DE2834893C2

DE2834893C2 -

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Publication number: DE2834893C2
Application number: DE2834893A
Authority: DE
Inventors: Yuichi Takarazuka Jp Yamamura; Ichiro Aoyamadai Suita Jp Azuma; Katsusuke Takatsuki Jp Ennyu; Osamu Takarazuka Jp Aoki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-08-09
Filing date: 1978-08-09
Publication date: 1987-08-27
Also published as: FR2399844A1; FR2399844B1; SE447629B; BE869610A; HU179726B; FI65370C; AU526788B2; DK153443B; FI782442A; JPS631291B2; CA1118348A; IT1098381B; GB2002229A; FI65370B; US4543253A; CH643459A5; JPS5428813A; GB2002229B; DK352578A; IT7826609A0

Description

Die Erfindung betrifft ein stabilisiertes, immuntherapeutisches Mittel mit Adjuvans- und Antitumoraktivität auf der Basis von an Trägeröl gebundenem Mikroben-Zellwandgerüst vom Genus Nocardia, das als immuntherapeutisches Mittel gegen den Humantumor eingesetzt werden kann.

Es ist bereits bekannt, daß das Zellwandgerüst von bestimmten Mikroorganismen (nachfolgend abgekürzt als "CWS" bezeichnet), z. B. solchen des Genus Mycobacterium, wie Mycobacterium bovis BCG, oder Nocardia, wie Nocardia rubra, Adjuvans- und Antitumor-Aktivitäten aufweist. Da das CWS jedoch eine wasserunlösliche Substanz ist, konnte sie bisher nicht in Form eines konventionellen wäßrigen Injektionsprä parats an Menschen verabreicht werden. Es mußte daher bei der Antitumor-Therapie in Form einer Suspension an Menschen verabreicht werden. Das CWS wurde daher als ein an ein Trägeröl gebundenes Präparat formuliert und dann zu einer Öl-in- Wasser-Suspension verarbeitet, die als Präparat verabreicht wurde.

So stellt beispielsweise das CWS von Mycobacterium bovis BCG, das mit einem Mineralöl behandelt und in einer Lösung von Kochsalz-0,2% Polyoxyethylensorbitanmonooleat suspendiert worden ist, ein wirksames Mittel für die Unter drückung des Tumorwachstums oder für die Rückbildung eines bereits vorhandenen Tumors bei Tieren dar (vgl. I. Azuma et al, "Gann (Cancer)", 65, 493-505 (1974); T. Yoshimoto et al, "Gann (Cancer)", 67, 441-445 (1976), und B. Zbar et al, "J. Nath. Cancer Inst.", 52, 1571-1577 (1974)). Es hat sich gezeigt, daß dieses an ein Trägeröl gebundene BCG-CWS wirksam ist in bezug auf die Verlängerung der Lebensdauer und in bezug auf die Verbesserung des immu nologischen Zustandes von einen Tumor tragenden Patienten (vgl. Y. Yamamura et al, "Gann (Cancer)", 67, 669-677 (1976); Y. Yamamura et al, "Gann (Cancer)", 66, 355-363 (1975), und K. Yasumoto et al, "Gann (Cancer)", 67, 787-795 (1976).

Vor kurzem wurde ferner gefunden, daß die Suspension des an ein Trägeröl gebundenen Mikroben-Zellwandgerüstes (CWS) von Nocardia, das im wesentlichen auf die gleiche Weise wie oben angegeben hergestellt wurde, wirksam ist als immunotherapeu tisches Mittel bei Humantumor (vgl. I. Azuma et al, "Gann (Cancer)", 67, 669-677 (1976)).

Obgleich das an ein Trägeröl gebundene CWS viele Vorteile in bezug auf Komplikationen und die Qualitätskontrolle als immuntherapeutisches Mittel im Vergleich zu lebenden Mikro organismen aufweist, ist es dennoch mit Mängeln behaftet, wie z. B. dem, daß die Suspension des an ein Trägeröl gebundenen CWS instabil ist und nicht länger als einen Tag unter den gleichen Bedingungen haltbar ist, so daß die Qualität des Präparats ebenso wie die Stärke seiner Aktivität bei längerer Lagerung abnimmt. Es war daher bisher erforderlich, die Suspension des an ein Trägeröl gebundenen CWS jedesmal unmittelbar vor ihrer Verwendung, d. h. unmittelbar vor der Verabreichung an den damit zu behandelnden Patienten, herzu stellen. Ein solches Präparat ist aber für die Therapie, ins besondere in einem Krankenhaus, zu umständlich und daher in der Praxis nicht verwendbar.

