phys. et Chem. Szeged 10, 91 bis 93 (1964) wird ein Kletten
extrakt beschrieben, der das Tumorwachstum verhindert.
Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem nach einer Extraktion
des trockenen Pflanzenmaterials mit Dichlormethan
das Lösungsmittel wieder abdestilliert wird und anschließend
mit Petrolether ein schwer filtrierbarer Niederschlag
ausgefällt wird. Nachdem der Niederschlag abzentrifugiert
ist, wird das Lösungsmittel erneut abdestilliert. Man
erhält ein braunes viskoses Öl, das durch Chromatographie
weiter gereinigt wird. Die Aktivität bei der Inhibierung
des Tumorwachstums dieses Öls ist jedoch nicht zufrieden
stellend.
Die Anmelderin hat kürzlich ein Verfahren zur Isolierung
und Reinigung eines in Kohlsaft vorhandenen, desmutagenen
Faktors vorgeschlagen (vergl. JA-OS 1 22 715/79). Dieses Verfahren
umfaßt die Stufen:
- 1) Zentrifugieren des Kohlsaftes,
- 2) Ultrazentrifugieren der entstehenden überstehenden Lösung,
- 3) Behandlung der überstehenden Lösung mit einer Anionenaustausch-Cellulose,
- 4) Aufbringen der durchgelaufenen Fraktion auf eine Kationenaustausch-Cellulose enthaltende Säule,
- 5) Sammeln der aktiven Fraktion, die bei niedriger Salzkonzentration eluiert wird, und
- 6) Adsorbieren der Fraktion an einem Molekularsieb zur weiteren Reinigung der Fraktion.
Die schließlich erhaltene Fraktion zeigt charakteristische
Absorptionsspektra bei 280 nm und 404 nm und ist ein Hämoprotein,
das gegenüber Hitze stabil ist, das aber die Eigenschaft
aufweist, daß es durch proteolytische Enzyme desaktiviert
wird.
Von diesem desmutagenen Faktor, der durch Isolierung aus
Kohlsaft erhalten wird, ist bekannt, daß er nicht nur die
Mutagenität von Trp-P-1-(3-amino-1,4-
dimethyl-5H-pyrido[4.3.-b]indol) und Trp-P-2-(3-amino-1-
methyl-5H-pyrido[4.3-b]indol) inhibiert, sondern ebenfalls
die von N-Butyl-N-acetoxy-nitrosoamin, den Reaktionsprodukten
der Sorbinsäure mit Nitraten, 2-Aminoanthracen,
Äthidiumbromid wie auch verschiedene Mutagene,
die eine Mutagenität als Ergebnis des Metabolismus der
Pyrolysate solcher Aminosäuren, wie Tryptophan, Ornithin
usw., manifestieren.
Die letzte Fraktion, die aus Kohlsaft erhalten wird, besitzt
jedoch den Nachteil, daß sie bei gleichzeitiger Anwesenheit
eines proteolytischen Enzyms desaktiviert wird.
Weiterhin kann sie nicht nur die Mutagenität solcher Mutagene
nicht inhibieren, die ohne Metabolisierung Mutagenität
aufweisen, wie die Oxidationsfarben (z. B. 4-Nitro-o-
phenylendiamin und 2-Nitro-p-phenylendiamin), sondern sie
besitzt weiterhin die Wirkung, daß sie die Mutagenität
wesentlich verstärkt (d. h. aktiviert).
Die Anmelderin hat in Agric. Biol. Chem. 42 (6), Seiten
1236-1238, 1978, qualitativ berichtet, daß die überstehende
Lösung, die man durch Zentrifugieren von Kohl,
Broccoli, grünem Paprika, Auberginen, Äpfeln, Kletten,
Schalotten, Ginger, Ananas und Pfefferminzblättern erhält,
die Mutagenität von Pyrolysaten des Tryptophans inhibie
ren.
Obwohl alle diese Gemüse und Früchte, die Aktivität besitzen,
die Mutagenität, die solchen Pflanzen zuzuordnen
ist,
zu inhibieren, haben weitere Untersuchungen gezeigt,
daß von diesen nur die aktive Fraktion, die aus der Klette
erhalten wird und in gereinigtem Zustand vorliegt, eine
überlegene Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität
aufweist. Es wurde jetzt gezeigt, daß die aus Kletten
erhaltene Fraktion eine überraschend einzigartige Aktivität
aufweist.
Bei den Untersuchungen wurde weiterhin gefunden, daß die
wasserlösliche Substanz, die auf gleiche Weise wie Klettensaft
aus Pflanzen der gleichen zusammengesetzten Familie,
wie die der Kletten, erhalten wird, beispielsweise
aus dem Saft von Shungiku, Pestwurz (butterbur) und Salat,
nicht die Aktivität aufweist, die Mutagenität, die diesen
Substanzen zuzuordnen ist, zu inhibieren.
