DE2453823A1

DE2453823A1 - Neue methylensteroide

Info

Publication number: DE2453823A1
Application number: DE19742453823
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Kieslich; Henning Dr Koch; Rudolf Prof Wiechert
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1974-11-11
Filing date: 1974-11-11
Publication date: 1976-05-20
Also published as: FR2290214A1; JPH0148760B2; DK142057C; BE835427A; GB1530615A; DK503775A; DE2453823C2; JPS5191392A; JPS645880B2; FR2290214B1; US4012510A; DK142057B; JPS62187486A; CH623062A5; NL7513156A

Description

naohgereioht|

Die Erfindung betrifft neue, pharmakclogisch wirksame Methylensteroide, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten.

Die neuen Methylensteroide sind gekennzeichnet durch die allgemeine Formel I

C=O

B-

'CH,

(D ,

die Bindung — eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung, X ein Wasserstoff atom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe, Y eine Hydroxymethylengruppe, eine Alkanoyloxymethylengruppe

oder eine Carbonylgruppe,
R, ein^Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine Alkanoyl-

oxygruppe und
R2 ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichenSäure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten«

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Der Wirkungsbeginn und die Wirkungsdauer der neuen Methylensteroide sowie ihre Löslichkeit in physiologisch verträglichen Lösungsmitteln sind ebenso wie bei den bekannten Kortikoiden insbesondere davon abhänghig, ob und gegebenenfalls mit welcher

Säure eine in der 11,17 und/oder 21-Position ständige Hydroxylgruppe verestert ist.

Als veresterte 21-Hydroxygruppen R^ kommen vorzugsweise Acyloxygruppen mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen im Acylrest, Sulfatgruppen öder Phosphatgruppen in Betracht. Geeignete Acyloxygruppen sind beispielsweise solche, die sich von geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäuren ableiten, welche in üblicher Weise, beispielsweise durch Hydroxygruppen, Aminogruppen oder Halogenatome substituiert sein können.

Ferner eignen sich als Acyloxygruppen auch Reste cycloaliphatischer, aromatischer, gemischt aromatisch-aliphatischer oder heterocyclischer Säuren, die ebenfalls in üblicher Weise substituiert sein können. Als geeignete Acyloxygruppen seien beispielsweise genannt: die Formyloxy-, Acetoxy-, Propionyloxy-, Butyryloxy-, Pentanoyloxy-, Hexanoyloxy-, Octanoyloxy-, Undecanoyloxy-, Dimethylacetoxy-, Trimethylacetoxy-, Diäthylacetoxy-, tert.-Butylacetoxy-, Benzoyloxy-,' Phenacetyloxy-, Cyclopentylpropionyloxy-, Hydroxyacetoxy-, Monochioracetoxy-, Dichloracetoxy-, Trichioracetoxy-,

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■ferner die Dimethylaminoacetoxy-, die Slrimethylaminoacetoxy-, die Mäthyläminoacetoxy-, die Piperidinoacetoxy-, die ÜTicotinoyloxy-, die to -Carboxypropionyloxy- und die υό -Carboxypentanoyloxygrtippe.

Zur Herstellung wasserslöslicher Wirkstoffe können die 21-Acyloxyverbindungen mit einer "basischen Stickstoffgruppe im Acylrest in die entsprechenden Säureadditionssalze, wie zum Beispiel die Hydrochloride,.Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Oxalate, Tartrate oder Maleate überführt werden. Ferner lassen sich die 21-Dicarbonsäuremonoester, sowie die Schwefelsäure- und Phosphorsäureester zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit in ihre Alkalisalze, wie zum Beispiel die Natrium- oder Kaliumsalze, überführen.

Als veresterte 11- oder 17-ständige Hydroxygruppen kommen Acyloxygruppen in Betracht, die vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatome im Acylrest besitzen* Besonders geeignete Acyloxygruppen sind Alkanoyloxygruppen wie zum Beispiel die Acetoxy-, die Pröpiönyloxygruppe, die· Butyryloxygrüppe, die Pentänoyloxygruppe oder die Hexanoyloxygruppe* -

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Methylensteröide ist dadurch gekennzeichnet,

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-t-

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a) daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

worin Z, E-, und Ep die gleiche Bedeutung wie in Formel I "besitzen,

»
mit einer Kultur eines zur 11-Hydroxylierung befähigten Mikro-

,.. fermentiert
organismusVund gegebenenfalls zusätzlich in der 1,2-Position dehydriert,

sowie gewünschtenfalls eine.in der 11-Position vorhandene Hydroxygruppe O3cydiert_r vorhandene Estergruppen verseift oder vorhandene Hydroxygruppen verestert* oder

b) daß man eine zur Herstellung von 15«₅16a-Methylen-Δ '-. kortikoiden der allgemeinen Formel I eine Verbindung der allgemeinen Formel III

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CH₂R₅

GH

(HD ,

und X die gleiche Bedeutung wie in Formel I "besitzen,

Z und V eine gegebenenfalls veresterte oder verätherte Hydroxymethylengruppe oder eine gegebenenfalls ketalisierte Carbonylgruppe darstellen und

, ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls veresterte

oder verätherte Hydroxygruppe bedeutet,

in·Gegenwart von Zink mit Methylenjodid umsetzt und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet, in der 11- und/oder 20-Position vorhandene Hydroxygruppen oxydiert sowie vorhandene Hydroxygruppen verestert.