Aufgabe der Erfindung war es daher, die Mängel des Suspen sionspräparats des an ein Trägeröl gebundenen Mikroben- Zellwandgerüsts vom Genus Nocardia zu beseitigen und ein stabilisiertes immuntherapeutisches Mittel auf der Basis dieses Suspensionspräparats zu entwickeln, das über einen längeren Zeitraum hinweg haltbar ist und seine Adjuvans- und Antitumoraktivität beibehält, so daß es für die therapeutische Verwendung insbesondere in einem Krankenhaus verwendbar ist.

Nach umfangreichen Untersuchungen auf diesem Gebiet wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe durch ein stabilisiertes, immuntherapeutisches Mittel mit einer spezifischen Zusammensetzung gelöst werden kann, das durch Gefrier trocknen verfestigt worden ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein stabilisiertes, immun therapeutisches Mittel mit Adjuvans- und Antitumoraktivität auf der Basis von an Trägeröl gebundenem Mikroben- Zellwandgerüst vom Genus Nocardia, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß es aus einer Suspension besteht, die sich zusammensetzt aus dem Mikroben-Zellwandgerüst von Nocardia rubra mit dem Trägeröl, einem Polyalkoholester als Suspendiermittel und einem Zuckeralkohol oder Zucker als Dispergiermittel und wobei die Suspension durch Ge friertrocknen verfestigt worden ist.

Das erfindungsgemäße stabilisierte immuntherapeutische Mittel ist im verfestigten Zustand für einen viel längeren Zeitraum stabil und kann daher über einen viel längeren Zeitraum hinweg aufbewahrt werden als die bisher verwendete, stets frisch herzustellende Suspension des an das Trägeröl gebundenen CWS, wobei es nicht nur seine physikalische Stabilität, sondern auch seine Adjuvans- und Antitumoraktivität praktisch unverändert beibehält. Es kann leicht zu einer einheitlichen Suspension des an das Trägeröl gebundenen CWS verarbeitet werden, die ebenso stabil und wirksam ist wie die frisch hergestellte Suspension durch einfache Zugabe von sterilisiertem Wasser auch nach Ablauf eines längeren Lagerungszeitraums, ohne daß seine Aktivität darunter leidet. Außerdem kann das erfindungsgemäße stabilisierte, immuntherapeutische Mittel in großtechnischem Maßstab hergestellt werden, ohne daß die Produktqualität darunter leidet.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Trägeröl um ein tierisches Öl, ein pflanz liches Öl, ein Mineralöl oder ein halbsynthetisches Öl, ins besondere um Drakeol 6VR, Squalen, Squalan, Miglyol oder Vitamin A-Palmitat.

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Suspendiermittel handelt es sich vorzugsweise um einen Polyoxyethylensorbitanester, insbesondere um Polyoxyethylensorbitan-monolaurat, -monapal mitat, -monostearat, -monooleat, Sorbitan-monolaurat, -mono palmitat, -monostearat und -monooleat.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Dispergiermittel um einen Zuckeralkohol oder um einen Zucker, insbesondere um Mannit, Sorbit oder Glukose.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung besteht das stabilisierte, immuntherapeutische Mittel aus einer Suspension, die sich zusammensetzt aus dem Mikroben-Zell wandgerüst (CWS) von Nocardia rubra, Squalen, Polyoxyethylen sorbitanmonooleat und Mannit.

Es eignet sich besonders gut für die Herstellung einer inji zierbaren Suspension.

Wenn in der Beschreibung und in den Ansprüchen hier von der "Zusammensetzung" des erfindungsgemäßen stabilisierten, immun therapeutischen Mittels die Rede ist, so ist dies stets so auszulegen, daß es selbstverständlich auch noch andere übliche Bestandteile enthalten kann.

Das erfindungsgemäß verwendete Mikrobenzellwandgerüst von Nocardia rubra kann hergestellt werden durch Fraktionieren und Reinigen von Zellwänden der Zellen des kultivierten Mikroorganismus Nocardia rubra auf konventionelle Weise (vgl. I. Azuma et al, "J. Nath. Cancer Inst.", 52, 95 (1974), und I. Azuma et al, "Biken J.", 18, 1 (1975)). Ein Beispiel für eine solche Herstellung des erfindungs gemäß verwendeten CWS von Nocardia rubra wird weiter unten näher beschrieben.