In der oben erwähnten Literaturstelle werden nur die überstehenden
Materialien beschrieben, die man beim Zentrifugieren
von Gemüse- und Pflanzensäften erhält. Es finden
sich keine Hinweise oder Angaben hinsichtlich eines Verfahrens
zur Isolierung der aktiven Komponente aus diesen
überstehenden Materialien bzw. Lösungen und hinsichtlich
ihrer Reinigung. Somit findet sich kein Hinweis oder Angabe
bezüglich der aktiven Komponente im gereinigten
Zustand.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen desmutagenen
Faktor, der in Kletten vorhanden ist, in gereinigtem
Zustand zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß soll ein desmutagener Faktor in gereinigtem
Zustand zur Verfügung gestellt werden, der die Aktivität
aufweist, daß er die Mutagenität dieser Substanzen,
ohne daß die metabolisiert werden, inhibiert.
Erfindungsgemäß soll in gereinigtem Zustand ein desmutagener
Faktor zur Verfügung gestellt werden, der im wesentlichen
keine Abnahme in seiner Aktivität bei der Inhibierung
der Mutagenität zeigt, selbst wenn er bei erhöhten
Temperaturen behandelt oder mit einem proteolytischen Enzym
behandelt wird.
Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Verfügung
gestellt werden, gemäß dem ein desmutagener Faktor
wirksam aus Kletten isoliert und gereinigt werden kann.
Diese Aufgabe und die Vorteile der Erfindung werden in
der folgenden Beschreibung erläutert.
Die Erfindung betrifft eine aus Kletten erhaltene aktive
Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutagenität Aktivität
aufweist, erhältlich durch die Anzahl und Reihenfolge
der folgenden Verfahrensschritte:
- a) Zetrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
- b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nie derschlags;
- c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
- d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions- Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Katio nenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.
Die aktive Fraktion, die sich von der Klette ableitet
und die erfindungsgemäß in gereinigtem Zustand zur Verfügung
gestellt wird, ist eine wasserlösliche, in Kletten
enthaltene Substanz, die an Anionenaustausch-Cellulose,
jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert
wird. Sie besitzt einen Absorptions-Wellenlängenpeak im
Bereich von 280 bis 300 nm und weist die Aktivität auf,
daß sie die Mutabilität inhibiert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
der oben beschriebenen aktiven Fraktion, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Stufen
aufweist:
- a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
- b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nieder schlags;
- c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
- d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorp tions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Katio nenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.
Die Klette, wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet
wird, ist die Pflanze Arctium lappa Linne oder Arctium
lappa L. der Gattung Arctium der zusammengesetzten bzw.
entsprechenden Familie.
Die Klette, die bei der vorliegenden Erfindung für die Isolierung
der aktiven Fraktion verwendet wird, kann nicht
nur die Wurzeln der Klette, sondern ebenfalls ihre Früchte,
Stiele und Blätter umfassen. Es ist somit möglich,
die geerntete Klette direkt zu verwenden, ohne sie in ihre
Teile zu zerlegen. Weiterhin kann sie entweder in frischem
oder getrocknetem Zustand verwendet werden.
Es wurde durch Untersuchungen festgestellt, daß die aktive
Fraktion, die aus der Klette erfindungsgemäß erhalten
wird, überlegene Eigenschaften hinsichtlich ihrer Aktivität
bei der Inhibierung der Mutagenität zeigt und keine
wesentliche Abnahme aufweist, selbst wenn die Fraktion bei
erhöhten Temperaturen von beispielsweise etwa 100°C während
15 Minuten behandelt wird oder wenn sie mit einem
proteolytischen Enzym behandelt wird.
Bezüglich der anderen Eigenschaften dieser aktiven Fraktion
wurde gefunden, daß die Aktivität bei der Inhibierung
der Mutagenität stark durch Manganionen abnimmt, daß
aber keine wesentliche Abnahme durch Magnesium- oder Calciumionen
auftritt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Isolierung der Substanz, die die Mutagenität inhibiert,
und ihre Reinigung aus Kletten wird zuerst das Fremdmaterial,
das in dem Klettensaft enthalten ist, mittels Zentrifugieren
entfernt.
Der Klettensaft kann auf folgende Weise hergestellt werden.
