DE2406959A1 - Anordnung zur bestimmung von antigenen - Google Patents
Anordnung zur bestimmung von antigenenInfo
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Description
BEHRINGWSRKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lannj
Aktenzeichen: Hoe 74/b 003 u.H. - Ma 181
Datum: 13. Februar 1974
Anordnung zur Bestimmung von Antigenen
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oderfquantitativen immunologischen Bestimmung
mehrerer Antigene und ein Verfahren zu deren Durchführung.
Im menschlichen Serum und in Körperflüssigkeiten gibt es Proteinarten, die in der medizinischen Diagnostik nach
bestimmten Krankheitsbildern oder nach physiologischen Aufgaben unter einem übergeordneten Begriff zusammengefasst werden können.
Zum Beispiel bezeichnet man die Proteine saures sk- -Glykoprotein,
C^-Antitrypsin, Coeruloplasmin und Haptoglobin, die bei entzündlichen
Krankheitsprozessen gegenüber den Normalwerten verändert sind, als akute-Phase-Proteine. Unter dem Begriff
Immunglobuline fasst man die Proteine IgG, IgA, IgM, IgD und
IgE zusammen. Sie sind von wesentlichem Einfluss auf die Immunabwehr des Organismus, und ihre Konzentrationen erfahren
bei bestimmten Erkrankungen charakteristische Veränderungen.
Bei quantitativen Proteinanalysen ist es daher erforderlich, zur Diagnose oder zur Charakterisierung eines Krankheitsverlaufes mehrere Proteine einer solchen Gruppe zu untersuchen.
Es ist zu erwarten, dass immer mehr solcher
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Proteingruppen aufgefunden werden, die bei bestimmten Krankheitsbildern Konzentrationsänderungen erfahren, die
im Zusammenhang gesehen werden müssen.
Es ist daher für Reihenuntersuchungen von Patienten, die an akuten entzündlichen Erkrankungen leiden, wünschenswert,
wenn man in einem Analysengang die Konzentrationswerte für beispielsweise alle vier akute-Phase-Proteine ermitteln kann.
Bisher ist es notwendig, je einen Analysengang für jede
Proteinart durchzuführen.
Die Grundlage der immunologischen Nachweis- und Bestimmungsmethoden
beruht auf der Eigenschaft von Antigenen mit spezifisch gegen die Antigene gerichteten Antikörpern, wie sie
in den entsprechenden Antiseren enthalten sind, stöchiometrisch
unter Ausbildung von Präzipitaten zu reagieren. Die '
als einfache lineare und einfache radiale Immundiffusion bezeichneten Verfahren sind darauf aufgebaut, daß Antigene
in eine Antiserum enthaltende Matrix diffundiei'en und dabei
einen Antigen-Antikörperkomplex bilden. Der Äquivalenzbereich der Komplexbildung wird bei entsprechender Konzentration
der Reaktanten durch Präzipitatlinien angezeigt, die ■mit bloßem Auge beobachtet werden können oder nach Anfärbung
mit geeigneten Farbstoffen sichtbar gemacht werden können.
Wird das Antigen durch ein elektrisches Spannungsfeld in einer Matrix, die einen homologen Antikörper enthält, bewegt,
so entsteht je nach der Wanderungsgeschwindigkeit des Antigens ein mehr oder weniger langgestrecktes Präzipitat. Die ■
Diffusions- bzw. Wanderungswege sind jeweils das Maß für die Menge des zu bestimmenden Antigens. Xtfird keine Beziehung
mit einer Standardantigenmenge hergestellt, so gilt die Präzipitatbildung als qualitativer Nachweis der unbekannten
Substanz.
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Diese als Immundiffusion bzw. Immunoelektrophorese bezeichneten
Techniken- ermöglichen jedoch je Analysengang die Be-Stimmung
von nur einem einzelnen Antigen. Eine Weiterentwicklung der Immunoelektrophorese wurde von Laurell, Scand.
J.elin.Lab.Invest. 29, suppl. 124, 21-37 (1972), beschrieben,
bei der mit Hilfe eines Antiserums, das Antikörper mit
Spezifitäten gegen mehrere Antigene enthält, durch Elektroimmunodiffusion
die Bestimmung mehrerer Antigene grundsätzlich möglich ist.