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Zur Durchführung des Verfahrens gemäß Variante a) verwendet man die übliche Fermentation mit lla- oder llß-hydroxylierenden Mikroorganismen. Für die lla-Hydroxylierung verwendet man vorzugsweise Pilzstämme der Gattung Aspergillus (so zum Beispiel Aspergillus occhraceus) als Mikroorganismen. Für die llß-Hydroxylierung können beispielsweise Pilzstämme der Gattungen Curvularia (zum Beispiel Curvularia lunata), Cunninghamella (zum Beispiel Cunninghamella bainieri, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinolata und Cunninghamella blackesleana), Äbsidia (zum Beispiel Absidia orchidis und Absidia coerula), Helmintösporium ₅ Rhizoctonia (zum Beispiel Ehizoctonia solani), Verticillium (zum Beispiel Verticillium theobromae), Stachylidium (zum Beispiel Stachylidium bicolor), Piellicularia (zum Beispiel Pellicularia filamentosa) oder Colletotrichum (zum Beispiel Colletotrichum pisi) verwendet werden. Die Fermentation mit diesen Mikroorganismen wird unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Bei dieser Umsetzung wird eine in der 21-Position ständige Acylgruppe meist abgespalten. Die Verfahrensvariante a) wird vorzugsweise mit solchen Verbindungen der allgemeinen Formel II durchgeführt, die in der 21-Position eine Hydroxygruppe oder eine Acyloxygruppe tragen.

Die sich als Gegebenenfallsmaßnahme anschließende Dehydrierung der in der 1,2-Position gesättigten Steroide der allgemeinen Formel I kann sowohl mittels mikrobiolgischer Arbeits-

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■methoden als auch mittels rein, chemischer Methoden durchgeführt werden. So kann man beispielsweise die Δ -Steroide unter den üblichen Bedingungen mit Bakterienkulturen der Gattungen Bacillus (zum Beispiel Bacillus lentus oder Bacillus sphaericus) oder Arthrobacter (zum Beispiel Arthrobacter simplex) in der

1,2-Position dehydrieren. Andererseits ist es aber auch möglich, die Δ -Dehydrierung in der Weise durchzuführen, daß man die Δ -Steroide mit den für diese Reaktion üblichen Oxydationsmitteln, wie zum Beispiel Selendioxyd oder 2,3-Dichlor-5,6-dizyanobenzochinon, in inerten Lösungsmitteln erhitzt»

Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Verfahrensvariante b) kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die man üblicherweise bei der Einführung von Methylengruppen in Steroide mittels der Simmons-Smith Reaktion anwendet (siehe John Friend! Organic Reactions in Steroid, Chemistry, Volume II, Seite IO7-II3 · van Nostrand Reihhold Comp. New York u.a. 1972). Beispielsweise genannt sei die Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel II mit Methyljodid in Gegenwart eines Äthers (wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Di-n-butyläther,' Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyäthan und eines -Zink-Kupfer- oder Zink-Silber-Pulvers. Für diese Reaktion kann man als Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel II solche Verbindungen einsetzen, die freie, veresterte oder verätherte Hydroxylgruppen und/oder freie oder

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ketalisierte Oxogruppen besitzen. Ils veresterte Hydroxylgruppen kommen vorzugsweise Alkanoyloxygruppen mit 1-8 Kohlenstoffatomen im Alkanoylrest (wie zum Beispiel die ITormyloxygruppe, die Acetoxygruppe, die Butyryloxygruppe oder die Trimethylacetoxygruppe) oder die Benzoyloxygruppe in Betracht. Geeignete verätherte Hydroxygruppen sind vorzugsweise leicht spaltbare Gruppen wie zum Beispiel die tert.-Butyloxygruppe, die Benzyloxygruppe oder die Trimethylsilyloxygruppe. Geeignete ketalisierte Oxogruppen sind beispielsweise Alkylendioxygruppen mit 2-6 Kohlenstoffatomen im Alkylenrest wie zum Beispiel die Äthylendioxygruppe und die 2,2-Dimethylpropylendioxygruppe.

Nach erfolgter Reaktion werden dann gegebenenfalls vorhandene Ester-Äther-oder Ketalgruppen in an sich bekannter Weise gespalten, beispielsweise, indem man gegebenenfalls vorhandene Trimethylsilyloxygruppen, tert.-Butyloxygruppen oder Alkylendioxygruppen mittels saurer Katalysatoren (wie Salzsäure, Schwefelsäure, Perchlorsäure oder p-Toluolsulfonsäure) in einem wasserhaltigen niederen Alkohol oder Keton, beziehungsweise in einem wasserhaltigen polaren Äther (wie Dioxan oder Tetrahydrofuran) hydrolysiert.

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Die sieh als Gewünschtenfallsmaßnahme anschließende Oxydation der llß-Hydroxysteroide der allgemeinen Pormel I zu den entsprechenden 11-Ketonen erfolgt nach bekannten Arbeitsmethoden, beispielsweise mittel Chromsäure, N-Bromsuccinimid oder N-Bromacetamid.

Die gewünschtenfalls nachfolgende Verseifung der Ester erfolgt nach an sich bekannten Arbeitsmethoden.

Beispielsweise genannt sei die Verseifung der Ester in V/asser oder wäßrigen Alkoholen in Gegenwart von sauren Katalysatoren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure oder von basischen Katalysatoren, wie Kaliumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid oder Kaiiumhydroxid.

Eine sich gegebenenfalls anschließende Veresterung freier Hydroxylgruppen erfolgt ebenfalls mit Hilfe der an sich bekannten ,Arbeitsmethoden. So kann man beispielsweise die Hydroxysteroide mit AcylChloriden oder Acylanhydriden in Gegenwart von Säuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoff, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder in Gegenwart von Basen, wie Kaliumcarbonat, Pyridin, Kollidin oder p-Dimethylaminopyridin verestern.

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- flfö - " Gewerblicher Rechtsschutz

-... Andererseits ist es möglich, die Hydroxyverbindungen mit Carbonsäuren in Gegenwart von Trifluoressigsäureanhydrid zu verestern.

Aus den 21-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I können in an sich bekannter Weise die Alkalisulfat» der 21-Konoschwefelsäureester hergestellt werden, beispielsweise in dem man die 21-Hydroxyverbindungen mit Schwefeltrioxyd in Pyridin umsetzt, und den erhaltenen Schwefelsäurester durch Behandeln mit Alkalibasen in das Alkalisalz überführt.

