DE2451417C3

DE2451417C3 - Ester der 6,-Dimethyl-4-hydroxymethyl- l-phthalazon-7-carbonsäure, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2451417C3
Application number: DE2451417A
Authority: DE
Inventors: Michiro Inoue
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-10-30
Filing date: 1974-10-29
Publication date: 1981-01-29
Also published as: DK561874A; AU7295474A; LU71191A1; IL45675A; IN139552B; CH610892A5; IE39831B1; DE2451417B2; IL45675A0; PH10519A; HU168797B; ES431454A1; CH611282A5; IE39831L; DK134345B; SE412389B; CA1029377A; GB1459606A; SE7413530L; FI59402C

Description

ROOC

CH₃O

worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet

Z Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise (a) eine Verbindung der allgemeinen Formel

CO-Z

CHj

ROOC

(Π)

CH₃O

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung iiesitzt und Z eine Alkoxygruppe, Halogengruppe oder eine Gruppe der Formel

Il

— O —C —OR'

worin R' eine Methyl oder Äthylgruppe darstellt, bedeutet, mit einem Alkaliborhydrid in Gegenwart oder Abwesenheit eines Metallhalogenides umgesetzt wird oder (b) eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₃

ROOC

CH₃O

worin R die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzt, mit Hydrazin umgesetzt wird.

3. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen pharmazeutischen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der Rest R bedeutet die Methyl-, Äthyl-, n- oder iso-Propylgruppe.

In der DE-OS 22 37 832 ist angegeben, daß 4-Hydroxymethyl-1 -phthalazon pharmazeutische

Effekte auf die Behandlung von Haemorrhagie, Thrombose und Atherosclerose besitzt Weiterhin ist in der Beschreibung der DE-OS 22 38 566 angegeben, daß Alkoxycarboiiyl-4-hydroxymethyl-1 -phthalazon-deri vate die gleichen pharmakologischen Effekte aufweisen wie die in der DE-OS 22 37 832 angegebenen Verbindungen.

Anschließende Untersuchungen des Stoffwechsel-(I) durchganges bei Tieren und klinische Teste des 7-

Alkoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-l -phthalazones ergaben, daß bei der Verabreichung an Menschen und Tiere diese Verbindung rasch im Stoffwechsel zu der entsprechenden 7-Carboxyverbindung umgesetzt wird. Die Stoffwechselhydrolyse führt zur Bioinaktivierung der Alkoxycarbonylverbindung mit dem Ergebnis, daß die Zeitdauer der biologischen Wirkung der Verbindung relativ kurz ist.

Es wurde jetzt gefunden, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung gegenüber Stoffwechselabbau beständig sind und verlängerte biologische Aktivitäten im Vergleich zu den bekannten Verbindungen besitzen. Beim Test auf experimentelle Atherosclerose, die durch Cholesterinfütterung eingeleitet wurde, erwiesen sich die Verbindungen gemäß der Erfindung als hoch aktiv zur Verhinderung der Atherosclerose und zur Hemmung der Cholesterinabscheidung auf der Arterienwand; ihre Wirksamkeit ist etwa 3- bis 5mal größer als bei den bekannten Verbindungen. Die Verbindungen gemäß der Erfindung verhindern auch die Steigerung der Koagulierbarkeit und der Thrombogenizität des Blutes, die durch Cholesterin oder Adrenalin induziert werden; die Wirksamkeit ist ebenfalls etwa 5- bis lOmal größer als bei den bekannten Verbindungen. Das heißt die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindern wirksamer die Abkürzung der Gerinnungszeit des Blutes sowie die Erhöhung der durch Adenosindiphosphat induzierten Plättchenaggregation bei Menschen.

Weiterhin erwiesen sich die Verbindungen gemäß der Erfindung als aktiv zur Erniedrigung und Normalisierung des erhöhten Blutdruckes beim Test auf Hypertension von spontan hypertensiven Ratten, während die bekannten Verbindungen keine signifikante Aktivität auf erhöhten Blutdruck von Ratten zeigen. Diese Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in verbindung mit ihrem Hemmeffekt auf die cyclische AMP-Phosphodiesterase in Verbindung gebracht (ΠΙ) _w werden, die in biologischen Testen als üeispiel gebracht wird.

Lie Verbindungen gemäß der Erfindung sind somit wirksam ffir die Behandlung von hypertensiven Krankheiten, atherosclerotischen und thrombotischen Krankheiten. Derartige thrombotische Krankheiten umfassen beispielsweise Cerebralthrombose, Coronarthrombose und periphere Thrombose. Die atherosklerotischen Krankheiten umfassen Cerebralatherosclerose, Coronaratherosclerose, Arteriosclerosis obliterans, Throm-

W) boangitis obliterans, Thrombophlebitis, Angiopathie von Diabetes mellitus und Nephropathie von Diabetes mellitus. Sie besitzen auch eine gute Wirksamkeit bei der Behandlung von Krankheiten auf Grund der Fehlfunktion von cyclischen! AMP, beispielsweise Krebs,

t/, mentale und neurologische Störungen, Hormonstörungen und Herzfehlern.

