DE2459515C3

DE2459515C3 - Arzneimittelzubereitungen mit antidiabetischer Wirkung

Info

Publication number: DE2459515C3
Application number: DE19742459515
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr. 6000 Frankfurt Geiger; Hans-Hermann Dr. 6232 Bad Soden Schöne
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-12-17
Filing date: 1974-12-17
Publication date: 1982-02-11
Also published as: ATA278775A; DE2459515A1; AT341077B; DE2459515B2

Description

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Gegenstand der Erfindung sind Insulinzubereitungen aus kristallinem Insulin in wäßriger Suspension, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie gelöstes Des-Bl-Phenylanalin-insulin derselben Spezies und insgesamt 25—80 meg Zinkionen pro 1001. E. Insulin enthalten. >o

Das Verhältnis von kristallisiertem Insulin zu gelöstem Des-Phe-Insulin bestimmt das Zeit-Wirkungs-Profil. Es kann zwischen 60 :40 und 90: 10 liegen und beträgt bevorzugt 80 : 20 bis 90 :10. Der Gesamt-Insulingehalt der Zubereitung beträgt zweckmäßig 40—100 r, I.EVml. Die Suspension wird auf einen pH-Wert von 6,8 — 7,2, vorzugsweise pH 6,8—7,0, eingestellt und enthält 25 -80 meg Zinkionen pro 100 I.E.

Aus der DE-OS 22 56 215 ist es bekannt, daß in Insulinzubereitungen kristallines Insulin neben anior- »1 phem Des-Bl-Phenylalanin-Insulin (Des-Phe^B1-Insulin) derselben Spezies enthalten sein kann. Dabei handelt es sich um eine Suspension des amorphen Des-Phe^BI-Insulins.

Im Gegensatz dazu ist der Gegenstand vorliegender r> Erfindung eine Kombination von kristallinem Insulin mit gelöstem Des-Phe^B'-Insulin, welches durch den beanspruchten Zinkionen-Gehalt überraschenderweise in Lösung zu halten ist.

Es war nicht ohne weiteres zu erwarten, daß die beanspruchte Lösung stabil ist, da es sich um zwei Substanzen handelt, die zu einer Co-Kristallisation fähig sind, so daß die beobachtete Haltbarkeit allen physikalisch-chemischen Erwartungen des Fachmannes widerspricht. A^r>

Während bisher bei Insulinen gleicher Spezies keine Zinkkonzentration gefunden wurde, bei der die gelöste und kristalline Form nebeneinander über längere Zeit stabil sind (bei niederer Zinkkonzentration geht Kristallinsulin in Lösung, bei höherer Zinkkonzentra- ·><> tion fällt gelöstes Insulin aus) wurde bei der erfindungsgemäßen Kombination überraschenderweise gefunden, daß innerhalb der beanspruchten Zinkkonzentration beide Phasen nebeneinander stabil sind. Das hat sich in Beobachtungszeiträumen von mehr als 18 bzw. 10 v, Monaten für Rinder- bzw. Schweineinsulin erwiesen ohne daß die geringste Änderung eingetreten wäre.

Die erfindungsgemäße Insulinkombination weist auch gegenüber vorbekannten Insulinzubereitungen mit Insulinen der gleichen Spezies deutliche Vorteile auf. mi Insbesondere hat die erfindungsgemäße Insulinkombination ein ideales Zeit-Wirkungsprofil mit relativ hoher Anfangskonzentration und langer, aber nicht zu langer Wirkungsdauer.

