DE2428957A1 - Verfahren zur herstellung von desacetoxycephalosporin c - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C

Die vorliegende Erfindung bezieht' sieh auf ein Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C durch Fernientierung, wobei in der nachfolgenden Beschreibung und in den Ansprüchen das Desacetoxycephalosporin C und/oder dessen Salze, soweit nichts anderes angegeben wird/ aus Zweckmässigkeitsgründen als DACPC bezeichnet v/erden. '

DACPC stellt als selchen ein wertvolles Anti-W oi;iiri.;rr. (\?,v und kann als Au-^:?.ⁱ£-:-".~.?ve^r'liiriciiJri?; für >Ί*<ρ Herstel.'ί-ung von Cepha j ospori nanr.i bj.otu ka, wie z.B.

Tür dit: Or-Ale V«rabj.<?iOrrunß vferWGTiueu ννθΓ-deil.

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Solche Antibiotika sind für klinische Zwecke sehr wertvoll, weil sie bei bestimmten Infektionen hervorragende Wirkungen gegen grampositive und gramnegative Bakterien und auch hervorragende Wirkungen bei Infektionen durch gegen verschiedene Antibiotika resistente Bakterien besitzen. DACPC besitzt in der freien Form die folgende Formel:

O H η S HOOC-CH- (CH₀) .,-C-IiH-CU-C ""Ί

COOH

Das Ueberführen von DACPC in Cephalexin kann so durchgeführt werden, dass man den a-Aminoadipinsäurerest chemisch vom DACPC abspaltet, wobei man die 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure erhält, viorauf man eine von verschiedenen Acylgruppen entweder chemisch oder enzymatisch, beispielsweise nach der Methode gemäss Journal of American Chemical Society £4, 4035 (1972), in die 7-Steilung zur Aminogruppe einführt. Eine der bekannten Methoden für die Herstellung von Cephalosporinantlbiotika, vrelche eine "5 -Me thy !gruppe aufweisen, besteht darin, dass man ein durch Fermentation erhältliches Penicillin auf

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chemische Welse so zur Umsetzung bringt, dass eine Ei"weiter\i)Tg rlesIFUngos unter Bildung einer Cephalosporinverbin·- dung ,mit einer Methylgruppe in der "5-Stelluxig gebildet wird, welche man dann als synthetisches Zwischenprodukt 'für die Herstellung der gewünschten Antibiotika verwendet [Journal of American Chemical Society _8j5, 1896 (1963)].

Gemass einer anderen Methode wird Cephalosporin C (nachstehend der Kürze wegen lediglich als CPC bezeichnet), durch einen Perinentierungsprozess chemisch katalytisch zu DACFC reduziert, welches hierauf als Zwischenprodukt für die gewünschten Antibiotika verwendet wird [Journal of Medicinal Chemistry 7, 117 (196²O]. Diese Methoden bedingen aber eine Kombination sowohl eines Fermentierungsverfahrens als auch eines chemischen Verfahrens, wodurch die Methoden erschwert und die verschiedenen Arten von Ausrüstungen verteuert werden, so dass sie vom wirtschaftliehen Standpunkt aus betrachtet Nachteile aufweisen.

Aus diesen Gründen wurden ausführliche Versuche unternommen, um eine neue Methode zu entwickeln, dank welcher man DACPC leicht und wirtschaftlich bei niedrigen Gestehungskosten herstellen kann. Dabei wurde festgestellt, dass sich Mikroorganismen der Gattungen Streptomyces, Cephalosporium, Emericellopsis, Paeciiomyoes, Anixiopsis, A-rnnKvorcyces c\r\&-? Spirol ciiiiffi DACPC In freier Forir: od-r in Form von Salzen direkt in den Ku] turbriihen anzureichern

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vermögen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen und wirtschaftlich vorteilhaften Verfahrens für die Herstellung von DACPC in hoher Ausbeute, welches darin besteht, dass man einen Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces, Cephalosporiuni, Emericellopsis, Paecilomyces, Anixiopsis, Arachnomyces oder Spirodium gehört und DACPC zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium solange züchtet, bis das DACPC in der Kulturbrühe wesentlich angereichert ist, worauf man das DACPC daraus gewinnt.

Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann man beliebige Mikroorganismen, welche zu den Gattungen Streptomyces (z.B. Streptomyces griseus, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces hy^groscopicus), Cephalosporium (z.B. Cephalosporium acremonium, Cephalosporium polyaleurum und andere Arten), Emericellopsis (z.B. Emericellopsis microspora, Emericellopsis glabra), Paecilomyces (z.B. Paecilomyces carneus, Paecilomyces persicinus), Anixjopsis (z.B. Anixiopsis peruviana), Arachnomyces (z.B. Arachnomyces minimus) oder Spiroidium (z.B. Spiroidiurn fuscum) gehören, verwenden, soweit sie DACPC zu erzeugen vermögen.

Die folgenden Mikroorganismen können.unter anderen beispielsweise mit Vorteil für das erfindungsgemässe Verfahren Verwendung finden. "■ Streptomyces griseus U-25 (IFO-13550, FERM-P Nr. 209^,

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Streptomyces elavuligerus C-778 (IFO-13548, FERM-P Nr. 2093) Streptomyces hygroseopicus U-442 (lFO-13598, ATCC- )

Cephalosporium sp.(ATCC-1155O) Cephalosporium sp. (ATCC-14553)

Cephalosporium acremoniurn C-3900 (IF0-9756, FERM-P Nr. 2287) Cephalosporium acremonium K-l86 (IFO-9918, ATCC-204l6) Cephalosporium polyaleururn Y-505 (IF0-9535, FERM-P Nr. 11βθ,

ATCC-20360)

Cephalosporium polyaleurum 7-64 (IFO-9920, AT.CC-2O4l5) Cephalosporium polyaleurum 199 (IFO-9394, FERM-P Nr. 1159,

■-.. _. ATCC-20359)

Emerlcellopsis microspora I512I (IF0-9723, FERK-P Nr. 2095) Emerlcellopsis microspora K-1Ö3 (IFO-992,. ATCC- ) Emericellopsis glabra (IFO-9031) Emericellopsis glabra (lFO-9033) Emericellopsis glabra (lFO-9034) Paecilomyces carneus C-2237 (IF0-9729, FERM-P Nr. 2096,

ATCC-20417)

Paecilomyces carneus C-4053 (lFO-9730, FERM-P Nr. 2098) Paecilomyces persiclnus C-3OO9 (lFO-9731, FERM-P Nr. 2097,

ATCC-20418)

Anixiopsis peruyiana C.B.S.-301.67 Anixiopsis peruviana K-21 (IFO-9916, ATCC-20419) Arachnomyccs minimus C.B.S.-324.7Ö' Arachnomyces minimus K-I54 (TFO-9917, ATCC-20420)

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Spiro! dium fuscurn (IFC-5^79) Spiroidium fuscurn K-461 (IPO-9923, ATCC-20421)

Die in Klammern nach den erwähnten Stämmen wiedergegebenen Bezeichnungen, wie 2.B. IFQ, PERM-P, CBS bzw. ATCC, stellen die Nummern, unter welchen sie beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan. (IPO);- the Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan (PERM); Centraalbureau voor Schirr.-rnelculturec, Holland (CBS); bzvr. American Type Culture Collection, USA (ATCC) zugänglich sind, dar.

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stärame sind die folgenden:
(A) Streptomyces griseus U-25
1. Morphologische Eigenschaften

a) Art der Verzweigung der sporogenen Hyphen:

monopodial verzweigt;. Büschel bildend. T₃) Konfiguration der sporogenen Hyphen: Rectus-flexibilis.

c) Zahl der Sporen: nicht weniger als 10.

d) Oberflächenstruktur und Grosse der Sporen: glatt, 0,8 auf 0,8 bis 1,2 u.

e) Flagellen:

nicht beobachtbar.

f) Sporangien:

nicht feststellbar.