Ferner kann man aus den 21-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I in an sich bekannter Weise die Alkalisalze der 21-Monophosphorsäureester herstellen, indem man beispielsweise die 21-Hydroxyverbindungen mit *Sulf onsäurechlorid in 21-Stellung verestert, die 21-Sulfonate mit Alkalijodid in Aceton in die 21-Jodverbindungen überführt, die Jodverbindungen mit Phosphorsäure in Gegenwart einer organischen Base umsetzt und die erhaltenen Phosphorsäuremonoester mit Alkali in die Dialkalimetallsalze überführt.

Die neuen Eortikoide der allgemeinen Formel I sind pharmakologisch wirksame Substanzen, die sich insbesondere dadurch auszeichnen, daß sie bei topischer Anwendung eine ausgeprägte antiinflammatorische Wirksamkeit besitzen» - -

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Geweiblicher Rechtsschutz

Darüberhinaus zeichnen sich diese Verbindungen oft durch einen raschen Wirkungsbeginn, eine hohe Wirkungsintensität und eine lange Wirkungsdauer aus, sie haben eine günstige Eesorbierbarkeit und in galenlschen Zubereitungen eine relativ gute Stabilität.

Die neuen Verbindungen eignen sich in Kombination mit den in der galenischen Pharmazie üblichen Trägermitteln zur lokalen Behandlung von Eontakt dermatitis, Ekzemen der verschiedensten Art, Neurodermatosen, Erythrodermie, Verbrennungen, Pruritis vulvae et ani, Eosacea, Erythematodes cutaneus, Psoriasis, Liehen ruber planus et verrucosus· und ähnlichen Hauterkrankungen.

Die Herstellung der ArzneiBiittelspezialitäten erfolgt in üblicher Weise, indem-man die Wirkstoffe mit geeigneten Zusätzen in die gewünschte Applikationsform, wie zum Beispiel.: Lösungen, ■ Lotionen, Salben, Cremen oder «ÄfLaster, überführt. In den so formulierten Arzneimitteln ist die Wirkstoffkonzentration von der Applikationsform abhängig. Bei Lotionen und Salben wird vorzugsweise eine' Wirkstoffkenzentration von 0,001 % bis 2' % verwendet.

Darüberhinaus sind die neuen Verbindungen gegebenenfalls in Kombination mit den üblichen Trägermitteln und Hilfsstoffe auch gut zur Herstellung von Inhalationsmitteln geeignet. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des ei·- " findungsgemäßen Verfahrens. ' ·' . ■

: _ 18 - · '-609821/095 2

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Beispiel 1

a) JO g llß-Hydroxy-l,4,16-pregnatrien-3,20-dion werden in 300ml absolutem Pyridin mit 30 ml Trimethyl-chlorsilan versetzt und 24 Stunden bei Räumtempera tür gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, mit Wasser ausgewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Eindampfen werden 36,5 S rohes llß-Trime.thylsilyloxy-l,4,16-pregnatrien-3,20-dion erhalten. Eine aus Diisopropyläther umkristallisierte Probe schmilzt bei 196-197,5°C.

b) 6,72 g Kaiium-tert.-butylat werden in 79 ml Dimethylformamid und 13j2 ml tert.-Butanol gelöst. Zu der auf -25°C gekühlten Lösung werden 5»3 ml Trimethylphosphit gegeben und trockener

ft

Sauerstoff durchgeleitet. Dann werden 8,8 g llß-Trimethylsilyloxy-l,4,16-pregnatrien-3₁20-dion gelöst in 62 ml absolutem Tetrahydrofuran zugetropft, anschließend noch 15 Minuten . Sauerstoff durchgeleitet und weitere 30 Minuten bei -25°C nachgerührt. Nach dem Einrühren in schwach essigsaures Eiswasser wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in Methylenchlorid aufgenommen und getrocknet. Der Rückstand wird an Silikagel chromatographiert und es werden aus Diisopropyläther/Methylenchlorid timkristallisiert Ii95 g 17-Hydroxy-llß-trimethylsilyloxy-l,4,15-pregnatrien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 193-195)5°C erhalten,

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c) 1,5 S 17-Hydroxy-llß-trimethylsilyloxy-l,4,15-pregnatrien-3,20-dion werden in 35 ml absolutem Tetrahydrofuran mit 1,35 g lithium-tri-tert.-butoxyalanat versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser einge-· rührt, mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Organische Phase wird mit Wasser neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel chromatographiert und es werden 1,17 g 17,20|-Dihydroxy-llß-trimethylsilyloxy-l,4,15-pregnatrien-3-on als öl erhalten.

ä) 3?8 g 17,205-Dihydroxy-llß-trimethylsilyloxy-l,4,15-pi'egnatrien-3-on werden in 25 ml absolutem Äther und 25 ml abso-

lutem 1,2-Dimethoxyäthan gelöst, mit 7,6 g Zink-Kupfer-Paar und 6,13 ml Methylenjodid versetzt und 7,5 Stunden am Rückfluß erhitzt. Dann wird nochmals die gleiche Menge Zn-Cu-Paar und Methylenjodid nachgegeben und weitere 18 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Reaktionslösung wird mit Methylenchlorid verdünnt, mit gesättigter Ammoniumchloridlösung und mit Wasser gewaschen. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand an Silikagel chromatographiert und es werden 2,5 g i'V,20^ Dihydroxy-llß-trimethylsilyloxy-15a _V16a-methylen-l,4-pregnadien-3-on als öl erhalten.

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e) 2,5 g 17,20|-Dihydroxy-llß-trimethylsilyloxy-15a,16a-methylenl,4-pregnadien-3-on werden in 73»5 ml Dimethylsulfoxid gelöst, auf 10-15°C abgekühlt, 6,74 ml Triäthylamin zugesetzt und innerhalb 25 Minuten eine Lösung von 4,9 g Pyridin-SO,-Komplex in 19*5 ml Dirnethylsulfoxid zugetropft. Es wird dann eine Stunde bei Eaumtemperatur nachgerührt, in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand an Silikagel chromatographyert und es werden 2,0 g 17-Hydroxy-llß-trimethylsilyloxy-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion erhalten. Eine aus Diisopropyläther/Methylenchlorid umkristallisierte Probe schmilzt bei 216-218,5°C.

f) 2,0 g 17-Hydroxy-llß-trimethylsilyloxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion werden in 40 ml Methanol mit 2 ml 1 4 1 verdünnter Salzsäure 1,5 Stunden bei Eaumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen.

Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand aus Essigester umkristallisiert und es werden 1,03 g llß,17-Dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 233-248⁰C (Zersetzung) erhalten.

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Bei s.p i e 1 2

a) 11,0 g 3ß-Acetoxy-15a,16a-methylen-5-pr.egnen-17,20%-diol, werden in 230 ml Dimethylsulfoxid gelöst, auf 15°C abgekühlt, 30,8 ml Triäthylamin zugegeben und innerhalb 30 Minuten ein Lösung von 22 g Pyridin-Schwefel(VI)-oxyä-Eomplex in 100 ml Dimethylsulfoxid zugetropft. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur nachgerührt, dann in schwach essigsaures Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, - gut ausgewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Bückstand aus Essigester .umkristallisiert und es werden 7»5 g 17-Hydroxy-3ß-acetoxy-15a>16a-methylen-5-pregnen-20-On vom Schmelzpunkt 245-247 C (Zersetzung) erhalten. · · , ·

b) 10,0 g 17-Hydroxy-3ß-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on · werden in 350 ml Essigsäure und 100 ml Chloroform teilweise gelöst, 0,1 ml Bromwasserstoff in Essigsäure (37%ig) zugesetzt und innerhalb 1,5 Stunden eine Lösung von 2,85 ml Brom in 100 ml Essigsäure zugetropft. Es wird dann 1 Stunde nachgerührt, die Reaktionslösung mit Methylenchlroid verdünnt, mit Wasser, Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und getrocknet. Nach dem Eindampfen werden 17,9 g rohes 5, 6ß _i21-Tribrom-17-hydroxy-3ß-acetoxy-15a, 16a-methylen-5ctpregnan-20-on erhalten.

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c) 17,9 S rohes 5>6ß,21-Tribrom-17-hydroxy-3ß-acetO3qy--15a,16amethylen-5a-pregnan-20-on werden in 400 ml Aceton mit 9*1 S Natriumiodid und 40 g Kaliumacetat 4 Stunden unter Rühren am Rückfluß erhitzt. Nach Eiswasfeerfällung wird der abfiltrierte Niederschlag in Methylenchlorid aufgenommen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel Chromatograph!ert und es werden umkristallisiert aus Diisopropyläther/Aceton 4,75 g 17-Hydroxy-3ß,21-diacetoxy-15a,16a:- methylen-5~pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 197»5-199 C erhalten.

d) Ein Glasfermenter mit 20 1 fassungsvermögen wird mit 15 1 einer Nährlösung aus 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % Cornsteepliquor und 0,2 % Stärkezucker beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 250 ml einer 2-tägigen Schüttelkolbenkultur von Plavobacterium dehydrogenans ATCC 13 93O beimpft. (Die Schüttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 250 ml des gleichen Mediums mit der Abschwemmung einer 7 Tagen alten Sehrägagarkultür hergestellt.) Nach 24stündiger Vermehrung bei 30°C unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und Belüftung (15 Liter pro Minute) werden 900 ml der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich großen Fermenter mit 14 1 des gleichen Mediums überführt. Nach 6 Stunden wird die Kulturbrühe auf 13 1 reduziert, mit einer sterilfiltrierten Lösung von 6,5 g 17—Hydroxy-3ß,21-diacetoxy-15a, 16a-methylen-5-pregnen-

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20-on in 100 ml Dimethylformamid versetzt und unter gleichen • Bedingungen weitere 13 Stunden fermentiert.

Nach "beendeter Fermentation wird die Kulturbrühe dreimal mit je 6 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingedampft.'Der Rückstand wird mit 100 ml heißem Hexan vom verwendeten Antischaummittel Silicon SH freigewaschen und ergibt 4,7 g Rohprodukt, das aus Essigester mit geringem Kohlezusatz umkristallisiert wird. Man erhält 3,13 g 17,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion (Ausbeute 68 % der Theorie) vom Schmelzpunkt 225-226°C. '

Beispiel 3

Ein 20 1-Glasfermenter wird mit 14- 1 einer Nährlösung aus 3 % Glucose-, 1 % Cornsteep liquor., 0,2 % NaNO₅, 0,1 % KH₂PO₄, 0,2 % K₂HPO₄, 0,05 % MgSO₄, 0,002 % FeS0₄-_rund 0,05 % KCl beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 900 ml einer 3 Tage alten Schuttelkolbenkultur von Pellicularia filamentosa f. sp. sasakii, IFO 6675, beimpft. (Die Schüttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 900 ml des gleichen Mediums mit einer Abschwemmung einer 7*ägigen Schrägagarkultur hergestellt.)

Nach 12stündiger Vermehrung bei 29°C unter den vorangehend.beschriebenen Bedingungen wird eine sterilfiltrierte Lösung von

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17,21-Diliydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion in 100 ml Dimethylformamid zugesetzt. Nach weiterer 36stündiger Fermentation wird die Kulturbrühe über Gaze abfiltriert. Der Mycelrückstand wird mehrmals mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschwasser werden mit Methylisobutylketon extrahiert und wie im Beispiel 2'd) beschrieben aufgearbeitet. Das Eohprodukt wird an Kieselgel mit einem Gradientensystem Hexan-Aceton chromatography er t.

Man erhält nach Umkristallisieren aus Essigester 1,2 g llß,17,21-Trihydroxy-15a)16a-methylen-4-pregnen-3,20^x-dion vom Schmelzpunkt 209-210⁰C.
Aus den polaren Fraktionen wird nach Umkristallisieren aus Diisopropyläther/Aceton 22 mg lla,17,21-Trihydroxy-15a_?16a-methylcn-4-

pregnen-3>20-dion vom Schmelzpunkt 214-215°C erhalten.