Nach dem Waschen der Kletten mit Wasser werden sie in eine
Entsaftungsvorrichtung gegeben, die mit einem Filter
versehen ist, um den Hauptteil des faserförmigen Materials
zu entfernen und um frischen Saft herzustellen. Alternativ
kann ein Pulver aus getrockneten Kletten während einer ausreichend
langen Zeit in Wasser oder einer Phosphatpufferlösung
gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur suspendiert
werden oder während es mit einer Zermahlungsvorrichtung
zerrieben wird. Das Pulver aus getrockneten Kletten sollte
so fein wie möglich sein. Wenn man ein solches Pulver verwendet,
sollte der Saft bevorzugt hergestellt werden, indem
man das Pulver bei normalerweise etwa 20 bis etwa
85°C während etwa 2 bis 24 Stunden behandelt, während das
Pulver mit einer Mühle bzw. Zerreibevorrichtung vermahlen
wird.
Der so hergestellte Klettensaft wird zur Entfernung von
Fremdmaterial daraus zentrifugiert. Das Zentrifugieren
kann als übliches Zentrifugieren bei 7000-15 000×G
durchgeführt werden. Man kann jedoch auch eine Ultrazentrifugierung
bei 100 000-200 000×-G verwenden. Es ist weiterhin
möglich, zuerst die übliche Zentrifugierung und
dann eine Ultrazentrifugierung zu verwenden. Die übliche
Zentrifugierung wird normalerweise während 30 bis 60 Minuten
durchgeführt. Bei dem Zentrifugieren werden die Faserstoffe,
wie die Chloroplasten oder Mitochondrien, entfernt.
Andererseits wird das Ultrazentrifugieren bevorzugt
während normalerweise 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Bei
dieser Behandlung werden die Microsomen oder Ribosomen
entfernt.
Zu dem überstehenden Material, welches man nach Entfernen
des Fremdmaterials aus dem Klettensaft, wie oben beschrieben,
erhält, gibt man dann eine Phosphatpufferlösung. Wenn
der Saft hergestellt worden ist, indem man Klettenpulver
zu einer Phosphatpufferlösung gibt, ist es nicht erforderlich,
weitere Phosphatpufferlösung zuzugeben. Diese Ausführungsform
fällt ebenfalls unter die vorliegende Erfin
dung.
Als Phosphatpufferlösung verwendet man bevorzugt eine Lösung,
deren pH-Wert normalerweise im Bereich von etwa 6,5
bis etwa 7,5 liegt. Es ist weiterhin bevorzugt, eine Phosphatpufferlösung
zu verwenden, deren Konzentration normalerweise
etwa 1 bis 2 Mol beträgt. Eine solche Phosphatpufferlösung
wird bevorzugt in einer Menge von ½₀ bis
¹/₁₀₀ Vol.-Teilen, bezogen auf das überstehende Material,
zugegeben. Die Phosphatpufferlösung sollte bevorzugt in
einer solchen Menge zugegeben werden, daß die Konzentration
der Phosphationen, die in Form der Phosphatpufferlösung
zu dem überstehenden Material zugegeben werden,
etwa 10 bis etwa 400 mMol beträgt.
Als Salz, das zu der entstehenden Lösung für die Aussalzung
zugegeben wird, kann man wasserlösliche Metallsalze
oder Ammoniumsalze anorganischer Säuren verwenden. Beispiele
anorganischer Säuren sind Mineralsäuren, wie
Kohlensäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Als Alkalimetallsalze
oder Ammoniumsalze solcher anorganischen Säuren
sind normalerweise bevorzugt Kaliumcarbonat, Ammoniumsulfat,
Natriumsulfat, Kaliumphosphat, etc.; das wasserlösliche
Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz der anorganischen
Säure wird bevorzugt in einer Menge von etwa 30 bis
80 Gew.-%, bezogen auf das Gemisch aus überstehendem Material
und Phosphatpufferlösung, zugegeben.
Die so ausgesetzte Lösung, die einen Niederschlag enthält,
wird dann einer Behandlung unterworfen, bei der der Niederschlag
daraus abgetrennt wird. Für die Isolierung des
Niederschlags kann man verschiedene Methoden, wie ein
Filtrieren oder Zentrifugieren, verwenden. Die Filtration
kann bei atmosphärischem, verringertem oder superatmosphärischem
Druck durchgeführt werden. Die Isolierung des
Niederschlags erfolgt jedoch bevorzugt durch Zentrifugieren.
Das Zentrifugieren wird normalerweise bei den zuvor
erwähnten Bedingungen der üblichen Zentrifugiertechnik
durchgeführt.
Der bei der Isolierung erhaltene Niederschlag wird dann in
einer Phosphatpufferlösung (pH 6,5 bis 7,5) gelöst und als
Lösung der Dialyse unterworfen. Die Phosphatpufferlösung
wird bevorzugt in einer Menge von normalerweise etwa 5
bis 10 ml/g Niederschlag verwendet. Obgleich die Dialyse
gegenüber Wasser oder einer Phosphatpufferlösung durchgeführt
werden kann, ist es im allgemeinen bevorzugt, die
letztere zu verwenden.