Unter dem erfindungsgemäß verwendeten Trägeröl ist ein Öl zu verstehen, das die Fähigkeit hat, die Anjuvans- und Antitumor-Aktivitäten des erfindungsgemäßen stabilisierten, immuntherapeutischen Mittels zu stimulieren. Ein solches Trägeröl kann umfassen ein natürliches und synthe tisches oder halbsynthetisches Öl und Beispiele für geeignete Öle sind in "Immunology", 27, 311-329 (1924), beschrieben und besonders bevorzugt werden verwendet ein tierisches Öl (wie Squalen, Vitamin A-Öl, Vitamin E-Öl und Ubichinon) und ein Metabolit davon, ein pflanzliches Öl (wie Miglyol, eine Mischung aus Erdnußöl, Aracel und Aluminiummo nostearat), ein synthetisches oder halbsynthetisches Öl (wie Squalan, Vitamin A-Palmitat), ein Mineralöl (wie flüssiges Paraffin und Drakeol 6VR), wobei besonders bevorzugt sind Squalen, Squalan, Miglyol, Drakeol 6VR und Vitamin A-Palmi tat.

Bezüglich des erfindungsgemäß verwendeten Trägeröls sei be merkt, daß dieses wirksam und brauchbar ist zum Stimulieren des Transports des CWS in den Wirkungsbereich (beispielsweise in den Thymuszellenbereich), wobei es die Funktion hat, das CWS in diesem Bereich für einen ziemlich langen Zeitraum zu halten und das Immunisierungsvermögen desselben zu ver längern. Unter den obengenannten beispielhaften Trägerölen ist ein tierisches Öl, insbesondere Squalen, erfindungsgemäß besonders bevorzugt, weil ein solches Trägeröl aus einer natürlichen Quelle stammt und daher eine natürliche Affinität gegenüber dem menschlichen Körper hat.

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Suspendiermittel handelt es sich um einen Polyalkoholester, wie z. B. Poly oxyethylensorbitanmonolaurat, -monopalmitat, -monostearat, -monooleat, Sorbtitan-monolaurat, -monopalmitat, -monostearat und -monooleat, wobei unter diesen Polyalkoholestern das Polyoxyethylensorbitanmonooleat besonders bevorzugt ist.

Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Dispergiermitteln handelt es sich um Zuckeralkohole, wie Mannit und Sorbit, und Zucker, wie Glukose, wobei Mannit als Zuckeralkohol besonders bevorzugt ist.

Bezüglich der Wirksamkeit des Dispergiermittels, das in dem erfindungsgemäßen verfestigten stabilisierten, immuntherapeutischen Mittel enthalten ist, sei bemerkt, daß es nicht nur dazu dient, die Überführung des stabilisierten immuntherapeu tischen Mittels in eine Suspension zu erleichtern, sondern auch dazu, die frisch hergestellte Suspension isotonisch zu machen.

Das Mengenverhältnis der Komponenten des erfindungsgemäßen stabilisierten, immuntherapeutischen Mittels untereinander, d. h. von CWS, Trägeröl, Suspendiermittel und Dispergiermittel, kann in beliebiger Weise festgelegt werden und bevorzugte und in der Praxis bewährte Verhältnisse der Komponenten untereinander gehen aus den weiter unten beschriebenen Aus führungsbeispielen hervor.

Das erfindungsgemäße stabilisierte, immuntherapeutische Mittel kann beispielsweise hergestellt werden durch Suspendieren einer Mischung der obengenannten Komponenten auf konventionelle Weise und Lyophilisieren der dabei erhaltenen Suspension. Dabei wird beispielsweise das CWS in einen Gewebehomogenisator eingeführt und das Trägeröl wird zugegeben, wonach die Mischung gewünschtenfalls zu einer glatten Paste gemahlen wird; zu der Mischung wird eine wäßrige Lösung des Dispergiermittels, die ein Suspendiermittel enthält, zugetropft und die Mischung wird ge mahlen und homogenisiert zur Erzielung einer gleichmäßigen Suspension und dann wird die so hergestellte Suspension in eine Phiole überführt, unter Verwendung von beispielsweise flüssigem Stickstoff schnell ausgefroren (abgekühlt) und lyophilisiert.

