DE3010972A1

DE3010972A1 - Verfahren zur herstellung von mindestens 120ie/cm hoch 3 heparin und daneben nur wenig fette und sonstige verunreinigungen enthaltenden waessrigen auszuegen, insbesondere organauszuegen, konstanter zusammensetzung

Info

Publication number: DE3010972A1
Application number: DE19803010972
Authority: DE
Inventors: Laszlo Dr Czebe; Pal Gere; Janos Illes; Gyoergy Kerey; Erzsebet Nezmelyi; Peter Rudolf; Istvan Dr Takacs
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1979-03-21
Filing date: 1980-03-21
Publication date: 1980-10-02
Also published as: FR2451744B1; ES490537A0; BE882369A; AU533021B2; NL8001693A; SE453725B; AU5663780A; YU76980A; SE8002125L; AU5663680A; AR219226A1; DD149532A5; JPS55164202A; ZA801564B; AT368004B; BE882370A; CS248011B2; DK119480A; DK166504C; PL222906A1

Description

DR. STEPHAN G. BESZEDES PATENTANWALT

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DACHAU BEI MDNCHEN

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P 1 325

Beschreibung
zur Patentanmeldung

RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR R.T.
Budapest, Ungarn

betreffend

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Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 IE/ctjt/ Heparin und daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 IE/cnr Heparin und daneben nur wenig Fette

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und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung durch mit einem wäßrigen Medium im Gegenstrom vorgenommene Extraktion von festen heparinhaltigen Rohstoffen.

Es ist bekannt, daß das Aufarbeiten von heparinhaltigen tierischen Organen zur Gewinnung des Heparines ein komplizierter und mit hohem Aufwand verbundener Vorgang, der mehrere Extraktionsstufen verschiedener Zweckbestimmung umfaßt, ist. Der Extraktionsvorgang ist eigentlich von der Art des Sammelns und Konservierens der heparinhaltigen Organe nicht zu trennen, da diese Arbeitsgänge die technische beziehungsweise industrielle Durchführbarkeit und die Ausbeute des Extraktionsverfahrens entscheidend beeinflussen. Die Extraktionsstufen bei der Gewinnung von Heparin erfordern viel Zeit und auch ihre Reproduzierbarkeit ist unsicher. Deswegen sind, wie sowohl das Fachschrifttum als auch das Patentschrifttum zeigen, zahlreiche Versuche gemacht worden, den die Wirksamkeit und die Wirtschaftlichkeit der ganzen Heparinhersteilung bestimmenden Extraktionsvorgang zu verbessern.. Ziel der Extraktion ist es offensichtlich, den nach dem Sammeln und Lagern der verschiedenen Organrohstoffe in diesen noch vorhandenen Heparingehalt möglichst vollständig herauszulösen, wobei das Verfahren den Wirkstoff nicht schädigen, keine Zersetzung herbeiführen soll. Ein weiteres Ziel ist es, aus der im Extraktionsverfahren erhaltenen wäßrigen Heparinlösung in wenigen Stufen Heparin der im Arzneimittelbuch festgelegten Qualität in guter Ausbeute herzustellen. Dazu ist es erforderlich, daß die Heparinextraktionsbrühe möglichst wenig mit die Reinigung erschwerenden heparinoiden fiebererzeugenden beziehungsweise pyrogenen Färb- und Polypeptidsubstanzen verunreinigt ist. Zur Erreichung einer möglichst selektiven Extraktion des Heparines ist zu berücksichtigen, daß die im

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Organauszug vorliegenden sonstigen Bestandteile (Fette, Lipoide, Eiweiße, Peptide und anorganische Salze) die Isolierbarkeit des Heparines verschlechtern, die Ausbeute verringern und verfahrenstechnische beziehungsweise technologische Probleme verursachen und wegen ihrer Gegenwart das Endprodukt nicht immer von sämtlichen Begleitstoffen völlig gereinigt werden kann. Von den genannten Zielen können mit den bekannten Rohstofftypen und Extraktionsverfahren nicht immer alle optimal verwirklicht werden.

Bei der Extraktion heparinhaltiger tierischer Organe werden in der Praxis 3 verschiedene Gruppen von Verfahren, die im folgenden kurz beschrieben werden, angewandt.

Der prinzipielle Aufbau der ersten Gruppe von Extraktionsverfahren stimmt mit dem von Charles und Scott (J. Biol. Chem. 102 [1933], 425) vorgeschlagenen Verfahren überein. Charakteristisch für diese Gruppe von Verfahren ist es, daß zur Extraktion, zum Zellenaufschluß der zerkleinerten, meistens tiefgekühlten heparinhaltigen Organe auch die eigenen hydroIysierenden Enzyme der überlebenden Gewebe genutzt werden (Autolyse). Das Material wird längere Zeit autolysiert, dann werden zur Vervollständigung der Extraktion schwach alkalische Salzlösungen zugesetzt und das Gemisch wird zum Sieden erhitzt. Verfahren auf der Grundlage der Autolyse sind zum Beispiel in den US-Patentschriften 2 571 697 und 2 797 184 beschrieben. Kombinationen der Autolyse mit weiteren Extraktionsstufen bilden die Gegenstände der US-Patentschriften 2 884 358 und 3 016 331.