Die Dialyselösung, aus der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht
durch Dialyse entfernt worden sind, wird dann
der Ultrafiltration unterworfen. Die Konzentration der
Dialyselösung findet durch Ultrafiltration statt. Es ist
bevorzugt, daß die Ultrafiltration weitergeführt wird, bis
das Volumen der Dialyselösung ¹/₃ bis ¹/₅ des ursprünglichen
Volumens beträgt. Als Filter, die bei der Ultrafiltration
verwendet werden können, können z. B. erwähnt werden
PM-30, XM-50, XM-100 und XM-300 (hergestellt von
Amicon Far East Ltd.). Von diesen ist die Ultrafiltrationsmembran
XM-300 besonders bevorzugt, durch die Moleküle mit
Molekulargewichten unter etwa 300 000 hindurchgehen.
Die konzentrierte Lösung, die man so erhält, nachdem die
Ultrafiltration durchgeführt wurde, enthält die erfindungsgemäße
aktive Fraktion. Diese konzentrierte Lösung
kann ebenfalls gegebenenfalls nach einem üblichen Lyophilisierungsverfahren
pulverisiert werden.
Wenn die konzentrierte Lösung der Lyophilisierung unterworfen
wird, ist es bevorzugt, daß Wasser in etwa der 3-
bis 5fachen Volumenmenge zu der Lösung zugegeben wird und
daß darauf die Lösung erneut einer Ultrafiltration unterworfen
wird, bevor die Lyophilisierung durchgeführt wird.
Die den desmutagenen Faktor enthaltende, aktive Fraktion
in Form einer konzentrierten Lösung oder eines Pulvers und
in gereinigtem Zustand, die erfindungsgemäß zur Verfügung
gestellt wird, wird als solche Menschen oder Säugetieren,
ausgenommen Menschen, oder nachdem sie mit geeigneten
pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Adjuvantien vermischt
worden sind, verabreicht.
Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung,
die die erfindungsgemäße aktive Fraktion zusammen
mit einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Träger
oder Adjuvans enthält, oder ein Arzneimittel, das die Zusammensetzung
enthält. Als Träger oder Adjuvantien können
alle die verwendet werden, die dem Fachmann geläufig sind,
wie Arzneimittelträgerstoffe, Schmiermittel, Desintegratoren,
Beschichtungsmittel für Kapseln, usw. Das Arzneimittel
kann in Form von Tabletten, Granulaten, mit Zucker
überzogenen Pillen, Pulvern, Sirupen, Lösungen oder
Kapseln vorliegen.
Wenn die erfindungsgemäße aktive Fraktion in einer der
zuvor angegebenen Formen vorliegt, wird sie bevorzugt oral
verabreicht. Die erfindungsgemäße aktive Fraktion kann
ebenfalls extern (z. B. durch Anwendung auf die Haut) verabreicht
werden. In diesem Falle ist es bevorzugt, sie in
Form einer Salbe, z. B. einer, bei der ein öllösliches
Grundmaterial, wie Wachs, verwendet wird, oder in Form einer
Wasser enthaltenden Emulsion oder einer wäßrigen Lösung
zu verwenden.
Säugetieren wird die pharmazeutische Zubereitung verabreicht.
Sie ist besonders für Tiere, die gegenüber der
Mutagenität empfänglich sind, geeignet. Die Dosismenge
kann auf geeignete Weise entsprechend den zu behandelnden
Tieren von Spezialisten, wie Ärzten und Pharmazeuten,
bestimmt werden. Sie beträgt im allgemeinen etwa 100 mg
bis 2,5 g/kg Körpergewicht/Tag.
Wie aus der Tatsache folgt, daß die erfindungsgemäße aktive
Fraktion eine Komponente ist, die in Kletten enthalten
ist, welche als Nahrungsmittel gegessen werden, ist sie
praktisch frei von Toxizität.
Der Ausdruck "Tiere, die gegenüber der Mutagenese empfänglich
sind" bedeutet solche Tiere, die ein Mutagen mit der
Nahrung aufgenommen haben oder in Kontakt mit einem Mutagen
gekommen sind oder von denen man erwarten kann, daß
sie ein Mutagen mit der Nahrung aufnehmen oder in Kontakt
mit einem Mutagen kommen.
Die durch Lyophilisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltene aktive Fraktion wird zweckdienlich zur
Herstellung von irgendeiner Form von Arzneimittel verwendet.
Sie ist ein wasserlösliches und stabiles, braunes
Pulver, welches von Verfärbungen frei ist und ihre Lagerungsstabilität
ist extrem gut.