Die Insulinzubereitung wird wie folgt hergestellt: M

1. Zur Herstellung der Suspension von Insulinkristallen (Kristalline Komponente der fertigen Zuberei tung) wird zunächst Insulin aus einem Zinkionen enthallenden Puffer kristallisiert. Dabei erhält man Insulinkristalle einheitlicher Größe von 15—35 μ, die einen Zinkgehalt von 0.3—1,0% besitzen. Die Kristalle werden nach Abtrennung der Mutterlauge in einer Pufferlösung suspendiert, deren Volumen so bemessen ist, daß die Suspensionen auf einen definierten Insulingehali im Bereich von 40—100 I.EVml eingestellt wird. Die Pufferlösung enthält so viel Zinkionen, z. B. in Form von Zinkchiorid, daß der gesamte Zingehalt der auf 40—100 LEVmI eingestellten Kristallsuspension 30-80 meg/100 I.E. beträgt Die Pufferlösung enthält außerdem noch Salze, wie Natriumacetat, zweckmäßig in einer Konzentration von 0,1 —0,2% Natriumchlorid, zweckmäßig in einer Konzentration von 0,5—1%, sowie Konservierungsmittel, wie 4 Hydroxybenzocsäuremethylester, zweckmäßig in einer Konzentration von etwa 0,1% und wird mit Natronlauge auf einen pi I-Wert im Bereich von pi I 6,8—7,2, vorzugsweise pH 6,8—7.0 eingestellt.

2. Zur Herstellung der Lösung von Des-Phe^BI-lnsulin der gleichen Spezies (gelöste Komponente der fertigen Zubereitung) löst man soviel kristallisiertes, trockenes Des-Phe^BI-lnsulin, das einen Zinkgehalt von 0,3—0,7% hat, in einer Lösungsflüssigkeit, daß die Lösung einen definierten Des-Phe^BI-Insulingehalt im Bereich von 40—100 I.EVml hat. Die Lösungsflüssigkeit enthält so viel Zinkionen, z. B. in Form von Zinkchlorid, daß der gesamte Zinkgehalt der Lösung 25—40 mcg/100 I.E. beträgt. Die L.ösungsflüssigkcit enthält außerdem Natriumchlorid und 4-Hydroxybcn/.ocsäuremethylester sowie zur Auflösung des Des-Phe"¹-Insulins ausreichende Mengen Essigsaure und Salzsäure. Nach Sterilfiltration wird die Des-Phe^lll-lnsulinlösung mit Natronlauge auf einen pH-Wert im Bereich von pH 6,8—7,2, vorzugsweise pH 6,8—7,0, eingestellt. Sie hat danach den gleichen Gehalt an Natriumchlorid, Natriuniacetat und 4-Ilydroxybenzoesäuremelhylesler wie die unter 1 beschriebene Pufferlösung.

3. Zur Herstellung der abfiillferligcn Depot-Insulinzubereitung mischt man die unter I. beschriebene kristalline Komponente und die unter 2. beschriebene gelöste Komponente, wobei Insulinkristalle und gelöstes DeS-PlIe¹¹¹InSuHn der gleichen Spezies verwendet werden. Das Volumenverhältnis kristalline Komponente : gelöste Komponente beträgt 60:40 bis 90:10, vorzugswe 80:20 bis 90 : 10. Der Gesamt Insulingehalt beträgt 40—100 I. E./111I. Der Zinkgehalt der fertigen Zubereitung ist vom Mischungsverhältnis der beiden Komponenten abhängig und betragt 25—80 mcg/100 I. E., der pH-Wert liegt im Bereich von pH 6,8 — 7,2 vorzugsweise 6,8—7,0.

Die erfindungsgeiiiäße Zubereitung besitzt eine länger dauernde und ausgeglichene Insulin-Depotwirkung. Sie ist auch nach einjähriger Lagerung bei 4°—8⁰C und bei 25'C hinsichtlich ihres physikalischen Zustandes und der biologischen Wirkung unverändert.

Die Zubereitung findet als Depot-Insulin bei der Behandlung des Diabetes mellitiis Verwendung. Sie ist insbesondere bei der Neueinstcllung von Patienten angebracht, wenn verhindert werden soll, daß sich Antikörper gegen mehrere Insulin-Spezies bilden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitungen.