Das erfindungsgemäß hergestellte erstarrte pharmazeutische Mittel kann durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor der Verabreichung an Patienten wieder suspendiert werden und es weist einige Anwendungs gebiete und Vorteile auf, die aus den nachfolgend angegebenen Punkten hervorgehen:

1.) Das erfindungsgemäße erstarrte pharmazeutische Mittel kann für einen viel längeren Zeitraum aufbewahrt werden als die frisch hergestellte Suspension des an Öl gebundenen CWS, wobei es nicht nur seine physikalische Stabilität, sondern auch die Stärke der Aktivitäten im wesentlichen unverändert beibehält. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß die frisch hergestellte Suspension des an Öl gebundenen CWS in der Regel mindestens eine Stunde zersetzt wird zu einer uneinheitlichen und ungleichmäßigen Suspension, aus der nur schwer wieder eine einheitliche und gleichmäßige Suspension hergestellt werden kann, was dazu führen kann, daß sie daher nach Ablauf einer längeren Konservierungs dauer derselben nicht die ursprüngliche therapeutische Wirksamkeit des CWS selbst mehr aufweist;
2.) das erfindungsgemäße erstarrte pharmazeutische Mittel kann leicht wieder zu einer einheitlichen Suspension des an Öl gebundenen CWS verarbeitet werden, die in dem gleichen Zustand hochstabil ist wie die frisch hergestellte Suspension durch einfache Zugabe von sterilisiertem Wasser dazu auch nach Ablauf eines längeren Konservierungszeitraumes (Aufbewahrungszeitraumes) und das wieder suspendierte Präparat kann die gleiche Aktivität wie die frisch hergestellte Suspension des an Öl gebundenen CWS und eine höhere therapeutische Wirksamkeit des CWS selbst auf weisen als die Suspension des an Öl gebundenen CWS, die für einen langen Zeitraum aufbewahrt worden ist, wie oben angegeben;
3.) bisher wurde die Suspension des an Öl gebundenen CWS jedesmal unmittelbar vor der Verabreichung wie oben angegeben hergestellt. Da eine Einzeldosis des CWS eine sehr kleine Menge ist (z. B. von etwa 100 bis 300 µg), ist die Herstellung der Suspension des an Öl gebundenen CWS sehr umständlich, und es ist andererseits sehr schwierig, eine Suspension der gleichen Qualität, welche die gegebene Menge enthält, herzustellen. Auch wenn eine größere Menge der Suspension des an Öl gebundenen CWS auf einmal hergestellt wird, um diese Menge zu überwinden, ist die Suspension selbst sehr instabil und kann nicht über einen langen Zeitraum hinweg wie oben angegeben aufbewahrt werden und deshalb kann ein Teil der Suspension nicht therapeutisch verwendet werden und wird weggeworfen. Erfindungsgemäß ist es jedoch leicht und möglich, ein erstarrtes (festes) Mittel herzu stellen, welches die gegebene geringe Menge des an Öl gebundenen CWS enthält, in einem großen Maßstabe und die Produktqualität zu kontrollieren.

Wegen der höheren Stabilität und der größeren Stärke der Aktivi täten der aus dem erfindungsgemäßen erstarrten (festen) Mittel wieder hergestellten Suspension besteht einer der erfindungsgemäßen Vorteile oder eine der unerwarteten und überraschenden Eigenschaften, wie oben erläutert, darin, daß diese beibehaltene höhere Stabilität und Stärke offenbar auf die Tatsache zurückzuführen sind, daß das an Öl gebundene CWS in einer solchen wiederhergestellten Suspension gleichmäßig dispergiert sein kann und daß das dispergierte, an Öl gebundene CWS in Form von feinen Kügelchen (mit einem Durchmesser von beispielsweise etwa 5µm) vorliegen kann, ohne daß eine Agglutination desselben zu größeren Teilchen auftritt.

Wie aus der obigen Erläuterung der Erfindung ersichtlich, sei darauf hingewiesen und betont, daß es mit der vorliegenden Er findung zum erstenmal gelungen ist, leicht in einem großtechnischen Maßstabe ein Antitumormittel des an Öl gebundenen CWS in einer guten Qualität herzustellen und dadurch die praktische Verwendung des CWS im Krankenhaus zu ermöglichen. Diese Tatsache ist epoche machend und bedeutet, daß die vorliegende Erfindung eine Hoffnung für die Krebspatienten ist.