Entsprechend unseren Untersuchungen wird angenommen,
daß die desmutagene Aktivität der aktiven erfindungsgemäßen
Fraktion auf solche Weise manifestiert wird, daß
sie die Mutagenität, die durch die Mutagene inhibiert
wird, inhibiert, indem sie direkt auf die Mutagene wirkt.
Die erfindungsgemäße aktive Fraktion wird somit bevorzugt
präventiv besonders solchen Säugetieren verabreicht, von
denen man erwartet, daß sie Mutagene mit der Nahrung aufnehmen,
oder solchen Tieren, von denen eindeutig bekannt
ist, daß sie Mutagene mit der Nahrung aufgenommen haben.
Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren zur Isolierung
und Reinigung der aktiven Fraktion gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren, wie auch die desmutagene Aktivität
der aktiven Fraktion und ihre anderen Eigenschaften.
5000 g Kletten werden mit Wasser gewaschen und dann in
einem Entsafter
zerkleinert. Man erhält etwa 3400 ml Klettensaft.
1400 ml dieses Saftes werden bei 9000×G während 30 min
zentrifugiert. Man erhält 2200 ml einer klaren, braunen,
überstehenden Lösung.
½₀ Volumenmenge einer 1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8)
wird mit dieser überstehenden Lösung vermischt, danach
wird das Gemisch ausgesalzt, indem man zu 1100 ml des Gemisches
80 Gew.-% eines Gemisches aus Ammoniumsulfat zugibt.
Das ausgesalzte Gemisch wird dann 15 min bei
9000×G zentrifugiert. Man erhält 80 g eines Niederschlags.
60 g dieses Niederschlags werden in einer 50 mMol Phosphatpufferlösung
(pH 6,8) gelöst und auf 600 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird bei 4°C gegenüber der zuvor erwähnten
Phosphatpufferlösung (pH 6,8) dialysiert. Man erhält
696 ml Dialyselösung.
464 ml dieser Dialyselösung werden dann auf ¹/₃ ihres ursprünglichen
Volumens konzentriert, indem man sie einer
Ultrafiltration unterwirft und ein Membranfilter XM-300
verwendet. Die
konzentrierte Lösung wird auf 200 ml durch Zugabe einer
50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,8) aufgefüllt und sie wird
erneut durch Ultrafiltration konzentriert, indem man das
gleiche Filter, wie zuvor erwähnt, verwendet. Man erhält
140 ml einer konzentrierten Lösung.
Von der bei der Ultrafiltration erhaltenen, konzentrierten
Lösung werden 70 ml bei -54°C während 24 h unter Verwendung
einer Lyophilisiervorrichtung
lyophilisiert. Man erhält 450 mg
trockenes Pulver.
Fig. 1 zeigt die ultraviolette Absorptionskurve, die man erhält,
indem man die Messungen, die mit einer wäßrigen
Lösung des lyophilisierten Pulvers durchgeführt wurden,
graphisch aufträgt. In Fig. 1 ist die Absorption auf der
Ordinate aufgetragen und die Wellenlänge (nm) ist auf
der Abszisse aufgetragen. Aus Fig. 1 folgt, daß die erfindungsgemäße
Fraktion einen Absorptionswellenlängenpeak
im Bereich von 280 bis 300 nm (maximale Wellenlänge etwa
290 nm) aufweist.
27 ml der gemäß dem obigen Verfahren (1) erhaltenen, konzentrierten
Lösung werden an einer Säule aus DEAE-Cellulose
(eine Anionenaustausch-Cellulose) bei folgenden Bedingungen:
Säulengröße=2,5×12 cm, Eluierungsrate=36 m/h
und Menge an eluiertem Material=10 ml/Reagenzglas
chromatographiert. Die Adsorption wird geprüft, indem
man die Eluierung unter Verwendung einer Eluierungspufferlösung,
nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung, durchführt,
in der man Kaliumchlorid mit einem Konzentrationsgradienten
im Bereich von 50 mM bis 2 M gelöst hat. Fraktionen,
die eine Hemmaktivität aufweisen, werden bei den
Fraktionen nicht nachgewiesen, die eluiert wurden, ohne
daß sie an der DEAE-Cellulose-Säule adsorbiert worden sind.
7 ml der konzentrierten Lösung werden auf ähnliche Weise
an einer Säule aus CM-Cellulose (Kationenaustausch-
Cellulose) bei den folgenden Bedingungen chromatographiert:
Säulengröße=2,5×7 cm, Eluierungsrate=40 ml/h, Menge
an eluiertem Material=5,8 ml/Reagenzglas. Die Adsorption
wird geprüft, indem man die Eluierung unter Verwendung einer
Eluierungspufferlösung, nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung,
durchführt, in der man Kaliumchlorid mit einem
Konzentrationsgradienten im Bereich von 50 mM bis
0,1 M gelöst hat.