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2* Wachstumseigenschaften auf verschiedenen I-Iedien: die Resultate bei. der Züchtung bei 28 ^CC während 1 bis "5 Wochen finden sich in der folgenden Tabelle 1,

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Tabelle Ι

Art des Mediums	Wachstum	Vegetatives My c el	Luftrnycel	Rückseite	LesIieheG Figment
:S a ccliar öse -M i trat- 'Agar	schlecht bis massig	farblos	normal, pulvrig; v/Giss bis creme farben	hellgelblich- or?.r.£e	keines
Glucose-Asparagin- A gar	gut	farblos	reichlich, pulv rig: v.'eiss Mc; hollgelblich- tanninfarben	hellgelb bis lohfarben	hell- iohfarben
Glyc srin-Aspara- gin-.\gar	gut	farblos bis cremefarben	reichlich, pulv rig; elfenbein farben bis leicht grünlichgraue T önung	helloliv	helloliv
Star rce -anorgani sche s 8aIz-Agar	massig	farblos	spärlich, pulvrig; staubförmiges Gelb	farblos	äusserst hell oliv !
Tyro 3in-Agar	gut'	farblos	reichlich, pulv rig; hellzitronen gelb: nachträglich rötlich (krebs;- farben) werdend;	farblos bis helieIfenbein farbig	äusserst hell- .^ oliv 4> ΝΪ O3 CD
					CII

Tabelle 1 (Fort setzung)

CO OO OO

Art des 'Mediums	Wachstum ,,	Vegetatives Mycel ;	Luftmycel ,	Rückseite	Lösliches .. ■ , Pigment.
Nä'iragar	massig	farblos bis cremefarben	massig bis r ei ehr-, Ii chj, pulvr1g; weiss bis hellgrau	bräunli ch^elb	keines
Hefernal2.£.gar f	gut	farblos bis cremefarben	reichlich., pu 1 vr i g; zitronenfaroen bin· bambusgelbfarben	senffarbig	zircianon-.·' farben
Hafermehlagar	gut., faltig	farblos bis cremefarben	sparIich, pulvrig; weiss	farblos	senffärben
Pepton-F.isen- Hefeextrakt-Agar	massig dünnes VJa oh s turn, schillernd	farblos bis cremefarben	kein Luftmycel	farblos	keines 1 , I .1 Ji

"5. Physiologische Eigenschaften:

Wachs tups temperatur: gutes Wachstum bei 28 bis 37 ⁰C Reduktion von Nitraten: positiv Verflüssigung von Gelatine: positiv

[-ielaninpi-uduktion: negativ k. Assimilation von Kohlenstoffquellen (bei 28 ⁰C auf Pridharn-Gottlieb-Agar):

+ : L-Arabinose, D-Glueose, D-Fructose, D-Mannit, D-XyIose

+ oder - : Saccharose, Inositol, L-Rhamnose, Raffinose.

Ein Vergleich der oben erwähnten Eigenschaften mit den Beschreibungen nach Bergey¹s "Manual of Determinative Bacteriology", ?. Auflage, S.A. Waksman's "The Actinomjrcetes", (Bd. 2) und "international Journal of Systematic Bacteriology" zeigt, dass der Stamm U-25 zur Gattung Streptornyces der Familie Streptoniyeetaeeae gehört. Der U-25 Stamm besitzt Eigenschaften, Vielehe stark jenen von Streptomyces griseus gleichkommen, obwohl dieser Stamm hinsichtlich der Verwertung von Kohlenstoffquellen sich leicht unterscheidet. Daher wird dieser Stamm als ein Stamm identifiziert, welcher zu Streptomyces griseus gehört.

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("R) Gtr eptcnry cos hygroscoplcus U-^j l42 "I. Morpliologi sehe Eigenschaften:

Das .Luftmye-el ist irn allgemeinen kurz, raonopodial ■verzwoigt, mit kräftigen Spiralen in dichttr traubenföx'iniger Füj'm. Die Ζεαίΐ der Sporeii in der Kette liegt bei nicht weniger als 10. Die Form der Sporen ist ellipsoid bis kurz zylindrisch, 0,5 ^is 0,7 auf

0,6 bis 1,1 ü lang und die Oberfläche ist glatt. Ks sind ■ v-jcdcr "Fla-gellen noch Sporangien feststellbar. 2. Wachsturnselgenschaften auf verschiedenen Medien siehe Tabelle 2, \\

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Tabelle

Medium	V/a ch s turn	tig, farb- biassgelb	LuftiTiycel	Rückseite	Lösliches Figment	IO ro GO
Gu.crose-Nitr :it- . Agar	gut, fal los bis	farblos sgelb	massig, pulvrig, Weiss bis oliv--grau	sonf-?-O^farben bis senfbraun	senffarbcn
Glucose-Aspo ragin- A π: ar	massig, bis blas	restriktiv,	ξ chwa ch, Vv ei c s oder mattes grau bis dunkclgrau	farblos
Cr lycerin- A s. para 3:. η-Agar	massig, farblos	farblos	massig, pulvrig., natürlich oder mattes grau bis beigogi'au	farblos oder grau- lohfarben	keines
Γ; t 'IrkG-ar.c rgar'ii ε cht	2 massig,	farblos	reichlich, pulvrig, v?eise bis natürlich, teilweise hygrosko- ■ pisch	färbLos oder cremefarben	keines
Tyrosin-Agar	massig,	kein.es	farblos	keines

Tabelle 2 (Fortsetzuiig)

VJ a ch s turn

Luftmycel

Rückseite

Pigment

Kährägar,

massig, farblos

keines

farblos

keines

OO OO PO

Hefe-Malz-Agar

gut, farblos

reichlich, pulvrig, v?eiss bis natürlich oder ■ matt grau
bis beigegrau, teilv?eise hygroskopisch

bernsteinfarbig;
bis tοραζfaνbig

keines oder hellborristQinfarb.cn

Hafernehlag-:c

gut, dick, farblos

reichlich, pulvrig, weiss bis natürlich oder beigegrau, teilxveise hygroskopisch

farblos bis
hell weizen··
farben

Iceines ode?." bambu f ar be.α

Pepton-Hefeextrakt-jmässig, restriktiv,

farblos

keines

: ar OJ. o

keines

ro oo co cn

"5. Physiologische Eigenschaften.

a) Wachstumstemperatur: gutes Wachstum bei 20 bis "57 ⁰C-

optimale Temperatur liegt bei 28 bis 32 ⁰C

b) Wachstum pH: das Wachstum erfolgt in einem

pH-Bereich von 5 bis 9 mit einem optimalen pH-Viert von 6 bis 7

c) Gelatineverfliissigung: keine Verflüssigung

d) Stärkezerfall: positiv (massig)

e) Wirkung auf Magermilch: keine Koagulation, jedoch

schwach peptonisiert

f) Reduktion von Nitraten: negativ

g) Melaninähnliches Pigment: negativ

h) Assimilation von Kohlenstoffquellen (bei 28 ⁰C auf

Pridham-Gottlieb-Agar)

+ : L-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannit, D-Xylose, Saccharose, Inositol, L-Rhamnose, Raffinose.

Die taxonomischen Eigenschaften von U-4^-2 lassen sich wie folgt wiedergeben:

(1) Sporenkettenmorphologie: Spiralen

(2) Sporenoberfläche: glatt

("5) Farbe des Wachstums: ' farblos bis blassgelb

<
(H) Luftmycel: verschiedene Grauvarianten

(5) Hygroskopische Flächen finden sich im Luftmycel.

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(6) Melaninähnllclies Pigment; keine .Eildung.

Aus diesen Eigenschaften geht hervor/ ciasß U-442 als ein Stamm identifiziert werden kann, welcher zu Strepto-"myce-5: hygroscopicus gehört, verglichen nach der Beschreibung gemäsaBergey's "Manual of Determinative Bacteriology", f. Auflage; S.A. Waksman's "The Actinornyoetes", Bd.- 2; und "iritcrnatiönal Journal of Systematic Bacteriology", 22, 2o3 (1972). "■ "'ν." ·
(C) Ceprialosporium sp. "ATCC-14553 und Cephalosporium

Die Kolonien auf Malzextraktagar und Kartoffel-Dextrose-Agar sind uriregelmässig, faltig, getrieben und üblicherweise feucht, färblos bis blassgelb. Das Luftrnyeel ist unzureichend. Die Rückseite ist farblos bis blassgelb. Das lösliche Pigment ist gelb. Hyphen 1 bis 3 u, septiert. Die als Seitenstärnme auf Hyphen" vorkommenden Konidiophoren sind- 30 bis 6o _;u lang und 2,5 bis 3,5 u breit an der Basis. Die Konidien sind raultiförmig, elliptisch oder rechteckig, geradlinig oder gebogen, glasklar, 6-9 χ 2-3 γ. Diese beiden Stämme besitzen verschiedene Produktivitäten an DACPC, Desacetylcephalosporin C [nachstehend kurzerhand mit DCPC bezeichnet] und CPC. .