Die Nachteile der auf die Autolyse gegründeten Extraktionsverfahren sind in der ungarischen Patentschrift

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776 und in der US-Patentschrift 2 587 924 beschrieben. Die Nachteile sind, wie experimentelle Erfahrungen zeigen, auf mehrere Gründe zurückzuführen:

A) Auch wenn angenommen wird, daß sich während der Extraktion zwischen der Extraktionslösung und den zu extrahierenden Organen ein Gleichgewichtszustand einstellt, muß wegen des hohen Wassergehaltes der Organe mit einem beträchtlichen Heparinverlust gerechnet werden. Mit dem Entfernen des extrahierten Organes aus dem System wird zwangsläufig auch Flüssigkeit (Heparinlösung) aus dem System entfernt. Da der Autolysegrad nicht an allen Stellen der gleiche ist, stellt sich der Gleichgewichtszustand zwischen der Extraktionsflüssigkeit und dem Organ nicht überall ein, das heißt, daß die tatsächlichen Verluste noch größer sind.

B) Während der der Autolyse vorangehenden Lagerung und während der Autolyse vermehren sich die das Heparin schädigenden Mikroorganismen, was zu einer Verminderung der Ausbeute führt und auch in sonstigen Hinsichten Fiebererzeugung([Pyrogenität] und Toxizität) nachteilig ist.

C) Eines der Hauptprobleme der Autolyseverfahren ergibt sich aus dem Sammeln der Organe und hierauf ist die unsichere Zusammensetzung des erhaltenen Auszuges zurückzuführen. Wegen der großen Volumina sind in dieser Phase der Aufarbeitung auch große Vorrichtungen erforderlich. Technisch beziehungsweise industriell durchführbar ist das Verfahren nur dann, wenn das Volumen bis zur

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Erzielung eines 1 t>is 10 Gew.-% Heparin enthaltenden Zwischenproduktes verringert werden kann. Wegen der Schwankungen in der Zusammensetzung schwankt auch die Qualität des erhaltenen Produktes, eine wirtschaftliche Aufarbeitung ist nur schwer möglich.

Das Wesen der zweiten Gruppe von Extraktionsverfahren besteht darin, daß der Wirkstoffgehalt der heparinhaltigen Organe nur mittels Chemikalien aufgeschlossen und als Heparin oder Heparin/Eiweiß-Komplex in Lösung gebracht wird. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in den ungarischen Patentschriften 148 776 und 149 339, der britischen Patentschrift 992 201 und den US-Patentschriften 2 623 001, 3 058 884 und 3 262 854 beschrieben. Auch bei dieser Gruppe von Verfahren ist es nachteilig, daß die einen hohen Wassergehalt aufweisenden Organrückstände aus dem System entfernt werden müssen, wobei je nach dem organischen Trockensubstanzgehait des Extraktionsrückstandes Heparinverluste von 20 bis 40 Gew.-% auftreten (siehe das Beispiel 1 der ungarischen Patentschrift 148 776 sowie die britische Patentschrift 992 201). Auch bei dieser Gruppe von Verfahren verursachen die Zusammensetzungsschwankungen Unzulänglichkeiten beziehungsweise Unannehmlichkeiten, wie schwankende Auszugzusammensetzungen und die mangelnde Reproduzierbarkeit der folgenden Aufarbeitungsstufen. Wegen dieser Schwierigkeiten wird zum Beispiel gemäß der US-Patentschrift 2 623 001 nach dem Aufschluß mit einem großen Volumen eine langwierige Dialyse vorgenommen. Im Verfahren gemäß der US-Patentschrift 2 262 854 besteht der Zwang, in den mit den größten Volumina vorgenommenen Phasen der Extraktion organische Lösungsmittel einzusetzen·

Bei den beiden beschriebenen Gruppen von Verfahren, den autolytischen Verfahren und den nur mit chemischem

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Aufschluß arbeitenden Verfahren, ist es demnach nachteilig, daß "bei der Extraktion, die im allgemeinen wegen der Konsistenz der üblichen Rohstoffe nur eine 1- oder 2-stufige Gleichstromextraktxon sein kann, im Endergebnis an Heparin recht arme, im Durchschnitt nur iO bis 20 IE/cnr , das heißt etwa 0,01 Gew.-% Heparin und neben diesem viele Begleit- und Störstoffe enthaltende Lösungen erhalten werden. Anschaulich ausgedrückt ist es so, daß um 1 000 MT^-R (6,5 kg) Heparin in Lösung zu bringen, die Extraktion mit einem Volumen von 50 000 bis 100 000 1 vorgenommen werden muß und der Heparinverlust mindestens 20 Gew.-% beträgt.

Bei der dritten Gruppe von Extraktionsverfahren werden die heparinhaltigen Organe zwecks Verminderung der Heparinverluste und Vermeidung der bei der Vorautolyse auftretenden Unsicherheiten nicht nur mit Chemikalien behandelt, sondern auch noch einer bis zur völligen oder fast völligen Auflösung führenden langwierigen und intensiven Proteolyse unterworfen, indem Enzyme, wie Trypsin, Pankreasextrakt, Papain beziehungsweise Elastase, in das System eingebracht werden. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in der ungarischen Patentschrift 147 323 und den US-Patentschriften 2 587 924, 2 989 438 und 3 817 924 beschrieben, während die US-Patentschriften 2 884 358 und 3 016 331 auf die Kombination von Autolyse und enzymatischer Proteolyse eingehen. Trotz der vorhandenen Vorteile wird doch die Wirtschaftlichkeit 'dieser Verfahren von dem mit den für die spezifische Menge der Organe erforderlichen proteolytischen Enzymen verbundenen Aufwand empfindlich berührt und es dadurch auch kompliziert. Auf 2 kg heparinhaltige Organe bezogen muß zum Beispiel bei einem der genannten Verfahren eine Menge von 1,5 bis 3 kg Pankreas beziehungsweise Pankreasrückstand zugesetzt werden.

