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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C.
In der deutschen Offenlegungsschrift 1492053 ist ein Verfahren zur Gewinnung von C ephalosporin C, Penicillin N oder Cephalosporin P mittels einer Emericellopsis-Cephalosporium-Kultur beschrieben. Bei diesem Verfahren erfolgt die Züchtung des Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Gleichgewichtszustand, wobei wachstumsbegrenzende Nährstoffe in jedem Falle auf den Wert eingestellt werden, durch den die Bildung der Antibiotika begünstigt wird.
Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C werden in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen Paecilomyces carneus
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wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, worauf das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Die Cephalosporinverbindung Deacetoxycephalosporin C wird durch die folgende Strukturformel dargestellt :
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Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden abfiltriert und das filtrierte Kulturmedium wird mit
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zu entfernen. Das DeacetoxycephalosporinC wird aus dem wässerigen semi-gereinigten Kulturmedium durch Chromatographie auf folgende Weise gewonnen (Wenn hier von Kulturmedium oder -lösung beim Züchten von Mikroorganismen gesprochen wird, wird darunter das Medium verstanden, das man bei der Züchtung erhält. Dieses kann auch einfach als "Brühe" bezeichnet werden. Das Wort "Medium" wird in diesem Zusammenhang im Sinne des englischen Wortes"broth"verwendet.) : Das wässerige Medium wird zuerst über
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Aktivkohle chromatographiert.
Die mit Aktivkohle beschickte Säule wird mit Wasser gewaschen, um Verunreinigungen weiter zu entfernen, und danach wird die Aktivität mit 50% igem wässerigem Aceton eluiert.
Das Eluat wird konzentriert und über ein anionisches Austauschharz geleitet. Das Deacetoxycephalosporin C wird davon, bevorzugt mit einer 0, 15n Natriumacetatlösung, eluiert.
Die Eluate werden dann zur Trockne eingedampft oder lyophilisiert, wobei man eine rohe Deaoetoxycephalosporin C-Präparation erhält. Das Rohmaterial wird durch weitere Chromatographie über eine Cellulosesäule oder über Silicagel gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden entweder auf ein geringes Volumen konzentriert oder zur Trockne eingedampft. Das Konzentrat oder der trockene Feststoffrückstand wird in einer minimalen Menge an Isopropanol gelöst und die Lösung wird in Diäthyläther gegossen, um Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz auszufällen. Die Mikroorganismen, die beim erfindungsgemässen Verfahren nützlich sind, wurden als Glieder der Klasse Fungi imperfect klassifiziert, da sie keine geschlechtlichen Sporen bilden.
Sie wurden weiter in die Klasse Moniliales, die Familie Moniliaceae und die Gattung Paecilomyces klassifiziert.
Die obige Klassifizierung der Mikroorganismen, die bei der Erfindung nützlich sind, basiert auf den beobachteten morphologischen und Kultureigenschaften. In den folgenden Abschnitten erfolgt eine taxanomisehe Beschreibung des Mikroorganismus Paecilomyces carneus NRRL 5711. Die Bezugnahme auf "Maerz
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beziehtBook Co., Inc., New York [1950].
Morphologie und Kultureigenschaften von Paecilomyces.
Paecilomyces carneus NRRL 5711 (A 13215) :
A 13215 wird als Stamm von Paecilomyces carneus (Duchel und Heim) in der Ordnung Moniliales klassifiziert.
Die Kolonien sind allgemein samtartig bis flockig und die Tiefe des Luftfilzes variiert entsprechend dem Substrat. Das Wachstum auf Lösungsagar nach Czapek Ist relativ dünn und etwas funiculär. Die Kolonien sind im allgemeinen farblos, werden mit der Konidienentwicklung etwas verfärbt. Die Peripherien sind manchmal geringfiigig gekerbt oder gesägt und auf Agar nach Czapek sind sie durch ein Band vontiefsubmersem Mycel betont. Die Umkehrfarben haben leuchtend grünliche Tönungen bis zu gelben Tönungen, und in einigen Medien treten braune Tönungen auf.
Die verzweigten Konidiophoren, die von 100 bis 300 ja lang sind, entstehen aus dem Agar oder aus wuchernden Lufthyphen. Sich gabelnde Verzweigungen können Längen von 40 J. erreichen. Häufig treten
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in zahlreichen Arten auf den Konidiophoren und deren Verzweigungen. Sie können spitz als Einzelsterigma oder in Wirteln bis zu 5 auftreten. Sie können als Windungen längs der Hauptachse mit Internodien von 5 bis 20 J. l. auftreten. Im allgemeinen sind die Sterigmata in Wirteln stark divergent. Metuale sind weniger häufig, aber manchmal treten sie in Wirteln auf, wobei nur ein einziges Sterigma daran haftet. Die individuellen Sterigmata, die stark divergent sind, treten oft länger längs der Konidlophoren und deren Verzweigungen auf.
