DE2338254A1 - Verfahren zur messung des plasminogengehaltes durch bestimmung der bildung von fibrin in einer probe - Google Patents

Verfahren zur messung des plasminogengehaltes durch bestimmung der bildung von fibrin in einer probe

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Description

26. Juli 1973 Dr, med. E. Jacobi., 4006 Erlcrath, Schinlcelstr. 30 c
"Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes durch Bestimmung der Bildung von Fibrin in einer Probe"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes durch Bestimmung der Bildung von Fibrin in einer Probe.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Bestimmung von Plasminogen im Patientenblut. Sie ist erforderlich, um eine fibrinolytische oder antifibrinolytische Therapie bei thromboembolisch Erkrankten oder bei Patienten mit globaler Gerinnungsstörung dosieren und ihren Verlauf kontrollieren zu können.
Bekanntlich wird bei der Blutgerinnung durch Thrombin das lösliche Fibrinogen in das unlösliche Fibrin umgewandelt. Plasmin, welches im Blut als Plasminogen (Vorstufe) vorliegt und durch Antiplasmine blockiert ist, spaltet das Fibringerinnsel wieder auf.
In den letzten Jahren ist es auf dieser Grundlage beispielsweise gelungen, durch den Plasminaktivator Streptokinase mit
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Hilfe des körpereigenen Plasmins Blutgerinnsel wieder aufzulösen. Mit dieser Therapie wurden sowohl Thrombosen als auch Herzinfarkte erfolgreich behandelt. Die Streptokinasebehandlung konnte jedoch keine breite Anwendung finden, da bislang die Mortalitätsrate zu hoch war. Das beruht darauf, daß bisher die routinemäßige Plasminogenbestimmung nicht möglich ist, aber bei zunehmender Piasminaktivierung die Verblutungsgefahr ansteigt.
Es sind zwar verschiedene Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes bereits bekannt, z. B. der Clot lysis time Recorder, Ea. Medicon Ltd., Glasgow, Scotland, der Enzo- -Diffusion Fibrin-Platten-Test der Fa. Hyland, Travenol International GmbH, Münchent und der Plasminogen-Platten-Test der Fa. Behringwerke, Marburg, Lahn. Diese Verfahren sind für Routinezwecke ungeeignet, weil sie einerseits zu aufwendig sind und andererseits zu viel Zeit erfordern, d. h. in der Regel zwischen 6 und 48 Stunden dauern. Bei nahezu allen Verfahren wird zur Plasminogenbestimmung die Auflösung des Fibringerinnsels gemessen, was aber einer Messung nur schwer zugänglich ist. IT. a. beruht daher die Länge der vorbekannten Verfahren auf der Schwierigkeit, die Antiplasmine vom Plasminogen zu trennen, was bisher nur unvollständig gelungen ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes zu schaffen, das erheblich schneller zu den gewünschten Meßergebnissen führt und sich daher für die routinemäßige Plasminogenbestimmung eignet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Bildung des Fibrins in einer Lösung von Fibrinogen und antiplasminfreiem, plasminaktiviertem Probenplasma unter
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Beifügung von Thrombin verzögert und der Plasminogengehalt durch die Bestimmung der Verzögerung der Gerinnung festgelegt wird.
Bei der Erfindung aktiviert man antiplasminfreies Plasminogen z. B. von einem Patienten vor Einsetzen einer konstant gewählten Fibrinbildung zu Plasmin, so daß die plasminbedingte Fibrinspaltung mit der Fibrinbildung einsetzt. Die Gerinnung "bei der Fibrinbildung wird durch die Plasminwirkung verzögert, und die Verzögerung der Gerinnung liefert das Maß für das Plasminogen.
Insbesondere wird erfindungsgemäß die Bildung des Fibrins durch die Bestimmung des Zeitpunktes seiner Verfestigung gemessen und die Verminderung des,Plasminogengehaltes durch Vergleich des normalen Verfestigungszeitpunktes mit dem Verfestigungszeitpunkt bei beschleunigter Gerinnung gemessen.
Statt die Zeitpunkte zu bestimmen, kann man auch den Gerinnungsverlauf festlegen.
Die Fibrinbildung kann konstant vorgegeben werden, indem eine konstante Menge Fibrinogen durch eine konstante Dosis Thrombin zum Gerinnen gebracht wird. Die Messung der Fibrinverfestigung stellt kein Problem dar, weil hierfür Mechaniken in Form der sogenannten Koagulometer (z.B. nach Schnittger Gross) zur Verfügung stehen.
Durch Waschen vonCitratplasma mit 3 Teilen Iso-amyl-alkohol wird die gesamte Antiplasminaktivitat eliminiert (The Significance of Plasma Inhibitor (s) in the Control of Fibrinolytic (Plasmin) Activity in Blood, MONKHOUSE, F.C. et al., Thrombos. Diathes. haemorrh. 1972, 28, 367-375).
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In der Regel wird die Messung so ausgelegt, daß die Bildungsgeschwindigkeit des Fibrins mäßig schneller verläuft als die Abbaugeschwindigkeit.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der beigefügten Graphik näher erläutert:
Auf der Abszisse ist die Zeit aufgetragen, während die Ordinate die Verfestigung bzw. Gerinnung wiedergibt. Die Parallele zur Abszisse, die mit a bezeichnet ist, bedeutet den Endpunkt der Messung im Koagulometer.
Die mit 1 bezeichnete Kurve zeigt den Verlauf der Fibrinbildung bei einer Probe, die aus Fibrinogen, Urokinase und Thrombin besteht (ohne Plasmin). Bei dem Ausführungsbeispiel ist die Messung so ausgelegt, daß die Bildungsgeschwindigkeit des Fibrins mäßig schneller verläuft als die Abbaugeschwindigkeit. Bei normalem Plasminogengehalt (100 %) ergibt sich die Kurve 3, welche die Fibrinbildung bei einer Probe aus Fibrinogen, Plasmin (100 %), Urokinase und Thrombin wiedergibt.
Die Kurve 2 zeigt die Bildung von Fibrin in einer Probe aus Fibrinogen, Urokinase und Thrombin, sowie Plasim in 50 #-iger Verdünnung.
Die Graphik zeigt, daß die Verminderung des Plasminogens durch die Bestimmung einer für die Meßgenauigkeit ausreichenden Verkürzung der Fibrinbildungszeit erreicht wird.
Eine Eichkurve erhält man, wenn man die Meßzeiten, die durch Verdünnung von Plasminogenproben gesunder Versuchspersonen gewonnen werden, in ein doppelt logarithmisches
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Millimeterpapier gegen die prozentuale Verdünnung aufträgt. Die Punkte ergeben dann annäherungsweise eine Gerade.
Nachfolgend wird ein praktisches Beispiel für das erfindungsgemäße Meßverfahren beschrieben:
Zunächst erfolgt die Zubereitung von antiplasminfreiern Plasma. Dazu wird Citratplasma ca. 1 Min. mit 3 Teilen ■ Iso-amy-alkohol geschüttelt und anschließend bei 3000 U/min für ca. 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgehebert und verworfen. Darauf ist eine erneute Zentrifugation für ca. 30 Minuten bei ca. 40C erforderlich. Danach wird der Restüberstand verworfen.
Die eigentliche Messung geschieht wie folgt:
Vorgegeben wird eine definierte Menge Fibrinogen (z.B. 0,1 ml Humanfibrinogen-plasminogenfrei der Fa. Behringwerke in einer Konzentration von 200 mg #). Eine Probe antiplasminfreies Patientenplasraa wird hinzugefügt (z.B. 0,1 ml). Hierauf gibt man einen Piasminaktivator hinzu (z.B. 1 E Urokinase in 0,1 ml).
Nach einer konstanten Aktivierungszeit (z.B. 30 see. bei 37° C) wird Thrombin zugefügt (z.B. Test-Thrombin der Fa. Behringwerke 0,3 E in 0,1 ml) und das automatische Zählwerk des Koagulators wird in Gang gesetzt.
Auf der zuvor ermittelten Eichkurve wird das zur Meßzeit zugehörige Plasminogen in Prozent abgelesen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielbaren Vorteile bestehen vor allem darin, daß die in den meisten Kliniken
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vorhandenen üblichen Koagulometer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzt werden können. Der Test ist auch sehr einfach in der Handhabung, bo daß er in den labors von medizinisch technischen Assistentinnen durchgeführt werden kann.
Die Verkürzung der Meßzeit gegenüber den eingangs als bekannt vorausgesetzten Verfahren macht das erfindungsgemäße Verfahren für Routinezwecke geeignet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem nennenswert billiger.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich, die Tests in der klinischen Diagnostik z.B. in Form käuflicher Testsets einzuführen, um z.B. durch Dosierung von Streptokinase nach der Höhe des aktuellen Piasminogenspiegele diese Therapie zu verbessern und Komplikationen zu verringern.
Patent an Sprüche
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes durch Bestimmung der Bildung von Fibrin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung des Fibrins in einer Lösung von Fibrinogen und antiplasminfreiem, plasminaktiviertem Probenplasma unter Beifügung von Thrombin verzögert und der Plasminogengehalt durch die Bestimmung der Verzögerung des Gerinnungszeitpunktes festgelegt wird.
    Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung des Fibrins durch die Bestimmung des Zeitpunktes seiner Verfestigung gemessen und die Verminderung des Plasminogengehaltes durch Vergleich des normalen Verfestigungszeitpunktes mit dem Verfestigungszeitpunkt bei beschleunigter Gerinnung gemessen wird.
    Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gerinnungsverlauf bestimmt wird.
    Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß Plasminogen vor der Fibrinbildung mittels eines Aktivators in Plasmin umgewandelt wird.
    Verfahren nach Anspruch 1 und wenigstens einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Antiplasmine durch Iso-amylalkohol zur Herstellung des Testplasmas ausgewaschen werden.
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    6. Verfahren nach Anspruch 1 und einem oder jjohreron der vorauogelienden Ansprüche ,dadurch gekennzeichnet, daß öJc Gerinn\3ngi:;gc£3oh\,'.i2i-di£'keit von Planmaproben Gesunci(?r als Vergleichsgröße verviendet wird.
    6 0 '} 8 0 7 / 0 5 C) H
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