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(D) Cephalosporium polyaleurum 7-6k'

1. Charakteristika auf Agarmeaien

(1) MaIz-Extrakt-Agar:

Wachstum gut, sich ausbreitend. Luftmyeel spärlich, durchwegs zottig, blass gelblichbraun. Rückseite farblos .

(2) Kartoffel-Agar:

Wachstum gut, sich ausbreitend. Luftmycel reichlich, oft gebündelt in Strängen, weiss bis biassbraun, mit radialen Falten, zottig. Rückseite farblos oder blassgelb.
(^) Czapek-Agar:

Wachstum gut, sich ausbreitend, Luftmycel reichlich, oft gebündelt in Strängen, rein weiss, zottig. Rückseite farblos.

(4) Hafermehl:

Wachstum gut, sich ausbreitend, Luftmycel spärlich, niedrig und flach, zottig, hellfarben, Rückseite farblos bis blassgalb.

(5) 1 $> Glucose-Bouillon-Agar:

Wachstum gilt, sich nicht ausbreitend, mit manchen radialen Falten. Luftmycel· reichlich, rein weiss, zottig. Rückseite blassgelb.

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2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften

Extrem spärliche Bildung von Konidien. Die dünnen Lufthyphen, 1,0 bis 1,5 γ breit, sind reichlich verzweigt und farblos. Die Konidiophoren breiten sich aus dem Luftmycel geradlinig aus, mit Längen von 40 bis 6θ η und Breiten von 1,0 bis 1,5 p* jedoch mit einer Breite von 2 u an den Haftstellen. Die Konidien sind ellipsoidal mit etwas zugespitzten Enden oder asymetrisch; einzellig und farblos. Grosse 1,5 bis 2 auf "5 bis 6 u; traubenförmig in einer Masse an der Extremität der Konidiophoren'. Manche kleine asexuellen Sporen, welche Weizenrr.ehlsporen entsprechen, werden direkt a\xs den Spitzen und Seiten der Hyphen gebildet. Kurz und hin und wieder kurvig, 3 bis k auf k bis 6 u, farblos. Wenn auch zeitweilig zwei davon miteinander vereinigt sind, so sind sie doch in manchen Fällen einzeln vorhanden.

Die Bildung von Konidien ist auf die Anfangsphase des Wachstums beschränkt und sehr spärlich. Andererseits werden manche Aleuriosporen, d.h. Weizenmehlsporen, in der Zwischenphase und nachher gebildet und können innerhalb der Kolonie überall festgestellt werden. Es werden keine Organe für die sexuelle Reproduktion auf den Medien beobachtet.

Die geeignete Wachstumstempcratur liegt bei 25 bis "50 ⁰C und der geeignete pH-Wert bei 5,0 bis 7,0.

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Ein Vergleich der oben erwähnten Eigenschaften von Stämmen K-I86 und 7-6¹J- mit den Angaben in "Dictionary of Fungi", 6. Auflage, und Barnett Hunter, "illustrated Genera of Imperfect Fungi", 3. Auflage, deutet eindeutig daraufhin, dass diese Stämme zur Gattung Cephalosporium, • der Familie Moniliaceae, der Ordnung Moniliales von Fungi Imperfecti gehören.

Im Lichte der Beschreibungen gemäss Gilman, "A Manual of Soil Fungi (1957)" und Sukapure et al, "Myeologia 58, 351 (1966)" wurde der Stamm K-I86 als ein Stamm identifiziert, welcher zu Cephalosporium acremonium gehört.

Der Stamm 1-6K ist ein Stamm, welcher zu einer neuen Art gehört, welche als Cephalosporium polyaleururn bezeichnet wurde.

(E) Emericellopsis microspora K-I63 1. Eigenschaften auf Agarmedien

(1) Malzextrakt-Agar:

Wachstum gut, mit leuchtenden Falten auf der Oberfläche, sich schwach ausbreitend, farblos bis blass lachsrosa. Rückseite hellorange bis lachsrosa. Luftmycel spärlich, flockig und weiss.

(2) Kartoffel-Glucose-Agar: <

Wachstum gut, sich schwach ausbreitend, weiss bis

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helllaehsrosa. Rückseite gelb bis orangegelb.

Luftmycel reichlich, flockig.

Manche schwärzlichbraune Sporenschläuche werden .gebildet.

Gzapek-Agar:

Wachstum gut, niedrig und flach. Luftmycel zottig und weiss. Rückseite hellorange.

.'__■■ (4) Sabouraud-Agar:

Wachstum gut, niedrig und flach, schwach sich ausbreitend, lachsrosa. Luftrryeel flockig und weiss. ·".;. Rückseite-leicht orange,
(5) Hafermehlagar:

gutes Wachstum, sich leicht ausbreitend, lachsrosa. Luftmycel spärlich, flockig und weiss. Rückseite helloranse bis lachsrosa. Schwärzlichbraune Sporen-

. schlauche Werden gebildet.

2. " Mikroskopische Morphologie '

Die mikroskopische Morphologie des Stammes, gewachsen auf den obigen Medien, ist die folgende:

Das Luftmycel, 1,5 bis 2 u breit, ist verzweigt und farblos. Die Konidiophoren erstrecken sich aus dem vegetativen oder Luftmycel in Längen von 30 bis 60 u auf 1,5 bis 2,5 η mit Konidien an den Extremitäten. Die Grosse der Konidien sehwankt von ^vj bis 8 r. 1,5 bi r» h n; oval bis rechteckin;.

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Die Ascocarpen sind dunkelfarbig und im wesentlichen sphärisch, mit Grossen von ungefähr 30 bis 60 u.
Jeder Ascus enthält 8 Ascosporen, 9 bis 12 u messend. Die Ascosporen sind-· rechteckig bzw. länglich .bis oval und hell_r grünlichbraun, 3 bis 3>5 auf 4,5 bis 5 u messend. Die Sporen besitzen Flügel und scheinen verschiedene Formen aufzuweisen. Die Länge der Flügel liegt bei 1,5 bis 3 V»

(F) Paeeilomyces carneus C-2237 und C-4053 1. Eigenschaften auf Agarmedien

(1) Malzextrakt-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht übermässig ausbreitend, kissenähnlich, weiss bis milchbraun, zuweilen mit blassrosa Tönung. Rückseite gelblichgrünbraun bis dunkelgrünlichschv.'arz, ergeben aber kein grünes
Pigment.

(2) Kartoffel-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftrnycel flockig bis kissenartig, weiss. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.
Czapek-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis kissenartig, weiss bis milchweiss.
Rückseite gelblichgrün.
Sabouraud-Agar:
gutes Wachstum., sich nicht ausbreitend, Luftmycel·

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flockig bis kissenartig und-weiss. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.
(5) Hafermehlagar:

gutes· Wachstum, sich schwach ausbreitend. Luftmycel flockig bis kissenartig, hin und wieder pulvrig. Weiss bis milchweiss. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.

2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften

Luftmycel, 1,5 bis 2 u breit, ist verzweigt. Die Konidiophoren werden auf dem Luftmycel gebildet und zwar einzeln oder mono- oder biquirlich. Ca. 2 u breit. Die Piolen haben eine verlängerte Form (eine Form ähnlich einem verlängerten Kolben) mit Spitzen, die sich leicht ausdehnen unter Bildung von Konidien. Grosse 15 bis 20 auf 2 bis 2,5 u. Die Konidien sind elliptisch und scheinen leicht angerauht zu sein, bei langen Ketten von 3 bis 4 auf 2 bis 2,5 u. Keine Organe für sexuelle Reproduktion können auf den obigen Medien festgestellt werden.

Optimale Wachstumsbedingungen liegen bei 24 bis 28 ⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 7.

(G) Paecilomycespersicinus C-3009 1. Eigenschaften auf

(l) Malzextraktagar:

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gutes Wachstum, sich leicht ausbreitend, Luftmycel ist flockig bis kraus und hin und wieder strangförmig. Weiss bis milchbraun und zeitweilig blass rötliche Färbung. Rückseite gelb bis gelblichbraun, wird nie grün. Ein gelblichbraunes Pigment wird im Medium erzeugt.