Die Herstellung einiger Ausgangsverbindungen gemäß der Erfindung wird nachfolgend erläutert. Die

45

dabei aufgeführten Ziffern entsprechen jeweils den im folgenden Reaktionsschema angegebenen Ziffern der Verbindungen.

Das Diels-Alder-Addukt von Isodehydraeetsäureäthylester und Dimethylacetylendicarboxylat (I) (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft, 70, Seite 1354 (1937)] wird zu dem Phthalsäurederivat (2) hydrolysiert Die Behandlung von (2) mit Essigsäureanhydrid ergibt das Phthalsäureanhydridderivat (3). Die Behandlung des letzteren mit Malonsäure in Pyridin (80 bis 85°C) ergibt das S-hydroxy-S-methylphthalidderivat (4) in 60°/oiger Ausbeute. Die Oxidation von (4) in einer alkalischen Wasserlösung mit Kaliumpermanganat und anschließende Behandlung der Lösung mit Hydrazin ergibt die Säure (5), welche wiederum zu dem Ester (6) in 80%iger Gesamtausbeute verestert wird:

Me

COOMe

EtOOC I COOMe
Me
(D

HO Me

Me

EtOOC

Me

COOH

OOH

Me

YY

co

AA /

EtOOC [ CO
Me
(3)

COOH

COOEt

EtOOC

Me

EtOOC

Et = Äthyl

Die Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel Behandlung der letzteren mit Thionylchlorid und die (IH) kann beispielsweise nach dem folgenden Reaktions- anschließende Behandlung des erhaltenen Säureschema hergestellt werden. Das Die-.a-AIder-Addukt (1) chlorides mit Diazomethan liefert das Diazoketon (10). wird teilweise mit einem geringen Oberschuß von Die Behandlung der letzteren mit verdünnter Schwe-Kaliumhydroxid zu der Monosäure(9; hydrolysiert. Die 35 feisäure liefert das Isochroman-l,4-dion(ll):

Me

COOH

Me COCHN₂

EtOOC I COOMe
Me
(9)

EtOOC I COOMe
Me
(10)

Me

EtOOC

Me = Methyl

Bei einer Ausführungsform des Verfahrens (a) gemäß der Erfindung wird eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit einem Alkaliborhydrid in Gegenwart eines Lösungsmittels umgesetzt. Das bevorzugte Metallborhydrid besteht aus Natriumborhydrid und wird in äquimolarer Menge oder im Überschuß, vorzugsweise 1,5 bis 5MoI je Mol der Verbindung der allgemeinen Formel (II), eingesetzt. Die Umsetzung wird vorzugsweise in Gegenwart eines Metallhalogenides, wie Calciumchlorid, Magnesiumbromid, Lithiumbromrd oder Lithiumjodid, durchgefahrt. Lösungsmittel, Katalysatoren und Temperaturen, die vorteilhaft bei diesem Verfahren verwendet werden, sowie die durchschnittlichen Ausbeuten des Verfahrens sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.

Z	Lösungsmittel	Metall- halogenid	Temp. (C)	Ausbeute (%)
Alkoxy	Äthanol Methanol	CaCI₃	- 10°-30°	90-95
Hologen	Dioxan Tetrahydrofuran	-	10°-100°	50-80
— 0 — C- Il O	Tetrahydrofuran Dioxan	—	- 10°-50°	50-80



-OR'

ί.

Bei einer Ausführungsform des Verfahrens (b) wird eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) mit einer äquimolaren Menge oder einer überschüssigen Menge an Hydrazin vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels oder Verdünnungsmittels umgesetzt. Wasser und Äthanol werden als Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel bevorzugt. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Tempemur zwischen 30 und 100° C ausgeführt.

Andererseits können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R eine andere Alkylgruppe als eine Äthylgruppe ist, vorteilhafterweise ausgehend von einem e.e-Dimethyl^-äthoxycarbonyl^-hydroxy-

methyl-1-phthalazon hergestellt werden, das nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wurde. Beispielsweise

IO liefert die Behandlung von 6,8-DimethyI-7-äthoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-i-phthalazcn (!2) mit Trifluoressigsäure oder Kaliumhydroxid das 6,8-Dimethyl-7-carboxy-4-hydroxymethyl-l-phthalazou (13) in guter Ausbeute und das letztere kann zur Verbindung (14) in 80%iger Ausbeute mit einem Diazoalkan oder mit Ν,Ν-Dimethylformamiddiacetal entsprechend der Formel