Beispiel 4

Ein 2 1-Erlenmeyerkolben wird mit 500 ml einer Nährlösung, bestehend aus 1,5 % Pepton, 1,2 % Cornsteep liquor und 0,2 % MgSO^, beschickt, sterilisiert und mit der Abschwemmung einer 3 Tage alten Schrägagarkultur von Bacillus lentus ATCC 13 805 beimpft. Nach 48 Stunden Schütteln auf einem Rotationsschüttler (165 Umdrehungen pro Minute) bei 30⁰C werden 50 ml der Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen, in einen 2 1-Erlenmeyerkolben mit 500 ml einer sterilen Nährlösung, bestehend aus 0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Cornsteep liquor und 0,05 % Stärke-

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zucker, überführt und 24 Stunden geschüttelt. Zehn 2 1-Erlenmeyerkolben, "beschickt mit je 500 ml des gleichen Mediums, werden jeweils mit 50 ml der erhaltenen Vorkultur "beimpft, nach 6 Stunden jeweils mit einer Lösung von 100 mg llß,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3i20-dion in 4 ml Dimethylformamid beschickt und 24 Stunden bei 30⁰C und 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die Kulturbrühen werden vereinigt und mit Methylisobuty!keton extrahiert. Die Extrakte ergeben nach Evaporieren 1,2 g Rohprodukt, das aus Diisopropyläther/Aceton umkristallisiert, llß,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen~l,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 205-207°C liefert.

Beispiel 5

Ein 2 1-Erlenmeyerkolben mit £00 ml einer sterilen Nährlösung, bestehend aus 1 % Cornsteep liquor, 1,25 % Sojabohnenmehl und 0,005 % Sojaöl, wird mit der Abschwemmung einer 10 Tage alten Schrägagarkultur von Aspergillus ochraceus ATCC 1008 beimpft und 72. Stunden bei 3O⁰C und 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Mit je 50 ml dieser Kultur werden sieben 2 1-Erlenmeyerkolben, beschickt mit je 500 ml des gleichen Mediums, beimpft und nach 16 Stunden mit je 100 mg 17,21-Dihydroxy~15a,16cc-methylen-4-pregnen-3,20-dion in 4 ml Dimethylsulfoxyd versetzt. Nach 21 Stunden Kontaktzeit werden die vereinigten Kulturbrühen ohne Mycelabtrennung mit Methylisobutylketon extrahiert. Die Extrakte ergeben nach

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Evaporieren 992 mg Rohprodukt, "welches nach Umkristallisieren 331 mg 11α,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4~pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 213-215°C ergibt.

Beispiel 6

Unter den Bedingungen des Beispiels 4 werden iit sechs 2 1-Erlenmeyerkolben aus 600 mg lla,17,21-Trihydroxy-15cc,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion durch Fermentation mit Bacillus lentus ATCC 13 8O5-68O mg rohes Dehydrierungsprodukt erhalten, welches nach Aufreinigung über präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten im System Chloroform/Methanol 95+5 reines 11a,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 225-227°C ergibt.

Beispiel 7

Unter gleichen Bedingungen wie im Beispiel 4 beschrieben wird mit Corynebacterium simplex ATCC 6946 die 1,2-Dehydrierung von • 11a,17121-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erzielt.

Beispiel 8

100 mg lla,I7,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 4 ml Dimethylformamid· gelöst und unter Rühren mit 6 mg Blei(II)-acetat und 0,08 ml Acetanhydrid versetzt. Nach anschließendem 2stündigen Eühren bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung in Wasser eingegossen. Der ausgefallene Nieder-

• - 27 -6 0 9 8 2 1 / 0 9.5 2

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schlag wird abgesaugt, getrocknet, aus Essigester-Isopropyläther umkristallisxert und man erhält das lla,17-Dihydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion.

Beispiel 9

500 mg 11α, 17-Dihydroxy—21-acetoxy-15o:, 16α-methylen-1,4—pregnadien-3,20-dion werden in 15 ml Aceton bei 10°C mit 0,4 ml Chromschwefelsäure (hergestellt aus 267 g Chromsäure, 400 ml V/asser, 23O ml konzentrierter Schwefelsäure aufgefüllt zu 1 Liter) versetzt, 15 Minuten bei 10°C nachgerührt und in Eiswasser gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, in Methylenchlorid aufgenommen, mit V/asser gewaschen und getrocknet. Nach dem Eindampfen wird an Silicagel chromatographiert und es wird das 17-Hydroxy-21-acetoxy-15cc,16a-methylen-l,4-pregnadien-3₎ll,20-trion erhalten.

Beispiel 10

a) 11,35 g 17-Hydroxy-3ß,21-diacetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in I70 ml Methanol und I70 ml Methylenchlorid bei Eiskühlung mit einer Lösung von 568 mg Kaliumhydroxid in 10 ml Methanol versetzt und 1,5 Stunden bei Eistemperatur - nachgerührt. Anschließend wird mit. Essigsäure neutralisiert, die Lösung im Vakuum weitgehend eingeengt und in Eiswasser gefällt. Der ausgefallene Fiederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Nach Chromatographie an Silicagel

- 28 -

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werden nach Diisopropylätherverreibung 7₅3 g 17j21-Diliydroxy-• 3ß-acetoxy-15a,1&^α-methylen-5-pregnen-20-on erhalten. Eine aus Essigester umkristallisierte Probe schmilzt bei 228-233,5°C (Zersetzung).

b) 7>0 g 17,21-Mhydro:xy-3ß-acetoxy-15a, 16a-methyl en-5-pregnen-20-on werden in 280 ml Essigsäure mit 700 mg kristallwasserhaltigem Zinkacetat.2 Stunden bei 120⁰G gerührt. Es wird dann im Vakuum weitgehend eingeengt, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser neutral gewaschen. Nach dem Eindampfen werden 7»0 g rohes 20~Hydroxy-3ß-acetoxy-15a,-16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al erhalten.

c) 7»0 g 20-Hydroxy-3ß-acetoxy-15oc, 16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al werden in 28 ml Pyridin mit 14 ml Acetanhydrid 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in

Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und in Äther aufgenommen. Die Ätherphase wird mit verdünnter Salzsäure, Wasser, Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand an Silicagel chromatographiert und es werden 6,5 g 3ß>20-Diacetoxy-15a,16amethylen-5,17(20)-pregnadien-21-al erhalten.