Die gesamte Lösung wird eluiert, ohne daß sie an der CM-
Cellulosesäule adsorbiert wurde. Eine Eluierungskurve,
wie sie in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt
ist, wird erhalten. Wird die eluierte Fraktion auf ihre
Inhibitorwirkungen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren
geprüft, so stellt man fest, daß die desmutagene Rate
88% beträgt. Dieser Wert ist etwa der gleiche (87,4%) wie
der einer wäßrigen Lösung eines trockenen Pulvers (87,4%),
die 12 mg/ml trockenes Pulver enthält, in einer Menge von
500 µl/Platte, wie aus der folgenden Tabelle 2 folgt. Aus
den bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnissen ist weiterhin
erkennbar, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion
ein Polyelektrolyt ist, der eine starke anionische Base
enthält.
(a) Der Test zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen
wird auf folgende Weise durchgeführt. Zu einer Lösung
des Mutagens in 0,02 ml Dimethylsulfoxid gibt man 0,5 ml
einer Fraktion, die man bei jeder der Stufen des obigen
Verfahrens (1) erhalten hat, oder die Endfraktion (die
aktive erfindungsgemäße Fraktion). Danach erfolgt die Reaktion
bei 37°C während 30 min. Zum Vergleich wird die
Reaktion auf gleiche Weise, aber unter Verwendung von
0,5 ml Phosphatpufferlösung anstelle der verschiedenen
Fraktionen durchgeführt. Die Reaktionsgemische werden dann
durch Erhitzen bei 100°C während 10 min sterilisiert. Nach
Beendigung der Wärmebehandlung werden 3 ml weicher Agar
(0,6% Difco Agar) und 0,1 ml einer Suspension von Salmonella
TA 98 (Histidin, erfordernd His-) zugegeben und die
Gemische werden dann auf das zuvor beschriebene, selektive
Agarmedium ausgegossen. Die Züchtung erfolgt bei 37°C während
2 Tagen. Danach werden die Kolonien aus Revertanten
(Histidin, die kein His⁺ erfordern) gezählt.
Wird ein Mutagen verwendet, das Mutagenität nur bei der
Metabolisierung zeigt, wie 2-Aminoanthracen, Äthidiumbromid,
Trp-P-1 oder Trp-P-2, erfolgt der Test auf gleiche
Weise, aber nach der Zugabe zu den zuvor erwähnten 0,3 ml
weichem Agar eines S-9-Gemisches, welches wie im folgenden
beschrieben hergestellt wird. Zur Bestätigung wird
SD Rattenleber verwendet, ein Leberhomogenat, dessen meta
bolische Enzymaktivität durch PCB verstärkt wurde und welches
unter Bildung einer Lebermicrosomfraktion (S-9) zentrifugiert
wurde. Das S-9-Gemisch wird dann hergestellt,
indem man zu dem Lebermicrosom, die man so erhält, anorganische
Salze in den folgenden Mengen zugibt.
Anorganische Salze, die zu dem S-9-Gemisch zugegeben werden:
Lebermicrosom 3 ml
0,25 M Phosphatpufferlösung 4 ml
0,16 M MgCl₂ 0,5 ml
0,66 M KCl 0,5 ml
0,05 M G-6-P 1,0 ml
0,04 NADP 1,0 ml
Zusammensetzung des selektiven Agarmediums:
MM (X20) 50 ml
40% Glucose 10 ml
0,8% Difco Nährbrühe 10 ml
Biotin (100 µg/ml) 1 ml
Agar 15 ml
destilliertes Wasser930 ml
Zusammensetzung von MM (X-20):
(NH₄)₂SO₄ 2,0%
KH₂PO₄ 20,0%
MgSO₄ · 7H₂O 0,2%
Natriumcitrat 1,0%
pH 7,0 mit KOH
Die Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität der
Mutagene wird auf die zuvor beschriebene Weise geprüft.
Nimmt man die Menge (ml) der Fraktion, die für die Inhibierung
von 50% der Mutagenität erforderlich ist, so wird
die Aktivität auf Grundlage der Menge (mg) Protein, die
pro Einheitsvolumen (ml) der Fraktion vorhanden ist, an
gegeben.
(b) Inhibierung der Mutagenität von 2-Nitro-p-
phenylendiamin (80 µg/Platte)
In Tabelle 2 ist der Einfluß der Konzentration auf die
desmutagene Wirkung des trockenen Pulvers (erfindungsgemäße
aktive Fraktion) angegeben.
Aus den Ergebnissen der Tabelle 2, die den Einfluß
der Konzentration der erfindungsgemäßen aktiven
Fraktion auf die Inhibitorwirkung zeigt, ist erkennbar,
daß die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wenn 2-Nitro-
p-phenylendiamin verwendet wird.