(CHj)₂NCH(OR)₃,

worin R eine der vorstehend angegebenen Alkyigruppen darstellt, nach dem Verfahren gemäß Angewandte Chemie Intern. Ed, 2, Seite 212 (1963) oder Helvetica Chimica Acta, 48, Seite 1746 (1965) verestert werden:

CH₂OH

Me

EtOOC

(12)

Me O

Me

HOOC

(13)

CH₂OH

OR

Me O (Me)₂NCH

i
\

Me

ROOC

CH₂OH

N
NH

Me O

OR

(14)

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können allein verabreicht werden oder in Arzneimittel, wie Pulver, Tabletten, Granulate, Kapseln, Pastillen, Suspensionen zur oralen Verabreichung und Lösungen und Suspensionen für parenterale Verabreichung eingearbeitet werden.

Träger oder Verdünnungsmittel können pharmazeutisch verträgliche Flüssigkeiten oder Feststoffe sein und der Ausdruck Träger umfaßt im Rahmen dieser Erfindung auch Adjuvantien. Beispiele für flüssige Träger sind destilliertes Wasser zur Injektion, isotonische Natriumchloridlösung, Ringer-Lösung, Locke-Lösung, Polyäthylenglykol, Äthylalkohol, Propylenglykol, Glycerin und pflanzliche öle. Die festen Träger umfassen beispielsweise Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Stärke, Saccharose, Cetylalkohol, Kakaobutter und Spermacetwachs (Walrat).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von 6,8-dimethyl-7-äthoxycarbonyl-4-hydroxyirethyI-l-phthalazon

Unter Rühren wurde zu einer Lösung von 500 mg Natriumborhydrid in 200 ml Äthanol anteilweise 1,4 g 6,8-Dimethyl-4,7-diäthoxycarbonyl-1 -phthalazon bei — 5 bis 0°C zugesetzt und dann wurde eine Lösung von 700 mg wasserfreiem Calciumchlorid in 200 ml Äthanol tropfenweise zur Lösung zugesetzt. Es wurde weiterhin 3 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde unter verringertem Druck eingeengt und mit Wasser verdünnt und der pH-Wert auf 5 mit Essigsäure eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert, wobei 6.8-

Dimethyl^-äthoxycarbonyl^-hydroxymethyll-phthalazon (1,2p) mit einem Schmelzpunkt von 17! bis 172°C erhalten wurde, dessen Spektren nachfolgend angegeben sind:

45

50

55

60

65 UV-Spektrum:

(AtO H) πιμ, 218 (ε=57 000), 259 (ε = 15 000),
292(ε=11 800),307(ε=9600),321 (ε-7400).

IR-Spektrum:

(KBr) cm -'; 3400 (breit), 2920,1730,1650,1600,
1450,1280,1250,1150,1120,1030 (breit), 900.

NMR-Spektrum:

(Bestimmt in Dimethylsulfoxid)-d₆) ό: 1,25 (t, 3H),
2,4 (s, 3H), 2,69 (s, 3H), 4.25 (q, 2H), 4,7 (d, 2H),
5,2 (t, IH), 735 (s, IH).

Analyse: (ChHi₆O₄N₂):

Berechnet: C 60,86; H 5,84; N 10,14;
gefunden: C 60,78; H 5,80; N 10,34.

Die Ausgangssubstanz kann wie folgt hergestellt werden:

Ein Gemisch aus 4,6-Dimethyl-5-äthoxycarbonylbenzol-1,2-dicarbonsäureanhydrid (7,8 g, Schmelzpunkt 80 bis 8I⁰C), durch Erhitzen auf 100°C während 10 Stunden getrocknete Malonsäure (6,5 g) und absolutem Pyridin (7 ml) wurde auf 80 bis 85°C während 15 Stunden erhitzt. Nach der Abkühlung wurde 10%ige, wäßrige Salzsäur? zugesetzt und das Gemisch mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und mit gesättigter wäßriger Nariiumbicarbonatlösung extrahiert. Der Natriumbicarbonatextrakt wurde mit verdünnter Salzsäure sauer gemacht und mi: Äthylacetat extrahiert. Der extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der erhaltene Rückstand wurde aus Äther/n-Hexan umkristallisiert und ergab 5,7-Dimethyl-6-äthoxycarbonyl-3-hydroxy-3-methylphthalid (5,4 g, Ausbeute 62%) mit einem Schmelzpunkt bei 118 bis 120⁰C.