• - 29 -

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Patentabteilung

Eine aus Diisopropyläther umkristallisierte Probe schmilzt "bei 147,5-151°C.

<0 6j5 g 3ß,20-Diacetoxy-15oc,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al werden in 65 ml Tetrahydrofuran mit 6,5 g Lithium-tri-tert.-butoxyalanat versetzt und 30 Minuten "bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen werden 6,5 g rohes 21-Hydroxy-3ß,20-diacetoxy-15a,16a-methylen-5il7(20)-pregnadien erhalten.

e) 6,5 g 21-Hydroxy-3ß,20-diacetoxy-15a,16a-methylen-5,17(2O)-pregnadien werden in 260 ml Methanol mit 65 ml 2 η Salzsäure 3,5 Stunden unter Rückfluß'erhitzt. Anschließend wird in Eiswasser gefällt, der Niederschlag abfiltriert, in Methylenchlorid aufgenommen, mit "Wasser gewaschen und getrocknet. Der nach dem Eindampfen erhaltene Rückstand wird and SiIicagel chromatographiert und es werden aus Essigester umkristallisiert 2,6 g 3ßν21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 174,5-179,5°C erhalten.

f) 2,0 g 3ß,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-5-pi^>egnen-20-on werden in 20 ml Dimethylformamid und 2 ml Acetanhydrid gelöst, mit 1,28 g Bleiacetat versetzt und 1,5 Stunden "bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, gewaschen und getrocknet,

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Aus Essigester umkristallisiert werden 1,8 g 3ß-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 168,5-169,5°C erhalten.

g) 500 mg 3ß-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pi^>egnen-20-on werden in 25 ml Toluol und 1 ml Cyclohexanon mit einer Lösung von 100 mg Aluminium!sopropylat in 2 ml Toluol versetzt und 45 Minuten unter langsamen Abdestillieren erhitzt. Es wird dann mit Äther verdünnt, mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird an Silicagel chromatographiert und es werden umkristallisiert aus Diisppropyläther 275 mg 21-Acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 124~125°C erhalten.

Beispiel 11

Ein Glasfermenter mit 20 1 fassungsvermögen wird mit 15 1 einer Nährlösung aus 4,4 % Glucose (Stärkezucker), 1 % Malzextrakt, 0,3 % NaNO₃, 0,1 % KH₂PO₄, 0,05 % KCl, 0,05 % MgSO₄, 0,002 % PeSO₄ und 0,5 % Cornsteep liquor "beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 12O⁰C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer 3-tägigen Schuttelkolbenkultur von Curvularia lunata NRRL 2380 beimpft. (Die Schuttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 250 ml des gleichen Mediums mit der Abschwemmung einer 7 Tage alten Sehrägagarkultür hergestellt.) Nach 48-stündiger Vermehrung "bei 30°C unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und

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-SC-

Belüftung (15 Liter pro Minute) werden 900 ml der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich großen Fermenter mit 14 1 des gleichen Mediums überführt. Nach 12 Stunden werden 3 g 21-Acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion - in 100 ml Dimethylformamid gelöst - zugesetzt und weitere 28 Stunden fermentiert. Man arbeitet auf wie in Beispiel 3 beschrieben und erhält 2,7g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie an Kieselgel aufgetrennt wird und das llß,21-Dihydroxyr-15a, 16α-methylen—4-pregnen-3»20-dion liefert.

Beispiel 12

Unter den Bedingungen des Beispiels 4 werden in zwei 2 1-Erlenmeyerkolben 200 mg llß,21-Dihydroxy-15a, 16a-methylen-4r-pregnen-

*
3,20- dion mit Bacillus lentus ATCC 13 805 zum llß,21-Diyhydroxy

15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion dehydriert.

Beispiel 13

a) Zu 2.,5 ml auf -40⁰C gekühltem Dimethylformamid werden 2,5 ml flüssiger Fluorwasserstoff gegeben, dananch 250 mg N-Bromsuccinimid zugegeben und dann 500 mg 3ß-Hydroxy-21-acetoxy-■ 15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on gelöst in 5 ml Methylenchlorid eingetragen. Es wird dann 5 Minuten bei -15°C nachgerührt, in gesättigte Kaliumhydrogencarbonatlösung eingegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen werden 700 mg rohes 6ß-Fluor-5-brom~3ß-hydroxy

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21-acetoxy-15a,16a-methylen-5a-pregnan-20-on erhalten.

b) 700 mg 6ß-i¹luor-5-brom-3ß-hydroxy-21-acetoxy-15oc,16a-methylen-5a-pregnan-20-on werden in 15 ml Aceton mit 0,55 ml Chromschwefelsäure (hergestellt aus 267 g Chromsäure, 400 ml Wasser, 230 ml konzentrierter Schwefelsäure aufgefüllt zu 1 Liter} versetzt und 10 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der Niederschlag abfiltriert, in Methylenchlorid aufgenommen und getrocknet. Nach dem Eindampfen werden 7OO mg rohes 6ß-Fluor-5-brom-21-acetoxy-15«,16amethylen-5a-pregnan~3,20~dion erhalten.

c) 7OO mg 6B-I¹IuOr-5-brom-21-acetoxy^l5a, 16a-methylen-5a-pregnan-3,20-dion werden in 15 ml Essigsäure 3 Stunden bei 3O⁰C gerührt, es werden dann 300 mg kristallines Natriumacetat zugesetzt und weitere 10 Minuten bei 30⁰C gerührt. Anschließend wird in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand an Silicagel chromatographiert und es werden umkristallisiert aus Diisopropyläther 150 mg 6a-Eluor-21-acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3>20-dion vom Schmelzpunkt 155»5-157>5°C erhalten.