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Bei Verringerung der spezifischen Enzymmenge werden die Proteolyse und der Filtriervorgang außerordentlich langwierig. Beim Verfahren nach der US-Patentschrift 3 817 831 dauert die mit Pepsin vorgenommene Proteolyse beziehungsweise Autolyse 24 Stunden und die mit Pankreatin vorgenommer..· Proteolyse beziehungsweise Autolyse 15 Stunden und anschließend wird 1-mal grob filtriert und nach 24 Stunden ultrafiltriert. Besonders nachteilig ist es, daß infolge des Zeitaufwandes bei den einzelnen Stufen die Infektionsgefahr durch Bakterien sich erhöht und durch die Gegenwart der mit den Enzymen eingebrachten abbauend wirkenden und die Glukosidbindungen des Heparines zersetzenden Enzyme der Heparinverlust vergrößert wird.

Infolge der völligen oder fast völligen Proteolyse gelangen auch die Begleitstoffe des Heparines, zum Beispiel Mucopolysaccharide, Nucleinsäurederivate, Farbstoffe, Fette und Lipoide, in Lösung und stören die schnelle und wirksame Aufarbeitung beträchtlich. Gemäß dem Beispiel 3 der US-Patentschrift 3 817 831 kommt in der Lösung B nach der Beendigung der Proteolyse und der Grobfiltration auf einen Heparingehalt von 0,027 Gew.-% ein Gesamttrockensubstanzgehalt von 10,35 Gew.-^, der also um 3 Größenordnungen höher ist. Aus diesem Grund bereitet auch die Ableitung der wirkstofffreien aufgearbeiteten Lösung in die Kanalisation Umweltschutzprobleme. Das Produkt der mit Proteolyse arbeitenden Verfahren ist eine außerordentlich verdünnte Lösung (6 bis 45 IE/cnr entsprechend 0,004 bis 0,03 Gew.-% Heparin); in konzentrierteren Lösungen kann wegen der auftretenden Substrathemmung beziehungsweise Substratinhibition keine Proteolyse vorgenommen werden.

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Der längste und komplizierteste Abschnitt des gesamten Herstellungsverfahrens ist das Herauslösen des Heparines aus den tierischen Organen und die gut reproduzierbar durchführbare Verminderung des Volumens der erhaltenen Lösung. Die Extraktion erfordert wegen der Proteolyse und der in mehreren Stufen durchgeführten physikalisch- -chemischen Maßnahmen viel Zeit und ist mit hohem Aufwand verbunden, weil wegen der sehr geringen Wirkstoffkonzentrationen Vorrichtungen mit großen Volumina angelegt und betrieben werden müssen. Bei der Extraktion mit Chemikalien beziehungsweise proteolytischen Enzymen fallen die Kosten dieser Stoffe sehr ins Gewicht. Die Reproduktion ist unsicher, da infolge der verschiedenen Sammel- und Lagerungsbedingungen der Wirkstoffgehalt innerhalb weiter Grenzen schwankt. Nachteilig ist ferner, daß die Aufarbeitbarkeit der in um mehrere Größenordnungen größeren Mengen vorhandenen Verunreinigungen ungünstig beeinflußt wird.

Die bei der Heparinherstellung üblichen Organsammelverfahren ermöglichen es demnach nicht, den nach der Lagerung noch verbliebenen Heparingehalt ohne nennenswerten Verlust in Form von reinem Heparin zu gewinnen. Die Extr-aktionsverfahren mußten der Qualität des Ausgangsmateriales angepaßt werden; dessen schwankende Qualität erfordert es, in den Extraktionsvorgang Arbeitsgänge, welche die Selektivität vermindern, die Kompliziertheit jedoch erhöhen, einzuschalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren zur Herstellung von Heparin enthaltenden Auszügen, insbesondere

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Organauszügen, durch Extraktion von heparinhaltigen Rohstoffen unter Verwendung eines wäßrigen Mediums mit einem Gehalt an einem Salz, welches einfacher ist, mit einer kürzeren Durchlaufzeit und mit geringeren Volumina durchgeführt werden kann, damit auch wirtschaftlicher ist, insbesondere mit einem geringeren Energie-, Chemikalien- und Arbeitskräfteaufwand verbunden ist, und eine bessere Selektivität hat, so daß ein Auszug, dessen Zusammensetzung konstant ist, der wenig störende Verunreinigungen enthält und dessen Wirkstoffkonzentration extrem hoch (mindestens 120 IE/cnr ) ist, erhalten wird, zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung optimal erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 ΙΕ/cm Heparin und daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung durch Extrahieren von heparinhaltigen Rohstoffen unter Verwendung von wäßrigen Lösungen von Salzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als heparinhaltiger Rohstoff ein 90 bis 95 Gew.-^ Trockensubstanz enthaltendes heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial von hoher spezifischer Oberfläche verwendet wird und dessen Extraktion mit der wäßrigen Lösung eines Salzes im Gegenstrom diskontinuierlich oder kontinuierlich bei für das jeweilige Aufarbeitungssystem und den jeweiligen Rohstoff optimalen Temperatur und pH-Werten durchgeführt wird-

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⁴*^m

Vorteilhaft wird die Gegenstromextraktion bei 20 bis 80⁰C durchgeführt.