Zu einer Lösung von 5,7-Dimethyi-6-äihoxycarbonyl · 3-hydroxy-3-methylphthalid (1.32 g) und Kaliumhydroxid (1 g) in Wasser (100 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von 1,58 g KMnO₄ in 80 ml Wasser unter Rühren zugesetzt. Es wurde weitere 1,5 Stunden gerührt, dann das ausgefällte Mangandioxid abfiltriert und

das Filtrat mit Kohlendioxid gesättigt. Zu der Lösung wurden 5 ml 80%iges Hydrazinhydrat zugesetzt und dann wurde die Lösung auf 70 bis 80°C während 2 Stunden erhitzt. Nach der Abkühlung wurde die Lösung mit verdünnter Salzsäure angesäuert und der erhaltene Niederschlag vom Methanol abfiltriert und umkristallisiert, wobei 6,8-Dimethyl-7-äthoxyciirbonyl-l-phthalazon-4-carbonsäure (1,1 g) mit einem Schmelzpunkt von 216 bis 2)8°C erhalten wurde.

Die e.e-Dimethyl^-äthoxycarbonyl-l-phthala/on-4-carbonsäure wurde unter Rückfluß mit absolutem Äthanol und konzentrierter Schwefelsäure erhitzt und das Gemisch in üblicher Weise aufgearbeiiet, wobei 6,8-Dimethyl-^-diathoxycarbonyl-1 -phthalazon mit

einem Schmelzpunkt von 159 bis 161°C in einer Ausbeute von 90 bis 95% erhalten wurde.

Beispiel 2

in ana\norr Wpiqp wip in Β?>5^ηΙ?! I, Würde ?A!S 6.8-

Dimethyl-4,7-dimethoxycarbonyl-1 -phthalazon:
Schmelzpunkt 240 bis 241⁰C (umkristallisiert aus Methanol) das 6.8-Dimethyl-4-hydroxymethyl-7-methoxycarbonyl-1-phthalazon: Schmelzpunkt 204 bis 205°C (umkristallisiert aus Methanol) NMR-Spektrum (bestimmt in Dimethylsulfoxid-dejo: 2,4 (s, 3H). 2,7 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 4.6 (d, 2H), 5,3 (breit, IH), 7.8 (s. IH) hergestellt.

Als Ausgangssubstanzen hierfür dienten das Diels-Alder-Addukt von Isodehydracetsäuremethylester und Dimethylacetylendicarboxylat,

4,6-Dimethyl-5-methoxycaΓbonylbenzol-l,2-dicarbonsäureanhydrid: Schmelzpunkt 129 bis 131°C (umkristallisiert aus Äthylacetat/n-Hexan)
5,7-Dimethyl-6-methoxycarbonyl-3-hydroxy-3-methylphthalid: Schmelzpunkt 104 bis 106⁰C (umkristallisiert aus Äthylacetat/n-Hexan)

e.e-Dimethyl^-methoxycarbonyl^-carboxy-1 -phthalazon: Schmelzpunkt 221 bis 223°C umkristallisiert aus Methanol).

Beispiel 3

HprqtpllnntJ vnn fi R-Dimpthvl-7-äthoxvrarhnnvl-4-hydroxymethyl-l -phthalazon

Eine Lösung aus 2 g 6,8-Dimethyl-7-äthoxycarbonylisochroman-!,4-dion,4 ml 80%igen Hydrazinhydrat und 50 ml Äthanol wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde unter verringertem Druck eingeengt, mit Wasser verdünnt und mit verdünnter Salzsäure schwach sauer gemacht. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert und ergab e^-Dimethyl^-athoxycarbonyl^-hydroxymethyl-1 -phthalazon (1.2 g) mit einem Schmelzpunkt von 171 bis 172°C, dessen IR-Spektrum identisch mit der in Beispiel 1, erhaltenen Probe war. Die Ausgangssubstanz kann wie folgt hergestellt werden 3,5-Dimethy!-4,6-diäthoxycarbonylbenzoesäure wurde bei schwachem Rückfluß mit Thionylchlorid erhitzt und der Überschuß an Thionylchlorid abdestilliert- Der erhaltene Rückstand wurde mit einer Lösung eines Oberschusses von Diazomethan in Äther behandelt und ergab S.S-Dimethyl^.e-diäthoxycarbonyl-w-diazoacetophenon (Schmelzpunkt 78 bis 89° C) in 60%iger Gesamtausbeute. Die letztere Verbindung wurde unter Rühren zu einer Mischung aus einer 15°/oigen wäßrigen Schwefelsäüreiösung (2ni!) und Dioxan (10 m!) bei Raumtemperatur zugesetzt Die Lösung wurde 2 Stunden gerührt und dann wurde die Temperatur der Lösung auf 80 bis 90"C erhöhf und wahrend 1 Stunde dabei gehalten. Die Lösung wurde abgekühlt, mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde eingedampft und der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert, wobei 6,8-Dimethyl-7iithoxycarbonylisochroman-l,4-dion mit einem Schmelzpunkt von 142 bis I44^CC in 73% Ausbeute erhalten wurde.