Bei einem Gemisch von zwei Antikörperarten liefert die
Methode noch relativ übersichtliche Bilder. Die Länge der
Immunpräzipitate ist aber abhängig von der Proteinkonzentration, so daß nicht ohne weiteres zu entscheiden ist,
welcher der von der gleichen Auftragssteil·- ausgehende Präzipitatgipfel einem bestimmten Protein zuzuordnen ist. .
Völlig unübersichtlich werden die Verhältnisse, wenn mehr .als zwei Antikörperarten auftreten.
Die wesentliche Einschränkung dieasrMethode ist demnach, daß
äie Größenordnung der Konzentrationen und das elektrophoretisch^
Verhalten der beiden Antigene einerseits voneinander abgesetzte Präzipitate liefern muß, und daß andererseits
bekannt sein muß, welches Präzipitat dem zu bestimmenden einzelnen Antigen zuzuordnen ist.
Bei der Untersuchung von Patientenseren kann dies"zu folgenschweren
Fehlinterpretation der Ergebnisse führen. Mißverständliche Ergebnisse erfordern zudem eine Wiederholung der
Bestimmung für die geeignetes Material häufig nicht mehr vorhanden ist. .
Es bestand seit längerem der Bedarf nach einem immunologischen Verfahren zur Bestimmung mehrerer Antigene einer Probe
in einem einzigen Ansatz, das Verwechslungen der ermittelten Konzentrationen ausschließt.
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Es war - wie erwähnt - bekannt, in einem Antigengemisch,
das einer Elektrophorese in einer Matrix unterworfen wird, die einen monospezifischen Antikörper gegen"eines der Antigene
enthält, das entsprechende Antigen zu bestimmen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass bei einer elektrophoretischen
Wanderung eines Antigengemisches durch mehrere aneinandergereihte Matrixstreifen, wovon jeder Streifen ein
spezifisches Antiserum gegen ein einziges Antigen enthält,
sich jeder einzelne Matrixstreifen so verhält, als wäre die Elektrophorese nur mit einer einheitlich mit einem Antikörper
beladenen Matrix durchgeführt. Die Antigene durchwandern
diejenigen Matrixstreifen unangefochten, in de.nen sich ein anderes als das für sie spezifische Antiserum befindet
und präzipitieren ausschliesslich in demjenigen Matrixstreifen, der das für sie spezifische Antiserum enthält.
Auf diese ¥eise ist die qualitative und quantitative Bestimmung von gleichzeitig mehreren Antigenen möglich.
Gegenstand der Erfindung ist demnach eine Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung
mehrerer Antigene in Antigengemischen durch Immunoelektrophorese in einer antikörperhaltigen Matrix, dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger für die Matrix mit mehreren aneinandergereihten, jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden
Matrixstreifen beschichtet ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur qualitativen
und quantitativen Bestimmung von Antigenen durch Verwendung dieser Anordnung.
Immunoelektrophoresen werden am häufigsten auf Agar- oder Agarose-Gel als Matrix vorgenommen. Es können jedoch auch
andere gelbbildene Substanzen wie Stärke, Gelatine oder Acrylamid verwendet werden.
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Die beigefügte Abbildung zeigt in Fig. 1 schematisch die
Herstellung der erfindungsgemässen Anordnung und in Fig. 2
eine typische Verteilung der Präzipitate in einer erfindungsgemässen Matrix nach Durchführung einer Immuno-Elektrophorese.
In der Fig. 1 ist dargestellt, in welcher Weise eine Trägerplatte (1) mit Agar als Matrix mit Gelstreifen (2) bis (5)
beschichtet wird, wovon jeder Streifen ein bestimmtes monospezifisches Antiserum enthält. Die Streifen werden in
der gewünschten Breite nacheinander zunächst als flüssige . antiserumhaltige Lösung von beispielsweise Agar oder Agarose
in Elektrophoresepuffer auf der waagerecht liegenden Platte in der Form ausgegossen, dass man z.B. durch einen Block (£),
vorzugsweise einen solchen aus Metall, die Fläche der Platte, die mit dem nächsten Gel beschichtet werden soll, abgrenzt.
Nach dem Erstarren des Gels wird der Block weitergerückt und der nächste freiwerdende Streifen mit flüssigem Gel ausgegossen.