(2) Kartoffel-Agar:

gutes Wacnstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis pulvrig, weiss. Rückseite hellbraun.

(3) Czapek-Agar:

äusserst schlechtes Wachstum. Luftmycel 1st nur rudimentär.

(4) Sabouraud-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend. Luftmycel ist relativ spärlich, flockig bis pulvrig und weiss bis hellbraun. Rückseite farblos bis hellbraun.

(5) Hafermehlagar:

gutes Wachstum, sich schwach im Medium ausbreitend. Reichliches Luftmycel, zottig bis flockig und in manchen Fällen gebündelt, wobei das Aussehen strangförmig wird. Weiss bis hellbraun, hin und wieder hellrötliche Färbung. Rückseite geblichbraun bis gelblichrosa.
2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften Das Luftmycel tritt hin und wieder vereinzelt auf,

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in anderen Fällen aber sind verschiedene davon miteinander verbündeItund liefern die Form eines Stranges.

Es werden keine Konidiophoren gebildet, doch werden aus dem Luftmycel Fiolen oder Stränge von Luftmycelien gebildet.

Jede Fiöle hat die Form eines verlängerten Kolbens, 10 bis 30 ii lang und an den Punkten des Zusammentreffens eine Breite von 1,8 bis 2,2 u. Die Fiole trägt Konidien an den Enden. Das Konidium ist ellipsoidal bis eiförmig, die Oberfläche glatt oder schwach faltig. Grosse 2 bis 3 auf 2,5 bis 4,0 p. Lange Ketten werden gebildet. Keine Organe für sexuelle Reproduktion werden auf den obigen Medien festgestellt.

Das optimale Wachstum findet bei 24 bis 28 ⁰C und einem pH-Wert von ca. 5 bis 7 statt.

Gemäss Ainsworth et al., "Dictionary of Fungi", 6. Auflage, und Barnet Hunter, "Illustrated Genera of Imperfect Fungi", 3. Auflage, fallen die Stämme C-2237, C-3009 und C-4053, welche die obgenannten mikrobiologischen Eigenschaften haben, unter die Gattung Paecilomyces, die Familie Moniliaceae, die Ordnung Moniliales von Fungi Imperfecti.

"■""-. Nach "Transactions British Mycological Society" 40., 17-89 (1957) dürften die Stämme ^SC-2237 und C-4053 zu Paecilomyces carneus Duche et Heim gehören. Der Stamm C-3009

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wurde aufgrund der obigen Literatur 'und "Micological Papers" Nr. 107, 1-23 (1967) gemäss Commonwealth Micological Institute als ein Stamm identifiziert, welcher zu Paecilomyces persicinus Nicot gehört.

(H) Anixiopsis peruviana CBS-301.67 und K-21

Der Stamm CBS-301.67 ist ein bekannter Stamm, welcher in CBS-List of Cultures, 28. Auflage, 1972, beschrieben wird.

Der Stamm K-21 hat ähnliche mikrobiologische Eigenschaften mit Ausnahme der Möglichkeit der Herstellung von DACPC, d.h. Desacetylcephalosporin C, und CPC.

Diese Stämme gehören zu Eurotiales-Eurotiaceae-Anixiopsis und haben die folgenden Eigenschaften:

Kolonien auf Malzextraktagar oder Leonian-Hefeextrakt-Agar breiten sich langsam oder nicht aus, sind weiss bis blassbraun, werden später braun bis dunkelbraun unter Bildung von Perithezium. Rückseite erst gelb bis gelblichbraun, später jedoch dunkelbraun bis beinahe schwarz. Lösliches Pigment ist gelb, später olivenfarbenbraun. Hyphen: glasklar, dünnwandig, indirekt, septiert, gezweigt, 1 bis 2,5 u· Durchmesser.

Perithecia cleistocarpous: dunkelbraun, beinahe schwarz im trockenen Zustande an gewiesen unterhalb dem Luftmycel erzeugten Stellen, an anderen Stellen eine «, uijiiX'Tläulilioiit; Schiolit auf der Oberfläche des

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Agars mit wenig Luftmycel bildend, kugelförmig, unbehaart mit Ausnahme von spärlichen Haftstellen an den Lufthyphcn, l40 bi.s 350 u Durchmesser.

Asci in grossen, eng aneinanderhaftenden traubenartigen Formen, ohne bestimmte Orientierung, subkugelförmig, 6,5 bis 8,0 χ 5,5 bis 6,5 u, achtsporig, dünnwandig, unendlich klein«

Paraphysen sind spärlich, fadenförmig, traubenfÖrmig, septiert, 2 bis 4 u Durchmesser, vermischt mit Asci.

Ascosporen sind scheibenförmig, 2,5 bis 3.»0 χ 2,5 bis %0 χ 2,0 bis 2,5 u in kugelförmiger Masse, fein seeigelartig, stark blassgelb.

Chlamldosporen sind kugelförmig bis subkugelförrnig, hyalin,- glatt, 8 bis 10 u mit schwach verdickten Wandungen, meistens endständig, zerstreut vorhanden auf den Hyphen, in der Hyphenmasse eingetaucht, nicht reichlich..

Keine anderen Konidien oder Spermatia.

(I) Arachnomyces minimus CBS-~52*U70 und X-154

Stamm CBS-324.70 ist ein bekannter Stamm, welcher in CBS-List of Cultures, 28. Auflage, 1972_; beschrieben

- V

Viird. "

Stamm Y-154 hat rr-rliche raikrobiologische P/iren- .

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schäften mit Ausnahme der Fähigkeit zur Herstellung von DACPC, DCPC und CPC.

Diese Stämme gehören zu Eurotiales-Eurotiaceae-Arachnomyces und besitzen die folgenden Eigenschaften:

Kolonien auf Weitzman und Silva-Hutner-Medium erreichen einen Durchmesser von 2,5 cm in zwei Monaten bei Zimmertemperatur, sind filzig, grünlichgelb, erzeugen ein violettbraunes Pigment, das sich im Medium ausbreitet. Rückseite braun, gesprenkelt bzw. getüpfelt. Mycelium hyalin, dünnwandig, kaum septiert, mit zahllosen ampullenförmigen Anschwellungen, kugelförmige Zellen von 7 bis 11 u Durchmesser in der Nachbarschaft der Sporenschlauchfruchtanfängen und Ascocarpen und gelegentlich auch an anderen Stellen erzeugend.

Ascocarpen: subkugelförmig bis kugelförmig, rötlichbraun durch reflektiertes Licht, beinahe opak im reifen Zustand, haarig zufolge reichlicher Mycelbildungen, welche Im Reifezustand versch'.N'inden, verschiedene lange haarähnliche Anhänge bildend, 100 bis "515 u Durchmesser, im Reifezustand sich unregelmässig öffnend.

Ascocarpanhängsel 2,5 bis 5,5 u breit, bis zu 3 mm oder langer.

Asci: subkugelförmig bi:* kugelförmig, ohne Stiel, verschwindend klein, achtsporig, 5,5 bis 8,5 u

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Durchmesser. Ascosporen: flachgedrückt, hellgelblich bis braun bei transmittierendem Licht, hellrÖtlichbraun bis tönfarben in Masse, glatt, 2,8 bis "5,5 x 1,5 bis 2,0 u. Konidialzustand: einer.

(J) Splroidium fuscum IFO-5479 und K-461

Stamm IFO-5479 ist ein bekannter,Stamm, welcher in IFO-List of Cultures, 5. Auflage, 1972, beschrieben ist.; : :^: ■ -.'-..■"

Der Stamm K-461 hat ähnliche mikrobiologische Eigenschaften mit Ausnahme des Vermögens zur Herstellung von DACPC, DCPC und CPC.