Es ist auch vorteilhaft, die Gegenstromextraktion bei einem Elektrolytgehalt (Salzgehalt) von 1,5 bis 12,0 G_ew.-# durchzuführen.

Ferner wird vorteilhaft die Gegenstromextraktion bei einem pH-Wert von 8 bis 12,8 beziehungsweise in einer 0,25 bis 1,On, insbesondere 0,5 bis 1,0 n, Alkalilauge durchgeführt. Die Temperatur, die Elektrolytkonzentration und der pH-Wert werden zweckmäßig während des gesamten Extraktionsvorganges auf einem konstanten Wert gehalten.

Vorzugsweise wird während der Extraktion das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit (Salzlösung) zum zu extrahierenden Material auf einen einem zu erzeugenden Auszug mit einem Heparingehalt von mindestens I50 IE/cnr, insbesondere 150 bis 300 IE/cnr, entsprechenden Wert eingestellt. Dazu ist es zweckmäßig, das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit zur Trockensubstanz auf 3»5 : 1 bis 7 : 1_t insbesondere 4 : 1 bis 6:1, ganz besonders etwa 5 : 1, zu halten.

Als Salze beziehungsweise Elektrolyte können beliebige gegenüber Heparin inerte Salze, vorzugsweise Natriumchlorid, verwendet werden. Zum Einstellen des pH-Wertes können 1- oder mehrwertige Laugen, zweckmäßig Natriumhydroxyd oder sonstige bei der Heparinextraktion übliche Laugen, eingesetzt werden. Unter heparinreichem Rohmaterial ist ein Ausgangsmaterial, welches um 5 bis 35 Gew.-^ mehr Heparin, bezogen auf die Trockensubstanz, enthält als jedes natürliche Ausgangsmaterial, zu verstehen. So kann

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als Ausgangsrohmaterial das in der in der anderen der ungarischen Patentanmeldung RI-705 entsprechenden gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung der Anmelderin beschriebenen Weise hergestellte heparinreiche Trockenkonzentrat, welches körnig und amorph ist und eine hohe spezifische Oberfläche aufweist, verwendet werden. Das Wesen seiner Herstellung besteht darin, daß heparinhaltige tierische Organe erforderlichenfalls nach ihrer Zerkleinerung, in einem wäßrigen Medium 0,5 bis 15 Stunden lang bei 10 bis 50°C gelagert werden, aus der vorbehandelten Suspension bei 75 bis 10O°C ein wasserunlöslicher Heparin/Eiweiß—Komplex gefällt wird und dieser durch Fortsetzen des Erhitzens auf diese Temperatur aggregiert beziehungsweise zusammenballen gelassen wird und der ausgeflockte Niederschlag abgetrennt und, zweckmäßig bei weniger als 1OQ⁰C, zu einem krümeligen Produkt bis zum Erreichen eines Trockensubstanzgehaltes von 90 bis 95 Gew.-^ getrocknet wird. Vorteilhaft werden als heparinhaltige tierische Organe solche, welche zu einer Stückgröße von 4- bis 6 mm zerkleinert sind, verwendet. Es ist auch vorteilhaft» die tierischen Organe in Form einer wäßrigen Suspension mit einem Trockensubstanzgehalt von 1,5 bis 17 Gew.-% einzusetzen. Vorzugsweise werden die als Ausgangsmaterial verwendeten tierischen Organe in den meisten Fällen mit Wasser mit einer Temperatur von 18 bis 5O°G» insbesondere 36 bis 4-2⁰C, verdünnt. Es ist auch bevorzugt, die Vorbehandlung 2 bis 6 Stunden, insbesondere 4- bis 6 Stunden, bei 30 bis 50°C durchzuführen. Nach einer Ausführungsform der Herstellung des genannten Ausgangsmateriales des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Erhitzen der vorbehandelten Suspension auf

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75 bis 100 C in der Weise durchgeführt, daß sie in einem kontinuierlichen System in kurzer Zeit auf diese Temperatur gebracht wird und bei dieser Temperatur 2 bis 15 Minuten, insbesondere 2 bis 8 Minuten, wärmebehandelt wird. Gemäß einer Alternative zur letzteren wird das Erhitzen der vorbehandelten Suspension auf 75 bis 100⁰C in der Weise durchgeführt, daß diskontinuierlich gearbeitet wird sowie die Suspension in der kürzestmöglichen Zeit auf die Temperatur von 75 bis 100°C gebracht und bei dieser Temperatur mindestens 15 Minuten wärmebehandelt wird. Vorzugsweise wird die Abtrennung des gefällten Heparin/Eiweiß-Komplexes in einer mit der Schwerkraft arbeitenden mechanischen Trennvorrichtung mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 20 bis 25 Gew.-% durchgeführt, wobei das inaktive Filtrat verworfen wird. Es ist auch bevorzugt, als mechanische Trennvorrichtung eine solche mit sich ständig err suernder Eilterflache und insbesondere mit geschlossenem Dampfraum, zu verwenden. Vorteilhaft -wird die Trocknung kontinuierlich durchgeführt. Vorteilhaft können auch einzelne Stufen diskontinuierlich durchgeführt werden.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungs— gemäßen Verfahrens wird die Gegenstromextraktion diskontinuierlich bis zur Erschöpfung durchgeführt.

Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gegenstromextraktion kontinuierlich, vorzugsweise in einer in Zellen unterteilten Ü-Extraktjbnsvorrichtung, insbesondere unter Anwendung von Vibrationen oder anders ausgedrückt in einer pulsierenden U-Extrakt Ions vorrichtung, durchgeführt. Eine solche

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U-Extraktionsvorrichtung ist in der ungarischen Patentschrift 159 977 beschrieben. Sie ist also nicht nur zur Extraktion von Heilpflanzen, sondern auch zur erfindungsgemäßen Herstellung von wäßrigen Heparinextrakten mit hohem Wirkstoffgehalt gut geeignet. Die Extraktionsvorgänge in dieser Vorrichtung sind wie folgt: Sprühaufschluß im Gleichstrom, SprühvoraufSchluß, VoraufSchluß durch Herabtropfen, dann Vibrationsextraktion im Gegenstrom und schließlich Nachextrakt-i on durch Herabtropfen. Diese Vorrichtung ist aus Zellen aufgebaut und zwischen den einzelnen Zellen ist die Neigung der wäßrigen Auszüge, zurückzufließen und sich zu vermischen, stark gehemmt. Durch die Vibration wird das dem jeweiligen Augenblick zugehörige Extraktionsgleichgewicht wesentlich schneller erreicht. Dies hat den Vorteil, daß sowohl die auf das zu extrahierende Material bezogene Flüssigkeitsmenge als auch die Dauer der Extraktion und die Extraktionsweglänge bedeutend vermindert werden können.

Vorteilhaft wird die Gegenstromextraktion in einer einzigen Vorrichtung durchgeführt.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zusammengefaßt wie folgt:

: ' a) Bei den üblichen 1- oder 2-stufigen Gleichstromextraktionsverfahren zur Extraktion von Heparin ist es erforderlich, die Temperatur und den pH-Wert einem Programm entsprechend zu ändern beziehungsweise Chemikalien zuzusetzen. Die erfindungsgemäße Gegenstromextraktion kann dagegen

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in einer einzigen Vorrichtung in einem für das jeweilige System optimal gewählten wäßrig-alkalischen Medium als einfaches Herauslösen verwirklicht werden. Die Verfahrensbedingungen brauchen nicht geändert und Chemikalien brauchen nicht zugesetzt zu werden.

b) Bei der Gegenstromextraktion wird bei kurzer Verfahrensdauer ein praktisch fettfreier Auszug konstanter Zusammensetzung, der mindestens 5- bis 10-mal so konzentriert ist wie die mit üblichen Extraktionen erhaltenen Auszüge, in guter Ausbeute erhalten. Dies ist darauf zurückzuführen, daß das Verhältnis von Heparin zu Begleitstoffen wesentlich günstiger ist.

c) Die Durchführung der Gegenstromextraktion ist nicht an bestimmte Chemikalien gebunden. Es können immer die jeweils am besten zugänglichen Chemikalien verwendet werden.

d) Der Volumbedarf der Gegenstromextraktion

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beträgt jr bis -π* des Volumbedarfes der bekannten Verfahren. Der Heparinauszug fällt gleichmäßig, konzentriert und in geringem Volumen an. Die Volumkapazität der Vorrichtungen kann verringert und ihr Ausnutzungsgrad erhöht werden.

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e) Durch die Verringerung des Volumens wird eine beträchtliche Energie- und Arbeitseinsparung erzielt und es werden auch weniger Chemikalien benötigt.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß erfindungsgemäß durch Extraktion im Gegenstrom einen extrem hohen Heparingehalt aufweisende Auszüge konstanter Zusammensetzung hergestellt werden können und dabei der Zeitaufwand gering ist und die Volumina klein und daher die zu verwendenden Vorrichtungen einfach sind.

Bei Verwendung der in der ungarischen Patentschrift 159 977 beschriebenen U-Extraktionsvorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und beim Extrahieren bei 5O⁰G mit einer Extraktionslösung aus einer 0,5 bis 1,0 η Alkalilauge mit einem Natriumchloridgehalt von mindestens 5# bei einer Verweilzeit von 30 Minuten in der Extraktionsvorrichtung und bei Einstellung des Verhältnisses der Extraktionsflüssigkeit zum getrockneten Organkonzentrat auf etwa 5 s 1 wird der Wirkstoff praktisch quantitativ extrahiert. Das Organ- ;konzentrat quillt durch die Wasseraufnahme etwas auf, bewahrt jedoch seinen formbeständigen, körnigen Charakter und seine ausgezeichnete Filtrierbarkeit auch bei hohen Laugenkonzentrationen. Eine Erhöhung der Laugenkonzentration wirkt sich praktisch nicht auf die Menge des herausgelösten Feststoffes aus und auch die Menge der in Lösung gehenden Peptide und Eiweiße ist praktisch unverändert. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß in den die

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Hauptmenge des Trockenkonzentrates ausmachenden Eiweißen beim Trocknen irreversible Denaturationsvorgange ablaufen.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurden 5*0 kg gemäß dem Beispiel der anderen der ungarischen Patentanmeldung RI-705 entsprechenden gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung der Anmelderin hergestelltes heparinhaltiges Rohmaterial in 10 gleiche Teile geteilt. Diese Portionen von je 0,5 kg wurden den Vorschriften der diskontinuierlichen Extraktion im Gegenstrom entsprechend in 5 Extraktionsstufen aufgearbeitet. Die einzelnen Extraktionsstufen wurden wie folgt durchgeführt.