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Beispiel 14

Unter den Bedingungen des Beispiels 11 werden 3 S 6a-J?luor-21-acetöxy-150Cil6a-methylen-4-pregnen-3,2O-dion mit Curvularia lunata NEEL 2380 fermentiert und aufgearbeitet. Das Eohprodukt, 2,4 g, wird durch Saulenchromatograpliie aufgetrennt und ergibt das 6a-ITuor-llß, 21-dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-

B e i s pi e 1 15

Unter den Bedingungen des Beispiels 4 werden in zwei 2 1-Erlenmeyerkolben 200 mg 6a-Fluor-llß,21-dihydroxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion mit Bacillus lentus ATCC 13 805 zum öa-Fluorllß,21-dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion dehydriert. .

Beispiel 16

a) 500 mg 17-Hydroxy-llß-trimethylsilyloxy-15a,16a-methylen-• l,4-pregnadien-3,20-dion werden in 50 ml Acetanhydrid mit .600 mg Calziumcarbonat 40 Stunden bei 140⁰C gerührt. Es wird vom Calziumcarbonat abfiltriert, das FiItrat in Eiswasser.eingerührt, -der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es werden 600 mg rohes 17-Acetoxyllß-trimethylsilyloxy-15a, 16a-methylen-l, 4-pregnadien-3,20-dion erhalten. .

':- 34 -

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b) 600 mg rohes 17-Acetoxy-llß-trimethylsilyloxy-15ct,16amethylen~l,4-pregnadien-3,20-dion werden in 15'ml Methanol mit 0,6 ml 1+1 verdünnter Salzsäure 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann wie in Beispiel 1 e) beschrieben aufgearbeitet und der Rückstand an Silicagel chromatographiert. Es werden 240 mg llß-Hydroxy-17-acetoxy-15a,16amethylen-l,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 17

200 mg llß,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 1 ml Pyridin mit 0,5 1 Acetanhydrid 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, gewaschen und

getrocknet. Es werden 210 mg llß,17-Dihydroxy-21-acetoxy-15a,16a-

methylen-4~pregnen-3,20-dion erhalten. '

Beispiel 18

100 mg llß,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in'l ml Pyridin mit 0,5ml Buttersäureanhydrid 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, vom ausgeschiedenem Öl abdekantiert und dieses dann in Methylenchlorid aufgenommen. Nach präparativer DünnschichtChromatographie werden II5 mg llß,17-Dihydroxy-21-butyryloxy-15a»16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

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Beispiel 19

250 mg llß ,17,21-Trihydroxy-15a -> 16a-methyl en-1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 1,5 ml Pyridin mit 0,75 ml Capronsäureanhydrid stehengelassen. Es wird dann wie in Beispiel 18 beschrieben aufgearbeitet und aufgereinigt. Es werden 210 mg llß,17-Dihydroxy-21-hexanoyloxy-15a,16a^methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 20

250 mg llß,21-Mhydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 1,5 ml Pyridin mit 0,75 ml önanthsäureanhydrid versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann wie in Beispiel 18 beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden I70 mg llß-Hydroxy-21-heptanoyloxy-15a,16a-methylen-4~ pregnen-3,20-dion erhalten.

Beispiel 21

180 mg llß,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion werden wie in Beispiel I7 beschrieben mit Acetanhydrid in Pyridin umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 145 mg llß-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 22

200 mg 6a-I?luor-llß,21-dihydroxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 2 ml Pyridin mit 0,25 1 Pivalinsaure-

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chlorid versetzt und 18 Stunden bei 5°C stehengelassen. Es wird wie in Beispiel 18 beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 130 mg 6a-Fluor-llß-hydroxy-21-trimethylacetoxy-15a»16oc-methylen-4-pregnen-3j20-dion erhalten.

Beispiel 23 ^ .

200 mg 6<z-ITuor-llß, 21-dihydroxy-15oc, 16a-methylen-l, 4-pregnadien-3,20-dion werden wie in Beispiel 18 beschrieben mit Buttersäureanhydrid in Pyridin umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 150 mg 6a-STuor-llß-hydroxy-21-butyryloxy-15oc, 16α-methyl en-1,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 24

40 ml absolutes Pyridin werden auf -15 C gekühlt, und unter Rühren werden 2,59 ml frisch destilliertes Schwefeltrioxid zugetropft, so daß die Innentemperatur nicht über -5 C ansteigt. In diese Lösung werden20 g 6a-I¹luor-llß,21-dihydroxy-15a₅16amethylen-l,4-pregnadien-3,20-dion eingetragen, und es wird mit 10 ml Pyridin nachgespült. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit 400 ml V/asser verdünnt, weitere 30 Minuten gerührt und mit 70,5 ml 1-n Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt. Zur Entfernung des Pyridins wird mit Methyleiichlorid extrahiert. Der pH-Vert der wäßrigen Phase wird mit 1-n Natronlauge auf pH 8 nachgestellt, und die Lösung wird im Vakuum bei 40°C Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand wird in 500 ml Methanol gelöst, das Natriumsulfat abfiltriert und das

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-Jßfy

Filtrat im Vakuum eingedampft und getrocknet. Man erhält Natrium-(6a ,fluor-llß-hydroxy-3,20-dioxo-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-21-yl)-sulfat.

Beispiel 25

In eine Lösung von 20 g 6a-]fluor-llß,21-dihydroxy-i5a,16amethylen-l,4-pregnadien-3,20-dion in 200 ml Pyridin werden unter Kühlen und Rühren 20 ml Methansulfonsäurechlorid eingetropft. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten wird die Reaktionslösung in Eiswasser gegossen und das ausgefallene 21-Mesylat abfiltriert. 15,4 g des so erhaltenen 6ct-]?luor-llß-hydro:xy-21-mesyloxy-15«,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dions werden in 500 ml Aceton gelöst und nach Zugabe von 15,4 g Natriumiodid in 400 ml Aceton 15 Minuten unter Sieden erhitzt. Die filtrierte Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit verdünnter Natriumthiosulfatlösung verrührt, abgesaugt, mit Wässer gewaschen, in. 300 ml Aceton gelöst und in der Wärme mit 120 ml Wasser ,gefällt. Hach Abkühlen isoliert man 14,1 g 6a-Fluor-21-ood-llß-hydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion mit einem Zersetzungspunkt bei 157-16O⁰C. 14,1 g der 21-Jodverbindung werden in 700 ml Acetonitril gelöst und mit 14,1 ml Orthophosphorsäure und 42 ml Triäthylamin 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Reaktionslösung unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand in Methanol aufgenommen und die Lösung

