DE2406959A1

DE2406959A1 - Anordnung zur bestimmung von antigenen

Info

Publication number: DE2406959A1
Application number: DE19742406959
Authority: DE
Inventors: Axel Dipl Chem Dr Sieber
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-02-14
Filing date: 1974-02-14
Publication date: 1975-08-28
Also published as: ATA106775A; IE40601L; FR2261529A1; LU71827A1; IT1031704B; DK137970B; FR2261529B3; JPS50116631A; NL7501489A; DE2406959B2; DK52275A; DE2406959C3; IE40601B1; US3930983A; GB1466040A; BE825572A; DK137970C

Description

BEHRINGWSRKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lannj

Aktenzeichen: Hoe 74/b 003 u.H. - Ma 181

Datum: 13. Februar 1974

Anordnung zur Bestimmung von Antigenen

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oderfquantitativen immunologischen Bestimmung mehrerer Antigene und ein Verfahren zu deren Durchführung.

Im menschlichen Serum und in Körperflüssigkeiten gibt es Proteinarten, die in der medizinischen Diagnostik nach bestimmten Krankheitsbildern oder nach physiologischen Aufgaben unter einem übergeordneten Begriff zusammengefasst werden können. Zum Beispiel bezeichnet man die Proteine saures sk- -Glykoprotein, C^-Antitrypsin, Coeruloplasmin und Haptoglobin, die bei entzündlichen Krankheitsprozessen gegenüber den Normalwerten verändert sind, als akute-Phase-Proteine. Unter dem Begriff Immunglobuline fasst man die Proteine IgG, IgA, IgM, IgD und IgE zusammen. Sie sind von wesentlichem Einfluss auf die Immunabwehr des Organismus, und ihre Konzentrationen erfahren bei bestimmten Erkrankungen charakteristische Veränderungen.

Bei quantitativen Proteinanalysen ist es daher erforderlich, zur Diagnose oder zur Charakterisierung eines Krankheitsverlaufes mehrere Proteine einer solchen Gruppe zu untersuchen. Es ist zu erwarten, dass immer mehr solcher

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Proteingruppen aufgefunden werden, die bei bestimmten Krankheitsbildern Konzentrationsänderungen erfahren, die im Zusammenhang gesehen werden müssen.

Es ist daher für Reihenuntersuchungen von Patienten, die an akuten entzündlichen Erkrankungen leiden, wünschenswert, wenn man in einem Analysengang die Konzentrationswerte für beispielsweise alle vier akute-Phase-Proteine ermitteln kann. Bisher ist es notwendig, je einen Analysengang für jede Proteinart durchzuführen.

Die Grundlage der immunologischen Nachweis- und Bestimmungsmethoden beruht auf der Eigenschaft von Antigenen mit spezifisch gegen die Antigene gerichteten Antikörpern, wie sie in den entsprechenden Antiseren enthalten sind, stöchiometrisch unter Ausbildung von Präzipitaten zu reagieren. Die ' als einfache lineare und einfache radiale Immundiffusion bezeichneten Verfahren sind darauf aufgebaut, daß Antigene in eine Antiserum enthaltende Matrix diffundiei'en und dabei einen Antigen-Antikörperkomplex bilden. Der Äquivalenzbereich der Komplexbildung wird bei entsprechender Konzentration der Reaktanten durch Präzipitatlinien angezeigt, die ■mit bloßem Auge beobachtet werden können oder nach Anfärbung mit geeigneten Farbstoffen sichtbar gemacht werden können.

Wird das Antigen durch ein elektrisches Spannungsfeld in einer Matrix, die einen homologen Antikörper enthält, bewegt, so entsteht je nach der Wanderungsgeschwindigkeit des Antigens ein mehr oder weniger langgestrecktes Präzipitat. Die ■ Diffusions- bzw. Wanderungswege sind jeweils das Maß für die Menge des zu bestimmenden Antigens. Xtfird keine Beziehung mit einer Standardantigenmenge hergestellt, so gilt die Präzipitatbildung als qualitativer Nachweis der unbekannten Substanz.

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Diese als Immundiffusion bzw. Immunoelektrophorese bezeichneten Techniken- ermöglichen jedoch je Analysengang die Be-Stimmung von nur einem einzelnen Antigen. Eine Weiterentwicklung der Immunoelektrophorese wurde von Laurell, Scand. J.elin.Lab.Invest. 29, suppl. 124, 21-37 (1972), beschrieben, bei der mit Hilfe eines Antiserums, das Antikörper mit Spezifitäten gegen mehrere Antigene enthält, durch Elektroimmunodiffusion die Bestimmung mehrerer Antigene grundsätzlich möglich ist.