Die nachfolgend angegebenen pharmakologischen und pharmazeutischen Testergebnisse sollen die erfinderischen und technischen Vorteile des erfindungsgemäßen erstarrten pharmazeutischen Mittels erläutern.

Materialien und Verfahren

Adjuvantien:
Die Herstellung des CWS von Nocardia rubra (nachfolgend abgekürzt mit N. rubra) ist vorstehend beschrieben.
Drakeol 6VR, Squalen und Squalan wurden als Öle für die Herstellung des an Öl gebundenem CWS von N. rubra verwendet.
Antigene:
m-[4-(4′-Monophenylazo)phenyl]-N-acetyl-L-tyrosin (ABA-N-Acetyltyrosin) und ABA-bakterielle α-Amylase (ABA-B- αA) wurden nach dem in "J. Biol. Chem", 238, 1726-1730 (1959), beschriebenen Verfahren hergestellt. Die bakterielle α-Amylase (vom Verflüssigungs-Typ, Charge Nr. E5X01), gereinigt, von Bacillus subtilis wurde von der Firma Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Japan, bezogen.
Tumore:
Leukemia EL4 von C57BL/6J-Mäusen, Mastocytoma P815-X2 von DBA/2-Mäusen, Meth A von BALB/c-Mäusen, Fibrosarcom, indu ziert durch 3-Methyl-cholanthren in C57BL/6J-Mäusen, bezeichnet als MC104, wurden verwendet. EL4, Mastocytoma P815-X2 und Meth A wurden serienmäßig aufrechterhalten durch Passage des Ascites in jeweils syngenetischen weiblichen Mäusen. MC104 wurde serien mäßig aufrechterhalten durch subkutane Transplantation in synge netischen Mäusen.
Mäuse:
Die Mäuse waren 6 bis 8 Wochen alte weibliche Mäuse von BALB/c, C578BL/6J und DBA/2. Den Tieren wurde Futter und Wasser zur freien Verfügung gegeben.
Mediumlösung:
Das Eagle-Minimal-Essential-Medium (MEM), enthielt 100 U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin, Medium RPMI-1640. Das Fötus-Kalbserum (Charge Nr. 4055722) wurde durch 30-minütiges Erhitzen vor der Verwendung auf 56°C inaktiviert.
Direkter Zytotoxizitäts-Test:
Eine Tumorzellen (MethA)-Suspension in einer MEM-Lösung wurde mit einer gleichen Volumenmenge an Öl gebundenem CWS oder Öltröpfchen gemischt und 60 Minuten lang in einem eiskalten Wasserbad gehalten. Die Lebensfähigkeit der Tumorzellen wurde durch den Eosin Y-Ausschlußtest bestimmt.
Bestimmung der Adjuvans-Aktivität bei der Induktion der Hyper sensibilität vom verzögerten Typ:
In die vier Fußpfoten von Meerschweinchen wurde eine primäre Immunisierung verabreicht unter Verwendung einer Gesamtmenge von 50µg ABA-N-Acetyltyrosin mit der ohne das CWS von N. rubra in verschiedenen Trägerölen als Wasser-in-Öl-Emulsion. Zwei Wochen später wurden Hauttests mit 100µg ABA-BαA durchgeführt und die Reaktion wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach der intradermalen Injektion des Testantigens bestimmt.
Zellen-induzierter Zytotoxizitätstest:
C57BL/6J-Mäuse (H-2^b) wurden intraperitoneal immunisiert mit lebensfähigen Zellen von Mastocytoma P815-X2 (H-2^d) mit oder ohne an Öl gebundenes CWS von N. rubra. Am 11. Tage nach der Immunisierung wurde der Zellen-induzierte Zytotoxizitätsversuch durchgeführt unter Verwendung der Milzzellen von immunisierten Mäusen und von ⁵¹Cr- markiertem Mastozytoma P815-X2-Zellen nach dem Verfahren von Brunner et al, "Immunology", 18, 501-515 (1970), mit einigen Modifikationen (vgl. T. Taniyama et al, "Jpn. J. Microbiol.", 19, 255-264 (1975)). Das Verhältnis zwischen den Milzzellen (Effektor-Zellen) und den ⁵¹Cr-markierten Mastocytoma P815-X2- Zellen (Target-Zellen) betrug 100 : 1. Die Target-Zellenlysis wurde ausgedrückt in % der spezifischen Target-Zellenlysis unter Anwendung der folgenden Formel:

Die maximale Chromfreisetzung wurde gemessen durch vollständige Zellenlysis, wo nur Target-Zellen zweimal eingefroren und aufge taut wurden.
Herstellung des an Öl gebundenen CWS von N. rubra:
Das erstarrte (feste) Präparat des CWS von N. rubra wurde herge stellt wie in den nachfolgend angegebenen Ausführungsbeispielen beschrieben.