Beispiel 1

A. Herstellung der
Rinderinsulin- Kristallsuspension

16 g reines Kirstallinsulin vom Rind mit einer Mindestaktivität von 25 1. Eirng, berechnet auf Trokkensubstanz, werden in 750 ml 0.02 N Salzsäure, die 0,013% Zinkionen in Form von Zinkchlorid enthält, aufgelöst Zu dieser Insulinlösung werden 250 ml einer Lösung, welche 0,95% Eisessig und 2,8% Natriumchlorid enthält, hinzugegeben. Die klare Mischung wird sodann durch Sterilfiitration mittels Membranschicht keimfrei gemacht. Zu der steril filtrierten Lösung wird so viel einer sterilen 4 N Natronlauge hinzugefügt, daß ein pH-Wert zwischen pH 5,4—5,8 erreicht wird. Die erhaltene amorphe Insulinsuspension wird kurz unter sterilen Bedingungen bei Zimmertemperatur gerührt und daraufhin im Kühlschrank bei +4 bis +7⁰C zur Kristallisation eingestellt

Nach maximal 36—40 Stunden haben sich gleichmäßig geformte rhomboedrische Kristalle von einheitlicher Größe zwischen 15 bis 35 μ gebildet. Die Kristalle werden in sterilen Bechern bei niederer Tourenzahl abgeschleudert, wobei evtl. noch vorhandene geringe amorphe Anteile abgetrennt werden. Das abzentrifugierte Kristallisat wird sodann in 71 einer sterilen gepufferten, neutralen Insulinverdünnuiigslösung (Zusammensetzung s.Tabelle 1) wieder suspendiert (Stammsuspension).

Tabelle 1

Zusammensetzung der Insulinverdünnungslösung

In 10 1 Lösung sind enthalten:

10g	4-1 lydroxybenzoesäure-	= 0,1%
	methylester	= 0,14%
Hg	Natriumacetat · JH₂O =	= 0,75%
75 g	Natriumchlorid	= 5,0 mcg Zn ^f
105 mg	Zinkchlorid (ZnCI₂)
	Natronlauge bis
	zum pH 6,9
Die i	-ösung wird steril filtriert.	Herstellung der 40 I. E./ml enthaltenden
		Depot komponente

B. Herstellung der gelösten Komponente des Des-Phe-Rinderinsulin

6,304 g kristallisiertes Des-Phe^B1-!nsulin vom Rind -> werden in 3,51 einer Lösungsflüssigkeit der in Tabelle 2 wiedergegebenen Zusammensetzung aufgelöst

Tabelle 2

Zusammensetzung der Des-Phe^BI-Lösungsflüssigkeit

κι In 5 Liter Lösung sind enthalten:

5 g 4-Hydroxybenzoesäure-

methylester
2,85 ml Essigsäure

(ergibt 0,14%

Natriumacetat · 3 H₂O)

Natriumchlorid

Zinkchlorid

(wasserfrei)

4 η Salzsäure

Gemäß dem ermittelten Insulingehalt in der Stammsuspension wird diese nun durch weitere Zugabe der ">'> sterilen Verdünnungslösung auf den gewünschten Insulingehalt von 40 1. E./ml eingestellt. Ausbeute maximal 101.

Hestimmungdes Insulinkristallgehaltes
in der Stammsuspension

Zur Bestimmung des Insulinkristallgehaltes in der Stammsuspension wird der Kristallsuspension nach intnsiver Durchmischung mit Hilfe eines Magnetrührers «> 4mal je 10 ml (Vollpipette) entnommen und der Gehalt an Insulin nach folgenden Methoden bestimmt:

1. Gravimetrisch nach Trocknung mit Aceton und Äther und auswägen. hl

2. Nach Auflösen der Kristalle spektrophotometriseh im UV bei 280 nm.

3. Durch Bestimmung des N-Gehaltes.

37,5 g
21 mg

JO 5 ml

0,1%

0,75% = 2,0 mcg Zn⁺+/ml

Die klare Lösung des Des-Phe^BI-Insulins wird sodann mittels Membranfilter entkeimt und durch Zugabe von 400 ml Lösungsflüssigkeit, die nach der Insulinfiltration durch dasselbe Sterilfilter geschickt wurde, auf ein Volumen 3,9 I gebracht. Durch Zugabe von 4n steriler Natronlauge wird ein pH-Wert von 6,9 eingestellt (Verbrauch ca. 1 3 ml). Durch weitere Zugabe von 34 ml einer sterilen, neutralen Insulinverdünnungslösung (Zusaiiimcnse'7ung siehe Tabelle 1) wird ein Endvolumen von 5,9471 und ein Insulingehalt von 401. E./ml eingestellt, wobei eine Aktivität des Des-Phe^BI-lnsulins von 25 I .E./mg zugmr.degelegt wird.

C. 1 lerstellung der abfüllfertigen Zubereitung

Durch Mischen der nach A. hergestellten Depotkomponente, die Rirderinsulin-Kristalle enthält, mit der nach U. hergestellten Komponente, die gelöstes I)es-Phe^ll1-Rinder-lnsulin enthält, im Volumen-Verhältnis 80 : 20, erhält man eine Zubereitung, die 32 I.E./ml kristallines Insulin und 8 I. E./ml gelöstes Des-Phe^BI-Insulin, insgesamt also 40 I. E./ml Insulin enthält Die Suspension wird steril in Fläschchen zu je 10 ml abgefüllt.

Beispiel 2

A. Herstellung der .Schweineinsulin-Kristallsuspension

Eine sterile Suspension mit 16 g Sehweineinsulinkristallen von 15—35 μ Größe, die bei pH 5,4—5,8 aus einem geeigneten Puffer analog Beispiel 1, kristallisiert wurden, wird zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes werden die Kristalle in 7 1 einer sterilen, gepufferten, neutralen Insulinverdünnungslosung (Zusammensetzung s. Tabelle 3) wieder suspendiert (Stammsuspension).

Tabelle 3

Zusammensetzung der Insulinverdünnungslosung In 10 I Lösung sind enthalten:

10 g 4-Hydroxybenzoesäure-

methylester = 0,1%

14 g Natriumacetat ■ 3 H₂O = 0,14% 75 g Natriumchlorid = 0,75%

210 mg Zinkchlorid (ZnCI;) = 10 meg Zn^f+/ml Natronlauge bis
zum pH 6,9

Die Lösung wird steril filtriert.

Bestimmung des Insulinkristallgehaltes
in der Stammsuspension

Zur Bestimmung des Insulinkristtilgehaltes in der Stammsuspension wird der Kristallsuspension nach intensiver Durchmischung mit Hilfe eines Magnetrührers 4mal je 10 ml (Vollpipette) entnommen und der Gehalt an Insulin nach folgenden Methoden bestimmt:

1. Gravimetrisch nach Trocknung mit Aceton und Äther und auswägen.

2. Nach Auflösen der Kristalle spektrophotometrisch im UV bei 280 nm.

3. Durch Bestimmung des N-Gehaltes.

Herstellung der 401. EVmI enthaltenden
Depotkomponente

Gemäß dem ermittelten Insulingehalt in der Stammsuspension wird diese nun durch weitere Zugabe der sterilen Verdünnungslösung auf d_n gewünschten /nsulingehaJt von 40 I. E./ml eingestellt. Ausbeute maximal 101.

B. Herstellung der gelösten Komponente
von Des-Phe^B'-Schweineinsulin

6,304 g kristallisiertes Des-Phe-Insulin vom Schwein werden in 3,5 1 einer Lösiingsflüssigkeit der in Tabelle 4 wiedergegebenen Zusammensetzung aufgelöst.