Bei einem Gemisch von zwei Antikörperarten liefert die Methode noch relativ übersichtliche Bilder. Die Länge der Immunpräzipitate ist aber abhängig von der Proteinkonzentration, so daß nicht ohne weiteres zu entscheiden ist, welcher der von der gleichen Auftragssteil·- ausgehende Präzipitatgipfel einem bestimmten Protein zuzuordnen ist. . Völlig unübersichtlich werden die Verhältnisse, wenn mehr .als zwei Antikörperarten auftreten.

Die wesentliche Einschränkung dieasrMethode ist demnach, daß äie Größenordnung der Konzentrationen und das elektrophoretisch^ Verhalten der beiden Antigene einerseits voneinander abgesetzte Präzipitate liefern muß, und daß andererseits bekannt sein muß, welches Präzipitat dem zu bestimmenden einzelnen Antigen zuzuordnen ist.

Bei der Untersuchung von Patientenseren kann dies"zu folgenschweren Fehlinterpretation der Ergebnisse führen. Mißverständliche Ergebnisse erfordern zudem eine Wiederholung der Bestimmung für die geeignetes Material häufig nicht mehr vorhanden ist. .

Es bestand seit längerem der Bedarf nach einem immunologischen Verfahren zur Bestimmung mehrerer Antigene einer Probe in einem einzigen Ansatz, das Verwechslungen der ermittelten Konzentrationen ausschließt.

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Es war - wie erwähnt - bekannt, in einem Antigengemisch, das einer Elektrophorese in einer Matrix unterworfen wird, die einen monospezifischen Antikörper gegen"eines der Antigene enthält, das entsprechende Antigen zu bestimmen.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass bei einer elektrophoretischen Wanderung eines Antigengemisches durch mehrere aneinandergereihte Matrixstreifen, wovon jeder Streifen ein spezifisches Antiserum gegen ein einziges Antigen enthält, sich jeder einzelne Matrixstreifen so verhält, als wäre die Elektrophorese nur mit einer einheitlich mit einem Antikörper beladenen Matrix durchgeführt. Die Antigene durchwandern diejenigen Matrixstreifen unangefochten, in de.nen sich ein anderes als das für sie spezifische Antiserum befindet und präzipitieren ausschliesslich in demjenigen Matrixstreifen, der das für sie spezifische Antiserum enthält. Auf diese ¥eise ist die qualitative und quantitative Bestimmung von gleichzeitig mehreren Antigenen möglich.

Gegenstand der Erfindung ist demnach eine Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene in Antigengemischen durch Immunoelektrophorese in einer antikörperhaltigen Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Matrix mit mehreren aneinandergereihten, jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden Matrixstreifen beschichtet ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen durch Verwendung dieser Anordnung.

Immunoelektrophoresen werden am häufigsten auf Agar- oder Agarose-Gel als Matrix vorgenommen. Es können jedoch auch andere gelbbildene Substanzen wie Stärke, Gelatine oder Acrylamid verwendet werden.

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Die beigefügte Abbildung zeigt in Fig. 1 schematisch die Herstellung der erfindungsgemässen Anordnung und in Fig. 2 eine typische Verteilung der Präzipitate in einer erfindungsgemässen Matrix nach Durchführung einer Immuno-Elektrophorese.