Ergebnisse

Einfluß des mit verschiedenen Ölen behandelten CWS von N. rubra auf die Zellen induzierte Zytoxizität bei allogenetischen Mäusen. Das CWS von N. rubra wurde mit Sqalen oder Drakeol 6VR behandelt und in einer 0,9 %igen Kochsalzlösung suspendiert, die 0,2% einer Tween 80-Lösung enthielt. C57BL/6J-Mäuse wurden mit einer Mischung von Mastocytoma-Zellen und Adjuvantien, wie oben angegeben immunisiert. Wie in der folgenden Tabelle I angegeben, waren die Präparate von CWS von N. rubra, die mit Drakeol 6VR- Kochsalz, Squalen-Kochsalz oder Squalen-Mannit behandelt worden waren, eindeutig wirksam als Adjuvans für die Induktion der Effektor-Zellen in der Milz von allogenetischen Mäusen. Es wurde auch gezeigt, daß die lyophilisierten Adjuvantien, die durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor der Verwendung wieder suspendiert wurden, ebenso wirksam waren wie die vor der Ver wendung frisch hergestellten Adjuvantien.

Direkte Zytotoxizität für Tumorzellen

Wie in der folgenden Tabelle II angegeben, wiesen alle getesteten Präparate, welche das CWS von N. rubra enthielten, keine Zyto toxizität auf, wenn diese Adjuvantien und Tumorzellen (MethA von BALB/c) 60 Minuten lang in einem Eiswasserbad gehalten wurden, das lyophilisierte Präparat von Squalen-0,9% Kochsalzlösung, das 0,2% Tween 80 enthielt, zeigte jedoch eine gewisse Toxizität gegenüber Tumorzellen. Das frisch hergestellte Präparat war unter den gleichen Bedingungen nicht zytotoxisch. Das lyophilisierte Präparat des CWS von N. rubra, das mit Squalen-Mannit behandelt worden war, war nicht zytotoxisch.

Antitumor-Aktivität von an Öl gebundenem N. rubra-CWS

Die Antitumor-Aktivität von N. rubra-CWS, das mit Squalen, Squalan oder Trakeol 6VR behandelt und in einer 5,6 %igen Mannit-Lösung, die 0,2% Tween 80 enthielt, suspendiert worden war, wurde unter Verwendung von transplantierbaren Tumoren in syngenetischen Mäusen getestet. Wie in den folgenden Tabellen III, IV, V und VI angegeben, wiesen die Präparate von N. rubra- CWS, die mit verschiedenen Arten von Ölen behandelt worden waren, nahezu die gleiche Aktivität für die Unterdrückung des Tumorwachstums von EL 4-Leukämie, Meth A und MC 104 in den jeweiligen syngenetischen Mäusen auf. Wie in der Tabelle III angegeben, war die Unterdrückungsaktivität des CWS von N. rubra auf das Wachstum von Meth A bei BALB/c-Mäusen, wie gefunden wurde, nicht unterschiedlich zwischen einem frisch herge stellten Drakeol-Kochsalz-Präparat und den Squalen-Mannit- oder Squalan-Mannit-Präparaten, die vor der Verwendung lyophili siert und in sterilisiertem Wasser suspendiert worden waren.

Wirksamkeit der Ölzusammensetzung auf die Hypersensibilität vom verzögerten Typ bei Meerschweinchen.

Das CWS von N. rubra wurde in der Mischung als Öl (wie z. B. Trakeol 6VR, Squalen oder Squalan) und Arlacel A in einem Verhältnis 85 : 15 suspendiert und dann mit einer Lösung von ABA-N-Acetyltyrosin mit oder ohne das CWS von N. rubra als Wasser-in-Öl-Emulsion gemischt. Die Meerschweinchen wurden durch intramuskuläre Injektion der obigen Mischung aus dem Adjuvans und dem Antigen immunisiert. Zwei Wochen später wurde der Hauttest mit ABA-BαA durchgeführt und die Hautreaktion wurde 24 und 48 Stunden nach der intradermalen Injektion des Testantigens bestimmt. Wie in der Tabelle VII angegeben, wurde eine positive Hautreaktion gegenüber ABA-BaA bei Meerschweinchen beobachtet, die mit ABA-N-Acetyltyrosin zusammen mit dem CWS von N. rubra und Squalen oder Squalan sowie Drakeol 6VR als Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert worden waren.