Tabelle 4

Zusammensetzung der Dcs-Phe^H1-l.ösungsflüssigkeit

In 5 Liter Lösung sind enthalten:

5 g 4-Hydroxybcnzocsäurc-

methylestcr = 0.1%

2,85 ml Essigsäure

(ergibt 0,14%
Natriumacetat · 3 HjO)
37,5 g Natriumchlorid = 0.75%

42 mg Zinkchlorid

(wasserfrei) = 4,0 mcg Zn * ♦ /ml

5 ml 4 η Salzsäure

Die klare Lösung des f)cs-Phc^H1-lnsiilins wird sodann mittels Membranfilter entkeimt und durch Zugabe von 400 ml Lösungsflüssigkeit, die nach der Insulinfiliration durch dasselbe Stcrilfillcr geschickt wurde, auf ein Volumen 3,9 I gebracht. Durch Zugabe von 4 η steriler Natronlauge wird ein pH-Wert von 6.9 eingestellt (Verbrauch ea. 13 ml). Durch weitere Zugabe von 34 ml einer sterilen, neutralen Insulinverdünnungslösung (Zusammensetzung siehe Tabelle 1) wird ein Endvolumen von 3,9471 und ein Insulingehalt von 401. EVmI eingestellt, wobei eine Aktivität des Des-Phe^B1-Insulins ·-, von 25 1. EVmg zugrundegelegt wird.

C I Icrstcllung der abfüllfertigen Zubereitung

Durch Mischen der nach A. hergestellten Depotkomponente, die Schwcincinsulin-Kristalle enthält, mit der

Hi nach B. hergestellten Komponente, die gelöstes Des-Phe"'-Schwcincinsulin enthält, im Volumen-Verhältnis 80:20, erhält man eine Zubereitung, die 32 I. E./ml kristallines Insulin und 8 I. EVmI gelöstes Dcs-Phc-"'-lnsulin, zusammen also 40 I. EVmI Insulin

r. enthält. Die Suspension wird steril in Fläschchen zu je 10 ml abgefüllt.

Beispiel 3

2i) Man mischt 75 Teile der nach A. hergestellten Dcpotkoniponcntc, die Insulinkristallc enthält, mil 25 Teilen der nach B. hergestellten Komponente, die gelöstes Des-Phc^l!1-lnsulin derselben Spezies enthält und erhält eine Zubereitung, die 30 I. EVmI kristallines

r< Insulin und 10 I. E./ml gelöstes Des-Phe"'-Insulin, insgesamt also 401. [L/ml Insulin enthält. Die Suspension wird steril in Fläschchen zu je 10 ml abgefüllt.

Beispiel 4

ι» Man mischt 70 Teile der nach A. hergestellten Depotkomponente, die Insulinkristallc enthält, mit 30 Teilen der nach B. hergestellten Komponente, die gelöstes Dcs-Phc^l!l-lnsulin derselben Spezies enthält, und erhält eine Zubereitung, die 28 I. EVmI kristallines

t'· Insulin und 12 I. ['../ml gelöstes Dcs-Phc^m-!nsulin insgesamt also 40 I. E./ml Insulin enthält. Die Suspension wird steril in I'läschchcn /u je 10 ml abgefüllt.

B c i s ρ· i c I 5

Man mischt 90 Teile der nach A. hergestellten Depotkomponente, die Insulinkristallc enthält, mil IO Teilen der nach B. hergestellten Komponente, die gelöstes Dcs-Phc^HI-Insulin derselben Spezies enthält, ι, und erhält eine Zubereitung, die 36 I. EVmI kristallines Insulin und 4 I. EVmI gelöstes Dcs-Phe"¹ -Insulin, insgesamt also 401. E./ml Insulin enthält. Die Suspension wird steril in I'läschchcn zu je 10 ml abgefüllt.

Claims

Patentansprüche:

1. Insulinzubereitung aus kristallinem Insulin in wäßriger Suspension, gekennzeichnet durch einen Gehalt ai gelöstem Des^B1-Phenylalanin-Insulin derselben Spezies und einen Gehalt an 25—80 meg Zinkionen pro 1001. E. Insulin.

2. Insulinzubereitung gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß der Insulingehalt 40—100 IEJnA beträgt.