Die Form der Sterigmata typisiert die Gattung. Sie sind immer langzettig und sind praktisch zylindrisch von ihrer Basis bis auf ungefähr 75% ihrer Länge, wo sie stärker spitz zulaufen und eine lange dünne Röhre mit ungefähr 5, 0 x 0, 5 J. l. bilden.
Die Konidien sind unicellular, subkugelformig bis elliptisch, trocken und feingerauht und seeigelartig bis kleinstachelig. Sie bilden sich in langen Ketten und die Sporen scheinen durch eine Verbindungsbrücke zusammengehalten zu werden, ein Teil davon kann an den freien Konidien als kleine, herabhängende Zipfel, die geringer als 1 ju lang und 1 u breit sind, erkannt werden. Diese Oberflächeneigenschaften werden am besten an einem Ölimmersionsobjektiv beobachtet, wobei man Kontrastphasen-Beleuchtung verwendet. Zusätzlich zu diesen Konidien sind dickwandige, endständige Makrosporen (4, 9 x 3, 5 f. J,) an einigen Hyphen, die 100 x 3 J. l. lang sind, erkenntlich und die frei aus der Mycelmatte entstehen.
Auf Lösungsagar nach Czapek können die Kolonien bei 26 C in 10 Tagen Durchmesser von 32 mm erreichen, wobei danach kaum oder ein beschränktes weiteres Wachstum nach aussen beobachtet wird. Sie sind relativ flach, mit einer samtartigen bis flockigen Oberfläche und mässig funiculär. Die Oberfläche und Suboberflächen wachsen lederartig. Die Suboberflächen bilden Fächer heraus, die die Kolonie scharf begrenzen.
Nach 5Tagen sind die Kolonien weiss und werden gelblich-weiss (ISCC-NBS, 92) und nach 10 Tagen tragen sie
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nung. Die Umkehrfarbe ist dunkel-gelblich-grün (ISCC-NBS, 137), civettgrün (Maerz und Paul, 22-F-8).
Nach 3 Wochen ist die Umkehrfarbe hell-gelb-grun (ISCC-NBS, 119), rot-grün (Maerz und Paul, 19-D-1).
Die Konidienstrukturen variieren von einzelnen Sterigmata, die entweder spitz sind oder stark divergent
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ta, die an der Spitze angeordnet sind.
Gelegentlich sind eine oder zwei Windungen aus Sterigmata vorhanden, die die Konidlophoren unter dem
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Breite längs der breitesten Fläche gemessen wird. Die einzelnen divergenten Sterigmata können 20 g erreichen.
Die Konidiophoren bilden sich gabelnde Verzweigungen und diese Verzweigungen können Subverzweigungen bilden. Die Konidiophoren sind glattwandig und 2 bis 4 g breit. Lange Ketten aus hyalinen, seeigelartigen bis kleinstacheligen Konidien, die durch eine Verbindungsbrücke verbunden sind, entstehen aus den Sterigmata. In der Masse sind diese Konidien schwach rosa. Sie sind subkugelformig bis elliptisch und sind
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Das Zentrum kann gesprenkelt sein und die Kolonie kann sich nach aussen in strahlenförmig verlaufenden Falten erstrecken.
Ein fast weisser, 3 mm, samtartiger Rand - schwach gelb-grün (ISCC-NBS, 121), see- schaumgrün (Maerz undPaul, 18-A -1) - ergibt ein flockiges bis samtartiges Zentrum, das hell-grünlich-grau (ISCC-NBS, 154), flechtenartig grün (Maerz und Paul, 26-A-2) ist. Die umgekehrte Seite ist mit Ringen oder Streifen versehen, im Zentrum grünlich-gelb und von einem konzentrischen Ringmuster umgeben, das hellgelblich-grün (ISCC-NBS, 115) tibergriin (Maerz und Paul, 18-E-6) ist.