Die Gele haben in einer vorteilhaften Anwendung eine Breite von ca. 2-4 cm. Auf einer gebräuchlichen Platte 10 χ 10 cm
können somit bis zu vier oder fünf verschiedene Gelstreifen aufgebracht werden. Der unterste Gelstreifen (2) (kathodisch),
gekennzeichnet mit (-), sollte das Antiserum gegen das Antigen mit der geringsten Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen
Feld, der oberste (5) (anodisch) (in der Fig. 1 noch nicht aufgebracht), gekennzeichnet mit (+)» das Antiserum gegen
das Antigen mit der höchsten Wanderungsgeschwindigkeit enthalten. In den untersten Streifen werden dann die Auftragsstellen (7) eingestanzt, in die die zu untersuchenden Antigenlösungen
eingefüllt werden. Die Platte der Abb. 1 eignet sich also zur Bestimmung von vier verschiedenen Antigenarten
in sieben Proben. Bei entsprechend längeren Trägerplatten lassen sich bei Verwendung geeigneter Geräte jedoch beliebig
mehrere Proben auftragen.
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Ma 181
Die Matrixstreifen können"aber auch so angeordnet werden,
dass die Auftragsstellen sich in einem schmalen Streifen eines antiserumfreien Gels befinden, an das sich dann der
erste Streifen mit einem antiserumhaltigen Gel anschliesst. Diese Anordnung hat den Vorteil, dass die Antigene nacheinander
je nach ihrer Wanderungsgeschwindigkeit in das erste
Gel eintreten. Das langsamste Antigen, das im ersten Streifen reagiert, stört somit bei der Bildung des Immunpräzipitats
nicht die übrigen Antigene, die schon weiter gewandert sind.
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt unter den üblichen
Bedingungen der Elektroimmunodiffusion in einer dafür geeigneten Apparatur. Die Antigene werden als Lösungen in die
Auftragsstellen mittels einer Mikropipette oder Mikroliterspritze eingeführt. Nach Anlegen eines elektrischen Feldes
von 7 bis 10 V/cm wandern die Antigene so lange ungestört durch die antiserumhaltigen Gelstreifen hindurch, bis sie
in dem entsprechenden Streifen auf die spezifisch gegen sie'
gerichteten Antikörper treffen.
Nach einer Elektrophoresdauer von etwa 3 Stunden ist die Reaktion beendet. ¥ird bei niedrigen FeÜstärken, beispielsweise
2-3 V/cm, gearbeitet, dauert die Elektrophorese 8-16 Stunden.
Dabei erfolgt die Ausbildung der raketenförmigen Immunpräzipitate,
deren Länge ein Maß für die Antigenkonzentration ist. Zweckmässig erfolgt im Anschluss an die Elektrophorese
eine Anfärbung der Antigen-Antikörperkomplexe mit geeigneten Farbstoffen, beispielsweise mit dem Farbstoff Coomassi
Brilliant blue R nach-bekannten Techniken. Die Messung der
Präzipitatlinie kann mit einem Millimeter-Maßstab durchgeführt werden.
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In der Fig. 2 ist gezeigt, wie sich eine erfindungsgemässe
Bestimmung von gleichzeitig vier Antigenen in sieben Proben nach Abschluss der Elektrophorese und einer angeschlossenen
Anfärbung der Präzipitate darstellt. (7) entspricht den Auftragsstellen der Abb. 1.
Die Auswertung wird in der üblichen Weise über Eichkurven vorgenommen.
Zum Aufstellen einer Bezugskurve kann man sich 3 oder 4 verschiedene
Verdünnungen eines geeigneten Antigenstandards mit physiologischer NaCl-Lösung als Verdünnungsflüssigkeit
herstellen. Diese Verdünnungen müssen so eingestellt werden, dass sie den bevorzugten Meßbereich, bei Plasmaproteinen '
z.B. 3-30 mg/100 ml, abdecken. Die zu untersuchenden Patientensera
werden vorteilhaft 1:2 verdünnt aufgetragen.
Eine nahezu geradlinig verlaufende Eichkurve erhält man nach Auftragen der Präzipitatlängen als Funktion der Standardantigen-Konzentration
auf Millimeterpapier.
Beim Verzicht auf eine quantitative Bezugnahme der zu bestimmenden
Antigene ist die erfindungsgemässe Anordnung zum qualitativen Nachweis von. Antigenen einzusetzen. Dabei ist nur
registrieren, ob eine Präzipitatbildung des gesuchten Antigens mit dem entsprechend in die Matrix eingetragenen Antikörper
eintritt oder nicht.