In der Fig. 1 ist dargestellt, in welcher Weise eine Trägerplatte (1) mit Agar als Matrix mit Gelstreifen (2) bis (5) beschichtet wird, wovon jeder Streifen ein bestimmtes monospezifisches Antiserum enthält. Die Streifen werden in der gewünschten Breite nacheinander zunächst als flüssige . antiserumhaltige Lösung von beispielsweise Agar oder Agarose in Elektrophoresepuffer auf der waagerecht liegenden Platte in der Form ausgegossen, dass man z.B. durch einen Block (£), vorzugsweise einen solchen aus Metall, die Fläche der Platte, die mit dem nächsten Gel beschichtet werden soll, abgrenzt. Nach dem Erstarren des Gels wird der Block weitergerückt und der nächste freiwerdende Streifen mit flüssigem Gel ausgegossen. Die Gele haben in einer vorteilhaften Anwendung eine Breite von ca. 2-4 cm. Auf einer gebräuchlichen Platte 10 χ 10 cm können somit bis zu vier oder fünf verschiedene Gelstreifen aufgebracht werden. Der unterste Gelstreifen (2) (kathodisch), gekennzeichnet mit (-), sollte das Antiserum gegen das Antigen mit der geringsten Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld, der oberste (5) (anodisch) (in der Fig. 1 noch nicht aufgebracht), gekennzeichnet mit (+)» das Antiserum gegen das Antigen mit der höchsten Wanderungsgeschwindigkeit enthalten. In den untersten Streifen werden dann die Auftragsstellen (7) eingestanzt, in die die zu untersuchenden Antigenlösungen eingefüllt werden. Die Platte der Abb. 1 eignet sich also zur Bestimmung von vier verschiedenen Antigenarten in sieben Proben. Bei entsprechend längeren Trägerplatten lassen sich bei Verwendung geeigneter Geräte jedoch beliebig mehrere Proben auftragen.

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Die Matrixstreifen können"aber auch so angeordnet werden, dass die Auftragsstellen sich in einem schmalen Streifen eines antiserumfreien Gels befinden, an das sich dann der erste Streifen mit einem antiserumhaltigen Gel anschliesst. Diese Anordnung hat den Vorteil, dass die Antigene nacheinander je nach ihrer Wanderungsgeschwindigkeit in das erste Gel eintreten. Das langsamste Antigen, das im ersten Streifen reagiert, stört somit bei der Bildung des Immunpräzipitats nicht die übrigen Antigene, die schon weiter gewandert sind.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt unter den üblichen Bedingungen der Elektroimmunodiffusion in einer dafür geeigneten Apparatur. Die Antigene werden als Lösungen in die Auftragsstellen mittels einer Mikropipette oder Mikroliterspritze eingeführt. Nach Anlegen eines elektrischen Feldes von 7 bis 10 V/cm wandern die Antigene so lange ungestört durch die antiserumhaltigen Gelstreifen hindurch, bis sie in dem entsprechenden Streifen auf die spezifisch gegen sie' gerichteten Antikörper treffen.

Nach einer Elektrophoresdauer von etwa 3 Stunden ist die Reaktion beendet. ¥ird bei niedrigen FeÜstärken, beispielsweise 2-3 V/cm, gearbeitet, dauert die Elektrophorese 8-16 Stunden. Dabei erfolgt die Ausbildung der raketenförmigen Immunpräzipitate, deren Länge ein Maß für die Antigenkonzentration ist. Zweckmässig erfolgt im Anschluss an die Elektrophorese eine Anfärbung der Antigen-Antikörperkomplexe mit geeigneten Farbstoffen, beispielsweise mit dem Farbstoff Coomassi Brilliant blue R nach-bekannten Techniken. Die Messung der Präzipitatlinie kann mit einem Millimeter-Maßstab durchgeführt werden.

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In der Fig. 2 ist gezeigt, wie sich eine erfindungsgemässe Bestimmung von gleichzeitig vier Antigenen in sieben Proben nach Abschluss der Elektrophorese und einer angeschlossenen Anfärbung der Präzipitate darstellt. (7) entspricht den Auftragsstellen der Abb. 1.

Die Auswertung wird in der üblichen Weise über Eichkurven vorgenommen.

Zum Aufstellen einer Bezugskurve kann man sich 3 oder 4 verschiedene Verdünnungen eines geeigneten Antigenstandards mit physiologischer NaCl-Lösung als Verdünnungsflüssigkeit herstellen. Diese Verdünnungen müssen so eingestellt werden, dass sie den bevorzugten Meßbereich, bei Plasmaproteinen ' z.B. 3-30 mg/100 ml, abdecken. Die zu untersuchenden Patientensera werden vorteilhaft 1:2 verdünnt aufgetragen.

Eine nahezu geradlinig verlaufende Eichkurve erhält man nach Auftragen der Präzipitatlängen als Funktion der Standardantigen-Konzentration auf Millimeterpapier.

Beim Verzicht auf eine quantitative Bezugnahme der zu bestimmenden Antigene ist die erfindungsgemässe Anordnung zum qualitativen Nachweis von. Antigenen einzusetzen. Dabei ist nur registrieren, ob eine Präzipitatbildung des gesuchten Antigens mit dem entsprechend in die Matrix eingetragenen Antikörper eintritt oder nicht.