Diese Stämme gehören zu Fungi Imperfecti-Moniliales-Moniliaceae-Spiroidium und besitzen die folgenden morphologischen Eigenschaften:

- Schwaches bis massiges Wachstum auf Mais.stärke-Agar oder Czapek-Agar und gutes Wachstum auf Malz-Agar oder

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Die Kolonien sind zuerst weiss, werden allmählich grUnlichgelb getcnt, werden schliesslieh braun. Hyphen sc-hr fein, 1,5 bis 2 ja breit, schwach septiert, gelegentlich gebündelt. Die sporenbildenden Hyphen sind mit unregelmässigen Spiralen verzweigt, durch Bildung von Scheidewänden geteilt und bilden allmählich Chlamidosporen. Chiamidosporen: quadratförmig, rechteckig oder zylindrisch, 2 bis 3 V> enthalten oft Oeltropfen, schwellen oft beim Keimen und bilden Keimrohre. Organe für sexuelle Reproduktionen werden aus den Medien nicht gebildet,

Beim Züchten der erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen verwendet man ein Kulturmedium, welches Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, welche die Mikroorganismen assimilieren können.

Als Kohlenstoffquellen· kommen beispielsweise Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke, lösliche Stärke, Abfallmolassen, Glycerin, verschiedene organische Säuren, z.B. Essigsäure, Fumarsäure, Benzoesäure usw., verschiedene Alkohole, z.B. Aethanol, Butanol usw., η-Paraffine und verschiedene OeIe und Fette in Frage. Als Stickstoffquellen kann man verschiedene organische und anorganische Stickstoffquellen verwenden, z.B. Pepton, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Hefe-

[z.B. NH₁₁Cl, (NH^)₂S0_lt, NH^NO,, Ammoniumphosphat], Nitrate,

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ORIGINAL INSPECTED

(z.B. NaNO,, KNO,), etc.

Ueberdies kann man auch Metallsalze, z.B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate, und andere /Metallsalze, z.B. solche des Kaliums, Magnesiums, Calciums, Natriums usw., zugeben. Nötigenfalls kann man dom Kulturmedium auch verschiedene Substanzen^ Vielehe das Wachstum:und die Fähigkeit zur Erzeugung von DACPC erleichtern, zugeben, wie z.B. Methionin, Cystein, Cystin, Thiosulfate, Methyloleat, Speckö'l, verschiedene Vitamine, Aminosäuren, nuklelnsäurehaltige Materialien usw. Auf diese Weise kann man die Anreicherung von DACPC weiter steigern.

So ist beispielsweise Methionin für die Erzeugung von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattung Cephalosporium und Emericellopsis besonders wirksam, während Cystein und/oder Cystin für die Erzeugung von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattungen Paecilomyces, Araohnomyces, Anixiopsis und Spiroidium besonders geeignet sind. Die obigen Wirkungen ergeben sich aus den folgenden Vergleichsversuchen.

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Tabelle 3

ο co 00 00 N)

-4 -4

Wirkung; von Methionin	Angereichertes	DACPC 0	35	0,3	0,5	1,0	2,0
"~~~~—-~~^^ Konzentra- ^"~"-—^^^ tion {%) Stamm --~^^	0	BL-Methionin 0,01 0,1	500	70	105	100	30
Cephalosporin sp ATCC 14553	20	25	250	1500	1790	1900	■ .500
Cephalosporium acremonium K-186	50	70	300	400	560	550	150
Cephalosporin polyaleurum 7-64	70	90		450	540	550	260
Emericellopsis microspora E-I63	200	240

O I

Ki

CX) CO in

Tabelle

Wirkung von L-Cystein und/oder L-Cystin	0	Angereichertes DACPC (/ag/mi)	Cystein	0,5	1,0	0	L-Cys'tin	.0,1	0,5	MQ	1,0
	160	: L-	0,1 0,3	500	250	160	0,01	300	400	200	225
^"""---^Konzentration Stamm . .' ^"""^-\ (f°)	90	OyOl	450 520	320	150	• 90	180	150	220	220 110	120
Paecilomyces carneus C-2237	130 20	190	280 310	210 120	175 • 45	130 20	,105	180 80	200 105	100	45
Paecilomyces persicinus C-3009	50	120	• 200 250 80 102	130	70	50 ·	145 30-	85	115		S5
AnixioOsis peruviana CBS-301.67 Arachnoinyc es minimus CBS-324,70	150 - 30	90 145				60
Spire-idiom fuscum ΙΙΌ-5479	65

In den obigen Versuchen würde jeder Stamm unter den erwähnten Bedingungen, z.B« Medium, Temperatur, Bebrütungedauer usw., bebrütet, wie dies aue den folgenden Beispielen im Zusammenhang mit den entsprechenden Stämmen gezeigt wird.

Wie aus den obigen Experimenten hervorgeht, wirkt sich die Zugabe von mindestens 0,01 % und vorzugsweise von 0,01 bis 2,0 % und insbesondere von 0,1 bis 1,0 % Methionin für eine starke Produktion von DACPC durch die Mikroorga-

günstig nismen der Gattungen Cephalos-porium und Emericellopsis/aus, Eine Zugabe von mindestens 0,01 fo, vorzugsweise von 0,01 bis 1,0 % und insbesondere von 0,1 bis 0,5 % Cystein und/ oder Cystin 1st für eine starke Produktion von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattungen Paecilomyces, Arachnomyces, Anixiopsis und Spiroidiurn besonders wirksam.

- Die Züchtung des Mikroorganismus kann stationär oder durch Schüttelkultur geschehen. Im allgemeinen ist es von Vorteil, eine submerse Züchtung unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Züchtungstemperatur liegt mit Vorteil im Bereiche von ungefähr 18 bis 4o ⁰C und vorzugsweise im Bereiche von ungefähr 22 bis 35 ⁰C· Der pH-Wert wird auf einen pH-Wert zwischen 2 bis 10 und vorzugsweise zwischen 4 bis 9 gehalten. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise während 7? hi s 336 Stunden und insbesondere während 50 bi ρ 48o .stunden.

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Da der grössere Teil dos aufgearbeiteten DACPC in der flüssigen Phase der Xulturbrühe auftritt, ist es vorteilhaft-,, daß Myoel aus der Bralle zuerst durch Zentrifugieren zu entfernen und hierauf die gewünschte Verbindung aus der darüberliegenden Schicht bzw/ "Filtrat zu gewinnen. Eine fraktion!orte Isolierung von DACPC kann nach analogen Methoden, wie dies üblicherweise für die fraktionierte Gewinnung von schwach sauren organischen Produkten oder von Cephalosporin C oder anderen Verbindungen zur Anwendung gelangt, geschehen.

So kann man die Fraktionierung mit Vorteil unter -Verwendung in geeigneter Kombination von Chromatographie auf Ionenaustausohharzen, Aktivkohle, Cellulose, Kieselgel usw. und Gelfiltrierung durchführen. Für eine quantitative Bestimmung des DACPC verwendet man die Methode zur Bestimmung des antibiotlschen Wirkungsgrades von Produkten gegenüber Versuchsorganismen. Die Identifizierung des Produktes erfolgt beispielsweise durch Elementaranalyse, durch magnetische Kernresonanzspektrometrie, durch Infrarot spektrometrie, durch Ultraviolettspektrometrie, durch PapierelektrophoreEe und Dünnschichtchromatographie.

Verwendet man diese Methoden in Kombination, so kann man DACFC als"freie Verbindung oder in Form eines SaI-z-e? davon gewinnen,

Die. "Erfindung sei durch die folgenden Beispiele

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erläutert,, wobei die Teile jeweils Gewichtsteile bedeuten, sofern nichts arideres ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenem von g und ml.

Beispiel' 1

Ein Fermentierkolben mit einem Fassungsvermögen von 2 000 Vol.-Teilen wird mit 500 Vol.-Teilen eines Impfkulturmediums, enthaltend 2 % Glucose, 1 % Maltose, 1 /& Glycerin, 2 % Baurnv/ollsamenmehl, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % (NH₄J₂SO₄, 0,3 % NH₄NO₃, 0,01 % KH₂PO₄, 0,05 % MgS0₄'7H₂0, 0,005 % FeSO^-TH₂O, 0,01 % NaCi, 0,5 DL-Methionin und 1 % CaCO-, beschickt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit einer Anzahl Sporen a^is einer Schrägkultur von Streptomyces griseus U-25 (lFO-13550) angeimpft· und auf einer Schüttelvorrichtung während 72 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet.