Die Formen und Muster der Konidien, Sterigmata und Konidiophoren sind so wie zuvor beschrieben. Die Konidien bezitzenbreiten imbereich von 2, 1 bis 3, 5 g und Längen im Bereich von 2, 8 bis 4, 9 jan, die durch-
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breit, die durchschnittliche Grösse beträgt 13, 2 x 3, ,u. Die Konidiophoren und Verzweigungen sind genauso wie auf Agar nach Czapek. Zusätzlich werden einzelne Makrosporen, die als Aleurosporen bezeichnet werden können, an der Spitze der Hyphenfilamente gebildet, die aus dem Agar und der wuchernden Lufthyphenmatte entstehen zu scheinen.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agar tritt eine ähnliche Wachstums geschwindigkeit auf. Die Kolonie ist geringRigig gekerbt. Das Zentrum ist etwas flockig, fast ein samtartiger Filz, der ebenfalls etwas funiculär ist und es wird von einer Kreisperipherie umgeben, die aus kurzen Lufthyphen besteht. Das Zentrum ist gelb- lich-grau (ISCC-NBS, 93), gefärbt wie Holzasche (Maerz und Paul, 27-A-l) ; die Peripherie ist mittelgrau (ISCC-NBC, 265), platinfarben (Maerz und Paul, 45-A-3). Die Umkehrfarbe ist gräulich-olivgrün (ISCC- NBS, 127), bronzegrün (Maerz und Paul, 16-J-7).
DieBeziehungvonA13215zuP. carneus, Duchel undHeim, ist unmissverständlich wie vonA. H. S. Brown and J. Smith in "The Genus Paecilomyces Banier...", Trans. Brit. Mycol. Soc. 40 (1), 17-89 [1957] beschrieben. A13215-Sterigmata erscheinen möglicherweise länger zu sein. Die Aleurosporen, die auf Kartoffel-DextroseAgar beobachtet werden, wurden auch bei andern Paecilomyces species beobachtet, wie es von Raper und Thom in the Manual of the Penicilli beschrieben ist.
Weitere Penicillin N bildende Kulturen, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren, bedingt durch ihre taxonomischen Ähnlichkeiten mit Paecilomyces carneus NRRL 5711 verwendet werden können, wurden als Glieder der Gattung Paecilomyces klassifiziert. Zwei solche Kulturen sind als Paecilomyces carneus A. T. C. C. 16329 und P. carneus NRRL 2622 identifiziert.
Die erfindungsgemäss verwendeten Paecilomyces carneus-Mikroorganismen besitzen wie die oben beschriebenen Fungi die morphologischen Eigenschaften der Bildung von Phiolensporen aus Phialiden, die entweder einzeln aus Hyphen oder aus verzweigten oder unverzweigten Konidiophoren gebildet werden.
Zwei der oben beschriebenen Stämme von Paecilomyces wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Ver-
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Research Serive, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt, wo den Kulturen die bei der zuvor angegebenen taxanomischen Beschreibung nach dem Namen der entsprechenden Kultur aufgeführten Zahlen als Eingangszahlen zugeordnet wurden.
Die restliche Kultur, die die letztere Bezeichnung ATCC besitzt, nämlich Paecilomyces carneus ATCC 16329, wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der permanenten Kulturkollektion von American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt.
Wie zuvor erwähnt, wird ein Mikroorganismus, der bei der Erfindung verwendet wird, nach einem submersen aeroben Fermentationsverfahren kultiviert. Das Kulturmedium, das verwendet werden kann, kann irgendeines einer Anzahl von unterschiedlichen Medien sein. Beispielsweise kann man verschiedene Kohlenstoffquellen verwenden wie Saccharose, Glucose, Stärke und ähnliche Kohlenstoffquellen. Ähnlich kann man die Stickstoffquellen aus einer Vielzahl von Verbindungen auswählen wie Sojabohnenmehl, Sojabohnengriess oder -staub, Baumwollsamenöl, Erdnussmehl, Aminosäuren, Aminosäuremischungen, Peptonenu. ähnl.
Aus Wirschaftlichkeitsgründen bei der Herstellung, wegen der maximalen Ausbeute und der leichten Isolierung sind bestimmte Medien bevorzugt, beispielsweise sind Melassen eine bevorzugte Quelle von Kohlenhydraten, und bevorzugte Quellen von Stickstoff sind Sojabohnenmehl und Aminosäuren.