Beispiel 4

2 g 6,8-Dimethyl-7-äthoxycarbonyl-4-hydroxy-

methyl-1-phthalazon und 30 ml Trifluoressigsäure wurden 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Säure wurde entfernt und der Rückstand mit einem Gemisch aus Äthylacetat und IO%iger. wäßriger KOH-Lösung geschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Essigsäure angesäuert, der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert, wobei 6,8-Dimethyl-7-carboxy-4-hydroxymethyl-

l-nhthala7nn i1fi4g) mit rinpm Srhnipl7niinkl vnn 282 bis 284°C erhalten wurde.
Massenspektrum:

248 (M + ). 231.219.204. 175.

IR-Spektrum:

(KBr). cm-¹, 3400. 3250. 1705. 1640. 1380. 1280. 1160,1020.780.

Eine Suspension von 6.8-pimethyl-7-carboxy-4-hydroxyme'Hyl-1 -phthalazon in Äther wurde mit einer Lösung von Diazomethan in Äther behandelt. Nach der

jo Zersetzung des Überschusses an Diazomethan wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand aus Methanol umkristallisiert, wobei 6.8 Dimethyl-7-meihoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-l -phthalazon mit einem Schmelzpunkt von 204 bis 205⁼C erhalten wurde. Das

π IR-Spektrum war identisch mit demjenigen der in Beispiel 2 erhaltenen Probe.

Beispiel 5

Eine Suspension von 430 mg 6.8-Dimeth\!-7-carboxy-4-hydroxyniethyl-l-phthalazon. 20 ml Dimethylformamid-diisopropylacetal und 80 ml Toluol wurde 26 Stunden unter Rückfluß erhitzt und dann wurde das Losungsmittel unter verringertem urucK entternt. Der Rückstand wurde mit einem Gemisch aus Äthylacetat 4-, und einer 10%igen wäßrigen Kaliumcarbonatlösung gerührt. Die abgeschiedene organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer Kolonne mit Silicagel mit Chloroform als Eluierungsmittel Chromatographien. Aus den Eluaten wurde 6,8-DimethyI-7-isopropoxycarbonyl-4-hydroxymeth^> 1-phthalazon (185 mg) mit einem Schmelzpunkt von 176 bis 178° C erhalten.

IR-Spektrum:

(KBr) cm-': 3400 (breit). 1730, 1640, 1605, 1285, 1240,1160,1115.

Massenspektrum:

m/e; 290 (M + ). 248. 247, 232. 231, 204, 202. 200.

Biologische Teste

1) Effekt der erfindungsgemäßen Verbindungen zur
Verhinderung der Plättchenaggregation bei Menschen

rn vitro

Die Verbindungen gemäß der Erfindung zeigen einen ausgeprägten Effekt zur Verhinderung der durch ADP

IO

(Adcnosindiphosphat) oder Adrenalin eingeleiteten Pläuchenaggregation beim Menschen in vitro.

Proben von menschlichem CPRP (citratisiertem plättchenreich?n Plasma) wurden bei 37⁰C während 200 Sekunden mit ' Ίο Volumen Kochsalzlösung, die verschiedene Mengen der zu testenden Verbindung enthielt, inkubiert. Zu dem Gemisch wurde dann ADP (3^p:,Mol) oder Adrenalin (I ng/ml) zugesetzt. Die Intensität der primären und sekundären Aggregation wurde mit einem Plättchenaggregationsmeßgerät (Chrono-Log. Modell 300)bestimmt.

Die Intensität der durch ADP oder Adrenalin induzierten Aggregation jeder Probe, die mit der Verbindung inkubiert worden war, wurde mit derjenigen der gleichen Probe, die mit Salzlösung inkubiert worden war. verglichen. Das Verhältnis wird als Prozentsatz der Intensität der Aggregation mit der Verbindung gegenüber derjenigen mit Salzlösung angegeben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I enthalten.

Die Intensität der primären und sekundären Aggregation der Plättchen wurde nach dem Verfahren von H.Yamazaki, T. Sano und Mitarbeiter mit dem Titel »Platelet Functions in Thromboembolie Disorders«. Thrombosis et Diatheses Haemorrhagica, Band 60, [1974], Seiten 213-222, und den dort angegebenen Literaturstellen bestimmt.

Wie aus Tabelle I ersichtlich, hemmten die erfindungsgemäßen Verbindungen die durch ADP oder Adrenalin induzierte primäre Aggregation mit etwa vergleichbarer Aktivität zu 4-Hydroxymethyl-I -phthalazon (Verbindung gemäß der DE-OS 22 37 832) und Z-Äthoxycarbonyl^-hydroxymethyl-1 -phthalazon (Verbindung gemäß der DE-OS 22 38 566). Jedoch zeigten sich die Verbindungen gemäß der Erfindung weit wirksamer für die sekundäre Aggregation im Vergleich zu den ersteren Verbindungen. Das heißt die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmten die durch ADP oder Adrenalin induzierte sekundäre Aggregation in einer Konzentration von I bis 2,5 ng/ml mit statistischer Signifikanz, während 7-Äthoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-1-phthalazon die sekundäre Aggregation erst in einer Konzentration von 5 bis IO μg/ml hemmte.