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mit 1 η methanolischer Natronlauge auf pH 11 eingestellt. Man filtriert den Rückstand ab, dampft das Filtrat im Vakuum ein und nimmt den Rückstand in 70 ml Methanol auf, durch. Zugabe von Äther wird das Dinatriumsalz gefällt. Das Dinatriumsalz kann durch Umfallen aus Methanol mit Äther gereinigt werden. Man erhält 11,9 g Di-natrium-(6a-fluor-llß-hydro:xy-.3,20-dioxo-, 16a -methyl en-1,4-pr egnadien-21-yl )-pho sphat.

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Claims

Patentansprüche

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1.) Methylensteroide der allgemeinen Formel I

C=O

^wJXq

(D ,

worin .; ... · ·

die Bindung ■- eine Einfachbindung oder, eine Doppelbindung, , X ein Wasserstoff atom, ein Fluoratom oder eine Methyl-

gruppe, .

Ϊ eine Hydroxymethylengruppe, eine Alkanoyloxymethylengruppe

oder eine ,Carbonyigruppe,
E^ ein Wasser st off atom, eine Hydroxygruppe oder eine Alkanoyloxygruppe und

E₂ ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten.

ρ .■

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2. ) llß, 17a-Dihydroxy-15a, 16α-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion. 3.) llß-Hydroxy-17a-acetoxy-15a, 16α-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion.

4.) 11a, 17a, 21-G?rihydroxy-15a, 16a-methyl en—4-pr eignen-3,20-dion. 5.) 11a, 17a, 21-Triacetoxy-15a, 16a-me thyl en-4-pregnen-3»20-dion.

6. ) 11a, 17a, 21-Trihydroxy-15a, 16a-me thyl en-1,4-pr egnadien-3 > 20-dion.

7.) Ha, 17a-Dihydroxy-21-acetoxy-15a, 16a-me thyl en-1,4-pr egnadien-3,20-dion.

8.) 17a-Hydroxy-21-acet oxy-15a, 16a-me thylen-1,4-pr egnadien-3»H, 20-trion.

9.) llß,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3_i20-dion. 10.) llß,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion. 11.) 6a-Fluor-llß,21-dihydroxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion.

12.) 6a-Fluor-llß, 21-dihydroxy-15a ₁16a-me thyl en-1,4-pregnadien-3,20-dion.

13.) llß-Hydroxy-17a-acetoxy-15a, 16a-methylen-1,4-pregnadien-3,20-""-dion.

14.) llß,I7a-Dihydroxy-21-acetoxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen~3_r20-dion.

— 3 —

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llß, 17«-Dili7äro3£y-21-'biityryloxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion. ^; *

16.) llß, 17a-Dihydroxy-21-hexanoyloxy-15a, 16a-methylen-1,4-pregnadien-3^20-dion.

17-) llß-Hydroxy-21-]ieptanoyloxy-l5a,lea-methylen^-pregnen-3,2O-dio:ii. ' -

18.) llß-Hydroxy-21-aeetoxy-15a, 16a-methylen-l, 4-pregnadien-3i2O-dion. ν ; .-. . .· _; ■ .

19·) 6a-I^tluor-llß-hydroxy-21-trimethylacetoxy-15a, 16o£-methylen-

20.) 6a-Fluor-llß-liydroxy-21-butyryloxy-15a, 16a-methylen-1,4-

21. } Hatrium- (6a~.fluor-llß-hydroxy-3,20-dioxo-15a ,.16a^methylenl,4-pregnadien-21-yl)-sulfat, . ...

22.".) Di-natrium(6a-flUor-llß-hydroxy-3,20-dioxo-15a._r16a-methylenl,4-pregnadien-21-yl)-phosphat.

23«»') Pharmazeutische Itäparate gekennzeichnet durch einen Gehalt an ein oder zwei Methylensteroiden gemäß Anspruch 1 TdIs 22,

. Ι·*0

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■••a

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► o e —

Verfahren zur Herstellung von^Methylensteroiden der allgemeinen Formel I .

C=O

CH.

(D ,

die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung, X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe,

Y eine Hydroxymethylengruppe, eine Alkanoyloxymethylengruppe oder eine Carbonylgruppe,

R-, ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine Alkanoyloxygruppe und

Ro eijg. Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten, .

dadurch gekennzeichnet,

■ - 5 -

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a) daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

C=O

(II) ,

worin X, R-, und R₂ die gleiche Bedeutung wie in Formel I "besitzen, ,

mit einer Kultur eines zur 11-Hydroxylierung befähigten

fermentiert,
MkroorganismusVund gegebenenfalls zusätzlich in der 1,2-Position dehydriert sowie gewünschtenfalls eine in der 11-Position vorhandene Hydroxygruppe oxydiert, vorhandene Estergruppen verseift oder vorhandene Hydroxygruppen verestert, oder

la?) daß man eine zur Herstellung von 15a, 16a-Methylen-Δ ' kortikoiden der allgemeinen Formel I eine Vex'bindung der allgemeinen Formel III

- 6

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CH₂E₃

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(IH) ,

und X die gleiche Bedeutung wie in Formel I "besitzen,

Z und V eine gegebenenfalls veresterte oderverätherte Hydroxymethylengruppe .oder eine gegebenenfalls ketalisierte Carbonylgruppe darstellen und R₅, ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls veresterte oder verätherte Hydroxygruppe. bedeutet. . ....-'.-

in Gegenwart von Zink mit Methylenjodid umsetzt und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet, in der 11- und/oder 20-Position vorhandene Hydroxygruppen oxydiert sowie vorhandene Hydroxygruppen verestert.

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