Anorganische Nährsalze, die in das Kulturmedium einverleibt werden können, umfassen die gewöhnli-
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chen Salze, die fähig sind,'Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-,
Bromid-, Nitrat-, Carbonat-, Eisen- (n)-, Eisen- (m)-, Magnesium-, Mangan-Ionen und ähnliche Ionen zu ergeben. Die erfindungsgemässen Fungi erfordern ähnlich wie andere Mikroorganismen, die Antibiotika er- geben, bestimmte unentbehrliche Spurenelemente für das Wachstum, Ihre Entwicklung und ihren Metabolis- mus. Solche Spurenelemente können zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden, jedoch sind sie im allgemeinen in ausreichender Menge als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorhanden, die zu dem Kulturmedium zugefügt werden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Paecilomyces-Mikroorganismen können in Vorrichtungen kleiner
Grösse wie in 11-Schüttelkolben kultiviert werden, wobei man geringe Mengen an Deacetoxycephalosporin C erhält. Für eine Herstellung der Cephalosporinverbindungen in grösserem Massstab werden die Mikroorganis- men in Fermentationstanks in grösserem Massstab unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kul- tiviert.
Bei derHerste1lung vonDeacetoxycephalosporin C in grösseremMassstab werden die Sporen der Organis- men auf einer Agar-Schrägfläche gehalten. Die Sporen aus der Schrägfläche werden verwendet, um ein vegetatives Medium mit geringem Volumen zu inokulieren. Das vegetative Medium wird inkubiert, wobei man eine starke frische, tiefwachsende Kultur des Mikroorganismus erhält. Dieses vegetative Wachstum wird dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in grösserem Massstab verwendet.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, weiteres vegetatives Medium als Inokulum fUr das Fermentationsmedium zu verwenden. Solche vegetativen Medien der zweiten Stufe oder Organmedien werden im allgemeinen verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums signifikant oder wesentlich grösser ist als das Volumen des ersten vegetativen Mediums. Auf diese Weise werden die Sporen der Organismen zuerst in einem geringen Volumen an vegetativem Medium kultiviert, wobei man das Inokulum für ein vegetatives Medium mit grösserem Volumen erhält.
Das vegetative Medium mit grösserem Volumen bildet dann eine ausreichende Konzentration an Organismus, um einen schnellen Beginn der Fermentation in einem Fermentationstank in grossem Massstab zu initieren. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium besitzen, oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, um das Wachstum und die Bildung der Organismen in kleinem Massstab zu unterstützen.
Es wurde beobachtet, dass die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen Deacetoxycephalosporin C innerhalb eines pH-Bereiches von ungefähr pH 6, 2 bis ungefähr pH 8, 0 züchten und bilden. Während der submersen, aeroben Fermentation in Tanks in grossem Massstab nimmt der PlI-Wert des Mediums von einem Anfangs-pH-Wert von ungefähr 6, 5 auf einen End-pH-Wert von ungefähr 7, 5 zu.
Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen können bei Temperaturen zwischen ungefähr 20 und 350C gezüchtet werden. Das Deaoetoxycephalosporin C scheint bei einer Temperatur von ungefähr 26 C in optimalen Ausbeuten gebildet zu werden.
Die maximaleBildungvon Deacetoxycephalosporin C tritt auf, wenn der Organismus in Tanks in grossem Massstab während einer Zeit zwischen ungefähr 4 und 7 Tagen gezüchtet wird. Wenn man jedoch in Vorrichtungen in kleinerem Massstab züchtet, wie in 11-Schüttelkolben, verläuft das Wachstum der Organismen schneller und Deacetoxycephalosporin C wird in einer kürzeren Zeit, beispielsweise während 2 oder 3 Tagen, gebildet.
Da der End-pH-Wert in Fermentationsmedium in grossem Massstab einen Wert von PH 8, 0 oder höher zu
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boliten. Einige der zuvor erwähnten Verbindungen sind säurelabil. Es ist daher bei der Gewinnung von
Deacetoxycephalosporin C aus dem Fermentationsmedium wünschenswert, das gesamte Fermentationsme- dium für kurze Zeit bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um einen Teil der mitgebildeten Verunreini- gungen zu zerstören. Bei Fermentationen in kleinem Massstab kann das Penicillin N durch die Zugabe einer
Penicillinase zu dem Medium zerstört werden.
Das Deacetoxycephalosporin C-Fermentationsprodukt wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe, die so behandelt wurde, gewonnen und von den andern Bestandteilen des Fermentationsmediums durch Chroma- tographie über einem Ionenaustauschharz abgetrennt. Es wird weiter durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel gereinigt und anschliessend ausgefällt und umkristallisiert.