Tabelle I

Hemmungsverhältnii. der Plättchenaggregation bei Menschen in vitro

Inkubiert mit	μκ/ml	Falle	ΑϋΡ3μΜοΙ	Sekundär	Fälle	Adrenalin 1 μg/ml	Sekundär
			Primär	75,5 ±5.9")		Primär	62.7 ±10,7")
Acctylsalicylsäure	300	10	108.9 ±3,6	70.2 ±10.1*)	10	107.5 ±2.6	46,6 ±7,9")
(Kontrolle)	80	10	95,7 ±1,8	78.0 ±9.9	10	95.6 ±5.2	45.0 ±7,8")
	40	10	98,9 ± 3.4	68.3 ±3.8')	10	105,7 ±3.3	60.2 ±8,0*)
4-Hydroxymethyl-	300	10	84,5 ±2,0·)	64.9 ±6.7	10	85.4 ±3.1*)	69,2 ± 7,2
1-phthalazon	80	10	82,4 ±3.2	72,0 ±6.8	10	923 ±6,0	85.9 ±10,1
(Kontrolle)	40	10	86.2-2,5	15,7 ±0.4")	10	98,8 ±5,9	33,0 ±7,1")
7-Äthoxycarbonyl-	80	10	62,9 ±5,0"	58.6 ±7.6")	10	81.9 ±6.5*)	71,7 ±13,5*)
4-hydroxymethyl-	20	14	77,0±5,l"	67.1 ±6.3")	10	92.9 ±16.9	82,1 ±9,5
l-phthsilazon	10	14	81,9 ±5,2"	84,9 ±6,3	10	97,0 ±4,1	80,8 ±13,9
(Kontrolle)	5	14	90,5 ±5,6	41,9±2.2	10	105,8 ±6,9	—
6,8-Dimethyl-	40	10	68,5 ±5,2	56.2 ±6.3")	_	_	99,6 ±13.2
7-äthoxycarbonyl-	20	10	93,1 ±8,2	49.9 ±6,9")	10	97,5 ±7,5	57,1 ±16,0")
4-hvdroxvmethvl-	10	10	90,6 ±3,8	59,8±11,3**)	10	89,1 ±7,3	52,4 ±7,J
1-phthalazon	5	12	93,3 ±8,9	96.0 ±8.7	10	82,4 ±3,0	52,8 ±7,5")
[erfindungsgemäß)	2.5	10	91,7 ±8,3		10	88.5 ±3,1*')
) B < 0,05. *) P < 0,01.
Hemmverhältnis
	intensität der Aggregation der mit der Verbindung inkubierten CPRP

Intensität der Aggregation der mit Salzlösung inkubierten CPRP

2) Effekt der erfindungsgemäßen Verbindungen für die

Verhinderung und den Regress der experimentell

induzierten Atherosclerose

Die Verbindungen gemäß der Erfindung zeigen einen ausgeprägten Effekt zur Verhinderung der durch Cholesterin induzierten Atherosclerose von Versuchs tieren und gleichzeitig zeigen sie auch einen Regresseffekt gegen voreingestellte durch Cholesterin induzierte Atherosclerose, wobei der Cholesteringehalt in der Aortawand der Tiere verringert wird.

40 gesunde Albinokaninchen des gleichen Alters und der gleichen Familie wurden im Versuch verwendet. Sie wurden in fünf gleiche Gruppen geteilt und jede der fünf Gruppen erhielt oral 4-HydroxymethyI-1-phthalazon (Kontrolle), /-Äthoxycarbonyl-^hydroxy-

55

60

65 methyl-1-phthalazon (Kontrolle), 6,8-Dimethyl-T-äthoxycarbonyW-hydroxymethyl-1 -phthalazon und Placebo (Kartoffelstärke) jeweils in täglichen Dosierungen von 1 mg/kg mit 150 g/Tag einer Diät, welche 1% Cholesterin enthielt, während 15 Wochen.