Tabelle 3 zeigt die Inhibitorwirkungen der erfindungsgemäßen
aktiven Fraktion (letzte Fraktion) bei verschiedenen
Mutagenen.
Aus den Ergebnissen der Tabelle 3 folgt insbesondere, daß
die erfindungsgemäße aktive Fraktion bemerkenswerte Inhibitorwirkungen
zeigt. Das heißt, daß der Inhibitorfaktor,
der in den Säften von Kohl und Broccoli vorhanden ist,
Pflanzen, die in der zuvor erwähnten Literaturstelle beschrieben
werden, nur Inhibitorwirkungen zeigt, wenn er
mit solchen Mutagenen verwendet wird, die Mutagenität
zeigen, nachdem sie metabolisiert wurden (Äthidiumbromid,
2-Aminoanthracen, Trp-P-1 und Trp-P-2), aber
keine Inhibitorwirkungen, wenn er mit einem Teil der Oxidationsfarben
verwendet wird, der Mutagenität
zeigt, ohne metabolisiert zu sein (z. B. 2-Nitro-p-phenylendiamin
oder 2-Nitro-o-phenylendiamin). Dies zeigt, daß die
erfindungsgemäße Fraktion, wie aus Tabelle 3 folgt, eine
bemerkenswerte Inhibitorwirkung nicht nur, wenn sie zusammen
mit der ersteren Klasse der Mutagene verwendet wird,
sondern selbst, wenn sie mit der letzteren Klasse zusammen
verwendet wird, aufweist. Ihre Funktion und Wirkungen sind somit
überraschend einzigartig.
Als nächstes wird die Wärmebeständigkeit der erfindungsgemäßen
Endfraktion geprüft. 500 ml der erfindungsgemäßen
Endfraktion (eine wäßrige Lösung eines lyophilisierten
Pulvers) werden 15 min auf 100°C unter Rückfluß erhitzt
und abgekühlt. 500 ml einer wäßrigen Lösung der Endfraktion,
die nicht in der Wärme behandelt worden ist, werden
mit den verschiedenen Mutagenen mit den in Tabelle 4 angegebenen
Konzentrationen vermischt. Danach werden die
Gemische 30 min bei 37°C umgesetzt. Danach wird der Test
zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen, wie in (5) oben
angegeben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind
in Tabelle 4 angegeben.
Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, daß die erfindungsgemäße
Endfraktion bzw. letzte Fraktion gegenüber Wärme
stabil ist und durch diese nicht entaktiviert wird und
daß sie weiterhin zufriedenstellende Inhibitorwirkungen
aufweist.
Die Stabilität der Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines
lyophilisierten Pulvers) gegenüber proteolytischen
Enzymen wird ebenfalls geprüft. Als proteolytische Enzyme
werden DNase 1 (ein Enzym, welches DNA abbaut), RNase
(ein Enzym, welches RNA abbaut) und Pronase (ein Enzym,
welches verschiedene Proteine abbaut) verwendet.
Sie werden jeweils
zu der Endfraktion in solcher Menge zugegeben, daß die
Endkonzentration etwa 20 µg/ml beträgt, und das Gemisch
wird dann 30 min bei 37°C umgesetzt.
Diese Reaktionsprodukte (500 µl) werden dann mit den in
Tabelle 5 aufgeführten Mutagenen vermischt, die die darin
angegebenen Konzentrationen aufweisen. Die Gemische werden
30 min bei 37°C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion
wird der Versuch zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen,
wie oben unter (5) beschrieben, durchgeführt. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfindungsgemäße
Endfraktion, die gegenüber den proteolytischen
Enzymen extrem stabil ist, durch diese nicht entaktiviert
wird und weiterhin zufriedenstellend Inhibitorwirkungen
manifestiert.
Die Stabilität der erfindungsgemäßen Endfraktion gegenüber
verschiedenen mehrwertigen Metallionen oder Protein-
Denaturierungsmitteln wird ebenfalls geprüft.
Magnesiumchlorid, Manganchlorid und Calciumchlorid werden
jeweils vermischt und gelöst, so daß die Konzentration
(Endkonzentration) in der entstehenden Lösung 10 mM an
erfindungsgemäßer Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines
lyophilisierten Pulvers) beträgt. Andererseits wird im
Falle von EDTA, einem Protein-Denaturierungsmittel, die
Mischung und Lösung davon auf solche Weise durchgeführt,
daß die Konzentration 2,5 mM beträgt, während sie im Falle
von SDS (Natriumdodecylbenzolsulfonat), ebenfalls einem
Protein-Denaturierungsmittel, die Mischung und Lösung so
durchgeführt wurde, daß ihre Konzentration 0,1% beträgt.