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Für die "Bestimmung eignen sich alle Antigene, die unter geeigneten
Bedingungen eine elektrophoretische Wanderung zeigen und ■gegen die spezifische Antiseren erhalten werden können. Antigene,
die unter den gewählten Bedingungen als solche keine oder nur eine geringe elektrophoretische Beweglichkeit zeigen, können
nach bekannten Methoden wie der Carbamylierung oder der Umsetzung mit ß-Propiolacton, Formaldehyd, Äthylenoxid u.a.
entsprechend modifiziert der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode unterworfen werden. Ein bevorzugtes Am^endungsgebiet
der Methode liegt naturgemäss in der klinischen Diagnostik zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Bestandteile des Plasmas
und der Körperflüssigkeiten. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, die Anordnung und das Verfahren auch..zur
Bestimmung von mjlrobiellen Stoffwechselprodukten oder Pflanzeninhaltsstoffen
einzusetzen, sofern sie aitigene Eigenschaften
zeigen.
Die eindeutige Zuordnung der Präzipitate zu den zu bestimmenden Antigenen macht die erfindungsgemässe Methode für Personen ohne
besondere Qualifikationen durchführbar. Sie wird somit als Routinemethode für Kliniken und Forschungslaboratorien mit
gutem Erfolg eingeführt werden können.
Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel erläutert werden.
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Zur Herstellung einer Matrixplatte erhitzt man eine Mischung aus 1,5 g Agarose und 100 ml Barbitalpuffer, pH 8,6, p. 0,02,
bis zum Sieden- Wenn sich die Lösung geklärt hat, läßt man abkühlen. Das Zumischen 'von Antiserum für die Herstellung antiserumhaltiger
Matrixplatten erfolgt bei 56 C. Die heiße, flüssige Agaroselösung kann in einem 56°C v/armem Wasserbad auf diese für
'die Mischung optimale Temperatur abgekühlt v/erden. Das Wasserbad
dient gleichzeitig zum Vorwärmen des Antiserums.
Auf einer Glasplatte 10 χ 10 cm.wird mit Hilfe eines Metallblocks
am unteren Rand ein ca. 2 cm breiter Streifen einer l,5%igen Agaroselösung von 56°C ausgegossen, der kein Antiserum enthält.
Die Schichtdicke des Agarosestreifens beträgt ca. 1,5 mm. Es
werden.ca. 3 ml Agaroselösung benötigt. Nach dem Erstarren des Gels.wird der Metallblock um 2 cm weitergeschoben und 3 ml eines
Agarosegels ausgegossen, das 2% eines Anti-C3-Serums vom Kaninchen enthält. In der gleichen Weise gießt man je einen Streifen mit
2% Anti-Transferrin, mit 5% Anti-ß-Lipoprotein und mit 1% An-ti-Haptoglobin-Serum
an. In den unteren Streifen stanzt man die Auftragsstellen mit 2,5 mm Durchmesser zur Aufnahme von 5 p.1 der
zu untersuchenden Patientenseren.
Die elektrophoretisch^ Auftrennung erfolgt/bei einer Feldstärke
von 10 V/cm 3 Stunden lang. " " .
Die Länge der Präzipitate wird mit den entsprechenden Werten der mit Standardsubstanzen erhaltenen Angaben in Beziehung gesetzt
und erlaubt auf diese Weise die quantitative Bestimmung des Komplementfaktors
C 3, des Transferrins, des ß-Lipoproteins und des
Haptoglobins in einem Ansatz. . ■ .
/* nach Beschicken der Auftragsstellen
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Claims (4)
1. Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen
Bestimmung mehrerer Antigene in Antigengemisehen durch Immunoelektrophorese in einer antikörperhaltigen Matrix,,
dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Matrix mit mehreren aneinandergereihten, jeweils ein spezifisches
Antiserum enthaltenden Matrixstreifen beschichtet ist.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Matrix mit einem antiserumfreien Matrixstreifen
zur Aufnahme der Antigengemische und daran' aneinandergereiht mehreren jeweils ein spezifisches Anti-serum
enthaltenden Matrixstreifen beschichtet ist.
3. Verfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene gekennzeichnet durch Verwendung
einer Anordnung nach Anspruch 1.
4. Verfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene gekennzeichnet durch Verwendung
einer Anordnung nach Anspruch 2.
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