Nach Beendigung des Zeitraumes wurden sie getötet und der Prozentsatz der durch Fettstreifen befallenen Oberfläche wurde in jeder Aorta der Kaninchen, die mit Sundan IV gefärbt waren, gemessen. Der Prozentsatz der durch Fettstreifen befallenen Oberfläche in der Aorta der Kaninchen wurde nach dem Verfahren von T. Shimamoto, F. Numano, T. Fujita; American Heart Journal, 7!, Seite 2! 6 - 237 (1966) bestimmt

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle H aufgeführt

Tabelle II

Gruppe, die erhielt

Prozenlsatz der durch Fellstreifen befallenen Oberfläche

Placebo-Kontrolle (Kartoffelstärke) 54,6 ±5,4 4-Hydroxymethyl-1 -phthalazon 36,8 ± 5,2")

(Kontrolle)

T-Äthoxycarbonyl^-hydroxymethyl- 28,8 ± 3,6* *) I -phthalazon (Kontrolle)

ö.S-Dimethyl^-äthoxycarbonyl- 16,2 ±4,3**)

4-hydroxymethyl-l -phthalazon
(erfindungsgemäß)

P < 0,05 gegenüber der Placebo-Kontrollgruppe. P < 0,01 verabreichte Gruppe.

Für den Regreßtest wurden 50 gesunde Albinokaninchen mit einer Diät, die 1% Cholesterin enthielt, während 15 Wochen gefüttert. Fünf Kaninchen wurden am Ende der 15. Woche der Cholesterinfütterung getötet und die verbliebenen 45 Kaninchen wurden in 3 Gruppen aufgeteilt. An jede der Gruppen wurden oral 7-Äthoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-1 -phthalazon (Vergleich), 6,8-Dimethyl-7-äthoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-1 -phthalazon und Placebo (Kartoffelstärke) jeweils in täglichen Dosierungen von 1 mg/kg mit 150 g einer üblichen Diät verabreicht. Jeweils 5 Kaninchen der drei Gruppen wurden nach 6, 10 und 20 Wochen getötet. Der Gesamtgehalt an Cholesterin in der Aortawand wurde durch Gaschromatographie bestimmt; die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Gruppe, verabreicht mit

Zeit- Cholesterinraum gehalt (Woche) fog)

Placebo-Kontrolle 6 32,1 ±3,6

(Kartoffelstärke) 10 33,8 ±3,0

20 29,5 ±5,4

Z-Äthoxycarbonyl^-hydroxy- 6 24,6 ± 3,0

methyl-l-phthalazon 10 12,2 ± 3,5

(Vergleich) 20 6,4 ±2,7

6,8-Dimethyl-7-äthoxy- 6 20,8 ±3,1

carbonyl-4-hydroxy- 10 9,7 ±4,2

methyl-1-phthalazon 20 4,2 ±1,8 (erfindungsgemäß)

1. Der Gesamtgehalt an Cholesterin in Aortawand wurde nach dem Verfahren von T. Shimamoto, F. Numano, T. Fujita und Mitarbeiter, Asian med. Journal, Band 8, Seite 825 - 838 (1965) gemessen.

2. Der gesmate Cholesteringehalt sn- Ende der ersten 15 Wochen betrug 42^5 + 8,5 μg/mg Trockengewicht

3. Der in der Tabelle IH angegebene gesamte Cholesteringehalt ist in μg/! mg der getrockneten Aortawand angegeben. Der Wert in der Tabelle ist der Durchschnittswert für 5 Kaninchen.

3) Effekt der e-findungsgemäßen Verbindungen

zur Hemmungdercyclischen AMP-Phosphodiesterase

in der Aortawand von Kaninchen

und in menschlichen Plättchen >

Die Verbindungen gemäß der Erfindung zeigen einen ausgeprägten Hemmeffekt gegen die cyclische AMP-Phosphodiesterase in der Aortawand von Kaninchen und in menschlichen Plättchen.

ι» Die überstehende Flüssigkeit von homogenisierten intimen Medien der Aortawand von Kaninchen oder das menschliche plättchenreiche Plasma wurde mit einem Reagensgemisch aus mit Tritium markiertem cyclischen AMP (cyclisches Adenosin-3',5'-mono-

ii phosphat) und verschiedenen Mengen der Verbindungen inkubiert.

Das inkubierte Gemisch wurde durch Säulenchromatographie gereinigt und die das Nucleotid enthaltende Fraktion quantitativ mit einem flüssigen

in Szintillationszähler analysiert.

Tabelle IV zeigt den Hemmeffekt dieser Verbindungen gegen die cyclische AMP-Phosphodiesterase. Die Werte in der Tabelle zeigen die erforderliche Menge der Verbindungen, um 50% Hemmung der

2> cyclischen AMP-Phosphodiesterase zu ergeben.

Wie sich aus Tabelle IV zeigt, sind die Verbindungen gemäß der Erfindung stärker wirksam zur Hemmung der Phosphodiesterase als Theophyllin, Kaffein oder die bekannte Verbindung. Das bedeutet, daß die vorliegenden Verbindungen zur Erhöhung der Konzentration von cyclischem AMP in den Plättchen und der Aortawand wirksam sind.