Getrennt davon wird ein 50 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbehälter mit 30 000 Vol.-Teilen eineswässrigen Mediums, enthaltend 3 $ Glucose, 3 % Maisstärke, 2 $ Baumwollsamenmehl, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % (NH₁P₂SO₄, 0,3 % NH₄NO₅, 0,01 % KH₂PO₄, 0,05 % MgSO₄·7Η₂0, 0,005 % FeSO^-TH₂O, 0-01 % NaC^, 0,5 % DL-Mßthionin und 1 % CaCO-,s gefüllt. Der Behälter wird in an sich bekannter Weiße sterilisiert und kUhlengelassen. Dieses Medium

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wird aseptisch rait der oben erwähnten Impfkultur angeimpft und unter Schütteln bei 28 ⁰C bebrütet. Nach l64~stündigem Fermentieren wird die Kulturbrühe filtriert, worauf man 25 VoI«-Teile eines Kulturfiltrates erhält. Dieses FiI--trat enthält 110 -)ig/ml DACPC. Das Filtrat wird durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und auf einer mit 8 000 Vol.-Teilen Aktivkohle beschickten Säule adsorbiert. Nach dem "Waschen mit V/asser wird mit 20 000 Vol.-Teilen einer 50 fo-lgen wässrigen Acetonlö'sung eluiert. Das Eluat wird unverzüglich über eine Säule, welche mit 3 000 Vol.-Teilen eines Anionenaustauschharzes, nämlich Amberlite IRA-900 (Acetatform),(hergestellt durch die Firma Rohm.und Hass Company) beschickt' ist, geleitet und nach dem Waschen mit Wasser wird mit 10 000 Vol.-Teilen einer 0,3n-Ammoniurnac et at lösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird ein zweites Mal über eine Säule von 1 500 Vol.-Teilen Aktivkohle geleitet und nach dem Waschen mit Wasser mit 3 000 Vol.-Teilen einer 50 ^-igen wässrigen AcetonlÖsung eluiert. Das erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 50 Vol.-Teile eines Konzentrates erhält.

Das so erhaltene Konzentrat wird einer mit 3 000 VoI*-Teilen Cellulose beschickten Säule zugeführt und mit 70 ":&-lgoTTi -wässrigem Propanol eluiert- Die an DACPC reichen Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck

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eingeengt.

Das so erhaltene Konzentrat wird über eine mit 150 Vol.-Teilen Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem" Waschen mit Wasser wird das Material mit 300 VoL-Teilen einer 50 $-lgen wässrigen Acetonlßsung eluiert«. Das Eluat wird mit Natriumhydroxyd neutral gestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Diese Konzentrat wird mit Aethano?. versetzt und das Gemisch in der Kälte stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden durch Filtrieren gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet. Auf diese Weise erhält man 0,670 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC.

Beispiel 2

vermögender

Ein 5 000 Vol.-Teile aufzunehmen / Fermentierbehälter wird »it 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums, enthaltend 3 % Glucose, 3 % Maisstärke, 0,5 % Hefeextrakt., 1 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % rohes Sojabohnenmehl., 0,05 % FIgSO₁, -7H₂O imd 0,5 % CaCO₃, gefüllt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Streptomyces hygroscopicus U-442 (lFO-13598) angeimpft und unter Schütteln während 144 Stunden bei 48 ⁰C bebrütet, wodurch man 820 ^g/ml DACPC in 'der Kulturbrühe anreichert. Es werden bei dieser Arbeitsweise auch andere Cephalosporinverbirdung^n_; z.B. CPC und OCPC, ale Nebenprodukte gewonnen. Werden 2 000 Vol.-Teile des

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Külturflltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so erhält man- 0,30 Teil von Kristallen des Na triunisalzes von DACPC.

Beispiel· 3

'."■■ Ein 2 000 Vol.-Teile fassender FermentierbehMlter ■'wird mit 500 Vol. -Teilen eines Impf Kulturmediums gefüllt, welches 5 % Glucose, 1,0 ^cp Baumwo 11 samenmehl, 0,5 £? rohes S.cja.bahnenmenl, 0,5 # Hefeextrakt, 0,5 % Polypepton und 1 fo Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit einer Masse von Sporen aus einer Schrägkultur von Cephalosporium sp. ATCC-l²i-553 angeimpft und während 9& Stunden bei 28 ⁰C bebrütet. Getrennt davon wird ein 50 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbeha.lter mit 30 000 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches 8 % Saccharose, 1 '% Baumwo 11 samenmehl, 3 % Maisquellflüssig-' keit, 0,5 % DL-Methionin, 0,15 % CaCO, und 0,05 % Sojabohnenöl enthält. Die Sterilisation erfolgt in üblicher Weise, worauf man kühlen lässt. Das Medium wird aseptisch mit der oben erwähnten Impfkultur angeimpft und unter Schütteln und Rühren während 168 Stunden bei 24 ⁰C bebrütet,

Nach beendeter Züchtung wird die Brühe isoliert und filtriert, wobei man 25 000 Vol,-Teile eines Plulturfiltratüb erhält.

Dieses Piltrat enthält 105 ug/ml DACPC. Ferner enthält dieses PiItrat Penicillin N, CPC und DCPC.

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Diesem Pi !trat v:ird hierauf mit Penicillinase (hergestellt durch Schwarz-J'anr) versetzt, um Penicillin K zu zersetzen, worauf man das Material unmittelbar einer Säule zuführt, welche mit 8 000 Vol.-Teilen AmberIite IPA-900 (Acetatform) beschickt ist, um das DACPC darauf zu adsorbieren. Daß so adsorbierte DACPC wird mit 20 Vol.-Teilen einer 0, jSn-Amrnoniurnacet at lösung eluiert und die an DACPC reichen Fraktionen v/erden gesammelt. Dieses Eluat wird über eine Spule geführt, xvelche mit 3 000 vol.-Teilen Aktivkohle beschickt ist, worauf man nach dem Wo.-. sehen mit Wasser das adsorbierte DACPC mit β 000 Vol.-Teilen einer 50 ^-igen wässrigen Acetonlösung eluiert. Die an DACPC reichen Fraktionen werden gesammelt, mit Natriumhydroxyd neutralisiert und eingeengt, wobei man ein DACPC enthaltendes Konzentrat erhält'.

Diese Lösung enthält nicht nur DACPC, sondern auch DCPC und CPC. Um die beiden letzteren Verbindungen fraktioniert zu entfernen, wird die Lösung über eine Säule von Cellulose geleitet und das Material mit einer 70 %-igen wässrigen Propanollösung eluiert, worauf CPC, DACPC und DCPC in der genannten Reihenfolge getrennt -werden. Die DACPC-Fraktionen werden gesammelt, eingeengt und erneut auf einer Cellulosesäule chromatograpMert. Die DACPC-Fraktionen wsrcien gGGanirfislO.

Die so erhaltene Lösung wird übor eine Säule von

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Aktivkohle geleitet und nach dem Waschen mit Wasser wird das Material mit einer 50 $-igen wässrigen Acetonlb'sung eluiert. Das Eluat wird mit einer Natriumhydroxydlb'sung neutralisiert, eingeengt und nach der Zugabe von Aethanol in der Kälte stehengelassen, worauf das Natriumsalz von DACPC ausfällt. Diese Kristalle werden durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhält man 0,520 Teil von Kristallen von DACPC.

Beispiel 4

Ein 50 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 30 000 Vol.-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 6 % Saccharose, 5 % Glucose, 3 $ Erdnussbrei, 3 % Sojabohnenmehl, 1 # DL-Methionin und 0,15 % CaCO, enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Cephalosporium acremonium K-186 (lFO-9918) angeimpft und unter Belüftung und unter Rühren (Belüftungsgeschwindigkeit 30 000 Vol.-Teile pro Minute; Rühren mit 250 Umdrehungen pro Minute) während 190 Stunden gezüchtet, wodurch 1790 ug/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert werden. Als Nebenprodukte erhält man CPC und DCPC. Behandelt man diese Kulturbrtihe in der gleichen Weise wie in Beispiel 3* so erhält man 10,5 Teile von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC.

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Beispiel 5

Ein 5 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 5 % Saccharose, 3 $ rohes Sojabohnenmehl, 1 % DL-Methionin, 0,15 % Calclumcarbonat und 3 % Methyloleat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Cephalosporium polyaleurum 7-64 (lFO-9920) angeimpft und unter Rühren während 192 Stunden bei 24 ⁰C bebrütet, wobei man 560 ug/ml DACPC in der Kulturbrühe anreichert. Als Nebenprodukte erhält man CPC und DCPC. Behandelt man 2 000 VoI.-Teile dieser Kulturbrühe in der gleichen Weise wie in Beispiel 3, so erhält man 0,250 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC.