Die verschiedenen Lösungen werden dann 30 min bei 37°C
behandelt.
Danach werden die Reaktionsgemische (500 µl) mit den in
Tabelle 6 aufgeführten Mutagenen bei den angegebenen
Konzentrationen vermischt, und anschließend erfolgt die
Reaktion bei 37°C während 30 min. Nach Beendigung der Reaktion
werden die Reaktionsprodukte auf ihre Inhibitorwirkungen,
wie oben bei (5), untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfindungsgemäße
Endfraktion einzigartige Eigenschaften besitzt
und daß sie gegenüber Protein-Denaturierungsmitteln und
Magnesiumchlorid und Calciumchlorid extrem stabil ist
und bei der Einwirkung von Manganchlorid eine große Abnahme
in ihrer desmutagenen Aktivität zeigt.
Die erfindungsgemäße Endfraktion ist somit, wie aus den
verschiedenen obigen Ergebnissen folgt, ein Polyelektrolyt
mit einem Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von
280 bis 300 nm und einer starken anionischen Base. Sie ist
eine antimutagene Substanz mit hoher Inhibitorwirkung, die
die Mutagenität von vielen Mutagenen inhibiert und insbesondere
von solchen Mutagenen, die Mutagenität manifestieren,
ohne daß sie metabolisiert worden sind. Ihre Inhibitoraktivität
ist gegenüber Wärme stabil und zeigt im wesentlichen
keine Abnahme durch ein proteolytisches Mittel,
nimmt jedoch durch Manganionen sehr stark ab.
Claims (9)
1. Eine aus Kletten erhaltene aktive Fraktion, die
bei der Inhibierung der Mutagenität Aktivität aufweist,
erhältlich durch die Anzahl und Reihenfolge der folgenden
Verfahrensschritte:
- a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
- b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Niederschlags;
- c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
- d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Sub stanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.
2. Verfahren zur Herstellung einer aktiven Fraktion nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden
Stufen aufweist:
- a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
- b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nieder schlags;
- c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
- d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Phosphatpufferlösung in
einer Menge von ½₀ bis ¹/₁₀₀, ausgedrückt durch das
Volumen, mit der überstehenden Lösung, die nach Entfernen
des Fremdmaterials aus dem Klettensaft durch Zentrifugieren
erhalten wird, vermischt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als wasserlösliches Ammoniumsalz
einer anorganischen Säure Ammoniumsulfat verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man das wasserlösliche Alkalimetallsalz
oder Ammoniumsalz der anorganischen Säure in
einer Menge von etwa 30 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das
Gewicht des Gemisches aus überstehender Lösung und Phosphatpufferlösung,
zugibt.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man den gesammelten, ausgesalzten
Niederschlag in der Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis
von 5 bis 10 ml des letzteren/g des ersteren ver
mischt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Dialyse gegenüber einer
Phosphatpufferlösung durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Dialyselösung auf ¹/₃ bis
¹/₅ ihres ursprünglichen Volumens durch Ultrafiltration
konzentriert.
9. Pharmazeutische Zubereitung für die Inhibierung
der Mutagenität von Mutagenen, dadurch gekennzeichnet,
daß sie als wirksame Komponente die
Fraktion gemäß Anspruch 1 zusammen mit mindestens einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Adjuvans ent
hält.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US4986985A (en) * | 1987-11-02 | 1991-01-22 | Bar Ilan University | Method of treating skin virus infections |
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US4976838A (en) * | 1988-12-01 | 1990-12-11 | Allied-Signal Inc. | Method for purification of bases from materials comprising base and salt |
JP2549515Y2 (ja) * | 1991-05-21 | 1997-09-30 | オムロン株式会社 | 動作確認用押ボタン付き電磁継電器 |
US6440448B1 (en) | 1998-03-16 | 2002-08-27 | Joseph Intelisano | Food supplement/herbal composition for health enhancement |
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CN107488598B (zh) * | 2017-09-12 | 2021-01-05 | 山东农业大学 | 一种牛蒡基蛹虫草菌丝体及其制备方法 |
CN109280691A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-01-29 | 吉林农业科技学院 | 大千生不同部位总黄酮对大肠杆菌的体外抑制作用的研究方法 |
Family Cites Families (2)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FoeldeAk, S. Dombradi, G.A., Acta Phys. et Chem. Szeged, 10, S. 91-93, (1964) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10223486A1 (de) * | 2002-05-27 | 2003-12-11 | Beiersdorf Ag | Kosmetische und/oder dermatologische Zubereitung mit 2,3-Dibenzylbutyrolactonen |
Also Published As
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GB2074447A (en) | 1981-11-04 |
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