Tabelle IV
Ι₅ο(μΜο1)

Verbindung

Plättchen Aortawand

(Mensch) Intima Media (Kanin- (Kaninchen) chen)

7-Äthoxycarbonyi- 4-hydroxymethyl- ' 1-phthalazon (Vergleich)	57	52	1,6	144
Theophyllin (Vergleich)	91	127	155
Kaffein (Vergleich)	350	-	460
6,8-Dimethyl-7-äthoxy- carbonyl-4-hydroxy- methyl-1 -phthalazon (erfindungsgemäß)	4,1	24

12 46

propoxycarboriyI-4-hydroxymethyl-1 -phthalazon
(erfmdungsgemäß)

(F=177-179°C;umkristallisiert aus Methanol)

Das Verfahren beim Versuch wurde entsprechend dem Verfahren von H. Hidaka und M. Shibuya vA new assey of cyclic nucleotide phosphodiesterase and its application to human«, Biochemical Medicine 10 (1974), S. 301 -311 durchgeführt

4) Hypotensiver Effekt der erfindungsgemäßen Verbindungen bei spontan hypertensiven Ratten

Die Verbindungen gemäß der Erfindung haben einen einzigartigen hypotensiven Effekt für spontanhypertensive Ratten. Die spontan-hypertensiven Ratten, abgekürzt SH-Ratten, wurden durch selektive Züchtung von spontan-hypertensiven Ratten und kontinuierliche Einjüchtung mit hypertensiven Tieren erzeugt, die als genetisch hypertensiv zu bezeichnen sind. Es wird angenommen, daß die SH-Ratten eine schlagende Ähnlichkeit für die für Menschen wesentliche Hypertension besitzen und in diesem Morbidzustand vorliegen.

4-Hydroxymethyl-1-phthalazon und 7-Äthoxycarbo-

Tabelle V-a

nyl-4-hydiOxyniethyl-l-phthalazon, die bekannt sind, zeigten keinen signifikanten hypotensiven Effekt bei intraperitonealen oder oralen Dosierungen bis zu 50 mg/kg. Andererseits zeigten die erfindungsgemäßen Verbindungen einen eindeutigen hypotensiven Effekt in Dosierungen von 0,78 bis 50 mg/kg, die intraperitoneal oder oral gegeben wurden, wie aus Tabelle V-b ersichtlich.

Beim Blutdrucktest wurden SH-Ratten mit dw-> Gewicht von 210 bis 250 g im Alter von 13 bis 15 Wochen verwendet und die untersuchten Verbindungen wurden intraperitoneal verabfolgt. Jeder Wert der Tabelle V zeigt den Durchschnittswert von drei Ratten.

Verbindung
(Dosierung: 50 mg/kg)

Rlntdnirk vor 24

4-Hydroxymethyl-l-phthalazon	Blutdruck	183	178	179	180	182	184
7-Äthoxycarbonyl-4-hydroxymethyl-	Blutdruck	178	165	176	180	179	184
1-phthalazon

Tabelle V-b

Verbindung: 6,8-Dimethyl-7-äthor<ycarbonyl-4-hydroxymethyl-l-phthalazon

Dosierung
mg/kg

Blutdruck und Depression (%)

Zeit (Std.) nach der Dosierung vor 1

24

48

Blutdruck
Depression %

170	165	132
	2,9	22,4
175	173	155
	1,1	11.4
173	170	138
	1.7	20.2
183	177	167
		8,/
	5) Toxizitätstest

Die Ergebnisse des Toxizitätstest (LD50) der Verbindungen gemäß der Erfindung sind zusammen mit bekannten Verbindungen in der folgenden Tabelle gezeigt. Der Versuch wurde durch orale Verabfolgung 110
35,3

120
28.6

36,4

143
21,9

unter Anwendung von Mäusen ausgeführt. Der Toxizitätstest zeigt, daß diese Verbindungen verhältnismäßig nicht-toxisch sind.

145	152
14,7	10,6
142	155
18,9	11,4
135	150
22,0	13,3
160	169
12,b	8,8

50

	LD30
	(mg/kg)
4-Hydroxymethyl-l-phthalazon	4000
7-Äthoxycarbonyl-4-hydΓOxymethyl-	5000
1-phthalazon
ö.e-Dimethyl^-äthoxycarbonyl-	4250
4-hydroxymethyl-1 -phthalazon
(erfindungsgemäße Verbindung)
6,8-dimethyl-7-isopropoxycarbonyl-	5000
4-hydroxymethyl-1 -phthalazon
Acetylsalicylsäure	1750
Coffein	200
Theophyllin	350

Claims

Patentansprüche:

1. Ester der 6,8-Dimethyl-4-hydroxymethyI-l-phthalazon-7-carbonsäure der allgemeinen Formel

CH₂OH

CH₃