Zu Beginn wird das filtrierte Fermentationsmedium einem vorläufigen Reinigungsverfahren unterwor- fen, wobei eine erste Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie n-Butanol, Amylacetat erfolgt, um Verunreinigungen zu entfernen. Das extrahierte Medium kann dann weiter vorbereitet werden, durch Chromatographie über aktiviertem Kohlenstoff gereinigt werden. Das extrahierte
Medium wird über einer Säule chromatographiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff, beispielsweise Pittsburgh
12 x 40 Kohlenstoff, gepackt ist und die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche, ge- färbte Verunreinigungen und wasserlösliche anorganische Stoffe zu entfernen.
Die Fermentationsprodukte werden dann mit 50%igem Aceton-Wasser von dem Kohlenstoff eluiert. Das
Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert, die dann über einem basischen, anionischen Austausch- harz chromatographiert wird. Unter den basischen anionischen Austauschharzen, die verwendet werden kön- nen, sind solche der Polystyrol quaternären Ammoniumart, beispielsweise solche, die im Handel unter den
Bezeichnungen Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich. ) und solche, die unter den Bezeichnungen IRA-400, IRA-45, IRA-68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. ) erhältlich sind.
Die Harze können in dem Hydroxylzyklus, dem Acetatzyklus, dem Formiatzyklus oder andern geeig- neten Zyklen vorliegen bzw. verwendet werden. Das konzentrierte Eluat aus der Kohlenstoffsäure wird auf das anionische Austauschharz gegeben und dann wird das Harz mit Wasser gewaschen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus demAustauschharz inSalzform mit einer geeigneten schwachen Base eluiert, beispielsweise ist das Elutionslösungsmittel wünschenswerterweise, wenn die Säule im Acetatzyklus verwendet wird, eine wässerige Lösung aus Natriumacetat in einer Konzentration von ungefähr In oder geringer.
Die Konzentration der Natriumacetatlösung ist nicht kritisch. Um jedoch die Anwesenheit von überschüssigem anorganischem Salz (Natriumacetat) im Eluat aus der Austauschsäule zu vermeiden, liegt die wünschenswerte Konzentration an Natriumacetat zwischen ungefähr 0, In und 0, 5n. Eine besonders bevorzugte Konzentration für die Eluierung, die überschüssiges Salz in dem Eluat vermeidet, beträgt 0, 15n. Wird das Austauschharz in dem Formiatzyklus oder bei andern geeigneten Zyklen verwendet, so kann das entsprechende Salz in wässeriger Lösung als Elutionslösungsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann man Ammoniumformiat verwenden, wenn das Harz in dem Formiatzyklus vorliegt.
Viele Fraktionen werden gesammelt und die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, bestimmt durch Bioautogramm, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert, über überschüssige anorganische Salze, beispielsweise Natriumacetat, das als Salzlösung zum Eluieren verwendet wurde, zu entfernen. Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen, um diese anorganischen wasserlöslichen Salze zu entfernen und das DeacetoxycephalosporinC wird dann aus der Säule mit einer 50%igen Aceton-Wasser-Mischung entfernt. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft oder, alternativ, wird das Aceton abdestilliert und die konzentrierte wässerige Lösung wird lyophili- siert, wobei man bei beiden Verfahren Deacetoxycephalosporin C als festes Rohprodukt erhält.
Die rohe Präparation von Deacetoxycephalosporin C wird durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel oder über andere geeignete nicht ionische Adsorbentien weiter gereinigt. Das Deaoetoxycephalosporin C wird aus der Säule mit Aceton : Wasser, 80 : 20, eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Papierchromatographie oder Bioautogramm, unter Verwendung eines Versuchsorganismus von Pseudomonas solanacearcum enthalten, werden vereinigt und auf ein geringes Volumen konzentriert oder bis zur Trockne eingedampft.
Der stark konzentrierte wässerige Rückstand oder der trockene Rückstand wird dann in einer minimalen Menge an Isopropylalkohol gelöst und die alkoholische Lösung wird in ein grosses Volumen an Diäthyl- äther gegossen. Das gereinigte Deacetoxycephalosporin C wird in Form des Salzes, das dem wässerigen Elutionsmittel, das man bei der Elution des anionischen Austauschharzes verwendet hatte, entspricht, erhalten. Wenn beispielsweise Natriumacetat als Elutionsmittel verwendet wurde, wird das Deacetoxycephalo- sporin C als Mononatriumsalz erhalten. Die Salzform des Deacetoxycephalosporins C wird filtriert und getrocknet.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet man bevorzugt bei der Isolierung die folgenden Bedingungen. Die gesamte Fermentationsbrühe wird auf einen PlI-Wert von 2 durch ZugabevonSchwefelsäure
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<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Lactose <SEP> 1
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Sojapepton <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> lösliche <SEP> Stoffe, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Trocknen <SEP> von <SEP> Getreide <SEP> und
<tb> Malzextrakten <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Eisen- <SEP> (II) <SEP> -sulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Spuren <SEP> Minerallösung <SEP> 3 <SEP> 0,
<SEP> 625 <SEP>
<tb> Agar <SEP> 2
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1. Enzymatischer Auszug von Sojabohnenmehl 2."Produlac", National Distillers Products Co.