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Für die "Bestimmung eignen sich alle Antigene, die unter geeigneten Bedingungen eine elektrophoretische Wanderung zeigen und ■gegen die spezifische Antiseren erhalten werden können. Antigene, die unter den gewählten Bedingungen als solche keine oder nur eine geringe elektrophoretische Beweglichkeit zeigen, können nach bekannten Methoden wie der Carbamylierung oder der Umsetzung mit ß-Propiolacton, Formaldehyd, Äthylenoxid u.a. entsprechend modifiziert der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode unterworfen werden. Ein bevorzugtes Am^endungsgebiet der Methode liegt naturgemäss in der klinischen Diagnostik zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Bestandteile des Plasmas und der Körperflüssigkeiten. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, die Anordnung und das Verfahren auch..zur Bestimmung von mjlrobiellen Stoffwechselprodukten oder Pflanzeninhaltsstoffen einzusetzen, sofern sie aitigene Eigenschaften

zeigen.

Die eindeutige Zuordnung der Präzipitate zu den zu bestimmenden Antigenen macht die erfindungsgemässe Methode für Personen ohne besondere Qualifikationen durchführbar. Sie wird somit als Routinemethode für Kliniken und Forschungslaboratorien mit gutem Erfolg eingeführt werden können.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel erläutert werden.

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BEISPIEL

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Zur Herstellung einer Matrixplatte erhitzt man eine Mischung aus 1,5 g Agarose und 100 ml Barbitalpuffer, pH 8,6, p. 0,02, bis zum Sieden- Wenn sich die Lösung geklärt hat, läßt man abkühlen. Das Zumischen 'von Antiserum für die Herstellung antiserumhaltiger Matrixplatten erfolgt bei 56 C. Die heiße, flüssige Agaroselösung kann in einem 56°C v/armem Wasserbad auf diese für 'die Mischung optimale Temperatur abgekühlt v/erden. Das Wasserbad dient gleichzeitig zum Vorwärmen des Antiserums.

Auf einer Glasplatte 10 χ 10 cm.wird mit Hilfe eines Metallblocks am unteren Rand ein ca. 2 cm breiter Streifen einer l,5%igen Agaroselösung von 56°C ausgegossen, der kein Antiserum enthält. Die Schichtdicke des Agarosestreifens beträgt ca. 1,5 mm. Es werden.ca. 3 ml Agaroselösung benötigt. Nach dem Erstarren des Gels.wird der Metallblock um 2 cm weitergeschoben und 3 ml eines Agarosegels ausgegossen, das 2% eines Anti-C3-Serums vom Kaninchen enthält. In der gleichen Weise gießt man je einen Streifen mit 2% Anti-Transferrin, mit 5% Anti-ß-Lipoprotein und mit 1% An-ti-Haptoglobin-Serum an. In den unteren Streifen stanzt man die Auftragsstellen mit 2,5 mm Durchmesser zur Aufnahme von 5 p.1 der zu untersuchenden Patientenseren.

Die elektrophoretisch^ Auftrennung erfolgt/bei einer Feldstärke

von 10 V/cm 3 Stunden lang. " " .

Die Länge der Präzipitate wird mit den entsprechenden Werten der mit Standardsubstanzen erhaltenen Angaben in Beziehung gesetzt und erlaubt auf diese Weise die quantitative Bestimmung des Komplementfaktors C 3, des Transferrins, des ß-Lipoproteins und des Haptoglobins in einem Ansatz. . ■ .

/* nach Beschicken der Auftragsstellen

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Claims

Ma 181 - 10 Patentansprüche

1. Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene in Antigengemisehen durch Immunoelektrophorese in einer antikörperhaltigen Matrix,, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Matrix mit mehreren aneinandergereihten, jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden Matrixstreifen beschichtet ist.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Matrix mit einem antiserumfreien Matrixstreifen zur Aufnahme der Antigengemische und daran' aneinandergereiht mehreren jeweils ein spezifisches Anti-serum enthaltenden Matrixstreifen beschichtet ist.

3. Verfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene gekennzeichnet durch Verwendung einer Anordnung nach Anspruch 1.

4. Verfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene gekennzeichnet durch Verwendung einer Anordnung nach Anspruch 2.

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