Die erste Portion des getrockneten Organkonzentrates wurde mit einer 4-0° C warmen 0,25 η Natronlauge mit einem Gehalt an 6 Gew.-% Natriumchlorid zu 3*2 1 Extraktionsgemisch angesetzt. Nach 20 Minuten wurde der Auszug mittels Vakuums durch ein Drahtsieb (Blücher-Trichter) filtriert. Die Filterfläche war ein Metallnetz mit Maschenweiten von 0,6 mm. Die erste Extraktionsbrühe wurde gesammelt und es wurde ihr Volumen gemessen und ihre Heparinaktivität bestimmt.

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Der auf dem Drahtsieb verbliebene nasse Organrückstand wurde erneut mit einer 40° C warmen 0,25 η Natronlauge mit einem Gehalt an 6 Gew.-% Kochsalz vermischt, wobei wieder ein Extraktionsvolumen von 3»2 1 eingestellt wurde. Die zweite Extraktion der bereits 1-mal extrahierten Organmasse wurde in der oben beschriebenen Weise durchgeführt. Das bei der zweiten Extraktion der ersten Portion des Organkonzentrates angefallene Filtrat wurde mit der zweiten Portion des getrockneten Konzentrates vermischt. Das Extraktionsvolumen wurde wieder auf 5,2 1 eingestellt.

Die folgenden Stufen waren sinngemäß die gleichen. Im Endergebnis wurde eine diskontinuierliche Gegenstromextraktion in 5 Stufen durchgeführt. Das Extraktionsvolumen betrug immer -3»2 1 und die Temperatur war stets 4O⁰C.

Das Volumen und die Heparinaktivität der gesammelten Auszüge sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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Tabelie

ο co O O O O co

Teil	Volumen des Filtrates	Insgesamt	Aktivität	Heparingehalt
Kr.	in	. in	in
	cm/³	IE/cm³	MIE
I	1 770	83	0,147
II	1 810	118	0,214
III	1 790	133	0,238
IV	1 750	140	0,245
V	1 800	143	0,257
VI	1 770	153	0,271
VII	1 800	153	0,275
VIII	1 780	152	0,271
IX	1 815	149	0,270
Χ/1	1 790	153	0,274
Χ/2	1 800	52,5	0,095
Χ/3	1 850	16,4	0,030
Χ/4	1 850	5,2	0,009
Χ/5	1 780	1,8	0,003
	2,599

No O

CO

CD CO

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Wie die Daten der obigen Tabelle zeigen, konnten aus 5,0 kg des 90,4- Gew.-^ Trockensubstanz enthaltenden als Ausgangsmaterial verwendeten Rohstoffes durch diskontinuierliche Extraktion in 5 Stufen 2,599 MIE Heparin gewonnen werden. Wie die einzelnen Stufen bei der Extraktion der zehnten Portion zeigen, war die Extraktion erschöpfend. Die Ausbeute war praktisch gleich der im folgenden Beispiel 2 (98,3# derselben).

Die Herstellung des als Ausgangsmaterial verwendeten heparinhaltigen Rohmateriales ist wie folgt durchgeführt worden:

Es wurde eine an einer Darmreinigungsinaschine angefallene einen-Trockensubstanzgehalt von durchschnittlich 6,3 Gew.-% aufweisende Dünndarmschleimhaut mit einer Förderpumpe in einem isolierten Rohrabschnitt in Strömung gehalten. In der Vorrichtung wurde die Verweilzeit auf 1,5 Stunden und die Temperatur auf 4-1⁰C eingestellt.

Die auf diese Weise autolysierte Suspension wurde mit Hilfe der in der der ungarischen Patentanmeldung RI-703 entsprechenden gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung der Anmelderin beschriebenen Vorrichtung kontinuierlich aufgearbeitet. Im Schnellerhitzer der Vorrichtung wurde die Suspension durch unmittelbares Einleiten von Dampf auf 90°C erwärmt und dann in einem der Vorrichtung zugehörigen wärmeisolierten spiralförmigen Rohrabschnitt bei schwacher Strömung 7»5 Minuten lang wärmebehandelt. Die koagulierenden Teilchen wurden mittels einer

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Austragspirale entfernt und auf einer Filtertrommel abgetrennt. Durch deren Austragspirale wurde der heparinhaltige Rohstoff kontinuierlich aus der Filtereinheit entfernt.

Das abgetrennte Produkt wurde über ein Dosiersystem in eine mit den Filtern in Verbindung stehende Trockenvorrichtung eingespeist. Die Trockenvorrichtung hatte die Form eines liegenden Zylinders, war innen mit Rührplatten beziehungsweise -blättern und Rollen ausgerüstet und wurde von außen mit Dampf und von innen mit heißer Luft geheizt. Die heiße Luft wurde in einem speziellen Lufterhitzer, in welchem aus der Umgebung angesaugte Luft durch Dampfheizung auf 142° C erhitzt wurde, erzeugt. Die Temperatur der austretenden feuchten Luft wurde auf 82 bis 88⁰C eingestellt.