Die bei den Tests erhaltenen Daten sind in den folgenden Tabellen angegeben.

Tabelle I

Einfluß des an Öl gebundenen N. rubra-CWS auf die Zellen - modifizierte Zytotoxizität gegenüber Mastocytoma P815-X2 bei C57BL/6J-Mäusen

Tabelle II

Direkte Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen (Meth A) von an Öl gebundenem N. rubra-CWS in vitro

Tabelle III

Unterdrückung des Tumorwachstums (Meth A) mit an Öl gebundenem CWS von N. rubra in weiblichen BALB/c-Mäusen

Tabelle IV

Unterdrückung des Tumorwachstums (Meth A) mit an Öl gebundenem CWS von R. rubra in BALB/c-Mäusen

Tabelle V

Unterdrückung des Tumorwachstums (MC104) mit an Öl gebundenem CWS von N. rubra bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen

Tabelle VI

Unterdrückung des Tumorwachstums (EL-4-Leukämie) mit an Öl gebundenem CWS von N. rubra bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen

Tabelle VII

Einfluß der Ölzusammensetzung auf die Hypersensibilität vom verzögerten Typ gegenüber ABA-N-Acetyltyrosin bei Meerschweinchen

Das in den folgenden Beispielen verwendete Nocardia rubra-CWS wurde wie folgt hergestellt:

Nocardia rubra wurde in einem Medium, das 2% Polypepton und 1% Hefeextrakte enthielt (pH 7,0) 3 Tage lang bei 30°C kultiviert (gezüchtet) und die Kulturbrühe (18 l) wurde filtriert. Etwa 400 g feuchtes Mycel wurden in 1 l Wasser suspendiert und mit einer Dynomühle (0,1 bis 0,2 mm-Perlen, 3000 UpM, 2 l/Std.) 3 mal gemahlen. Die dabei erhaltene Substanz wurde abgepuffert (pH 7,5), mit Nukleinacidase (DN-ase und RN-ase) 30 Minuten lang behandelt und dann zentrifugiert (800 × g, 15 Minuten). Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und weiter zentrifugiert (10 000 bis 20 000 × g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden gesammelt und in 1 l Aceton suspendiert und 24 Stunden lang gerührt. Die Niederschläge wurden durch Filtrieren gesammelt, in 2% Triton X-100(1 l) suspendiert, 24 Stunden lang gerührt und dann zentrifugiert (10 000 bis 20 000 × g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden erneut mit Triton X-100 auf die gleiche Weise wie vorstehend angegeben behandelt. Die dabei erhaltenen Niederschläge wurden mit einer Mischung (1 l) von Äthanol und Wasser (1 : 1) und danach zweimal mit 1 l Wasser gewaschen und zentrifugiert (10 000 bis 20 000 × g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden in Veronal-Puffer (pH 9,5) suspendiert, mit Pronase (50 mg) unter Rühren bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 24 Stunden behandelt und dann zentrifugiert (10 000 bis 20 000 × g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden mit 1 l Wasser 3 mal gewaschen und zen trifugiert (10 000 bis 20 000 × g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden mit einer Mischung (1 l) von Diäthyläther und Äthanol (1 : 1) gewaschen, unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur 3 Tage lang getrocknet, pulverisiert und dann gesiebt, 125 µm), wobei ein feines Pulver von N. rubra-CWS (etwa 7 g) erhalten wurde.

Das erstarrte (feste) erfindungsgemäße Mittel (Zubereitung) wurde in sterilem Wasser wieder suspendiert und intrapleural, intralesional, intradermal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal in einer Einzeldosis von 10 bis 2000 µg, vorzugsweise von 100 bis 200 µg CWS an Patienten verabreicht.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1