Beispiel 6

Ein 5 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 2 5OO Vol.-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % DL-Methionin und 1 % Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren des Mediums wird dieses mit Emericellopsis microspora K-I63. (lFO-9922) angeimpft und unter Schütteln während 144 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet, worauf sich 54o yug/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert haben. Als Nebenprodukte fallen CPC und DCPC an. 2 000 Vol.-Teile der Kulturbrühn werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 behandelt,

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wobei man 0,20 Teil Kristalle des ftatriumsalzes von DACPC erhält. -

Beispiel J.

-: (a) 30 Vol.-Teile eines Impfkulturmediums, welches 5 f> Glucose, 1 fo Baumwollsamenmehl, 0,5 % rohes Sojabohnenmehl, 0,5 fo Hefeextrakt, 0,5 f> Pepton und 1 fo Calciumcarbonat enthält, werden in einen Fermentierbehälter von 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen eingebracht. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Paecilomyees carneus C-2237 (IFO-9729) angeimpft und während 72 Stunden bei 25 ⁰C bebrütet. Hierauf wird die Impfkultur portionenweise und zwar jeweils mit 1,5 Vol.-Teilen zu 30 Vol.-Teilen Fermentlerkulturen gegeben. Jede dieser Medien befindet sich in Fermentierbehältern von jeweils 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen, "wobei in-diesen Behältern 4 % Baumwollsamenmehl, 1 fo .Calciumcarbonat und eine verschiedene Kohlenstoff quelle vorhanden ist. Die Arten und Mengen dieser Kohlenstoffquellen finden sich in der nachstehenden Tabelle 5·

(b) 30 Vol.-Teile eines Impfkulturmediums, welches 5 f> Glucose, 1 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % rohes Sojabohnenmehl, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton und 1 f> Calciumcarbonat enthält, werden in einen Fermentierbehälter von 500 Vol.-Teilen Faböungsvei-iiiögen eingetragen. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Paecilomyees persicinus C-3009 (IFO-9731) angeirnpft und während 72 Stunden

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bei 28 ⁰C bebrütet. Hierauf wird die' Impfkultur in Portionen von ,"jeweils 1,5 Vol.-Teilen in 30 Vol.-Teile von verschiedenen Fermentierungsmedien eingetragen. Jedes dieser Medien ist in Fermentierbehältern von 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen enthalten, wobei diese Behälter 4 % Baumwollsamenmehl, 1 % Calciumcarbonat und eine verschiedenartige Kohlenstoffquelle enthalten. Die Arten und Mengen dieser Kohlenstoffquellen finden sich in der Tabelle 6.

Im Falle von (a) und (b) gibt man in Jenen Fällen, in denen die Kohlenstoffquelle Essigsäure ist, eine 4o $-ige Essigsäurelösung, welche zuvor durch Zugabe von wässrigem Ammoniak teilweise neutralisiert und sterilisiert

worden ist, nach 72 Stunden, nach Ablauf von 96 Stunden

eine Menge von ■

und nach 120-stündiger Züchtung/0,75 Vol.-Teil davon hinzu. Ist die Kohlenstoffquelle ein Alkohol, z.B. 99*9 %-iges Aethanol, so wird diese Kohlenstoffquelle in Mengen von 0,4 Vol.-Teil nach 72'Stunden, 96 Stunden und 120-stündiger Züchtung hinzugegeben. Die Züchtung wird während 165 Stunden bei 24 ⁰C durchgeführt.

Nach erfolgter Fermentierung wird jede Fermentierungsbrühe isoliert und zentrifugiert und die obenauf fliessende Flüssigkeit in bezug auf DACPC, DCPC und CPC getestet. Die Resultate finden sich in den Tabellen 5 6. - '

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	Tabelle 5	C-2237	Angereichertem Cephalosporin- DCPC - CPC	120 ug/ml 120
Paeoilo.myces	carneus	Mengen an Antibiotica DACPC	35 ^ug/ml 20	80
Kohlen stoff quelle	Anfäng liche Konzen tration	l60" ug/ml i4o	10	60
Glucose Saccharose	8 % 8	100	5	10
lösliche Stärke	5	85	nicht feststell bar	110
Oly:cerin	5	15	25	5
Sojäboh- nenöl	5	120	nicht feststell bar
n-Paraffine	8	25
Essigsäure	2

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	Anfangs- konzen tration	Mengen an Antibiotica DACPC	-	Angereichertem Cephalosporln- DCPC CPC	110 jig Aal
	8 %	90 jug/ral		10 yUg/ml	30
Tabelle 6	8	50		15	15
Paecilonyoes persicinus C-3009	2	10		nicht feststell bar	5
Kohlen stoff quelle	2	15	nicht feststell bar
Saccha rose
Glucose
Essig säure
Ae t hand

Beispiel 8

(a) Ein 200 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % Calciumcarbonat und die in der Tabelle 7 erwähnte Verbindung enthält. Nach erfolgter Sterilisierung wird jedes Medium mit Paecilomyces carneus C-2237 (IFO-9729) angeimpft und unter Schütteln während I68 Stunden bei 24 ⁰C bebrütet. Nach erfolgter Fermentierung wird die

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FermentierbrLilie entnommen und zentrifugiert und obenauf f 1.1..essende Flüssigkeit auf ihren Gehalt an DACPC getestet,

(b) Ein.Fermentierbehälter mit 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen v/ird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums gefüllt, welches 8 fo Glucose/ 2 % Baumwollsämenmehl, 1 % CaI-ciumcarbonat und eine Verbindung der Tabelle 7 enthält. Nach erfolgter Sterilisierung wird jedes Medium mit Pac-cilomyces persicinus C-3009 (IFO-9731) angeimpft und hierauf unter Schütteln während 168 Stunden bei 24 ⁰C bebrütet» Nach erfolgter Fermentierung wird die Fermentierbrühe entnommen und zentrifugiert und die obenauf fliessende Flüssigkeit auf ihren Gehalt an DACPC getestet.

(c) Ein 200 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsämenmehl, \ ■%> Calciumcarbonat und eine der Verbindungen der Tabelle 7 enthält. Nach erfolgter Sterilisierung wird jedes Medium mit Paecilomyces carneus 0-4053 (IPO-9730) angeimpft und unter Schütteln während 168 Stunden bei 24 ⁰C bebrütet. Nach erfolgter Fermentierung wird die Fermentierbrühe entnommen und zentrifugiert und die obenauf fliessende Flüssigkeit auf ihren Gehalt an DACPC getestet.

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Tabelle 7

Zugegeben«
Verbindungen

Konzentration im Medium

Stämme

Paecilomyces Paecilornyces Paecilomyces carneuG persieinus carneus
C-2237 C-3009 C-4-053

L-Cystein 0,3 L-Cystin 0,3 keine

520 jig/ml 310 pg/tfil 110 μβ/ml ¹I00 jxg/ml 220 _;ug/ml 85 jag/ml 160 ug/tril 90 }ig/ml 30 jag/ml

Als Nebenprodukte fallen DCPC und CPC an.

Ein 5 000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2 500 Vol.-Teilen des gleichen Mediums, wie es oben unter (a) beschrieben worden ist und 0,3 % L-Cystein enthält, gefüllt. Nach erfolgter Sterilisierung wird das Medium mit Paecilomyces oarneus C-2237 (IFO-9729) angeimpft und nach der Methode gernäss obigem Absatz (a) gezüchtet. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen V/eise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,210 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel 9

Ein 2 000 Vol.-Teile Fassungsvermögen σλλΐweisender Ferment i erbehält er wird rnit 500 Vol.-Teilen eines

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- k-7 -

Impfkulturmediüms gefüllt, welches sich aus 5 % Saccharose, 1-% Baumwollsamenmehl, 3 % Maisquellflüssigkeit und 0,15 % Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach erfolgter Sterilisierung wird mit Anixiopsis peruviana CBS-301.67 aus einer Schrägkultur angeimpft und hierauf während 96 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet.