Der Ausgangsstoff wurde mit einer Geschwindigkeit von 600 l/Stunde in die Vorrichtung eingespeist. Nach 6 Stunden langem Betrieb waren 178 kg fast fettfreies Produkt mit einer Mikroorganismenzahl von 10 bis 10 /g und einem Trockensubstanzgehalt von 90,4- Gew.-% hergestellt. Mindestens 80 Gew.-# des Produktes fielen in den Korngrößenbereich von 1,6 bis 0,2 mm. Das Produkt war bei Raumtemperatur unbegrenzt lagerbar.

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Beispiel 2

Der im Beispiel 1 verwendete Ausgangsstoff wurde in einer U-Extraktionsvorrichtung gemäß der ungarischen Patentschrift 159 977 im Gegenstrom kontinuierlich extrahiert·

Das getrocknete Rohmaterial wurde der Vorrichtung kontinuierlich mit einer Zuführschnecke zugeführt. Aus einem über der Zuführschnecke angebrachten Sprühkopf wurde das doppelte Volumen einer 7O⁰G wannen 0,55 ⁿ Natronlauge mit einem Natriumchloridgehalt von 6 Gew.-% zugesetzt. Das Material hatte in der Zuführschnecke eine Yerweilzeit von 10 Minuten.

Im Gegenstrom zum in den einzelnen Zellen der U-Extraktionsvorrichtung befindlichen gequollenen Material wurde eine 0,1 η Natronlauge mit einem Gehalt an " 6 Gew.-^ Kochsalz geführt. Während der kontinuierlichen Gegenstromextraktion wurde eine Temperatur von 50⁰C aufrechterhalten. Zur Verbesserung des Stoffaustausches wurde der am Boden der U-Extraktionsvorrichtung befindliche Vibrator eingeschaltet.

Das Volumen des kontinuierlich angefallenen hellstrohgelben, fast völlig klaren Auszuges wurde mit einem Rotameter gemessen. Die Heparinkonzentration wurde durch •ί-stündliche Probenahme bestimmt.

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Der Heparingehalt des Auszuges wurde ebenfalls kontinuierlich gefällt und der erhaltene Niederschlag wurde mittels eines Trommelfilters abgetrennt.

Die verwendete Vorrichtung hatte eine Kapazität von 10 kg Trockenkonzentrat je Stunde und die Verweilzeit betrug 35 Minuten. In 10-stündigem Betrieb ,wurden 210 1 Auszug mit einer durchschnittlichen Heparinaktivität von 252 IE/cnr* gewonnen. Auf 100 kg 90,4 Gew.-^ Trockensubstanz enthaltendes Ausgangsmaterial bezogen war das eine Ausbeute von 52,9 MIE.

Der extrahierte nasse Rückstand wurde auf seine Heparinaktivität untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Gegenstromextraktion mit Verlusten von weniger als 2 Gew.-% durchgeführt werden konnte.

Der Rückstand war infolge seines hohen Eiweißgehaltes als Viehfutter geeignet.

Vergleichsbeispiel A

Es wurde dasselbe gemäß dem Beispiel der anderen der ungarischen Patentanmeldung RI-705 entsprechenden gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung der Anmelderin hergestellte heparinhaltige Ausgangsmaterial wie im Beispiel 1 in an sich bekannter Weise autolysiert und in Gegenwart von Toluol mit Elektrolytlösungen extrahiert.

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3115 kg dieses Rohmateriales wurden zusammen mit 100 kg 18 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendem feingemahlenem Schweinedarm, 450 1 Wasser und 150 1 einer 10#-igen Ammoniumsulfatlösung in einem Duplikator kräftig gerührt. Nach dem Verrühren wurde das Gemisch auf 38⁰C erwärmt. Dann wurde unter Rühren der pH-Wert mit einer 40#-igen Natronlauge auf 8,8 bis 9>2 eingestellt. Um schädlich» mikrobiologischen Vorgängen vorzubeugen, wurden dem Gemisch 3 1 Toluol zugesetzt.

Nach dem Zusatz von Enzymen wurde bei 38°C 36 Stunden lang proteolysiert beziehungsweise autolysiert, wobei das Gemisch von Zeit zu Zeit aufgerührt wurde. Der pH-Wert wurde alle 6 Stunden kontrolliert und erforderlichenfalls durch Zugabe einer 40#-igen Natronlauge korrigiert.

Nach 36 Stunden langer Proteolyse beziehungsweise Autolyse wurde der pH-Wert mit einer 18#-igen Salzsäure auf 7»3 bis 7*7 eingestellt und das Gemisch aufgekocht. Nach 10 Minuten langem Erhitzen zum Sieden wurden die koagulierten T_eile auf einem Filtersieb abgetrennt. Das Piltrat wurde bei 60⁰C durch Separieren fettfrei gemacht.

Es wurden 638 1 dunkelbraune Extrakt brühe, deren Heparinkonzentration 18,1 IE/cnr betrug, was einer Gesamtmenge von 11,54 MIE Heparin entspricht, erhalten. Dies war eine Ausbeute von nur 70,4%, bezogen auf die im Beispiel 2.