3. Die Lösung enthält die folgenden Salze pro 100 ml entionisiertem
Wasser :
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<tb>
<tb> Gewicht <SEP> Salz
<tb> 0, <SEP> 102g <SEP> CuSO <SEP> . <SEP> 5H <SEP> O
<tb> 0, <SEP> 018 <SEP> g <SEP> FeSO4#7H2O
<tb> 0, <SEP> 126g <SEP> MnCl <SEP> '20
<tb> 0, <SEP> 024 <SEP> g <SEP> ZnSO4#7H2O
<tb>
Die Schrägplatten wurden während 7 Tagen bei einer Temperatur von 260C inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und mit einem sterilen Stab leicht gekratzt, wobei man die Sporensuspensionen erhielt.
Die Sporensuspensionen, die so erhalten wurden, wurden jeweils verwendet, um zwei getrennte sterile Wachstumsmedien der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Malzextrakt <SEP> 2
<tb> Maiswasser <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Calciumchloriddihydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Spur <SEP> Minerallösung <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1. Fussnote 3 wie oben
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde vor der Behandlung in dem Autoklaven auf pH 6, 5 eingestellt.
Die inokulierten vegetativen Medien wurden bei einer Temperatur von 260C auf einer Rotations schüttelvorrichtung mit 250 Umdr/min mit einer Weite von 5, 08 cm während 48 h inkubiert.
Die inkubierten vegetativen Medien wurden dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 1% vegetativem Medium pro Volumen Fermentationsmedium verwendet. Die sterilen Produktionsmedien, die verwendet wurden, hatten die folgende Zusammensetzung :
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<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Saccharose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Natriumglutamat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Eisen- <SEP> )-ammoniumsulfathexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Kaliumnitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
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Wasser gewaschen, um lösliche anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumacetat, zu entfernen. Danach wurde die Säule mit 50%igem wässerigen Aceton eluiert.
Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man eine rohe feste Präparation von Deacotoxycephalosporin C-natriumsalz erhielt.
Das rohe Material wurde weiter durch Chromatographie über einer Säule gereinigt, die mit Cellulose (Avicel pH 101) gepackt war. Das Antibiotikum wurde aus der Cellulosesäule mit einer Losungsmittelml- schung, die Acetonitril : Wasser (80 : 20) enthielt, eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und dann wurden die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, vereinigt, wobei man zur Feststellung das oben beschriebene Chromatographiesystem verwendete.
Die vereinigten Fraktionen wurden dann zur Trockne eingedampft und der trockene Rückstand, der Deacetoxycephalosporin C enthielt, wurde in einer minimalen Menge Isopropanol gelöst. Die Alkohollösung wurde in eine Äthermenge gegossen, die ungefähr das 20-fache Volumen der Isopropanollösung hatte. Unter Rühren bildete sich das Natriumsalz von Deacetoxycephalosporin C als Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei man 126 mg des Antibitikums als Natriumsalz erhielt.
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Bei s pie I 2 : - In analoger Weise wie im Beispiel l angegeben wurde unter Anwendung der beschriebenen Medien, Kulturverfahren und Gewinnungsverfahren gearbeitet, jedoch an Stelle von Paecilomyces
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ten Fermentationsmedium ein Deacetoxycephalosporin C-Gehalt von 30 bis 40'Y/ml festgestellt.
Beispiel 3 : In analoger Weise wie im Beispiel 1 angegeben wurde unter Anwendung der beschrie benen Medien, Kulturverfahren und Gewinnungsverfahren gearbeitet, jedoch an Stelle von Paecilomyces carneus NRRL 5711 eine Kultur von Paecilomyces carneus NRRL 2622 eingesetzt. Dabei wurde im filtrierten Fermentationsmedium ein Deacetoxycephalosporin C-Gehalt von 75 bis 100 y/ml festgestellt.