Getrennt davon wird ein 50 000 Vol.-Teile Fassungsvermögen .".aufweisender Fermentiertank mit 30 000 Volumenteilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl, 0,5 fo DL-Mothionin und 1 # Calciumcarbonat zusammensetzt. Das Medium wird sterilisiert und in üblicher Weise kühlen gelassen. Dann wird das Medium aseptisch mit der oben erwähnten Impfkultur angeimpft und bei 28 ⁰C unter Rühren und Schütteln (Belüftung: 30 000 Vol.-Teile/Minute unter Schütteln) während 184 Stunden bebrütet. Hierauf wird die erhaltene Kulturbrühe gewonnen und filtriert, um das Mycel zu entfernen, wobei man 25 000 Vol.-Teile eines Kulturfiltrates erhält. Dieses Filtrat enthält 130 jug/ml DACPC, 25 ug/ml DCPC und 5 ^g/ml CPC.

Behandelt man dieses Kulturfiltrat in der gleichen V/eise wie in Beispiel 1,- so erhält man 0,650 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC.

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Beispiel 10

Ein Fermentierbehälter mit 5 000 Vol.-Teilen .Fassungsvermögen wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % DL-Methionin, 0,3 % L-Cystein und 1 % Calciumcarbonate enthält, gefüllt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Anixiopsis peruviana CBS-301-67 angeimpft und während 168 Stunden bei 28 °C bebrütet, wodurch 250 jig/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert werden.

Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,10 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC, DCPC und CPC werden gleichfalls als Nebenprodukte erhalten.

Beispiel 11

Ein Fermentierbehälter mit 5 000 Vol.-Teilen Fassungsvermögen wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % DL-Methionin, 0,3 % L-Cystin und 1 % Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Anixiopsis peruviana CBS-3OI.67 angeimpft und während I68 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet, worauf die Kulturbrühe 200 ug/ml DACPC in angereicherter Form enthält. Behandelt man 2 000 VoI.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,08 Teil von Kristallen des Na-

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triumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

: Beispiel 12

Ein 5 000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8 % Glucose, 2 % Baumwollsamenmehl·,0,5 ί° DL-Methionin und 1 % Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Anixiopsis peruviana K-21 (IFO-9916) angeimpft und dann während l68 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet. Auf diese Weise werden der Kulturbruhe 1050 pg/ml DACPC angereichert. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,^jf20 Teil Kristalle des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC,

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5 000 Vol.-Teilen v;ird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8 % 'Saccharose, 1 % Baumwollsamenmehl, 3\% Maisquellflüssigkeit und 1 % Calciumcarbonat enthält . Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Arachnomyces minimus K-15^ (ΙΒΌ-9917) angeimpi't und

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dann während 163 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet. Auf diese Weise werden 1200 ^ug/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert.

Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise, so erhält man 0,500 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel I¹I-

Ein 5 GOO-Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8 fo Saccharose, 1 % Baumwollsamenmehl, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % L-Cystein und 0,15 ^ Calciurncarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Arachnomyees minimus CBS-32^.70 aus einer Schrägkultur angeimpft und während 168 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet, wodurch in der Kulturbrühe 102 ug/ml DACPC angereichert werden. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man O,O45 Teil, von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC.

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Beispiel 15

Ein Ferment leihbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5 000 Vol.-Teilen wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Mediums, gefüllt, welches sich aus 8 % Saccharose, 1 fo Baumwollsamenmehl, 3 % Maisquelleflüssigkeit, 0,3 % L-Cystin und 0,15 % Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Arachnomyces minimus CBS-324.70 aus einer Schrägkultur angeimpft und während 168 Stunden bei 23 ⁰C bebrütet, wodurch 105 /ig/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert werden. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Külturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,048 Teil Kristalle des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC. .::-■

Beispiel l6

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögenvon 5 000 VoI ..-Teilen wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8 % Saccharose, 1 % Baumwollsamenmehl, 3 % Maisquelleflüssigkeit, 0,3 % L-Cystein und; 0,15 % Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium aus einer Schrägkultur mit Spiroidium'fuGC-um. lFQ-5^79. angcimpft und_v. während IS^ Stunden bsi 28 ⁰C bebrüt et ₃ wodurch l45 pg/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert werden. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des

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Kulturfiltrates in der gleichen Wei'se wie in Beispiel 1, so erhält man Ο,Οβ Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC.

Beispiel 17

Ein 5 000 Vol.«-Teil Fassungsvermögen aufweinender Fermentierbehälter wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches sich aus 8 % Saccharose, 1 % Baumwollsamenmehl, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,3 % L-Cystin und 0,15 % Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium aus einer Schrägkultur mit Spiroidium fuscum IFO-5^79 angeimpft und während 184 Stunden bei 2B ⁰C bebrütet, wodurch 115 ug/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert v/erden. Behandelt man 2 000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so gelangt man zu 0,05 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC.

Beispiel 18

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5 000 Vol.-Teilen wird mit 2 500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 8 % Saccharose, 1 Jo Baumwo 11 satrienmehl, 3 % Maisquellflütsigkeit und 1 $ Calcium-

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carbonat enthält. Nach dem Sterilisieren v/ird das Medium mit Spiroidium fusoumΚ·-4βΐ (lFO-9923) ange.i mpf t und v/^hrend 168 Stunden bei "28 ⁰C bebrütet, wodurch sich 1020 ,ug/rnl DACPC in der Kulturbrühe anreichern. Werden 2 000 VoI.-Teile des Kulturflltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so erhält man 0,410 Teil von Kristallen des Natriumsaizes von.DACPC. Als Nebenprodukte erhält tr.an. ebenfalls DCPC und CPC.

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Claims (1)

1. Patent ansprüciie

   1. Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C, dadurch gekennzeichnet,- dass man einen Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces, Cephalo- ■ sporium, Emericellopsis, Paecilomyces, Anixiopsis, Arachnomyces oder Spiroidium gehört und Desacetoxycephalosporin C zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, solange züchtet, bis Desacetoxycephalosporin C sich in wesentlicher Menge in der KulturbrUhe angereichert hat, worauf man das Desacetoxycephalosporin C isoliert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei l8 bis 40 ⁰C durchführt.

   3« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Kulturmediums zwischen 2 und 10 liegt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Cystein und/oder Cystin enthält.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Methionin enthält.

   6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge-

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   kennzeichnet, dass der Mikroorganisinus der Gattung Paecilomyces, Anixiopsis, Arachnornyces oder Spiroidium angehört.

   7· Verfahren nach Anspruch 5/ dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der'Gattung
   Cephalosporium oder Emericellopsis angehört.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Streptomyces griseus ist.

   9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus ist.

   lö. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Cephalosporium sp. ATCC-1^553 ist.

   11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Cephalosporium acremonlum ist.

   12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Cephalosporium

   polyaleurum ist.

   Γ5, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Eniericellopsis

   microRporä ist.

   l4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge-

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   kennzeichnet, dass der Mikroorganismus Paecilomyces carneus ist.

   15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus .Paecilomyces persicinus ist.

   .16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Anixiopsis peruviana ist.

   17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Arachnomyces minimus ist.

   18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Spiroidium fuscum ist.

   19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Streptomyces griseus U-25 (IFO-13550) ist.

   20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus U-442 (IFO-I3598) ist.

   21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Cephalosporium acremenium K-I86 (lFO-9918) ist.

   22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Cephalosporium polyaieurum 7-64 (IFO-9920) ist.

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   23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, dass der Mikroorganismus Emericellopsis microspora K-I63 (IFO-9922) ist. ·

   24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Paecilomyces earneus C-2237 (lFO-9729) ist.

   25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Paecilomyces earneus C-4053 (lFO-9730) ist.

   26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Paecilomyces persicinus C-3009 (lFO-9731) ist.

   27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Anixiopsis peruviana CBS-301.67 ist.

   28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Anixiopsis peruviana K-21 (IFO-9916) ist.

   29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Arachnoir.yces minimus GBS-324.70 ist.

   30.'Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Arachnomyces minimus K-154 (lFO-9917) ist.

   31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge-

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   ORIGINAL

   - 5ο -

   kennzeichnet, dass der Mikroorganismus Spiroidium fuscum IFO-5479 ist.

   32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus' Spiroidium fuscum K-461 (lFO-9923) ist.

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