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Vergleichsbeispiel B

Es wurde heparinhaltiges Trockenkonzentrat in der in der US-Patentschrift 3 817 831 beschriebenen Weise extrahiert, 40 kg Rohmaterial wurden in einem Duplikator mit 400 1 Wasser gründlich verrührt. Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 2,7 eingestellt und das Gemisch wurde auf 38⁰C erhitzt. Es wurde eine Pepsinmenge, die 10 kg Schweinemagenschleimhaut entsprach, zugesetzt und danach wurde der pH-Wert erneut auf 2,7 eingestellt. Unter ständigem Rühren wurde 20 Stunden lang proteolysiert und die Temperatur wurde auf 37 bis 39°C gehalten.

Nach 20 Stunden langer Proteolyse wurde der pH-Wert mit einer 40#-igen Natronlauge auf 8,0 eingestellt und dem Gemisch wurden bei 37°C 20 1 aktiviertes Pankreasgemisch zugesetzt. Die zweite Proteolyse dauerte 10 Stunden. Der pH-Wert wurde alle 2 Stunden kontrolliert und erforderlichenfalls mit Natronlauge erneut auf 8 eingestellt. Die Temperatur wurde auf 37°C gehalten. Nach der zweiten Proteolyse wurde das Gemisch zum Sieden erhitzt und dann durch ein Filtersieb filtriert. Es wurden 4-17 1 eines braunen Filtrates mit einer Heparinkonzentration von

32,0 iE/cnr , was einem Gesamtheparingehalt von 13,34- MIE entspricht, erhalten. Dies war eine Ausbeute ■von nur 64,2#, bezogen auf die im Beispiel 2.-

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Vergleichsbeispiel C

Das getrocknete heparinhaltige Ausgangsmaterial wurde gemäß der ungarischen Patentschrift 148 776 aufgearbeitet. Es wurden 14,2 kg Rohmaterial in einem Duplikat or mit 195 1 Wasser gründlich vermischt. Dann wurden 6,5 kg Kochsalz zugesetzt und der pH-Wert wurde mit einer 40#-igen Natronlauge auf 10 eingestellt. Unter gleichmäßigem Rühren wurde das Gemisch mit Dampf auf 65°0 erwärmt und bei dieser Temperatur mit Wasserstoffperoxyd behandelt. Dazu wurden vorangehend 250 cnr 40#-iges Wasserstoffperoxyd mit Wasser auf ein Volumen von 4 1 verdünnt und 1 1 dieser verdünnten Lösung wurde dem Gemisch zugesetzt. Die verbliebenen 3 1 wurden unter Aufrechterhalten der Temperatur von 65°C innerhalb 30 Minuten gleichmäßig zugegeben. Nach der Peroxydbehandlung wurde das Gemisch bei der gleichen Temperatur noch 1 Stunde lang gerührt und dann mit 600 g Ammoniumchlorid versetzt, wodurch sich ein pH-Wert von 8,7 einstellte. Mit dem Heizmantel des Duplikators wurde das Gemisch zum Sieden gebracht und es wurde 5 Minuten lang zum Sieden erhitzt, worauf der Rührer abgeschaltet wurde. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang absetzen gelassen. Die über den abgesetzten extrahierten Organrückständen überstehende hellgelbe völlig durchsichtige Flüssigkeit wurde durch einen an der Seite des Apparates befindlichen Stutzen dekantiert. Nach dem Dekantieren wurde das im Apparat verbliebene Gemisch aus Organrückständen und Flüssigkeit aufgerührt und dann durch ein Filtersieb mit einer Maschenweite von 0,8 mm filtriert.

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Die vereinigten Auszüge hatten ein Volumen von 168 1 und eine Heparinkonzentration von 32,4 IE/cm* _t was einer Gesamtmenge von 5|44- MIE Heparin entspricht. Das war eine Ausbeute von nur 73»7#» bezogen auf die im Beispiel 2.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 IE/cnr Heparin und daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung durch Extrahieren von heparinhaltigen Rohstoffen unter Verwendung von wäßrigen Lösungen von Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man als heparinhaltigen Rohstoff ein 90 bis 95 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendes heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial von hoher spezifischer Oberfläche verwendet und dessen Extraktion mit der wäßrigen Lösung eines Salzes im Gegenstrom diskontinuierlich oder kontinuierlich bei für das jeweilige Aufarbeitungssystem und den jeweiligen Rohstoff optimalen Temperatur und pH-Werten durchführt.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion bei.20 bis 80⁰C durchführt.

3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion bei einem Elektrolytgehalt (Salzgehalt) von 1,5 bis 12,0 Gew.-^ durchführt.

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4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch

gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion bei einem pH-Wert von 8 bis 12,8 beziehungsweise in einer 0,25 bis 1,On, insbesondere 0,5 bis 1,On, Alkalilauge durchführt.

5.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Extraktion das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit zum zu extrahierenden Material auf einen einem zu erzeugenden Auszug mit einem Heparingehalt von' mindestens 150 ΙΕ/cm entsprechenden Wert einstellt.

6.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion diskontinuierlich bis zur Erschöpfung durchführt.

7») Verfahren nach Anspruch 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion kontinuierlich, vorzugsweise in einer in Zellen unterteilten U-Extraktionsvorrichtung, insbesondere unter Anwendung von Vibratoren, durchführt.

8.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man die Gegenstromextraktion in einer einzigen Vorrichtung durchführt.

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