N. rubra-CWS4 mg Miglyol2 Tropfen 5,6 %ige Mannitol-Lösung,
enthaltend 0,2% Tween 801 ml

Das CWS von N. rubra (140 mg) wurde in einen Gewebehomogenisator eingeführt, der mit einem Teflon-Pistill ausgestattet war. Miglyol (70 Tropfen) wurden mittels einer 27 Gauge-Injektionsnadel einer Spritze dem CWS zugesetzt und diese Mischung wurde mit 1000 UpM zu einer glatten Paste gemahlen. Dann wurde eine 5,6 %ige wäßrige Mannit- Lösung (35 ml), die 0,2% Tween 80 enthielt, zu der Paste zugegeben und das Mahlen wurde fortgesetzt, bis eine gleichmäßige Suspension von kleinen Öltröpfchen, die an CWS von N. rubra assoziiert waren, erhalten wurde. Zur Herstellung des lyophili sierten Materials wurde die an Öl gebundene Suspension von N. rubra-CWS in 35 Phiolen (mit einem Volumen von 10 ml) über führt, unter Verwendung von flüssigem Stickstoff schnell ausge froren und dann bei Raumtemperatur lyophilisiert. Zur Herstellung einer Suspension vor der Verwendung wurde 1 ml sterilisiertes Wasser dem lyophilisierten Material zugesetzt.

Beispiel 2

N. rubra-CWS4 mg Drakeol-6VR2 Tropfen 5,6 %ige Mannit-Lösung,
enthaltend 0,2% Tween 801 ml

Anstelle des in dem obigen Beispiel 1 verwendeten Miglyols wurde Drakeol-6VR verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein erstarrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt.

Beispiel 3

N. rubra-CWS4 mg Squalen2 Tropfen 5,6 %ige Mannit-Lösung,
die 0,2% Tween 80 enthielt1 ml

Anstelle des in dem obigen Beispiel 1 verwendeten Miglyol wurde Squalen verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man eine erstarrte (feste) Zubereitung (Mittel) erhielt.

Beispiel 4

N. rubra-CWS4 mg Vitamin A-Palmitat2 Tropfen 5,6 %ige Mannit-Lösung,
die 0,2% Tween 80 enthielt1 ml

Anstelle des in dem Beispiel 1 verwendeten Miglyols wurde Vitamin A-Palmitat verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein er starrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt.

Beispiel 5

N. rubra-CWS4 mg Miglyol2 Tropfen 5,6 %ige Glukose-Lösung,
die 0,2% Tween 80 enthielt4 ml

Anstelle der in Beispiel 1 verwendeten 5,6 %igen wäßrigen Mannit- Lösung wurde eine 5 %ige wäßrige Glukoselösung verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein erstarrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt.

Bevorzugt ist "Miglycol 812". Es handelt sich um ein neutrales Öl, das ein Gemisch von Triglyceriden von ge sättigten pflanzlichen Fettsäuren mittlerer Kettenlänge ist. Die Säurezahl beträgt maximal 0,1; Verseifungszahl 325 bis 345; Jodzahl miximal 1; Jodfarbzahl maximal 2,0; Dichte bei 20°C 0,94 bis 0,96; Viskosität bei 20°C 28-32cP; Refraktion bei 20°C 21,448 bis 21,450.

Drakeol 6VR ist im einzelnen u. a. beschrieben in Iyakuhin Kaihatsu Kiso Koza XI, Yakuzai Seizoho (last volume), page 599, (published by Chÿin Shokan in Tokyo). Es handelt sich um ein flüssiges Paraffin. Eine ähnliche Zusammensetzung hat das Produkt Bayol F.

Die für das Zellwand-Gerüst verwendete Abkürzung "CWS" ist abgeleitet von der englischen Bezeichnung "cell wall skeleton" von Mikroorganismen.

Claims

1. Stabilisiertes, immuntherapeutisches Mittel mit Adjuvans- und Antitumoraktivität auf der Basis von an Trägeröl gebundenem Mikroben-Zellwandgerüst von Genus Nocardia, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Suspension besteht, die sich zusammensetzt aus dem Mikroben-Zellwandgerüst von Nocardia rubra mit dem Träger öl, einem Polyalkoholester und einen Zuckeralkohol oder Zucker und wobei die Suspension durch Gefriertrocknen verfestigt worden ist.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägeröl um Drakeol 6VR, Squalen, Squalan, Miglyol oder Vitamin A-Palmitat handelt.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polyalkoholester um einen Polyoxyethylen sorbitanester handelt.

4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zuckeralkohol um Mannit oder Sorbit und bei dem Zucker um Glukose handelt.

5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Suspension besteht, die sich zusammensetzt aus dem Zellwandgerüst von Nocardia rubra, Squalen, Poly oxyethylensorbitanmonooleat und Mannit.

6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer sterilisierten injizierbaren Suspension vorliegt.